Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En cellekulturmodell for å studere rollen som neuron-glia interaksjoner i Iskemi

doi: 10.3791/61388 Published: November 14, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en enkel tilnærming ved hjelp av spesifikke kulturmedier som gjør det mulig å etablering av nevron- og astrocyttberikede kulturer, eller nevron-gliakulturer fra embryonal cortex, med høyt utbytte og reproduserbarhet.

Abstract

Iskemisk slag er en klinisk tilstand preget av hypoperfusjon av hjernevev, noe som fører til oksygen og glukosemangel, og det påfølgende nevronale tapet. Tallrike bevis tyder på at samspillet mellom glial og nevronale celler utøver gunstige effekter etter en iskemisk hendelse. Derfor, for å utforske potensielle beskyttende mekanismer, er det viktig å utvikle modeller som tillater å studere neuron-glia interaksjoner i et iskemisk miljø. Her presenterer vi en enkel tilnærming for å isolere astrocytter og nevroner fra rotte embryonal cortex, og at ved hjelp av spesifikke kulturmedier, tillater etablering av nevron- eller astrocyttberikede kulturer eller nevron-gliakulturer med høyt utbytte og reproduserbarhet.

For å studere kryssforfølgelse mellom astrocytter og nevroner, foreslår vi en tilnærming basert på et co-kultursystem der nevroner dyrket i dekkslips opprettholdes i kontakt med en monolayer av astrocytter belagt i multiwell plater. De to kulturene opprettholdes fra hverandre av små parafinsfærer. Denne tilnærmingen tillater uavhengig manipulering og anvendelse av spesifikke behandlinger til hver celletype, noe som representerer en fordel i mange studier.

For å simulere hva som skjer under et iskemisk slag, blir kulturene utsatt for en oksygen- og glukosemangelprotokoll. Denne protokollen representerer et nyttig verktøy for å studere rollen som neuron-glia interaksjoner i iskemisk slag.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ifølge data fra Verdens helseorganisasjon dør om lag 5,5 millioner mennesker hvert år av iskemisk slag1. Denne tilstanden er preget av avbrudd av blodstrømmen til en bestemt hjerneregion, noe som resulterer i et reversibelt eller irreversibelt tap i tilførselen av oksygen og næringsstoffer til vevet, noe som endrer vevsfunksjonen og fører til mitokondriedysfunksjon, kalsiumdysregulering, glutamatspenning, betennelse og celletap2,3.

Bortsett fra vaskulære celler er nevronale og glialceller involvert i iskemisk slags patofysiologi4. Spesielt astrocytter er avgjørende for vedlikehold av nevroner og nylig ble vist å spille en kritisk rolle i responsen på den iskemiskelesjonen 5. Denne typen glialcelle utfører funksjoner av strukturell støtte, forsvar mot oksidativt stress, syntese av nevrotransmittere, stabilisering av cellecellekommunikasjon, blant andre6. Sammen med nevroner spiller astrocytter en direkte rolle i synaptisk overføring, regulerer frigjøring av molekyler som adenosin trifosfat, gamma-aminosmørsyre og glutamat7. En del av skaden forårsaket av iskemi er forårsaket av overdreven frigjøring av glutamat og akkumulering på synaptisk kløft, noe som fører til overaktivering av N-metyl-D-aspartatreseptorer, aktiverer nedstrøms signalkaskader, noe som til slutt resulterer i eksitotoksiitet8. Siden astrocytter er i stand til å fjerne glutamat fra synaptisk kløft og konvertere den til glutamin, er de avgjørende for å forsvare seg mot eksitotoksisitet, og dermed utøve en nevrobeskyttende effekt på iskemi. Disse cellene spiller også en rolle i iskemi-indusert nevroinflammasjon. Etter iskemisk fornærmelse gjennomgår aktiverte astrocytter morfologiske endringer (hypertrofi), sprer seg, og viser en økning i glialflimmersyreprotein (GFAP) uttrykk. De kan bli reaktive (astrogliosis), slippe proinflammatoriske cytokiner som tumornekrose faktor-α, interleukin-1α og interleukin-1β, og produsere frie radikaler, inkludert nitrogenoksid og superoksid, som igjen kan indusere nevronal død9,10. I motsetning kan reaktive astrocytter også spille en nevrobeskyttende effekt, siden de frigjør antiinflammatoriske cytokiner, for eksempel transformere vekstfaktor-β, som er oppregulert etterslag 11. Videre kan de generere et glial arr, som kan begrense vevregenerering ved å hemme aksonær spire; Imidlertid kan dette glial arret isolere skadestedet fra levedyktig vev, og dermed forhindre en gjennomgripende bølge av ukontrollert vevsskade12,13.

