En cellkultur modell för att studera roll Neuron-Glia interaktioner i Ischemia

Summary

Här presenterar vi ett enkelt tillvägagångssätt med hjälp av specifika kulturmedier som möjliggör inrättandet av neuron- och astrocyter-berikade kulturer, eller neuron-glia kulturer från den embryonala cortex, med hög avkastning och reproducerbarhet.

Abstract

Ischemisk stroke är ett kliniskt tillstånd som kännetecknas av hypoperfusion av hjärnvävnad, vilket leder till syre och glukos deprivation, och den därav följande neuronal förlust. Många bevis tyder på att samspelet mellan stödjeceller och neuronala celler utöva positiva effekter efter en ischemisk händelse. Därför, att utforska potentiella skyddsmekanismer, Det är viktigt att utveckla modeller som gör det möjligt att studera neuron-glia interaktioner i en ischemisk miljö. Häri presenterar vi en enkel strategi för att isolera astrocyter och nervceller från råtta embryonala cortex, och att genom att använda specifika kultur media, möjliggör inrättandet av neuron- eller astrocyte-berikade kulturer eller neuron-glia kulturer med hög avkastning och reproducerbarhet.

För att studera överhörning mellan astrocyter och nervceller föreslår vi ett tillvägagångssätt baserat på ett samkultursystem där nervceller odlade i täckliner upprätthålls i kontakt med ett monolayer av astrocyter pläterade i multiwell plattor. De två kulturerna underhålls ifrån varandra av små paraffinsfärer. Detta tillvägagångssätt möjliggör oberoende manipulation och tillämpning av specifika behandlingar på varje celltyp, vilket utgör en fördel i många studier.

För att simulera vad som sker under en ischemisk stroke utsätts kulturerna för ett protokoll för syre- och glukosbrist. Detta protokoll representerar ett användbart verktyg för att studera rollen av neuron-glia interaktioner i ischemisk stroke.

Introduction

Enligt uppgifter från Världshälsoorganisationen, cirka 5,5 miljoner människor dör varje år från ischemisk stroke¹. Detta tillstånd kännetecknas av avbrott i blodflödet till en viss hjärnregion, vilket resulterar i en reversibel eller irreversibel förlust i tillförseln av syre och näringsämnen till vävnaden, vilket förändrar vävnadsfunktionen och leder till mitokondriell dysfunktion, kalciumdysreglering, glutamat excitotoxicitet, inflammation och cellförlust^2,3.

Bortsett från vaskulära celler, neuronala och gliaceller är inblandade i patofysiologi av den ischemiska stroke⁴. I synnerhet är astrocyter väsentliga för underhåll av nervceller och nyligen visades spela en avgörande roll i svaret på den ischemiska lesion⁵. Denna typ av gliacell utför funktioner av strukturellt stöd, försvar mot oxidativ stress, syntes av signalsubstanser, stabilisering av cell-cell kommunikation, bland annat⁶. Tillsammans med nervceller, astrocyter spelar en direkt roll i synaptisk överföring, reglera frisättningen av molekyler såsom adenosintrifosfat, gamma-aminosmörsyra och glutamat⁷. En del av den skada som induceras av ischemi orsakas av den överdrivna frisättningen av glutamat och dess ackumulering vid den synaptiska spalten, vilket leder till överaktivering av N-metyl-D-aspartatreceptorer, aktiverande nedströms signalerande kaskader, vilket slutligen resulterar i excitotoxicitet⁸. Eftersom astrocyter har möjlighet att ta bort glutamat från den synaptiska spalten och omvandla den till glutamin, de är avgörande för att försvara sig mot excitotoxicitet, och därigenom utövar en nervskyddande effekt på ischemi. Dessa celler spelar också en roll i ischemi-inducerad neuroinflammation. Efter den ischemiska förolämpning, aktiverade astrocyterna genomgå morphologic förändringar (hypertrofi), proliferera, och visa en ökning av stödjeceller fibrillary sura protein (GFAP) uttryck. De kan bli reaktiva (astrogliosis), släppa proinflammatoriska cytokiner såsom tumörnekros faktor-α, interleukin-1α och interleukin-1β, och producerar fria radikaler, inklusive kväveoxid och superoxid, som i sin tur kan framkalla neuronal död^9,10. Däremot kan reaktiva astrocyter också spela en nervskyddande effekt, eftersom de släpper antiinflammatoriska cytokiner, såsom omvandla tillväxtfaktor-β, som är uppreglerad efter stroke¹¹. Dessutom kan de generera ett gliavärde ärr, som kan begränsa vävnadsregenerering genom att hämma axonal groning; emellertid kan detta glia ärr isolera skadestället från livskraftig vävnad, vilket förhindrar en kaskadvåg av okontrollerad vävnadsskada^12,13.

