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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Published: November 14, 2020 doi: 10.3791/61388
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Abstract

Der ischämische Schlaganfall ist ein klinischer Zustand, der durch eine Hypoperfusion des Hirngewebes gekennzeichnet ist, was zu Sauerstoff- und Glukoseentzug und dem daraus resultierenden neuronalen Verlust führt. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen gliaalen und neuronalen Zellen nach einem ischämischen Ereignis positive Effekte ausübt. Daher ist es wichtig, Modelle zu entwickeln, die es ermöglichen, neuron-glia Wechselwirkungen in einer ischämischen Umgebung zu untersuchen, um mögliche Schutzmechanismen zu erforschen. Hierin stellen wir einen einfachen Ansatz vor, um Astrozyten und Neuronen aus dem embryonalen Kortex der Ratte zu isolieren, und das ermöglicht durch die Verwendung spezifischer Kulturmedien die Etablierung neuron- oder astrozytierter Kulturen oder neuronglia-Kulturen mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit.

Um den Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen zu untersuchen, schlagen wir einen Ansatz vor, der auf einem Kokultursystem basiert, in dem Neuronen, die in Coverlips kultiviert sind, in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Mehrwellplatten platt sind. Die beiden Kulturen werden durch kleine Paraffinkugeln getrennt gehalten. Dieser Ansatz ermöglicht die unabhängige Manipulation und Anwendung spezifischer Behandlungen auf jeden Zelltyp, was in vielen Studien einen Vorteil darstellt.

Um zu simulieren, was während eines ischämischen Schlaganfalls geschieht, werden die Kulturen einem Sauerstoff- und Glukoseentzugsprotokoll unterzogen. Dieses Protokoll stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die Rolle von neuron-glia Wechselwirkungen bei ischämischen Schlaganfällen zu untersuchen.

Introduction

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sterben jedes Jahr etwa 5,5 Millionen Menschen an ischämischen Schlaganfällen1. Dieser Zustand ist durch die Unterbrechung des Blutflusses in eine bestimmte Hirnregion gekennzeichnet, was zu einem reversiblen oder irreversiblen Verlust in der Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen führt, was die Gewebefunktion verändert und zu mitochondrialer Dysfunktion, Kalziumdysregulation, Glutamatexzitotoxizität, Entzündung und Zellverlustführt 2,3.

Neben Gefäßzellen sind neuronale und gliale Zellen an der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfallsbeteiligt 4. Insbesondere Sind Astrozyten für die Aufrechterhaltung von Neuronen von wesentlicher Bedeutung und haben in jüngster Zeit gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf die ischämische Läsion5spielen. Diese Art von Gliazelle erfüllt Funktionen der strukturellen Unterstützung, Abwehr gegen oxidativen Stress, Synthese von Neurotransmittern, Stabilisierung der Zell-Zell-Kommunikation, unter anderem6. Zusammen mit Neuronen spielen Astrozyten eine direkte Rolle bei der synaptischen Übertragung und regulieren die Freisetzung von Molekülen wie Adenosintriphosphat, Gamma-Aminobuttersäure und Glutamat7. Ein Teil der durch Ischämie induzierten Verletzung wird durch die übermäßige Freisetzung von Glutamat und seine Akkumulation am synaptischen Spalt verursacht, was zur Überaktivierung von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren führt, die nachgeschaltete Signalkaskaden aktivieren, was letztlich zu Exzitotoxizität8führt. Da Astrozyten in der Lage sind, Glutamat aus dem synaptischen Spalten zu entfernen und in Glutamin umzuwandeln, sind sie entscheidend für die Abwehr von Exzitotoxizität und üben damit eine neuroprotektive Wirkung auf Ischämie aus. Diese Zellen spielen auch eine Rolle bei Derischämie-induzierten Neuroinflammation. Nach der ischämischen Beleidigung ereignen sich aktivierte Astrozyten morphologischen Veränderungen (Hypertrophie), vermehren sich und zeigen eine Zunahme der glialen fibrillären sauren Proteinexpression (GFAP). Sie können reaktiv werden (Astrogliose), pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1 und Interleukin-1" freisetzen und freie Radikale, einschließlich Stickstoffmonoxid und Superoxid, produzieren, die wiederum den neuronalenTod9,10induzieren können. Im Gegensatz dazu können reaktive Astrozyten auch eine neuroprotektive Wirkung spielen, da sie entzündungshemmende Zytokine freisetzen, wie z. B. die Transformation von Wachstumsfaktor-β, das nach Schlaganfall11hochreguliert ist. Darüber hinaus können sie eine gliaale Narbe erzeugen, die die Geweberegeneration durch Hemmung des axonalen Keimens einschränken kann; diese Glianarbe kann jedoch die Verletzungsstelle von lebensfähigem Gewebe isolieren und so eine kaskadierende Welle unkontrollierter Gewebeschäden verhindern12,13.