Dermed er det viktig å etablere modeller som tillater studier av nevron-glia interaksjoner under en iskemisk skade for å finne terapeutiske strategier som begrenser eller reverserer effekten av iskemisk skade. Sammenlignet med andre modeller som brukes til å studere iskemisk skade, nemlig in vivo modeller14,15,16, organotypiskekulturer 17,18,,19 og akutte hjerneskiver20,21,22, primære cellekulturer er mindre komplekse, noe som gjør det mulig studiet av individuelle bidrag av hver celletype i patofysiologien av iskemisk slag og hvordan hver celletype reagerer på mulige terapeutiske mål. Vanligvis, for å studere samspillet mellom nevron-berikede kulturer og astrocytt-berikede kulturer, nevroner og glial celler av postnatal opprinnelse brukes23,,24,eller postnatal glial celler og embryonale nevroner25,26. Her foreslås en enkel tilnærming for å etablere nevron- eller astrocyttberikede kulturer og nevron-gliakulturer fra samme vev. Disse primære cellene er hentet fra rotte embryonal cortex, en region som ofte påvirkes av slag27,28. Videre utføres dissosiasjonen av vevet bare ved en mekanisk prosedyre. Derfor tillater denne protokollen å isolere celler i samme utviklingsstadium, på en rask og rimelig måte, og med høy ytelse og reproduserbarhet.

Crosstalk mellom astrocytter og nevroner kan utforskes ved hjelp av et co-kultur system der nevroner dyrket i coverslips opprettholdes i kontakt med en monolayer av astrocytter seeded i multiwell plater. Små parafinkuler kan brukes til å sikre separasjon av de to cellekulturene. Denne tilnærmingen tillater uavhengig manipulering av hver celletype før de bringes i kontakt. For eksempel er det mulig å dempe et bestemt gen i astrocytter og se hvordan det kan påvirke den nevronale sårbarheten eller beskyttelsen mot iskemisk-indusert skade. En etablert metode for å indusere iskemisk-lignende forhold in vitro er oksygen og glukosemangel (OGD)3, som består i å erstatte den vanlige atmosfæren (95% luft og 5% CO2) av en anoksisk atmosfære (95% N2 og 5% CO2), forbundet med utelatelse av glukose.

Metoden som er beskrevet er egnet for å studere samspillet mellom nevroner og astrocytter i sammenheng med iskemisk slag, på en enkel, rask, reproduserbar og billig måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyr som ble brukt ble avlet ved CICS-UBI Health Science Research Centre i samsvar med de nasjonale etiske kravene til dyreforskning og med Den europeiske konvensjonen om beskyttelse av virveldyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål (direktiv 2010/63/EU).

1. Rotte embryo cortex primære cellekultur

  1. Kultur medium forberedelse
    1. Forbered neurobasalmediet (NBM) ved å legge til følgende kosttilskudd: 2 % B27, 0,5 m M glutamin, 25 μM glutamat og 120 μg/ml gentamicin. Homogeniser, juster pH til 7,2 og steriliser mediet med et vakuumfiltreringstrinn ved hjelp av et 0,22 μm filter. For nevron-glia cellekultur, supplere NBM celle kultur medium med 10% av Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum (HI-FBS).
    2. Forbered minimumssensiell Medium Eagle (MEM)-medium med følgende kosttilskudd: natriumhydrogenkarbonat 2,2 g/l, insulin fra storfe bukspyttkjertel 5 mg/l, D-glukose vannfri 3,4 g/l, penicillin (12 U/ml) /streptomycin (12 μg/ml) og 10 % HI-FBS. Homogeniser, juster pH til 7,2 og steriliser mediet med et filtreringstrinn.
  2. Utarbeidelse av materialer og utstyr
    1. Punktere terminaldelen av en 1 ml mikropipettespiss i plast fra side til side, ved hjelp av en nål med en bestemt diameter (0,5 mm for S; 0,6 mm for M; 0,8 mm for L) og forsegle åpningen av spissen med en flamme.
    2. Steriliser alt glasset. Gjennom disseksjonen holde verktøyene som brukes (f.eks, saks, pinsett, skalpell) nedsenket i 70% etanol. Spray materialene med 70% etanol før du går inn i laminærstrømningskammeret.
    3. Sett vannbadtemperaturen til 37 °C og plasser cellekulturmediet i vannbadet før du starter prosedyren.
      MERK: For immunocytochemistryanalyser bør poly-D-lysinbelegg utføres i multibrønnplater som inneholder dekkslepper.
  3. Rotte embryonal cortex kultur
    1. Fjern rotteembryoene fra en kvinnelig Wistar-rotte med 15-16 dager etter svangerskapet (slutten av parringen, som skal vare i 24 timer, regnes som den førstedagen i embryonal utvikling). For dette formålet, bedøve kvinnen med ketamin (87,5 mg/ kg) og xyazin (12 mg / kg) og fjerne embryoene. Deretter euthanize den kvinnelige rotte ved cervical forvridning, etter standard protokoll.
    2. Plasser embryoene i et 50 ml sterilt rør, tilsett fosfatbuffersaltvann (PBS) til det dekker embryoene og ta dem raskt til kulturrommet.
    3. Fortsatt inne i eggeplommeseken, legg embryoene i en petriskål som inneholder 25 ml kald PBS. Ved hjelp av saks og pinsett, bryte eggeplommeseken, fjern embryoet og overfør det til en annen petriskål som inneholder også kald PBS. PBS i petriskålen skal være nok til å dekke hele embryoet.
      MERK: Vær forsiktig når du åpner eggeplommeseken for å unngå å skade embryoet. I 1.3.3 og 1.3.4 brukte vi 90 mm diameter Petri retter plassert på toppen av ispakker dekket med absorberende papir for å holde PBS ved lav temperatur.
    4. For disseksjon av embryoet, overfør det til en annen petriskål som inneholder 30 ml kald PBS. Plasser embryoet under et dissekerende mikroskop og immobiliser det ved hjelp av en pinsett. Gjør det første snittet parallelt med cortex, går fra okulært hulrom til enden av snuten og vær forsiktig så du ikke halshugger dyret.
    5. Fjern forsiktig hodebunnen og meningene ved hjelp av pinsett, for ikke å skade det kortikale hjernevevet. Gjør neste snitt for å skille cortex. Overfør det kortikale vevet til et 15 ml rør som inneholder 5 ml PBS ved hjelp av en Pasteurpipette.
    6. Utfør den mekaniske fordøyelsen av det kortikale hjernevevet ved hjelp av 1 ml plastspisser tilberedt i 1,2.1. Triturat 10 ganger med en vanlig pipette og gjenta prosessen ved hjelp av pipetter med gradvis mindre hull (L, M og S), til bitene har falt fra hverandre.
    7. Etter den mekaniske fordøyelsen sentrifuger suspensjonen ved 400 x g i 3 min. Kast det overnaturlige og resuspend sedimentet med riktig cellekulturmedium som tidligere var oppvarmet ved 37 °C.
    8. Bestem det totale antallet celler som finnes i cellesuspensjonen (celletetthet) ved hjelp av et Neubauer-kammer, gjør de riktige fortynningene og plate cellene. Den første celletettheten ble definert basert på en tidligere studie5.
      1. For en nevron-beriket kultur, bruk 0,21 x 106 celler / cm2 som den første celletettheten og vedlikehold cellene i NBM kulturmedium uten HI-FBS.
      2. For neuron-glia kulturer bruk 0.14 x 106 celler/cm2 som den første celletettheten og opprettholde cellene i NBM kultur medium supplert med 10% HI-FBS.
      3. For en astrocyttberiket kultur, bruk 0,26 x 106 celler/ cm2 som den første celletettheten og vedlikehold cellene i MEM supplert som tidligere angitt.
      4. Plasser cellene i en inkubator satt til 37 °C, 95 % O2 og 5 % CO2.
        MERK: I lengre kulturperioder bør en antimitotisk som 27 μM 5-fluor-2′-deoksyuridin med 68 μM uridin tilsettes for å undertrykke cellevekst.

2. Samarbeidskultursystem

  1. Utarbeidelse av materialer
    1. Varm parafinen ved 150 °C i en varmeblokk i ca. 7 min. Oppbevars ved 150 °C til du er ferdig med prosedyren. Deretter, ved hjelp av en 1 mm diameter sterilt glass Pasteur pipette, tilsett en liten dråpe over steriliserte og PDL-belagte dekkslips. Parafinsfærene er uregelmessige, men de har ca. 2 mm diameter. Kulene vil tillate de to kulturene å bli skilt med ca 1,25 mm.
    2. Siden parafinen ikke er steril, plasser multibrønnen med parafinkulene under ultrafiolett stråling i 15 min.
    3. For å etablere co-kulturen, overfør dekkslipsen med parafinkulene ved hjelp av en pinsett som tidligere var nedsenket i 70% etanol i 15 min.
  2. Medkultur
    1. Når de to kulturene er klare til bruk (det vil si etter 7 dager i kultur under forholdene nevnt i trinn 1.3.8), overfører nevronene seeded i dekkslips med parafiner til brønnene som inneholder astrocytter.
    2. 24 timer før de to kulturene bringes i kontakt, endre kulturmediet til nevroner og astrocytter til NBM supplert, eller ikke, med HI-FBS, avhengig av formålet med eksperimentet.
    3. Etter å ha plassert begge celletypene i kontakt, vent 8-12 timer før du starter de forskjellige stimuli og prosedyrer.
      MERK: Den skjematiske representasjonen av samkultursystemet vises i figur 1.

3. Oksygen og glukosemangel

  1. Kultur Medium Forberedelse
    1. For OGD-eksperimentene bruker du Hanks balanserte saltløsning (HBSS). Klargjør HBSS-mediet med følgende reagenser: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4,0,49 mM MgCl2,139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogeniser og juster pH-en til 7,2. Steriliser mediet ved filtrering.
      MERK: Tilslut deg om nødvendig HBSS-oppløsningen med glukose (HBSSglu+), ved å tilsette 5,56 mM glukose. For kulturer sendt til OGD ikke supplere HBSS medium med glukose (HBSSglu-).
  2. OGD-prosedyre
    1. 7 dager etter såing cellene, fjerne kulturmediet og vask to ganger med HBSSglu-. Etter vask tilsett HBSSglu-cellekulturmediet og legg multibrønnen i hypoksikammeret.
    2. Forsegle hypoksikammeret og tilsett en gassblanding som inneholder 95% N2/5% CO2 i 4 min med en strøm på 20 L / min for å fjerne oksygenet som er tilstede inne i kammeret. Etter dette, stopp strømmen og plasser hypoksikammeret i en inkubator ved 37 °C i 4 timer eller 6 timer, avhengig av omfanget av den tiltenkte iskemien.
    3. Etter perioden med OGD erstatter du HBSSglu-mediet med riktig kulturmedium for de gjenværende prosedyrene.
      MERK: OGD-eksperimentet tar sikte på å simulere in vitro-forholdene som cellene lider under en iskemisk hendelse, så det er viktig å sertifisere at alle mediene som ble brukt tidligere, fjernes.

4. Immunocytochemistry analyse

MERK: Utfør immunocytokjemianalysen som tidligere beskrevet5.

  1. Kort sagt, for å karakterisere de forskjellige kortikale kulturer, inkubere cellene over natten ved 4 ° C med kanin anti-GFAP (1:2000) og mus anti-mikrotubule-assosiert protein 2 (MAP2; 1:500); og deretter 1 t ved romtemperatur med følgende sekundære antistoffer: anti-kanin konjugert til Alexa Fluor 546 og anti-mus konjugert til Alexa Fluor 488, begge kl 1:1000 fortynning.
  2. Merk cellekjernene ved inkubasjon med 2 μM Hoechst 33342 i 10 min ved romtemperatur.
  3. Monter dekkglass i fluorescensmonteringsmedium og få bilder på et epifluorescensmikroskop med en 63x forstørrelse.

5. Statistisk analyse

  1. Uttrykk data i prosent av det totale antallet celler eller som en prosentandel av kontroll og presentert som gjennomsnittlig ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) av minst 3 uavhengige eksperimenter utført i triplicate.
  2. Utfør statistisk analyse med programvare (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), ved hjelp av den ubetalte studentens t-test. Resultatene ble ansett som signifikante når verdiene p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å karakterisere kulturer, immunocytochemistry å vurdere antall celler som uttrykte GFAP eller MAP2, mye brukt markører av astrocytter og nevroner (Figur 2), ble utført i hver type kortikal kultur. Denne analysen viste at astrocyttberikede kulturer presenterte 97% av cellene som uttrykker GFAP (figur 2A). Når det gjelder nevron-beriket kultur 78% av cellene uttrykt MAP2, 4% av cellene uttryktGFAP, og 18% av cellene var både GFAP og MAP2-negative (Figur 2B). I forhold til nevron-glia kortikal kultur, 49% av cellene var MAP2-positive, 31% var GFAP-positive og 20% var negative for begge markører (Figur 2C).

Syv dager etter etableringen av kortikal kultur, ble neuron-glia kulturen og neuron-beriket kultur utsatt for OGD-prosedyren, i 4 timer eller 6 timer. Etter denne prosedyren ble antall MAP2- og GFAP-positive celler vurdert av immunocytokjemi. I neuron-glia kultur, tapet av MAP2-positive celler var 30% og 60% etter 4 h og 6 h av OGD, henholdsvis (Figur 3B),mens tapet av GFAP-positive celler var 9% og 17% etter 4 h og 6 h av OGD, henholdsvis (Figur 3C). Når det gjelder den nevronberikede kulturen, var det en reduksjon på henholdsvis 41 % og 64 % i antall MAP2-positive celler etter henholdsvis 4 timer og 6 timer OGD (figur 3A). Videre, i nevron-beriket kultur, var det en liten økning i skadeforlengelsen indusert av 4 timer OGD sammenlignet med neuron-glia-kulturen (figur 3A).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon av co-kultursystemet.
Astrocytter ble sådd i en multibrønn som inneholdt PDL-belagte dekkslepper og nevroner ble seeded i en multibrønn med PDL-belagte dekkslips som inneholder 3 parafinkuler.A (B)Når de to kulturene var klare til bruk, ble nevronene i dekkslepene med kulene overført til brønnene som inneholdt astrocytter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering av nevron-glia kortikal kultur, nevron-beriket kortikal kultur og astrocytt-beriket kortikal kultur.
Prosentandel av nevroner (MAP2-positive celler), prosentandel av astrocytter (GFAP-positive celler) og prosentandel av dobbeltnegative celler (MAP2-negative/GFAP-negative celler) på 7th dagen i kultur i (A) astrocytt-beriket kultur (B) nevron-beriket kultur og (C) neuron-glia kultur og representative bilder som viser immunstaining for MAP2 (grønn) og GFAP (rød). Det totale antallet celler ble vurdert ved å kvantifisere Hoechst 33342-merket kjerner med ikke-pyknotisk morfologi (blå). På grunn av det lave antallet nevroner i den astrocyttberikede kortikale kulturen, viser det representative bildet ikke MAP2-positiv farging. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SEM av 3 uavhengige eksperimenter (A) og 6 uavhengige eksperimenter (B, C) utført i triplicate. Bilder ble kjøpt med et 63x mål. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vurdering av nevronalt tap etter en OGD-periode.
(A, B) Antall nevroner/felt (MAP2-positive celler) i en nevron-glia kultur og nevron-beriket kultur og (C) antall astrocytter / felt (GFAP-positive celler) og representativt bilde av MAP2 (grønn) og GFAP (rød) immunostaining i en nevron-glia kultur. Det totale antallet celler ble vurdert ved å kvantifisere Hoechst 33342-merket kjerner med ikke-pyknotisk morfologi (blå). Neuron-glia og nevron-beriket kulturer ble sendt til oksygen og glukose deprivasjon (OGD) for en periode på 4 timer og 6 h. Dataene presenteres som gjennomsnittet ± SEM av minst 3 uavhengige eksperimenter utført i triplicate. Det totale antallet celler ble vurdert ved å kvantifisere Hoechst 33342-merket kjerner. **p < 0,01, ***p < 0,001 og ****p < 0,0001 sammenlignet med OGD 0 h (unpaired Student's t test) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metoden her beskrevet består av astrocytt og nevron isolasjon fra rotte embryonale kortikale vev, slik at etableringen av neuron- eller astrocytt-beriket kulturer eller neuron-glia kulturer. Den ble tilpasset fra en tidligere studie av vår gruppe5, hvor den kortikale nevron-glia og nevron-beriket embryonale kulturer isolasjon ble beskrevet og de to kulturene preget. Ved hjelp av disse kulturene fant Roque et al. at astrocytter spiller en nøkkelrolle i å reagere på en iskemisk skade og antyder at kommunikasjon mellom astrocytter og nevroner er avgjørende for nevrobeskyttelse5. I den nåværende protokollen, i tillegg til utarbeidelsen av nevron-glia og nevronberikede kulturer, er vi også i stand til å oppnå astrocytter-berikede kulturer, noe som gjør at vi kan studere effekten av et iskemisk miljø på nevroner og astrocytter isolert eller sammen.