Således är det absolut nödvändigt att fastställa modeller som tillåter att studera neuron-glia interaktioner under en ischemisk skada i syfte att hitta terapeutiska strategier som begränsar eller vända effekterna av ischemisk skada. Jämfört med andra modeller som används för att studera ischemisk skada, nämligen in vivo modeller ^14,15,16, organotypiska kulturer^17,18,19 och akut hjärnskivor^20,21,22, primära cellkulturer är mindre komplexa, vilket gör det möjligt att studera individuella bidrag av varje celltyp i patofysiologin i ischemisk stroke och hur varje celltyp svarar på möjliga terapeutiska mål. Typiskt, för att studera interaktioner mellan neuron-berikade kulturer och astrocyter-berikade kulturer, nervceller och gliaceller av postnatalt ursprung används^23,24, eller postnatala gliaceller och embryonala nervceller^25,26. Häri föreslås en enkel metod för att etablera neuron- eller astrocyte-berikade kulturer och neuron-glia kulturer från samma vävnad. Dessa primära celler erhålls från råtta embryonala cortex, en region som ofta påverkas av stroke^27,28. Dessutom utförs dissociationen av vävnaden endast genom ett mekaniskt förfarande. Därför tillåter detta protokoll isolera celler i samma utvecklingsstadium, på ett snabbt och billigt sätt, och med hög prestanda och reproducerbarhet.

Överhörningen mellan astrocyter och nervceller kan utforskas med hjälp av en co-kultur system där nervceller odlade i täckplattor upprätthålls i kontakt med ett monolager av astrocyter seedade i multiwell plattor. Små paraffinsfärer kan användas för att säkerställa separationen av de två cellkulturerna. Detta tillvägagångssätt tillåter oberoende manipulation av varje celltyp innan de bringas i kontakt. Det är till exempel möjligt att tysta en specifik gen i astrocyter och se hur den kan påverka den neuronala sårbarheten eller skyddet mot ischemisk-inducerad skada. En etablerad metod för att inducera ischemisk-liknande förhållanden in vitro är syre och glukos deprivation (OGD)³, som består i att ersätta den regelbundna atmosfären (95% luft och 5% CO₂) med en anoxic atmosfär (95% N₂ och 5% CO₂), samband med utelämnandet av glukos.

Den beskrivna metoden är lämplig för att studera interaktionerna mellan nervceller och astrocyter i samband med ischemisk stroke, på ett enkelt, snabbt, reproducerbart och billigt sätt.

Protocol

Alla djur som användes föddes upp vid CICS-UBI Health Science Research Centre i enlighet med de nationella etiska kraven för djurforskning och med Europeiska konventionen om skydd av ryggradsdjur som används för experimentella och andra vetenskapliga ändamål (direktiv 2010/63/EU). 1. Råtta embryo cortex primära cell kultur Förberedelse för kulturmedium Förbered Neurobasal Medium (NBM) genom att tillsätta följande kosttillskott: 2% B27, 0,5 mM glutamin, 25 μM gl…

Representative Results

För att karakterisera de kulturer, immuncytokemi för att bedöma antalet celler som uttryckt GFAP eller MAP2, allmänt använda markörer av astrocyter och nervceller (Figur 2), utfördes i varje typ av när kultur. Denna analys visade att astrocyteberikade kulturer presenterade 97% av de celler som uttrycker GFAP (Figur 2A). Angående den neuron-berikade kulturen 78% av cellerna uttryckta MAP2, 4% av cellerna uttryckt GFAP, och 18% av cellerna var både GFAP …

Discussion

Metoden här beskrivs består av astrocyten och neuron isolering från råtta embryonal kortikal vävnad, vilket möjliggör inrättandet av neuron- eller astrocyte-berikade kulturer eller neuron-glia kulturer. Den var anpassad från en tidigare studie av vår grupp⁵, där kortikala neuronen–glia och neuron-berikade embryonala kulturer isolering beskrevs och de två kulturerna kännetecknas. Använda dessa kulturer, Roque et al. fann att astrocyter spelar en nyckelroll i att svara på en ischemi…

Materials

24 -well culture plates	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 gas cylinder	ArLíquido
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010	1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature
B27 supplement (50x)	Gibco	17504-044
Dako Fluorescence Mounting Medium	Dako	S3023
D-glucose anhydrous	Fisher Scientific	G/0450/60	3.4 g/L
Epifluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver Z1x	63x objective
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom	S0615	10%
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1272	120 µg/mL
Glutamate	Sigma-Aldrich	G8415	25µM
Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	0.5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 µM; incubation period – 10 min at room temperature
Hypoxia incubation chamber	Stemcell Technologies	27310	Chamber used for OGD induction
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
Ketamine	Sigma-Aldrich	K-002	87.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium	Sigma-Aldrich	M0268	warm up to 37 °C before use
Mouse Anti-MAP2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	warm up to 37 °C before use
Paraffin pastilles for histology	Sigma-Aldrich	1.07164	Solidification point 56-58°C
Paraformaldehyde	Sigma -Aldrich	P6148	4% in PBS
Penicilin/Streptomycin	Biochrom	A 2213	penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL)
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1024
Rabbit Anti-GFAP	DAKO	Z0334	1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Sodium hydrogen carbonate	Fisher Scientific	S/4240/60	2.2g/L
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg