Summary
Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.
Abstract
O AVC isquêmico é uma condição clínica caracterizada pela hipoperfusão do tecido cerebral, levando à privação de oxigênio e glicose, e à consequente perda neuronal. Inúmeras evidências sugerem que a interação entre células gliais e neuronais exerce efeitos benéficos após um evento isquêmico. Portanto, para explorar potenciais mecanismos de proteção, é importante desenvolver modelos que permitam estudar interações neurônio-glia em um ambiente isquêmico. Aqui apresentamos uma abordagem simples para isolar astrócitos e neurônios do córtex embrionário de ratos, e que, usando meios de cultura específicos, permite o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neuron-glia com alto rendimento e reprodutibilidade.
Para estudar a conversa cruzada entre astrócitos e neurônios, propomos uma abordagem baseada em um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos banhados em placas multiwell. As duas culturas são mantidas separadas por pequenas esferas de parafina. Essa abordagem permite a manipulação independente e a aplicação de tratamentos específicos a cada tipo celular, o que representa uma vantagem em muitos estudos.
Para simular o que ocorre durante um acidente vascular cerebral isquêmico, as culturas são submetidas a um protocolo de privação de oxigênio e glicose. Este protocolo representa uma ferramenta útil para estudar o papel das interações neurônio-glia no derrame isquêmico.
Introduction
Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, cerca de 5,5 milhões de pessoas morrem todos os anos por acidente vascular cerebral isquêmico1. Essa condição é caracterizada pela interrupção do fluxo sanguíneo para uma determinada região cerebral, resultando em uma perda reversível ou irreversível no fornecimento de oxigênio e nutrientes para o tecido, o que altera a função tecidual e leva à disfunção mitocondrial, desregulação de cálcio, excitoxicidade do glutamato, inflamação e perda celular2,,3.
Além das células vasculares, as células neuronais e gliais estão envolvidas na fisiopatologia do derrame isquêmico4. Em particular, os astrócitos são essenciais para a manutenção dos neurônios e recentemente mostraram-se um papel crítico na resposta à lesão isquêmica5. Este tipo de célula gliaial exerce funções de suporte estrutural, defesa contra estresse oxidativo, síntese de neurotransmissores, estabilização da comunicação célula-célula, entre outras6. Junto com os neurônios, os astrócitos desempenham um papel direto na transmissão sináptica, regulando a liberação de moléculas como triphosfato de adenosina, ácido gama-aminobutírico e glutamato7. Parte da lesão induzida pela isquemia é causada pela liberação excessiva de glutamato e seu acúmulo na fissura sináptica, levando à superativação de receptores N-metil-D-aspartato, ativando cascatas de sinalização a jusante, resultando em excitotoxicidade8. Uma vez que os astrócitos são capazes de remover o glutamato da fissura sináptica e convertê-lo em glutamina, eles são cruciais na defesa contra a excitotoxicidade, exercendo assim um efeito neuroprotetor sobre a isquemia. Essas células também desempenham um papel na neuroinflamação induzida pela isquemia. Após o insulto isquêmico, os astrócitos ativados sofrem alterações morfológicas (hipertrofia), proliferam e mostram um aumento na expressão de proteína ácida fibrilar gliana (GFAP). Eles podem se tornar reativos (astrogliose), liberando citocinas pró-inflamatórias como o fator necrose tumoral-α, interleucina-1α e interleucina-1β, e produzindo radicais livres, incluindo óxido nítrico e superóxido, que por sua vez pode induzir a morte neuronal9,,10. Em contraste, os astrócitos reativas também podem ter um efeito neuroprotetor, uma vez que liberam citocinas anti-inflamatórias, como transformar fator de crescimento-β, que é regulado após o derrame11. Além disso, podem gerar uma cicatriz glianal, que pode limitar a regeneração tecidual inibindo o broto axonal; no entanto, essa cicatriz gliaria pode isolar o local da lesão do tecido viável, evitando assim uma onda cascata de danos teciduais descontrolados12,13.
Assim, é imprescindível estabelecer modelos que permitam estudar interações neurônio-glia sob uma lesão isquêmica, a fim de encontrar estratégias terapêuticas que limitem ou revertam os efeitos da lesão isquêmica. Comparado com outros modelos usados para estudar lesões isquêmicas, ou seja, os modelos in vivo 14,,15,16, culturas organotípicas17,,18,,19 e fatias cerebrais agudas20,,21,,22, culturas celulares primárias são menos complexas, o que possibilita o estudo de contribuições individuais de cada tipo celular na fisiopatologia do derrame isquêmico e como cada tipo de célula responde a possíveis alvos terapêuticos. Tipicamente, para estudar as interações entre culturas enriquecidas por neurônios e culturas enriquecidas por astrócitos, são utilizados neurônios e células gliais de origem pós-natal23,,24ou células gliais pós-natais e neurônios embrionários25,,26. Aqui é proposto uma abordagem simples para estabelecer culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos e culturas neurônio-glia a partir do mesmo tecido. Essas células primárias são obtidas a partir do córtex embrionário de rato, uma região frequentemente afetada pelo acidente vascular cerebral27,28. Além disso, a dissociação do tecido é realizada apenas por um procedimento mecânico. Portanto, este protocolo permite isolar células no mesmo estágio de desenvolvimento, de forma rápida e barata, e com alto desempenho e reprodutibilidade.
O crosstalk entre astrócitos e neurônios pode ser explorado usando um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos semeados em placas multiwell. Pequenas esferas de parafina podem ser usadas para garantir a separação das duas culturas celulares. Esta abordagem permite manipulação independente de cada tipo de célula antes de serem colocados em contato. Por exemplo, é possível silenciar um gene específico em astrócitos e ver como ele pode influenciar a vulnerabilidade neuronal ou proteção contra danos induzidos por isquêmicos. Um método estabelecido para induzir condições isquêmicas in vitro é a privação de oxigênio e glicose (OGD)3, que consiste em substituir a atmosfera regular (95% de ar e 5% DE CO2) por uma atmosfera anoxica (95% N2 e 5% CO2),associada à omissão de glicose.
O método descrito é adequado para estudar as interações entre neurônios e astrócitos no contexto do AVC isquêmico, de forma simples, rápida, reprodutível e barata.
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Protocol
Todos os animais utilizados foram criados no Centro de Pesquisa em Ciência da Saúde CICS-UBI, de acordo com os requisitos éticos nacionais para a pesquisa animal e com a Convenção Europeia para a Proteção de Animais vertebrados Usados para Fins Experimentais e Outros Científicos (Diretiva 2010/63/UE).
1. Cultura celular primária do córtex do embrião do rato
- Preparação média da cultura
- Prepare o Neurobasal Medium (NBM) adicionando os seguintes suplementos: 2% B27, 0,5 mM de glutamina, 25 μM de glutamato e 120 μg/mL gentamicina. Homogeneize, ajuste o pH para 7,2 e esterilize o meio com uma etapa de filtragem a vácuo, utilizando um filtro de 0,22 μm. Para a cultura celular neurônio-glia, suplementar o meio de cultura celular NBM com 10% do Soro Bovino Fetal Inativado por Calor (HI-FBS).
- Prepare o meio Mínimo Essencial De Águia Média (MEM) com os seguintes suplementos: carbonato de hidrogênio de sódio 2,2 g/L, insulina do pâncreas bovino 5 mg/L, Anidro D-glicose 3,4 g/L, penicilina (12 U/mL) /estreptomicina (12 μg/mL) e 10% HI-FBS. Homogeneize, ajuste o pH para 7,2 e esterilize o meio com uma etapa de filtragem.
- Preparação de materiais e equipamentos
- Puna a parte terminal de uma ponta de micropipette plástica de 1 mL de um lado para o outro, utilizando uma agulha com diâmetro específico (0,5 mm para S; 0,6 mm para M; 0,8 mm para L) e selar a abertura da ponta com uma chama.
- Esterilize todos os vidros. Durante toda a dissecção mantêm as ferramentas utilizadas (por exemplo, tesoura, pinça, bisturi) imersas em 70% de etanol. Pulverize os materiais com 70% de etanol antes de entrar na câmara de fluxo laminar.
- Coloque a temperatura do banho de água para 37 °C e coloque o meio de cultura celular no banho de água antes de iniciar o procedimento.
NOTA: Para ensaios de imunocitoquímica, o revestimento de poli-D-lisina deve ser realizado em placas multiwell contendo tampas.
- Cultura do córtex embrionário de rato
- Remover os embriões de ratos de um rato Wistar fêmea com 15-16 dias de gestação (o fim do acasalamento, que deve durar 24h, é considerado o1º dia do desenvolvimento embrionário). Para isso, anestesiar a fêmea com cetamina (87,5 mg/kg) e xilazina (12 mg/kg) e remover os embriões. Em seguida, eutanize o rato fêmea por deslocamento cervical, seguindo o protocolo padrão.
- Coloque os embriões em um tubo estéril de 50 mL, adicione soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) até cobrir os embriões e leve-os rapidamente para a sala de cultura.
- Ainda dentro do saco de gema, coloque os embriões em uma placa de Petri contendo 25 mL de PBS frio. Com a ajuda de tesouras e pinças, quebre o saco de gema, remova o embrião e transfira para outra placa de Petri contendo também PBS fria. O PBS na placa de Petri deve ser suficiente para cobrir todo o embrião.
NOTA: Tenha cuidado ao abrir o saco de gema para evitar danificar o embrião. Em 1.3.3 e 1.3.4 usamos placas de Petri de 90 mm de diâmetro colocadas em cima de blocos de gelo cobertos com papel absorvente para manter o PBS em baixa temperatura. - Para dissecção do embrião, transfira-o para outra placa de Petri contendo 30 mL de PBS frio. Coloque o embrião sob um microscópio dissecando e imobilize-o usando uma pinça. Faça a incisão inicial paralela ao córtex, indo da cavidade ocular até o fim da focinheira e tenha cuidado para não decapitar o animal.
- Remova cuidadosamente o couro cabeludo e as meninges usando pinças, a fim de não danificar o tecido cerebral cortical. Faça a próxima incisão para separar o córtex. Transfira o tecido cortical para um tubo de 15 mL contendo 5 mL de PBS usando uma pipeta Pasteur.
- Realize a digestão mecânica do tecido cerebral cortical utilizando as pontas plásticas de 1 mL preparadas em 1.2.1. Triturar 10 vezes com uma pipeta regular e repetir o processo usando pipetas com orifícios progressivamente menores (L, M e S), até que os pedaços tenham desmoronado.
- Após a digestão mecânica, centrifufique a suspensão a 400 x g por 3 min. Descarte o supernasce e resuspenque o sedimento com o meio de cultura celular apropriada previamente aquecido a 37 °C.
- Determinar o número total de células presentes na suspensão celular (densidade celular) usando uma câmara de Neubauer, fazer as diluições apropriadas e emplacar as células. A densidade celular inicial foi definida com base em um estudo anterior5.
- Para uma cultura enriquecida com neurônios, use 0,21 x 106 células/cm2 como a densidade celular inicial e mantenha as células em meio de cultura NBM sem HI-FBS.
- Para as culturas neurônio-glia, utilize 0,14 x 106 células/cm2 como densidade celular inicial e mantenha as células em média de cultura NBM suplementadas com HI-FBS de 10%.
- Para uma cultura enriquecida com astrócitos, use 0,26 x 106 células/cm2 como densidade celular inicial e mantenha as células em MEM suplementadas como indicado anteriormente.
- Coloque as células em uma incubadora a 37 °C, 95% O2 e 5% CO2.
NOTA: Por períodos de cultura mais longos, um anti-mitótico como 27 μM 5-fluoro-2'-desoxyuridina com 68 μM uridine deve ser adicionado para suprimir o crescimento celular.
2. Sistema de cocultura
- Preparação de materiais
- Aqueça a parafina a 150 °C em um bloco de aquecimento por aproximadamente 7 minutos. Mantenha a 150 °C até terminar o procedimento. Em seguida, com a ajuda de uma pipeta pasteur de vidro estéril de 1 mm de diâmetro, adicione uma pequena gota sobre as tampas esterilizadas e revestidas de PDL. As esferas de parafina são irregulares, mas têm aproximadamente 2 mm de diâmetro. As esferas permitirão que as duas culturas sejam separadas por aproximadamente 1,25 mm.
- Como a parafina não é estéril, coloque o multiwell com as esferas de parafina sob radiação ultravioleta por 15 minutos.
- Para estabelecer a cocultura, transfira o deslizamento de cobertura com as esferas de parafina usando uma pinça anteriormente imersa em 70% de etanol por 15 minutos.
- Co-cultura
- Quando as duas culturas estiverem prontas para uso (ou seja, após 7 dias na cultura sob as condições mencionadas na etapa 1.3.8), transfira os neurônios semeados nas tampas com esferas de parafina para os poços que contêm os astrócitos.
- 24 h antes que as duas culturas sejam trazidas em contato, mude o meio cultural dos neurônios e astrócitos para NBM complementado, ou não, com HI-FBS, dependendo do propósito do experimento.
- Depois de colocar ambos os tipos de células em contato, aguarde 8-12 h antes de iniciar os diferentes estímulos e procedimentos.
NOTA: A representação esquemática do sistema de cocultura é mostrada na Figura 1.
3. Privação de oxigênio e glicose
- Preparação média da cultura
- Para os experimentos OGD, use a Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hank. Prepare o meio HBSS com os seguintes reagentes: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4 .4 Homogeneize e ajuste o pH para 7,2. Esterilize o meio por filtragem.
NOTA: Se for o caso, suplemente a solução HBSS com glicose (HBSSglu+), adicionando 5,56 mM de glicose. Para culturas submetidas ao OGD não suplementar o meio HBSS com glicose (HBSSglu-).
- Para os experimentos OGD, use a Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hank. Prepare o meio HBSS com os seguintes reagentes: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4 .4 Homogeneize e ajuste o pH para 7,2. Esterilize o meio por filtragem.
- Procedimento OGD
- 7 dias após a semeadura das células, remova o meio de cultura e lave duas vezes com HBSSglu-. Depois de lavar adicione o meio de cultura de células HBSSglu e coloque o multiwell na câmara de hipóxia.
- Sele a câmara de hipóxia e adicione uma mistura de gás contendo 95% N2/5% DE CO2 por 4 min com um fluxo de 20 L/min para remover o oxigênio presente dentro da câmara. Depois disso, pare o fluxo e coloque a câmara de hipóxia em uma incubadora a 37 °C por 4h ou 6h, dependendo da extensão da isquemia pretendida.
- Após o período de OGD, substitua o hbssglu-médio pelo meio de cultura adequado para os procedimentos restantes.
NOTA: O experimento OGD visa simular as condições in vitro que as células sofrem durante um evento isquêmico, por isso é importante certificar que todas as mídias usadas anteriormente são removidas.
4. Ensaio de imunocytoquímica
NOTA: Realize o ensaio de imunocitoquímica conforme descrito anteriormente5.
- Resumidamente, para caracterizar as diferentes culturas corticais, incubar as células durante a noite a 4 °C com o coelhinho anti-GFAP (1:2000) e a proteína anti-microtúbula do rato 2 (MAP2; 1:500); e depois 1h à temperatura ambiente com os seguintes anticorpos secundários: anti-coelho conjugado a Alexa Fluor 546 e anti-rato conjugado à Alexa Fluor 488, ambos a 1:1000 diluição.
- Rotule os núcleos celulares por incubação com 2 μM Hoechst 33342 por 10 min a temperatura ambiente.
- Montagem de tampas no meio de montagem da fluorescência e adquira imagens em um microscópio de epifluorescência com uma ampliação de 63x.
5. Análise estatística
- Expresse dados como percentual do número total de células ou como percentual de controle e apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM) de pelo menos 3 experimentos independentes realizados em triplicado.
- Realize análise estatística com software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), usando o teste t do aluno não pago. Os resultados foram considerados significativos quando os valores de p < 0,05.
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Representative Results
Para caracterizar as culturas, a imunocitoquímica para avaliar o número de células que expressavam GFAP ou MAP2, marcadores amplamente utilizados de astrócitos e neurônios (Figura 2),foi realizada em cada tipo de cultura cortical. Esta análise revelou que as culturas enriquecidas com astrócito apresentaram 97% das células expressas GFAP (Figura 2A). Em relação à cultura enriquecida com neurônios, 78% das células expressas MAP2, 4% das células expressas GFAP e 18% das células eram GFAP e MAP2-negativos (Figura 2B). Em relação à cultura cortical neurônio-glia, 49% das células eram MAP2-positivas, 31% eram GFAP-positivas e 20% negativas para ambos os marcadores(Figura 2C).
Sete dias após o estabelecimento da cultura cortical, a cultura neurônio-glia e a cultura enriquecida com neurônios foram submetidas ao procedimento OGD, por 4h ou 6 h. Após esse procedimento, o número de células MAP2 e GFAP-positivas foi avaliado por imunocitoquímica. Na cultura neurônio-glia, a perda de células MAP2 positivas foi de 30% e 60% após 4h e 6h de OGD, respectivamente (Figura 3B), enquanto a perda de células GFAP-positivas foi de 9% e 17% após 4h e 6h de OGD,respectivamente (Figura 3C). Em relação à cultura enriquecida com neurônios, houve queda de 41% e 64% no número de células MAP2 positivas após 4h e 6h de OGD, respectivamente (Figura 3A). Além disso, na cultura enriquecida por neurônios, houve um ligeiro aumento na extensão da lesão induzida por 4h de OGD quando comparada à cultura neurônio-glia(Figura 3A).
Figura 1: Representação esquemática do sistema de cocultura.
(A) Os astrocitos foram semeados em um multiwell contendo tampas revestidas de PDL e neurônios foram semeados em um multiwell com tampas revestidas de PDL contendo 3 esferas de parafina. (B) Quando as duas culturas estavam prontas para uso, os neurônios nas tampas com as esferas foram transferidos para os poços que continham os astrócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização da cultura cortical neuron-glia, cultura cortical enriquecida por neurônios e cultura cortical enriquecida com astrócito.
Percentual de neurônios (células MAP2 positivas), percentual de astrócitos (células positivas GFAP) e percentual de células dupla-negativas (células MAP2-negativas/GFAP-negativas) no7º dia de cultura em (A) cultura enriquecida por astrônomos(B)cultura enriquecida por neurônios e(C) neurônio-glia cultura e imagens representativas mostrando a imunostaining para MAP2 (verde) e GFAP (vermelho). O número total de células foi avaliado pela quantificação de núcleos rotulados hoechst 33342 com morfologia não-pitnótica (azul). Devido ao baixo número de neurônios na cultura cortical enriquecida por astrócitos, a imagem representativa não mostra manchas MAP2 positivas. Os dados são apresentados como média ± SEM de 3 experimentos independentes (A) e 6 experimentos independentes(B, C) realizados em triplicado. As imagens foram adquiridas com um objetivo de 63x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da perda neuronal após um período de OGD.
(A, B) Número de neurônios/campo (células MAP2 positivas) em uma cultura neurônio-glia e cultura enriquecida por neurônios e(C) número de astrócitos/campo (células positivas GFAP) e imagem representativa de IMUNOstaining MAP2 (verde) e GFAP (vermelho) em uma cultura neurônio-glia. O número total de células foi avaliado pela quantificação de núcleos rotulados hoechst 33342 com morfologia não-pitnótica (azul). As culturas neuron-glia e neuron-enriquecidas foram submetidas à privação de oxigênio e glicose (OGD) por um período de 4h e 6 h. Os dados são apresentados como média ± SEM de pelo menos 3 experimentos independentes realizados em triplicado. O número total de células foi avaliado pela quantificação dos núcleos rotulados hoechst 33342. **p < 0,01, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001 em comparação com OGD 0 h (teste de T do Estudante não pago) Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
O método aqui descrito consiste no isolamento de astrócito e neurônio do tecido cortical embrionário de ratos, permitindo o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neurônio-glia. Foi adaptado de um estudo anterior do nosso grupo5,onde foram descritas as culturas embrionárias do neurônio cortical-glia e do neurônio enriquecidos com neurônios e as duas culturas caracterizadas. Usando essas culturas, Roque et al. descobriram que os astrócitos desempenham um papel fundamental na resposta a um dano isquêmico e sugerem que a comunicação entre astrócitos e neurônios é essencial para a neuroproteção5. No presente protocolo, além da preparação de culturas enriquecidas com neurônios e neurônios, também somos capazes de obter culturas enriquecidas com astrócitos, o que nos permite estudar o efeito de um ambiente isquêmico nos neurônios e astrócitos isolados ou juntos.
A análise dos dados da imunocitoquímica mostrou que 18% das células da cultura enriquecida com neurônios e 20% nas culturas neuron-glia foram negativas tanto para map2 quanto para GFAP. Estas células apresentaram núcleos com morfologia não-pitnótica. Dado que as culturas foram preparadas a partir do tecido embrionário, parte das células pode ainda não expressar o marcador neuronal, necessitando de maior maturação. Isso está em consonância com estudos anteriores indicando que a expressão MAP2 aumenta com a maturidade neuronal e que o número de células MAP2 positivas aumentou com o tempo na cultura e com a idade dos embriões no momento da dissecação29,30. Demonstramos anteriormente que na cultura neurônio-glia apenas 0,7% das células eram positivas para a molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizado de marcador microglial15. Embora o meio de cultura utilizado nas culturas neuron-glia tenha o apoio nutricional necessário para o crescimento celular glia, a quantidade de microglia no córtex de embriões com 15-16 dias é reduzida e à medida que o tempo de cultura é reduzido, o crescimento desse tipo de célula é limitado. O mesmo se aplica às culturas enriquecidas por neurônios, mas neste caso o crescimento das células gliais é ainda mais limitado devido à ausência de HI-FBS no meio da cultura.
Além de permitir que diferentes tipos de culturas sejam obtidas a partir da mesma preparação, o protocolo aqui descrito tem outras vantagens. A suspensão unicelular é obtida simplesmente por digestão mecânica, ao contrário de outros métodos que utilizam digestão enzimática e mecânica24,25,,31,,32; portanto, é mais rápido e mais barato. Outra vantagem é que esse protocolo também pode ser usado para preparar células de outras regiões cerebrais, como o hipocampo ou o midbrain, permitindo o estudo de patologias que afetam diferentes áreas do cérebro. Além disso, o procedimento alternativo descrito, que permite o estabelecimento de coculturas, permite a análise de alterações bioquímicas e morfológicas que ocorrem em tipos de células específicas presentes na cocultura por meio do uso de métodos como a imunocitoquímica. Um modelo comum para o estabelecimento de co-culturas é o transwell systems24,25,33,34. Ao contrário do que ocorre com um sistema de cocultura utilizando pequenos espaçadores, como as esferas de parafina, modelos de cocultura transwell não permitem realizar imunocitoquímica em ambas as células tipos presentes na co-cultura. Além disso, as co-culturas que utilizam espaçadores como as esferas de parafina são simples e de baixo custo.
Submeter culturas de neurônio enriquecido ou neurônio-glia ao OGD é um modelo in vitro comum para isquemia, no entanto, outros métodos in vitro têm sido usados, ou seja, métodos químicos e enzimáticos ou indução de excitoxicidade por glutamato3,35. Em comparação com outros métodos, o OGD permite a simulação das duas fases que ocorrem durante o acidente vascular cerebral isquêmico, ou seja, a privação de oxigênio e glicose e a reperfusão, o que é uma vantagem porque imita o que ocorre in vivo. Além disso, embora métodos químicos e enzimáticos possam ser úteis devido à sua rápida resposta e facilidade de aplicação, há uma preocupação com a relevância para o estado patológico in vivo, pois a hipóxia química leva a uma geração radical mais livre do que a anoxia, superando o que se observa in vivo35. Em relação ao protocolo OGD, observou-se que leva à perda neuronal e que a extensão da lesão pode ser ajustada alterando a duração do período OGD, a fim de atingir os requisitos experimentais. As diferenças observadas na perda neuronal após o período OGD em culturas enriquecidas por neurônios e culturas neurônio-glia podem ser devido ao papel protetor desempenhado pelos astrócitos, atenuando assim a morte neuronal.
Como esperado, os danos oGD aos astrócitos nas culturas neurônio-glia foram menores em 4h e 6 h quando comparados aos neurônios. A maior resistência dos astrócitos ao OGD é atribuída a múltiplos aspectos. Eles são capazes de manter os níveis de ATP por mais tempo do que os neurônios durante a isquemia, e a severa desregulação iônica prossegue mais lentamente36: primeiro porque os neurônios têm maior densidade de canais iônicos e uma consequente maior demanda energética para manter gradientes iônicos; e segundo porque a maioria dos estoques de glicogênio no cérebro é encontrada em astrócitos36. Além disso, os astrócitos expressam níveis mais baixos de receptores de glutamato ionotrópicos do que os neurônios e têm melhor tampão iônico e capacidade antioxidante36. Esses atributos presumivelmente estão por trás da conhecida perda seletiva de neurônios sobre os astrócitos36.
Quanto às limitações do protocolo aqui proposto, o mais significativo é que ele se baseia em um modelo in vitro que carece da complexidade das interações que ocorrem em um sistema in vivo, o que pode causar problemas de tradução para uma situação in vivo. No entanto, apresenta as vantagens associadas às culturas celulares, ou seja, simplicidade, facilidade de manipulação, a capacidade de fornecer informações básicas detalhadas sobre como uma população celular específica responde a um certo insulto3. Modelos in vitro de doença são menos demorados e menos caros de manter do que os modelos in vivo. Mais especificamente, para a modelagem do avc isquêmico, um modelo in vitro também possui a vantagem de ser mais fácil de controlar os níveis de glicose e oxigênio quando comparado com as alternativas in vivo 34. Além disso, também propomos o uso de co-culturas, o que pode dar um maior nível de complexidade, permitindo estudar a interação entre diferentes tipos celulares presentes em um tecido.
Existem algumas etapas críticas que requerem mais atenção ao executar o protocolo. Devido à exigência nutricional dos astrócitos, o NBM utilizado para a obtenção de culturas neurônio-glia deve ser suplementado com 10% dos fatores de crescimento contendo HI-FBS, aminoácidos e ácidos graxos. Essa suplementação é o que diferencia a cultura neurônio-glia da cultura enriquecida com neurônios. Para preparar uma cultura enriquecida por astrócitos deve ser utilizado um meio desprovido de suplementos necessários para o crescimento neuronal, como o B27. No protocolo atual, o meio de eleição para a cultura enriquecida por astrócitos era o MEM. Também é muito importante que as necessidades dos diferentes tipos de células sejam garantidas quando são colocadas em contato. Para isso, pode ser utilizado um meio cultural compatível com astrócitos e neurônios, ou seja, o NBM complementado com B27 e HI-FBS. Em relação ao protocolo OGD, as principais etapas críticas são a remoção de todo o O2 da câmara antes de iniciar o período OGD, e a lavagem adequada das células com HBSS sem glicose, a fim de eliminar toda a glicose presente no meio.
Em conclusão, aqui apresentamos um modelo in vitro para estudar o avc isquêmico estabelecido de forma simples, rápida, barata e reprodutível. Além disso, o método descrito também permite implementar culturas primárias enriquecidas com neurônios e astrócitos, mas também culturas neuronais ou glia, fornecendo assim um grande modelo in vitro para modelar várias doenças cerebrais, com um nível de complexidade maior do que linhas celulares imortalizadas e culturas neuronais ou gliais puras.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio de financiamento da Fundação para a Ciência e da Tecnologia por meio dos Projetos UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 e a bolsa SFRH/BD/135936/2018 à JP, por ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' através do projeto CENTRO-01-0145-FEDER-000013 e financiamento para a Plataforma PPBI-Português de Bioimagem através do Projeto POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
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