Analyse av immunocytochemistry data viste at 18% av cellene i neuron-beriket kultur og 20% i neuron-glia kulturer var negative for både MAP2 og GFAP. Disse cellene presenterte kjerner med ikke-pyknotisk morfologi. Gitt at kulturene ble utarbeidet av embryonalt vev, kan en del av cellene ennå ikke uttrykke den nevronale markøren, som trenger ytterligere modning. Dette er i tråd med tidligere studier som indikerer at MAP2-uttrykket øker med nevronal modenhet og at antall MAP2-positive celler økte med tiden i kulturen og med embryoenes alder på tidspunktet for disseksjon29,30. Vi har tidligere vist at i nevron-glia kultur bare 0,7% av cellene var positive for mikroglial markør ionisert kalsiumbindende adapter molekyl 15. Selv om kulturmediet som brukes i nevron-gliakulturer har den ernæringsmessige støtten som er nødvendig for glialcellevekst, reduseres mengden mikroglia i cortex av embryoer med 15-16 dager, og etter hvert som kulturtiden reduseres, er veksten av denne celletypen begrenset. Det samme gjelder nevronberikede kulturer, men i dette tilfellet er veksten av glialceller enda mer begrenset på grunn av fravær av HI-FBS i kulturmediet.

I tillegg til å tillate ulike typer kulturer å få fra samme forberedelse, protokollen her beskrevet har andre fordeler. Encellede suspensjon oppnås bare ved mekanisk fordøyelse, i motsetning til andre metoder som bruker både enzymatisk og mekanisk fordøyelse24,25,31,32; derfor er det raskere og billigere. En annen fordel er at denne protokollen også kan brukes til å forberede celler fra andre hjerneregioner, for eksempel hippocampus eller midbrain, slik at studiet av patologier som påvirker forskjellige områder av hjernen. Videre tillater den alternative prosedyren beskrevet, som tillater etablering av co-kulturer, analyse av biokjemiske og morfologiske endringer som forekommer i bestemte celletyper tilstede i samkulturen ved hjelp av metoder som immunocytokjemi. En vanlig modell for etablering av co-kulturer er transwell systemer24,25,33,34. I motsetning til hva som skjer med et co-kultursystem ved hjelp av små avstandsskjeler, for eksempel parafinsfærer, tillater transwell co-kulturmodeller ikke å utføre immunocytokjemi på begge celletyper som finnes i co-kulturen. I tillegg er co-kulturer som bruker avstandssyr som parafinsfærer enkle og lave kostnader.