Daher ist es unerlässlich, Modelle zu etablieren, die die Untersuchung von neuron-glia Wechselwirkungen unter einer ischämischen Verletzung ermöglichen, um therapeutische Strategien zu finden, die die Auswirkungen ischämischer Verletzungen begrenzen oder umkehren. Im Vergleich zu anderen Modellen zur Erforschung ischämischer Verletzungen, nämlich in vivo-Modellen 14,15,16, organotypische Kulturen17,18,19 und akute Hirnscheiben20,21,22, sind primäre Zellkulturen weniger komplex, was die Untersuchung einzelner Beiträge jedes Zelltyps in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls ermöglicht und wie jeder Zelltyp auf mögliche therapeutische Ziele reagiert. Typischerweise werden zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen neuronangereicherten Kulturen und astrozytenangereicherten Kulturen, Neuronen und Gliazellen postnatalen Ursprungs23,,24oder postnatale Gliazellen und embryonale Neuronen25,26verwendet. Hierin wird ein einfacher Ansatz vorgeschlagen, um neuron- oder astrozytenangereicherte Kulturen und Neuron-Glia-Kulturen aus demselben Gewebe zu etablieren. Diese Primärzellen werden aus dem embryonalen Kortex der Ratte gewonnen, einer Region, die häufig von Schlaganfall27,28betroffen ist. Darüber hinaus wird die Dissoziation des Gewebes nur durch ein mechanisches Verfahren durchgeführt. Daher ermöglicht dieses Protokoll die Isolierung von Zellen im gleichen Entwicklungsstadium, auf eine schnelle und kostengünstige Weise und mit hoher Leistung und Reproduzierbarkeit.

Das Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen kann mit einem Kokultursystem erforscht werden, in dem neuronenkultivierte In-Coverlips kultivierte Neuronen in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Multiwell-Platten gesät sind. Kleine Paraffinkugeln können verwendet werden, um die Trennung der beiden Zellkulturen zu gewährleisten. Dieser Ansatz ermöglicht eine unabhängige Manipulation jedes Zelltyps, bevor sie in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel ist es möglich, ein bestimmtes Gen in Astrozyten zum Schweigen zu bringen und zu sehen, wie es die neuronale Verletzlichkeit oder den Schutz vor ischämisch induzierten Schäden beeinflussen kann. Eine etablierte Methode zur Induzieren ischämisch-ähnlicher Bedingungen in vitro ist Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD)3, die darin besteht, die normale Atmosphäre (95% Luft und 5%CO2) durch eine anoxische Atmosphäre (95% N2 und 5%CO2) zu ersetzen, die mit dem Auslassung von Glukose verbunden ist.

Die beschriebene Methode eignet sich zur einfachen, schnellen, reproduzierbaren und kostengünstigen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten im Kontext eines ischämischen Schlaganfalls.

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Protocol

Alle verwendeten Tiere wurden im CICS-UBI Health Science Research Centre gemäß den nationalen ethischen Anforderungen für die Tierforschung und mit der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke (Richtlinie 2010/63/EU) gezüchtet.

1. Ratte Embryo Cortex primäre Zellkultur

  1. Kulturmedium Vorbereitung
    1. Bereiten Sie das Neurobasal Medium (NBM) vor, indem Sie die folgenden Ergänzungen hinzufügen: 2% B27, 0,5 mM Glutamin, 25 M Glutamat und 120 g/ml Gentamicin. Homogenisieren, den pH-Wert auf 7,2 einstellen und das Medium mit einem Vakuumfiltrationsschritt sterilisieren, indem man einen 0,22-mm-Filter verwendet. Für die neuron-glia Zellkultur, ergänzen Sie das NBM-Zellkulturmedium mit 10% des heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HI-FBS).
    2. Bereiten Sie das Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Medium mit folgenden Ergänzungen vor: Natriumhydrogencarbonat 2,2 g/L, Insulin aus Rinderbauchspeicheldrüse 5 mg/L, D-Glucose wasserfrei 3,4 g/L, Penicillin (12 U/ml) /Streptomycin (12 g/ml) und 10% HI-FBS. Homogenisieren, den pH-Wert auf 7,2 einstellen und das Medium mit einem Filtrationsschritt sterilisieren.
  2. Herstellung von Materialien und Ausrüstungen
    1. Punktieren Sie den Klemmenteil einer 1 ml Kunststoff-Mikropipettespitze von Seite zu Seite, wobei sie eine Nadel mit einem bestimmten Durchmesser (0,5 mm für S; 0,6 mm für M; 0,8 mm für L) verwendet und die Öffnung der Spitze mit einer Flamme versiegeln.
    2. Sterilisieren Sie alle Glaswaren. Während der gesamten Sezierung die verwendeten Werkzeuge (z.B. Schere, Pinzette, Skalpell) in 70% Ethanol getaucht. Sprühen Sie die Materialien mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in die laminare Strömungskammer gelangen.
    3. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 37 °C ein und legen Sie das Zellkulturmedium in das Wasserbad, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen.
      HINWEIS: Für immunzytochemische Assays sollte die Poly-D-Lysin-Beschichtung in Multiwell-Platten mit Abdeckungen durchgeführt werden.
  3. Ratte embryonale Kortexkultur
    1. Entfernen Sie die Rattenembryonen von einer weiblichen Wistar-Ratte mit 15-16 Tagen Schwangerschaft (das Ende der Paarung, die 24 h dauern sollte, gilt als der1. Tag der embryonalen Entwicklung). Zu diesem Zweck das Weibchen mit Ketamin (87,5 mg/kg) und Xylazin (12 mg/kg) beastheisieren und die Embryonen entfernen. Dann einschläfern Sie die weibliche Ratte durch Zervixdislokation, nach Standardprotokoll.
    2. Die Embryonen in ein 50 ml steriles Rohr geben, Phosphatpuffer-Saline (PBS) hinzufügen, bis es die Embryonen bedeckt und schnell in den Kulturraum bringen.
    3. Noch im Eisack, legen Sie die Embryonen in eine Petrischale mit 25 ml kaltem PBS. Mit Hilfe von Schere und Pinzette, brechen Sie den Eigelbsack, entfernen Sie den Embryo und übertragen Sie ihn auf eine andere Petrischale, die auch kalte PBS enthält. Die PBS in der Petrischale sollte ausreichen, um den gesamten Embryo abzudecken.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Öffnen des Eigelbsacks, um eine Beschädigung des Embryos zu vermeiden. In 1.3.3 und 1.3.4 verwendeten wir Petrischalen mit 90 mm Durchmesser, die auf Eispackungen mit saugfähigem Papier platziert wurden, um die PBS bei niedriger Temperatur zu halten.
    4. Zur Zerlegung des Embryos auf eine andere Petrischale mit 30 ml kaltem PBS übertragen. Legen Sie den Embryo unter ein Sezierendes Mikroskop und immobilisieren Sie ihn mit einer Pinzette. Machen Sie den ersten Schnitt parallel zum Kortex, von der Augenhöhle bis zum Ende der Schnauze gehen und achten Sie darauf, das Tier nicht zu enthaupten.
    5. Entfernen Sie vorsichtig die Kopfhaut und die Meninges mit einer Pinzette, um das kortikale Hirngewebe nicht zu beschädigen. Machen Sie den nächsten Schnitt, um den Kortex zu trennen. Übertragen Sie das kortikale Gewebe mit einer Pasteurpipette in ein 15 ml-Rohr mit 5 ml PBS.
    6. Führen Sie die mechanische Verdauung des kortikalen Hirngewebes mit den 1 ml Kunststoffspitzen aus, die in 1.2.1 hergestellt wurden. 10 Mal mit einer regulären Pipette trituieren und den Prozess mit Pipetten mit zunehmend kleineren Löchern (L, M und S) wiederholen, bis die Brocken auseinandergefallen sind.
    7. Zentrifugieren Sie nach der mechanischen Verdauung die Suspension bei 400 x g für 3 min. Den Überstand entsorgen und das Sediment mit dem entsprechenden Zellkulturmedium, das zuvor bei 37 °C erwärmt wurde, wieder aufsetzen.
    8. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die in der Zellsuspension (Zelldichte) vorhanden sind, mit einer Neubauer-Kammer, machen Sie die entsprechenden Verdünnungen und platten Sie die Zellen. Die anfängliche Zelldichte wurde auf der Grundlage einer früheren Studie5definiert.
      1. Für eine neuronangereicherte Kultur verwenden Sie 0,21 x 106 Zellen/cm2 als anfängliche Zelldichte und halten die Zellen im NBM-Kulturmedium ohne HI-FBS.
      2. Für die Neuron-Glia-Kulturen verwenden 0,14 x 106 Zellen/cm2 als anfängliche Zelldichte und pflegen die Zellen in NBM-Kulturmedium mit 10% HI-FBS ergänzt.2
      3. Für eine astrozytenangereicherte Kultur verwenden Sie 0,26 x 106 Zellen/cm2 als anfängliche Zelldichte und halten die Zellen in MEM, wie zuvor angegeben, aufrechtzuerhalten.
      4. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator, der auf 37 °C, 95%O2 und 5%CO2eingestellt ist.
        HINWEIS: Für längere Kulturperioden sollte ein Anti-Mitotik-Gehalt wie 27 -M 5-Fluor-2-Deoxyuridin mit 68 M Uridin hinzugefügt werden, um das Zellwachstum zu unterdrücken.

2. Co-Kultursystem

  1. Herstellung von Materialien
    1. Das Paraffin bei 150 °C in einem Heizblock ca. 7 min erhitzen. Halten Sie bis zum Abschluss des Vorgangs bei 150 °C. Dann, mit Hilfe einer 1 mm Durchmesser sterilen Glas Pasteur Pipette, fügen Sie einen kleinen Tropfen über sterilisierte und PDL-beschichtete Abdeckungen. Die Paraffinkugeln sind unregelmäßig, haben aber einen Durchmesser von ca. 2 mm. Die Kugeln ermöglichen es, die beiden Kulturen durch ca. 1,25 mm zu trennen.
    2. Da das Paraffin nicht steril ist, legen Sie den Multiwell mit den Paraffinkugeln 15 min unter uvvioletter Strahlung.
    3. Um die Co-Kultur zu etablieren, übertragen Sie den Coverslip mit den Paraffinkugeln mit einer Pinzette, die zuvor 15 min in 70% Ethanol getaucht war.
  2. Co-Kultur
    1. Wenn die beiden Kulturen einsatzbereit sind (d.h. nach 7 Tagen in der Kultur unter den in Schritt 1.3.8 genannten Bedingungen), übertragen Sie die in den Coverlips mit Paraffinkugeln gesäten Neuronen auf die Brunnen, die die Astrozyten enthalten.
    2. 24 h, bevor die beiden Kulturen in Kontakt gebracht werden, ändern Sie das Kulturmedium von Neuronen und Astrozyten zu NBM, ergänzt oder nicht, mit HI-FBS, je nach Zweck des Experiments.
    3. Nachdem Sie beide Zelltypen in Kontakt gesetzt haben, warten Sie 8-12 h, bevor Sie die verschiedenen Reize und Verfahren starten.
      HINWEIS: Die schematische Darstellung des Co-Kultursystems ist in Abbildung 1dargestellt.

3. Sauerstoff- und Glukoseentzug

  1. Kultur Medium Vorbereitung
    1. Verwenden Sie für die OGD-Experimente Hankes Balanced Salt Solution (HBSS). Bereiten Sie das HBSS Medium mit folgenden Reagenzien vor: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogenisieren und den pH-Wert auf 7,2 einstellen. Sterilisieren Sie das Medium durch Filtration.
      HINWEIS: Ergänzen Sie gegebenenfalls die HBSS-Lösung mit Glucose (HBSSglu+), indem Sie 5,56 mM Glukose hinzufügen. Für Kulturen, die der OGD vorgelegt werden, ergänzen sie das HBSS-Medium nicht mit Glukose (HBSSglu-).
  2. OGD-Verfahren
    1. 7 Tage nach dem Aussaat der Zellen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie zwei Mal mit HBSSglu-. Nach dem Waschen das HBSSglu-Zellkulturmedium hinzufügen und das Multiwell in die Hypoxiekammer legen.
    2. Versiegeln Sie die Hypoxiekammer und fügen Sie eine Gasmischung mit 95% N2/5%CO2 für 4 min mit einem Durchfluss von 20 L/min hinzu, um den in der Kammer vorhandenen Sauerstoff zu entfernen. Danach den Fluss anhalten und die Hypoxiekammer je nach Umfang der beabsichtigten Ischämie bei 37 °C bei 37 °C platzieren.
    3. Ersetzen Sie nach der Zeit der OGD das HBSSglu-Medium durch das entsprechende Kulturmedium für die verbleibenden Verfahren.
      HINWEIS: Das OGD-Experiment zielt darauf ab, die In-vitro-Bedingungen zu simulieren, unter denen die Zellen während eines ischämischen Ereignisses leiden, daher ist es wichtig zu bescheinigen, dass alle zuvor verwendeten Medien entfernt werden.

4. Immunzytochemie-Test

HINWEIS: Führen Sie den Immunzytochemie-Test wie zuvor beschrieben5durch.

  1. Kurz gesagt, um die verschiedenen kortikalen Kulturen zu charakterisieren, inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 4 °C mit Kaninchen Anti-GFAP (1:2000) und Maus Anti-Mikrotubule-assoziiertes Protein 2 (MAP2; 1:500); und dann 1 h bei Raumtemperatur mit den folgenden sekundären Antikörpern: Anti-Kaninchen konjugiert alexa Fluor 546 und Anti-Maus konjugiert Alexa Fluor 488, beide bei 1:1000 Verdünnung.
  2. Beschriften Sie die Zellkerne durch Inkubation mit 2 m Hoechst 33342 für 10 min bei Raumtemperatur.
  3. Mount deckt Die Lips in Fluoreszenz-Montagemedium ab und erfasst Bilder auf einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer 63-fachen Vergrößerung.

5. Statistische Analyse

  1. Express-Daten als Prozentsatz der Gesamtzahl der Zellen oder als Prozentsatz der Kontrolle und als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von mindestens 3 unabhängigen Experimenten, die in Dreifacharbeit durchgeführt wurden.
  2. Führen Sie statistische Analysen mit Software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) mithilfe des nicht gepaarten Schülertests durch. Die Ergebnisse wurden als signifikant angesehen, wenn Werte von p < 0,05.

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Representative Results

Um die Kulturen zu charakterisieren, wurde die Immunzytochemie zur Beurteilung der Anzahl der Zellen, die GFAP oder MAP2, weit verbreitete Marker von Astrozyten und Neuronen (Abbildung 2), in jeder Art von kortikaler Kultur exprimiert. Diese Analyse ergab, dass astrozytenangereicherte Kulturen 97% der Zellen zeigten, die GFAP exdrückten (Abbildung 2A). In Bezug auf die neuronangereicherte Kultur 78% der Zellen exprimiert MAP2, 4% der Zellen ausgedrückt GFAP, und 18% der Zellen waren sowohl GFAP und MAP2-negativ (Abbildung 2B). In Bezug auf die neurongliakortikale Kultur waren 49% der Zellen MAP2-positiv, 31% gfAP-positiv und 20% waren negativ für beide Marker (Abbildung 2C).

Sieben Tage nach der Etablierung der kortikalen Kultur wurden die Neuron-Glia-Kultur und die neuron-angereicherte Kultur dem OGD-Verfahren für 4 h oder 6 h unterzogen. Nach diesem Verfahren wurde die Anzahl der MAP2- und GFAP-positiven Zellen durch Immunzytochemie bewertet. In der neuron-glia-Kultur betrug der Verlust von MAP2-positiven Zellen 30% bzw. 60% nach 4 h bzw. 6 h OGD (Abbildung 3B), während der Verlust von GFAP-positiven Zellen 9% bzw. 17% nach 4 h bzw. 6 h OGD betrug (Abbildung 3C). In Bezug auf die neuronangereicherte Kultur gab es einen Rückgang der Anzahl der MAP2-positiven Zellen um 4 % bzw. 6 % der OGD nach 4 h bzw. 6 h OGD (Abbildung 3A). Darüber hinaus gab es in der neuron-angereicherten Kultur einen leichten Anstieg der Verletzungsverlängerung, die durch 4 h OGD im Vergleich zur neuron-glia-Kultur induziert wurde (Abbildung 3A).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Cokultursystems.
(A) Astrozyten wurden in einem Multiwell mit PDL-beschichteten Abdeckungen und Neuronen in einem Multiwell mit PDL-beschichteten Abdeckungen mit 3 Paraffinkugeln gesät. (B) Wenn die beiden Kulturen einsatzbereit waren, wurden die Neuronen in den Hüllen mit den Kugeln in die Brunnen mit den Astrozyten übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Charakterisierung der neuron-gliakortikalen Kultur, neuronangereicherte kortikale Kultur und astrozytenangereicherte kortikale Kultur.
Prozentsatz der Neuronen (MAP2-positive Zellen), Prozentsatz der Astrozyten (GFAP-positive Zellen) und Prozentsatz der doppelnegativen Zellen (MAP2-negative/GFAP-negative Zellen) am7. Tag in kultur in (A) Astrozyten-angereicherte Kultur (B) neuron-angereicherte Kultur und (C) Neuron-Glia-Kultur und repräsentative Bilder, die die Immunostainierung für MAP2 (grün) und GFAP zeigen. Die Gesamtzahl der Zellen wurde durch Quantifizierung von Hoechst 33342-markierten Kernen mit nicht-pyknotischer Morphologie (blau) bewertet. Aufgrund der geringen Anzahl von Neuronen in der astrozytenangereicherten kortikalen Kultur zeigt das repräsentative Bild keine MAP2-positive Färbung. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten (A) und 6 unabhängigen Experimenten (B, C) in Dreifacher Ausführung dargestellt. Die Bilder wurden mit einem 63-fachen Objektiv aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Bewertung des neuronalen Verlustes nach einer OGD-Periode.
(A, B) Anzahl der Neuronen/Felder (MAP2-positive Zellen) in einer neuron-glia-Kultur und neuron-angereicherten Kultur und (C) Anzahl Astrozyten/Feld (GFAP-positive Zellen) und repräsentatives Bild von MAP2 (grün) und GFAP (rot) Immunfärbung in einer neuron-glia Kultur. Die Gesamtzahl der Zellen wurde durch Quantifizierung von Hoechst 33342-markierten Kernen mit nicht-pyknotischer Morphologie (blau) bewertet. Die neuron-glia und neuron-angereicherten Kulturen wurden Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD) für einen Zeitraum von 4 h und 6 h unterzogen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von mindestens 3 unabhängigen Experimenten in Dreifacharbeit dargestellt. Die Gesamtzahl der Zellen wurde durch Quantifizierung von Hoechst 33342-markierten Kernen bewertet. **p < 0.01, ***p < 0.001 und ****p < 0.0001 im Vergleich zu OGD 0 h (ungepaarter Schüler-t-Test) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die hier beschriebene Methode besteht aus der Astrozyten- und Neuronenisolation aus dem embryonalen kortikalen Gewebe der Ratte, die die Etablierung neuron- oder astrozytierter Kulturen oder neuronglia-Kulturen ermöglicht. Es wurde aus einer früheren Studie unserer Gruppe5adaptiert, in der die kortikale Neuron-Glia und neuron-angereicherte embryonale Kulturen Isoliertheit beschrieben und die beiden Kulturen charakterisiert wurden. Mit diesen Kulturen, Roque et al. fand heraus, dass Astrozyten spielen eine Schlüsselrolle bei der Reaktion auf eine ischämische Schäden und legt nahe, dass die Kommunikation zwischen Astrozyten und Neuronen ist wichtig für den Neuroprotektion5. Im vorliegenden Protokoll sind wir neben der Herstellung von neuron-glia und neuron-angereicherten Kulturen auch in der Lage, astrozytenangereicherte Kulturen zu erhalten, was es uns ermöglicht, die Wirkung einer ischämischen Umgebung auf die isolierten oder zusammen isolierten Neuronen und Astrozyten zu untersuchen.

Die Analyse der Immunzytochemie-Daten zeigte, dass 18% der Zellen in der neuronangereicherten Kultur und 20% in Neuron-Glia-Kulturen sowohl für MAP2 als auch für GFAP negativ waren. Diese Zellen präsentierten Kerne mit nicht-pyknotischer Morphologie. Da die Kulturen aus embryonalem Gewebe hergestellt wurden, kann ein Teil der Zellen den neuronalen Marker noch nicht ausdrücken, was einer weiteren Reifung bedarf. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die darauf hindeuten, dass die MAP2-Expression mit der neuronalen Reife zunimmt und dass die Anzahl der MAP2-positiven Zellen mit der Zeit in der Kultur und mit dem Alter der Embryonen zum Zeitpunkt der Zerlegung29,30zugenommen hat. Wir haben bereits gezeigt, dass in der Neuron-Glia-Kultur nur 0,7% der Zellen positiv für den mikrogliaalen Marker ionisierten Calcium-Bindungsadapter Molekül 15waren. Obwohl das in Neuronen-Glia-Kulturen verwendete Kulturmedium die für das Wachstum der Gliazellen notwendige Ernährungsunterstützung hat, wird die Menge an Mikroglia im Kortex von Embryonen mit 15-16 Tagen reduziert und da die Kulturzeit reduziert wird, ist das Wachstum dieses Zelltyps begrenzt. Dasselbe gilt für neuronangereicherte Kulturen, aber in diesem Fall ist das Wachstum von Gliazellen aufgrund des Fehlens von HI-FBS im Kulturmedium noch begrenzter.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht nicht nur die Ermöglichung verschiedener Arten von Kulturen aus der gleichen Zubereitung, sondern hat auch andere Vorteile. Die einzellige Suspension wird einfach durch mechanische Verdauung erhalten, im Gegensatz zu anderen Methoden, die sowohl enzymatische als auch mechanische Verdauung verwenden24,25,31,32; daher ist es schneller und billiger. Ein weiterer Vorteil ist, dass dieses Protokoll auch verwendet werden kann, um Zellen aus anderen Gehirnregionen vorzubereiten, wie dem Hippocampus oder dem Mittelhirn, was die Untersuchung von Pathologien ermöglicht, die verschiedene Bereiche des Gehirns betreffen. Darüber hinaus ermöglicht das beschriebene alternative Verfahren, das die Etablierung von Kokulturen ermöglicht, die Analyse biochemischer und morphologischer Veränderungen, die bei bestimmten Zelltypen in der Kokultur auftreten, mit Methoden wie der Immunzytochemie. Ein gemeinsames Modell für die Etablierung von Kokulturen sind Transwell-Systeme24,25,33,34. Im Gegensatz zu dem, was bei einem Kokultursystem mit kleinen Abstandshaltern, wie den Paraffinkugeln, auftritt, erlauben Transwell-Cokulturmodelle keine Immunzytochemie auf beiden Inzellentypen, die in der Kokultur vorhanden sind. Darüber hinaus sind die Kokulturen, die Raumhalter wie die Paraffinkugeln verwenden, einfach und kostengünstig.

Die Unterwerfung neuronangereicherter oder neuron-glia-Kulturen auf OGD ist ein gemeinsames In-vitro-Modell für Ischämie, dennoch wurden andere In-vitro-Methoden verwendet, nämlich chemische und enzymatische Methoden oder die Induktion von Exzitotoxizität durch Glutamat3,35. Im Vergleich zu anderen Methoden ermöglicht OGD die Simulation der beiden Phasen, die während des ischämischen Schlaganfalls auftreten, nämlich der Entzug von Sauerstoff und Glukose und die Reperfusion, was ein Vorteil ist, weil es imitiert, was in vivovorkommt. Darüber hinaus, obwohl chemische und enzymatische Methoden aufgrund seiner schnellen Reaktion und einfache Anwendung nützlich sein können, gibt es bedenken, die Relevanz für den in vivo pathologischen Zustand, weil chemische Hypoxie führt zu mehr freie radikale Erzeugung als Anoxie, übertrifft, was in vivo35beobachtet wird. In Bezug auf das OGD-Protokoll haben wir beobachtet, dass es zu neuronalen Verlusten führt und dass die Verlängerung der Läsion durch Änderung der Dauer der OGD-Periode angepasst werden kann, um die experimentellen Anforderungen zu erreichen. Die Unterschiede, die beim neuronalen Verlust nach der OGD-Periode in neuron-angereicherten Kulturen und neuron-glia-Kulturen beobachtet wurden, könnten auf die schützende Rolle von Astrozyten zurückzuführen sein, wodurch der neuronale Tod abgeschwächt wird.

Wie erwartet, war die OGD-Schädigung von Astrozyten in Neuronen-Glia-Kulturen sowohl bei 4 h als auch bei 6 h niedriger als bei Neuronen. Der höhere Widerstand von Astrozyten gegen OGD wird auf mehrere Aspekte zurückgeführt. Sie sind in der Lage, ATP-Spiegel länger als Neuronen während der Ischämie zu halten, und schwere ionische Dysregulation geht langsamer36: erstens, weil Neuronen haben eine höhere Dichte von ionischen Kanälen und einen daraus resultierenden größeren Energiebedarf, um ionische Gradienten zu halten; und zweitens, weil die meisten Glykogenspeicher im Gehirn in Astrozytengefunden 36gefunden werden. Zusätzlich, Astrozyten drücken niedrigere Niveaus von ionotropen Glutamat-Rezeptoren als Neuronen und haben eine bessere ionische Pufferung und antioxidative Kapazität36. Diese Attribute liegen vermutlich dem bekannten selektiven Verlust von Neuronen über Astrozyten36zugrunde.

Was die Hier vorgeschlagenen Einschränkungen des Protokolls betrifft, so ist die wichtigste, dass es auf einem In-vitro-Modell basiert, dem die Komplexität der Wechselwirkungen fehlt, die in einem In-vivo-System auftreten, was zu Problemen der Übersetzung in eine In-vivo-Situation führen kann. Es stellt jedoch die Vorteile dar, die mit Zellkulturen verbunden sind, nämlich Einfachheit, einfache Manipulation, die Fähigkeit, grundlegende detaillierte Informationen darüber bereitzustellen, wie eine bestimmte Zellpopulation auf eine bestimmte Beleidigung reagiert3. In-vitro-Modelle von Krankheiten sind weniger zeitaufwändig und kostengünstiger zu warten als In-vivo-Modelle. Genauer gesagt, für die Modellierung des ischämischen Schlaganfalls, ein In-vitro-Modell besitzt auch den Vorteil, dass es einfacher ist, den Glukose- und Sauerstoffgehalt im Vergleich zu den in vivo Alternativen34zu kontrollieren. Darüber hinaus schlagen wir auch die Verwendung von Kokulturen vor, die ein höheres Maß an Komplexität verleihen können, so dass die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen in einem Gewebe untersucht werden kann.

Es gibt einige wichtige Schritte, die weitere Aufmerksamkeit bei der Ausführung des Protokolls erfordern. Aufgrund des Ernährungsbedarfs von Astrozyten sollte die Zur Gewinnung von Neuronen-Glia-Kulturen verwendete NBM mit 10% der HI-FBS-haltigen Wachstumsfaktoren, Aminosäuren und Fettsäuren ergänzt werden. Diese Supplementierung ist, was unterscheidet die Neuron-Glia-Kultur von der neuron-angereicherten Kultur. Zur Vorbereitung einer astrozytenangereicherten Kultur sollte ein Medium ohne Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden, das für das neuronale Wachstum erforderlich ist, wie B27. Im aktuellen Protokoll war das Medium der Wahl für die astrozytenangereicherte Kultur MEM. Es ist auch sehr wichtig, dass die Bedürfnisse der verschiedenen Zelltypen sichergestellt werden, wenn sie in Kontakt gebracht werden. Zu diesem Zweck kann ein Kulturmedium verwendet werden, das sowohl mit Astrozyten als auch mit Neuronen kompatibel ist, nämlich das mit B27 und HI-FBS ergänzte NBM. In Bezug auf das OGD-Protokoll sind die wichtigsten kritischen Schritte die Entfernung aller O2 aus der Kammer vor Beginn der OGD-Periode und das richtige Waschen der Zellen mit HBSS ohne Glukose, um alle Glukose im Medium zu beseitigen.

Zusammenfassend stellen wir hier ein In-vitro-Modell vor, um den ischämischen Schlaganfall auf einfache, schnelle, kostengünstige und reproduzierbare Weise zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht die beschriebene Methode auch die Implementierung neuron- und astrozytierter Primärkulturen, aber auch neuron-glia-Kulturen und bietet somit ein großartiges In-vitro-Modell für die Modellierung mehrerer Hirnerkrankungen, mit einer höheren Komplexität als verewigte Zelllinien und reine neuronale oder gliade Kulturen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Acknowledgments

Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia durch die Projekte UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 und das Stipendium SFRH/BD/135936/2018 an JP, von ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' durch das Projekt CENTRO-01-0145-FEDER-000013 und Finanzierung der PPBI-portugiesischen Plattform von BioImaging durch das Projekt POCI-01-0145-FEDER-022122.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 -well culture plates Thermo Fischer Scientific 142475
95% N2/5% CO2 gas cylinder ArLíquido
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
B27 supplement (50x) Gibco 17504-044
Dako Fluorescence Mounting Medium Dako S3023
D-glucose anhydrous Fisher Scientific G/0450/60 3.4 g/L
Epifluorescence microscope Zeiss AxioObserver Z1x 63x objective
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0615 10%
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272 120 µg/mL
Glutamate Sigma-Aldrich G8415 25µM
Glutamine Sigma-Aldrich G3126 0.5 mM
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature
Hypoxia incubation chamber Stemcell Technologies 27310 Chamber used for OGD induction
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 5 mg/L
Ketamine Sigma-Aldrich K-002 87.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium Sigma-Aldrich M0268 warm up to 37 °C before use
Mouse Anti-MAP2 Santa Cruz Biotechnology Sc-74421 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103-049 warm up to 37 °C before use
Paraffin pastilles for histology Sigma-Aldrich 1.07164 Solidification point 56-58°C
Paraformaldehyde Sigma -Aldrich P6148 4% in PBS
Penicilin/Streptomycin Biochrom A 2213 penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL)
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1024
Rabbit Anti-GFAP DAKO Z0334 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Sodium hydrogen carbonate Fisher Scientific S/4240/60 2.2g/L
Xylazine Sigma-Aldrich X1126 12 mg/Kg

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References

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