Utsette neuron-beriket eller neuron-glia kulturer til OGD er en vanlig in vitro modell for iskemi, likevel andre in vitro metoder har blitt brukt, nemlig kjemiske og enzymatiske metoder eller induksjon av excitotoxicity av glutamat3,35. Sammenlignet med andre metoder tillater OGD simuleringen av de to fasene som oppstår under iskemisk slag, nemlig deprivasjon av oksygen og glukose og reperfusjon, noe som er en fordel fordi det etterligner det som skjer in vivo. Videre, selv om kjemiske og enzymatiske metoder kan være nyttige på grunn av rask respons og brukervennlighet, er det en bekymring med relevansen for in vivo patologisk tilstand, fordi kjemisk hypoksi fører til mer fri radikal generasjon enn anoksi, overgår det som observeres i vivo35. Når det gjelder OGD-protokollen, observerte vi at det fører til nevronalt tap, og at utvidelsen av lesjonen kan justeres ved å endre varigheten av OGD-perioden, for å nå de eksperimentelle kravene. Forskjellene observert i nevronalt tap etter OGD-perioden i nevronberikede kulturer og nevron-gliakulturer kan skyldes den beskyttende rollen astrocytter spiller, og dermed dempe neuronal død.

Som forventet var OGD-skade på astrocytter i nevron-gliakulturer lavere ved både 4 timer og 6 timer sammenlignet med nevroner. Den høyere motstanden av astrocytter til OGD tilskrives flere aspekter. De er i stand til å opprettholde ATP nivåer lenger enn nevroner under iskemi, og alvorlig ionisk dysregulering fortsettersaktere 36: for det første fordi nevroner har høyere tetthet av ioniske kanaler og en påfølgende større energietterspørsel for å opprettholde ioniske gradienter; og for det andre fordi de fleste glykogen butikkene i hjernen finnes i astrocytter36. I tillegg uttrykker astrocytter lavere nivåer av ionotropiske glutamatreseptorer enn nevroner og har bedre ionisk bufring og antioksidantkapasitet36. Disse egenskapene ligger antagelig til grunn for det velkjente selektive tapet av nevroner over astrocytter36.

Når det gjelder begrensningene i protokollen som foreslås her, er det viktigste at den er basert på en in vitro-modell som mangler kompleksiteten i interaksjonene som oppstår i et in vivo-system, noe som kan forårsake oversettende problemer til en in vivo-situasjon. Det presenterer imidlertid fordelene forbundet med cellekulturer, nemlig enkelhet, enkel manipulasjon, evnen til å gi grunnleggende detaljert informasjon om hvordan en bestemt cellepopulasjon reagerer på en viss fornærmelse3. In vitro modeller av sykdom er mindre tidkrevende og billigere å vedlikeholde enn in vivo modeller. Mer spesifikt, for modellering av iskemisk slag, har en in vitro-modell også fordelen av å være lettere å kontrollere glukose- og oksygennivået sammenlignet med in vivo-alternativene 34. Videre foreslår vi også bruk av co-kulturer, noe som kan gi et høyere nivå av kompleksitet, slik at man kan studere samspillet mellom ulike celletyper tilstede i et vev.

Det er noen kritiske trinn som krever ytterligere oppmerksomhet når du utfører protokollen. På grunn av næringskravet til astrocytter, bør NBM som brukes til å skaffe nevron-gliakulturer suppleres med 10% av HI-FBS-inneholdende vekstfaktorer, aminosyrer og fettsyrer. Denne tilskuddet er det som skiller neuron-glia kulturen fra nevron-beriket kultur. For å forberede en astrocytt-beriket kultur bør et medium blottet for kosttilskudd som kreves for nevronal vekst, som B27, brukes. I den nåværende protokollen var valgmediet for den astrocyttberikede kulturen MEM. Det er også svært viktig at behovene til de forskjellige celletypene sikres når de bringes i kontakt. For dette formålet kan et kulturmedium som er kompatibelt med både astrocytter og nevroner, nemlig NBM supplert med B27 og HI-FBS, brukes. Når det gjelder OGD-protokollen, er de viktigste kritiske trinnene fjerning av alle O 2 frakammeret før du starter OGD-perioden, og riktig vasking av cellene med HBSS uten glukose, for å eliminere all glukose tilstede i mediet.

Til slutt presenterer vi en in vitro-modell for å studere det iskemiske slaget etablert på en enkel, rask, billig og reproduserbar måte. I tillegg gjør metoden som er beskrevet også å implementere nevron- og astrocyttberikede primærkulturer, men også nevron-gliakulturer, og dermed gi en flott in vitro-modell for modellering av flere hjernesykdommer, med et høyere nivå av kompleksitet enn udødelige cellelinjer og rene nevronale eller glialkulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner finansieringsstøtten fra Fundação para a Ciência e a Tecnologia gjennom Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 og fellesskapet SFRH/BD/135936/2018 til JP, av ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" gjennom prosjektet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 og finansiering til PPBI-portugisisk plattform for bioimaging gjennom Prosjektet POCI-01-0145-FEDER-022122.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 -well culture plates Thermo Fischer Scientific 142475
95% N2/5% CO2 gas cylinder ArLíquido
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
B27 supplement (50x) Gibco 17504-044
Dako Fluorescence Mounting Medium Dako S3023
D-glucose anhydrous Fisher Scientific G/0450/60 3.4 g/L
Epifluorescence microscope Zeiss AxioObserver Z1x 63x objective
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0615 10%
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272 120 µg/mL
Glutamate Sigma-Aldrich G8415 25µM
Glutamine Sigma-Aldrich G3126 0.5 mM
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature
Hypoxia incubation chamber Stemcell Technologies 27310 Chamber used for OGD induction
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 5 mg/L
Ketamine Sigma-Aldrich K-002 87.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium Sigma-Aldrich M0268 warm up to 37 °C before use
Mouse Anti-MAP2 Santa Cruz Biotechnology Sc-74421 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103-049 warm up to 37 °C before use
Paraffin pastilles for histology Sigma-Aldrich 1.07164 Solidification point 56-58°C
Paraformaldehyde Sigma -Aldrich P6148 4% in PBS
Penicilin/Streptomycin Biochrom A 2213 penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL)
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1024
Rabbit Anti-GFAP DAKO Z0334 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Sodium hydrogen carbonate Fisher Scientific S/4240/60 2.2g/L
Xylazine Sigma-Aldrich X1126 12 mg/Kg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
  2. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22, (9), 391-397 (1999).
  3. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6, (1), 11 (2011).
  4. Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
  5. Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37, (8), 1521-1528 (2017).
  6. Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
  7. Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13, (2), 54-63 (2007).
  8. Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158, (1), 293-300 (2009).
  9. Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41, (16-17), 1330-1334 (2008).
  10. Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35, (6), 1449-1453 (2004).
  11. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62, (8), 1227-1240 (2014).
  12. Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11, (4), 344-348 (2014).
  13. Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34, (3), 480-488 (2014).
  14. Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70, (5), 667-676 (2020).
  15. Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66, (6), 552-561 (2007).
  16. Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
  17. Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4, (2), 173-184 (1999).
  18. Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56, (8), 1088-1096 (2009).
  19. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, (1), 117-127 (2004).
  20. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19, (4), 498-502 (1988).
  21. Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36, (4), 709-720 (2016).
  22. Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31, (33), 11941-11952 (2011).
  23. Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13, (10), (2018).
  24. Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182, (5), 1750-1768 (2013).
  25. Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
  26. Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18, (1), 74 (2019).
  27. Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8, (2), (2018).
  28. Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
  29. Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393, (1), 127-133 (1986).
  30. Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7, (10), 3163-3170 (1987).
  31. Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2, (3), 209-214 (1998).
  32. Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852, (10), Pt A 2035-2041 (2015).
  33. De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36, (6), 463-477 (2017).
  34. Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
  35. Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47, (2), 561-569 (2016).
  36. Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10, (11), 1377-1386 (2007).
En cellekulturmodell for å studere rollen som neuron-glia interaksjoner i Iskemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gava-Junior, G., Roque, C., Mendes-Oliveira, J., Bernardino, A. C., Serrenho, I., Pires, J. P., Baltazar, G. A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia. J. Vis. Exp. (165), e61388, doi:10.3791/61388 (2020).More

Gava-Junior, G., Roque, C., Mendes-Oliveira, J., Bernardino, A. C., Serrenho, I., Pires, J. P., Baltazar, G. A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia. J. Vis. Exp. (165), e61388, doi:10.3791/61388 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter