Summary
Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.
Abstract
İskemik inme beyin dokusunun hipoperfüzyon uğrama ile karakterize klinik bir durumdur, oksijen ve glikoz yoksunluğu yol, ve sonuç nöronal kaybı. Çok sayıda kanıt glial ve nöronal hücreler arasındaki etkileşim bir iskemik olaydan sonra yararlı etkileri uygulamak düşündürmektedir. Bu nedenle, potansiyel koruyucu mekanizmaları keşfetmek için, bir iskemik ortamda nöron-glia etkileşimleri incelenmesine olanak sağlayan modeller geliştirmek önemlidir. Burada, astrositleri ve nöronları sıçan embriyonik korteksinden izole etmek için basit bir yaklaşım saklıyız ve özel kültür ortamını kullanarak, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile nöron veya astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya nöron-glia kültürlerinin kurulmasına olanak sağlıyor.
Astrositler ve nöronlar arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için, kapaklarda kültürlenen nöronların çok kuyu plakalı bir monokat astrositle temas halinde tutuldukları ortak kültür sistemine dayalı bir yaklaşım öneriyoruz. İki kültür küçük parafin küreleri tarafından ayrı tutulur. Bu yaklaşım bağımsız manipülasyon ve birçok çalışmada bir avantaj temsil eden her hücre tipi, özel tedavilerin uygulanması sağlar.
Iskemik inme sırasında meydana gelen leri simüle etmek için, kültürler oksijen ve glikoz yoksunluğu protokolüne tabi tutulur. Bu protokol iskemik inme nöron-glia etkileşimlerinin rolünü incelemek için yararlı bir araç temsil eder.
Introduction
Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre, yaklaşık 5.5 milyon kişi her yıl iskemik inme1ölür. Bu durum belirli bir beyin bölgesine kan akışının kesilmesi ile karakterizedir, doku fonksiyonunu değiştirir ve mitokondriyal disfonksiyon, kalsiyum disregülasyonu, glutamat eksitotoksisite, inflamasyon ve hücre kaybı 2 yol açan doku, oksijen ve besin kaynağı nda geri dönüşümlü veya geri dönüşümsüz kaybı ile sonuçlanan2,3.
Vasküler hücrelerin yanı sıra, nöronal ve glial hücreler iskemik inme patofizyolojisi katılır4. Özellikle, astrositler nöronların bakımı için gerekli olan ve son zamanlarda iskemik lezyon yanıtı kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir5. Glial hücre Bu tür yapısal destek fonksiyonları gerçekleştirir, oksidatif strese karşı savunma, nörotransmitterlerin sentezi, hücre-hücre iletişiminin stabilizasyonu, diğerleri arasında6. Nöronlar ile birlikte, astrositler sinaptik iletim doğrudan bir rol oynamak, adenozin trifosfat, gama-aminobutirik asit ve glutamat gibi moleküllerin salınımını düzenleyen7. Iskemi tarafından indüklenen yaralanma nın bir kısmı glutamat aşırı salınımı ve sinaptik yarık onun birikimi neden olur, N-metil-D-aspartat reseptörlerinin aşırı aktivasyonuyol, aşağı sinyal kaskadlar aktive, sonuçta eksitotoksisite neden8. Astrositler sinaptik yarık glutamat kaldırmak ve glutamin dönüştürmek mümkün olduğundan, onlar eksitotoksisite karşı savunmada çok önemlidir, bu nedenle iskemi üzerinde bir nöroprotektif etki uygulayarak. Bu hücreler aynı zamanda iskemi kaynaklı nöroinflamasyon bir rol oynamaktadır. Iskemik hakaretten sonra aktive astrositler morfolojik değişikliklere (hipertrofi), çoğalır ve glial fibrillary asidik protein (GFAP) ekspresyonunda artış gösterirler. Onlar reaktif olabilir (astrogliosis), tümör nekroz faktör-α, interlökin-1α ve interlökin-1β gibi pro-inflamatuar sitokinler serbest, ve serbest radikaller üreten, nitrik oksit ve süperoksit de dahil olmak üzere, hangi sırayla nöronal ölüm neden olabilir9,10. Buna karşılık, reaktif astrositler de nöroprotektif bir etki oynayabilir, onlar anti-inflamatuar sitokinler serbest beri, büyüme faktörü dönüştürme gibi-β, inme sonra upregulated olduğunu11. Ayrıca, onlar bir glial yara oluşturabilir, hangi aksonal filizlenme inhibe doku rejenerasyonu sınırlayabilir; ancak, Bu glial yara uygun doku yaralanma site izole edebilirsiniz, böylece kontrolsüz doku hasarı basamaklı bir dalga önlenmesi12,13.
Bu nedenle, iskemik yaralanmanın etkilerini sınırlayan veya tersine çeviren tedavi stratejileri bulmak için iskemik yaralanma altında nöron-glia etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanıyan modeller oluşturmak zorunludur. Iskemik yaralanma çalışma için kullanılan diğer modeller ile karşılaştırıldığında, yani in vivo modelleri14,15,16, organotipik kültürler17,18,19 ve akut beyin dilimleri20,21,22, birincil hücre kültürleri daha az karmaşıktır, hangi mümkün iskemik inme patofizyolojisi her hücre tipibireysel katkıları çalışma yapar ve nasıl her hücre tipi olası terapötik hedeflere yanıt verir. Tipik olarak, nöron zenginleştirilmiş kültürler ve astrosit zenginleştirilmiş kültürler arasındaki etkileşimleri incelemek için, nöronlar ve postnatal kökenli glial hücrelerkullanılır 23,24, veya doğum sonrası glial hücreler ve embriyonik nöronlar25,26. Burada nöron kurmak için basit bir yaklaşım önerilmektedir- veya astrosit zenginleştirilmiş kültürler ve nöron-glia kültürleri aynı dokudan. Bu birincil hücreler sıçan embriyonik korteks elde edilir, bir bölge sık inme etkilenen27,28. Ayrıca, doku dissociation sadece mekanik bir prosedür ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, bu protokol, hücrelerin gelişimin aynı aşamasında, hızlı ve ucuz bir şekilde ve yüksek performans ve tekrarlanabilirlik ile izole sağlar.
Astrositler ve nöronlar arasındaki çapraz konuşma, kapaklarda kültürlenen nöronların çok kuyu plakalı bir astrosit tek tabakası ile temas halinde tutuldukları bir ortak kültür sistemi kullanılarak incelenebilir. Küçük parafin küreler iki hücre kültürleri ayrılmasını sağlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşım, temas edilmeden önce her hücre türünün bağımsız manipülasyonuna olanak tanır. Örneğin, astrositlerde belirli bir geni susturmak ve iskemik kaynaklı hasara karşı nöronal kırılganlığı veya korumayı nasıl etkileyebileceğini görmek mümkündür. In vitro iskemik benzeri koşulları indüklemek için kurulmuş bir yöntem oksijen ve glikoz yoksunluğu (OGD)3, hangi normal atmosfer yerine oluşur (95% hava ve 5% CO2) bir anoksik atmosfer ile (95% N2 ve% 5 CO2),glikoz ihmali ile ilişkili.
Açıklanan yöntem, iskemik inme bağlamında nöronlar ve astrositler arasındaki etkileşimleri basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ucuz bir şekilde incelemek için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kullanılan tüm hayvanlar CICS-UBI Sağlık Bilimleri Araştırma Merkezi'nde hayvan araştırmaları için ulusal etik gerekliliklere ve Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlariçin Kullanılan Omurgalı Hayvanları Koruma Avrupa Konvansiyonu'na uygun olarak yetiştirilmiştir (Direktif 2010/63/EU).
1. Sıçan embriyo korteks birincil hücre kültürü
- Kültür orta hazırlık
- Nörobazal Orta (NBM) aşağıdaki takviyeleri ekleyerek hazırlayın: 2% B27, 0.5 mM glutamin, 25 μM glutamat ve 120 μg/mL gentamicin. Homojenize, pH'ı 7,2'ye ayarlayın ve 0,22 μm filtre kullanarak ortamı vakumlu filtrasyon adımıyla sterilize edin. Nöron-glia hücre kültürü için, Isı-Inaktive Fetal Sığır Serumu% 10 ile NBM hücre kültürü orta tamamlamak (HI-FBS).
- Aşağıdaki takviyeleri ile Minimum Esansiyel Orta Kartal (MEM) orta hazırlayın: sodyum hidrojen karbonat 2.2 g /L, sığır pankreas 5 mg / L insülin, D-glukoz anhidrous 3.4 g/L, penisilin (12 U / mL) / streptomisin (12 μg /mL) ve 10% HI-FBS. Homojenize, pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve bir filtrasyon adımı ile ortamı sterilize edin.
- Malzeme ve ekipmanların hazırlanması
- 1 mL plastik mikropipet ucunun terminal kısmını, belirli bir çapa sahip bir iğne (S için 0,5 mm; M için 0,6 mm; L için 0,8 mm) kullanarak delin ve ucun açılmasını alev kullanarak kapatın.
- Tüm cam ları sterilize et. Diseksiyon boyunca kullanılan araçları (örneğin, makas, cımbız, neşter) % 70 etanol batırılmış tutun. Laminar akış odasına girmeden önce malzemeleri %70 etanol ile püskürtün.
- Su banyosu sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve işlem başlamadan önce hücre kültürünü su banyosuna yerleştirin.
NOT: İmmünositokimya tahlillerinde poli-D-lizin kaplama, kapaklı çok kuyulu plakalarda yapılmalıdır.
- Sıçan embriyonik korteks kültürü
- 15-16 günlük gebelik (24 saat sürmesi gereken miyetingin sonunda, embriyonik gelişimin1. günü olarak kabul edilir) dişi bir Wistar sıçanından fare embriyolarını çıkarın. Bu amaçla kadını ketamin (87.5 mg/kg) ve ksilazin (12 mg/kg) ile uyuşturur ve embriyoları çıkarın. Sonra standart protokolü izleyerek servikal çıkış ile kadın sıçan ötenazi.
- Embriyoları 50 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin, embriyoları kaplayana kadar fosfat tampon salini (PBS) ekleyin ve hızla kültür odasına götürün.
- Hala sarısı kese içinde, soğuk PBS 25 mL içeren bir Petri kabına embriyoyerleştirin. Makas ve cımbız yardımıyla, sarısı kese kırmak, embriyo kaldırmak ve başka bir Petri çanak da soğuk PBS içeren transfer. Petri kabındaki PBS tüm embriyoyu karşılamaya yeter.
NOT: Embriyoya zarar vermemek için yumurta kesesini açarken dikkatli olun. 1.3.3 ve 1.3.4'te, PBS'yi düşük sıcaklıkta tutmak için emici kağıtla kaplı buz paketlerinin üzerine yerleştirilen 90 mm çapında Petri tabakları kullandık. - Embriyonun diseksiyonu için, 30 mL soğuk PBS içeren başka bir Petri kabına aktarın. Embriyoyu bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin ve bir cızırtıcı kullanarak hareketsiz hale getirin. Kortekse paralel ilk kesi yapın, ağız sonuna kadar oküler kavite gidiyor ve hayvan ın kafasını kesmek için dikkatli olun.
- Dikkatle kortikal beyin dokusuzarar değil, cımbız kullanarak kafa derisi ve menenjler kaldırın. Korteksi ayırmak için bir sonraki kesiği yapın. Kortikal dokuyu Pasteur pipeti kullanarak 5 mL PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Kortikal beyin dokusunun mekanik sindirimini 1.2.1'de hazırlanan 1 mL plastik uçlar kullanarak gerçekleştirin. Normal bir pipetle 10 kez triturate ve parçalar parçalanana kadar, giderek daha küçük delikler (L, M ve S) ile pipetler kullanarak işlemi tekrarlayın.
- Mekanik sindirimden sonra süspansiyonu 400 x g'de 3 dk santrifüj edin. Supernatant atın ve daha önce 37 °C'de ısıtılmış uygun hücre kültürü ortamı ile tortu resuspend.
- Neubauer haznesini kullanarak hücre süspansiyonunda bulunan toplam hücre sayısını (hücre yoğunluğu) belirleyin, uygun seyreltmeleri yapın ve hücreleri plakalayın. İlk hücre yoğunluğu bir önceki çalışmaya göre tanımlanmıştır5.
- Nöronla zenginleştirilmiş bir kültür için, ilk hücre yoğunluğu olarak 0.21 x 106 hücre/cm2 kullanın ve HI-FBS olmadan NBM kültür ortamındaki hücreleri koruyun.
- Nöron-glia kültürleri için ilk hücre yoğunluğu olarak 0.14 x 106 hücre/cm2 kullanın ve NBM kültür orta hücreleri korumak için 10% HI-FBS ile takviye.
- Astrositle zenginleştirilmiş bir kültür için, ilk hücre yoğunluğu olarak 0,26 x 106 hücre/cm2 kullanın ve MEM'deki hücreleri daha önce belirtildiği gibi koruyun.
- Hücreleri 37 °C, %95 O2 ve %5 CO2olarak ayarlanmış bir kuvöze yerleştirin.
NOT: Daha uzun kültür dönemleri için hücre büyümesini bastırmak için 27 μM 5-floro-2′-deoksitürin 68 m uridin gibi bir anti-mitotik eklenmelidir.
2. Ortak kültür sistemi
- Malzemelerin hazırlanması
- Parafini 150 °C'de Bir ısıtma bloğunda yaklaşık 7 dakika ısıtın. İşlem bitene kadar 150 °C'de tutun. Daha sonra, 1 mm çapında steril cam Pasteur pipet yardımı ile, sterilize ve PDL kaplı kapakları üzerinde küçük bir damla ekleyin. Parafin küreleri düzensizdir, ancak yaklaşık 2 mm çapa sahiptir. Küreler iki kültürün yaklaşık 1,25 mm ile ayrılmasını sağlayacaktır.
- Parafin steril olmadığı için, 15 dakika boyunca ultraviyole radyasyon altında parafin küreler ile multiwell yerleştirin.
- Ortak kültürü kurmak için, daha önce 15 dakika boyunca %70 etanol le batırılmış bir cızırtı kullanarak parafin küreleri ile kapak kaymasını aktarın.
- Ortak kültür
- İki kültür kullanıma hazır olduğunda (örneğin, adım 1.3.8'de belirtilen koşullar altında kültürde 7 gün geçirdikten sonra), parafin küreleri ile kapaklarda tohumlanan nöronları astrositiçeren kuyulara aktarın.
- 24 saat önce iki kültür temas getirilir, nöronların ve astrositlerin kültür ortamı nı nbm takviyesi ne de değil, HI-FBS ile, deneyin amacına bağlı olarak değiştirin.
- Temas her iki hücre tipleri yerleştirdikten sonra, farklı uyaranlar ve prosedürler başlamadan önce 8-12 saat bekleyin.
NOT: Ortak kültür sisteminin şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir.
3. Oksijen ve glikoz yoksunluğu
- Kültür Orta Hazırlık
- OGD deneyleri için Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi'ni (HBSS) kullanın. Aşağıdaki reaktifler ile HBSS ortamını hazırlayın: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homojenize ve 7.2 için pH ayarlayın. Filtrasyon ile ortamı sterilize edin.
NOT: Uygunsa, 5,56 mM glikoz ekleyerek HBSS çözeltisini glikoz (HBSSglu+) ile tamamlayın. OGD'ye gönderilen kültürler için HBSS ortamını glikoz (HBSSglu-) ile tamamlamayın.
- OGD deneyleri için Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi'ni (HBSS) kullanın. Aşağıdaki reaktifler ile HBSS ortamını hazırlayın: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homojenize ve 7.2 için pH ayarlayın. Filtrasyon ile ortamı sterilize edin.
- OGD prosedürü
- Hücreleri tohumlama dan 7 gün sonra, kültür ortamını çıkarın ve HBSSglu ile iki kez yıkayın. Yıkandıktan sonra HBSSglu- hücre kültürü ortamını ekleyin ve çok kuyuyu hipoksi odasına yerleştirin.
- Hipoksi odasını kapatın ve odanın içindeki oksijeni çıkarmak için 4 dk için %95 N2/5%CO2 içeren bir gaz karışımı ekleyin ve 20 L/dk'lık bir akışla. Bundan sonra, akışı durdurun ve hipoksi odasını amaçlanan iskeminin derecesine bağlı olarak 37 °C'de 4 saat veya 6 saat için bir kuvöze yerleştirin.
- OGD süresinden sonra HBSSglu-orta sını kalan işlemler için uygun kültür ortamı ile değiştirin.
NOT: OGD deneyi, hücrelerin iskemik bir olay sırasında maruz kalınan in vitro koşullarını simüle etmeyi amaçlamaktadır, bu nedenle daha önce kullanılan tüm ortamların kaldırıldığını onaylamak önemlidir.
4. İmmünositokimya testleri
NOT: Daha önce açıklandığı gibi immünostokimya tayinigerçekleştirin 5.
- Kısaca, farklı kortikal kültürleri karakterize etmek için, 4 °C'de hücreleri tavşan anti-GFAP (1:2000) ve fare anti-mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2; 1:500) ile bir gecede kuluçkaya yatırın; ve sonra 1 saat oda sıcaklığında aşağıdaki ikincil antikorlar ile: anti-tavşan Alexa Fluor 546 ve anti-fare Alexa Fluor 488, her ikisi de 1:1000 seyreltme konjuge.
- Hücre çekirdeklerini oda sıcaklığında 10 dk için 2 μM Hoechst 33342 ile kuluçkaya yatarak etiketlayın.
- Floresan montaj ortamındaki kapakları monte edin ve 63 x büyütme ile epifloresan mikroskobunda görüntüler elde edin.
5. İstatistiksel analiz
- Verileri, toplam hücre sayısının yüzdesi veya denetim yüzdesi olarak ifade edin ve üç aylık ortamda gerçekleştirilen en az 3 bağımsız denemenin ortalama ± standart hatası (SEM) olarak sunulur.
- Eşleşmemiş Öğrencit testini kullanarak yazılımla (GraphPad Software Inc., t San Diego, CA) istatistiksel analiz yapın. Sonuçlar p < 0.05 değerlerinde anlamlı olarak değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kültürleri karakterize etmek için, immünositokimya GFAP veya MAP2 ifade hücrelerinin sayısını değerlendirmek için, astrosit ve nöronların yaygın olarak kullanılan belirteçleri(Şekil 2),kortikal kültürün her türünde yapıldı. Bu analiz, astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin GFAP ifade eden hücrelerin %97'sini sunduğunu ortaya koymuştur(Şekil 2A). Nöron la zenginleştirilmiş kültüre ilişkin olarak hücrelerin %78'i MAP2, %4'ü GFAP ifade etmiş, hücrelerin %18'i hem GFAP hem de MAP2-negatiftir(Şekil 2B). Nöron-glia kortikal kültürüne göre hücrelerin %49'u MAP2-pozitif, %31'i GFAP pozitif ve %20'si her iki belirteç için negatifti(Şekil 2C).
Kortikal kültürün kurulmasından yedi gün sonra, nöron-glia kültürü ve nöron la zenginleştirilmiş kültür 4 saat veya 6 saat boyunca OGD prosedürüne tabi tutuldu. Bu işlemden sonra MAP2 ve GFAP pozitif hücrelerin sayısı immünositokimya ile değerlendirildi. Nöron-glia kültüründe, MAP2-pozitif hücrelerin kaybı 4 saat ve 6 h OGD'den sonra sırasıyla %30 ve %60 iken,(Şekil 3B),GFAP-pozitif hücrelerin kaybı sırasıyla 4 saat ve 6 saat OGD'den sonra %9 ve %17 idi (Şekil 3C). Nöron la zenginleştirilmiş kültüre ilişkin olarak, OGD'nin 4 ve 6 saat sonra MAP2-pozitif hücrelerinin sayısında sırasıyla %41 ve %64'lük bir azalma saptanmıştır(Şekil 3A). Ayrıca, nöron zenginleştirilmiş kültürde, nöron-glia kültürüne kıyasla 4 saat OGD ile indüklenen yaralanma uzantısında hafif bir artış saptandı (Şekil 3A).
Şekil 1: Ortak kültür sisteminin şematik temsili.
(A)Astrositler PDL kaplı kapaklar içeren çok kuyulu bir şekilde, nöronlar ise 3 parafin küresi içeren PDL kaplı kapaklı çok kuyuda tohumlandı. (B) İki kültür kullanıma hazır olduğunda, kürelerle birlikte kapaklarda bulunan nöronlar astrositleri içeren kuyulara aktarıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nöron-glia kortikal kültür, nöron zenginleştirilmiş kortikal kültür ve astrosit zenginleştirilmiş kortikal kültür karakterizasyonu.
Nöronyüzdesi (MAP2-pozitif hücreler), astrosit yüzdesi (GFAP-pozitif hücreler) ve çift negatif hücrelerin yüzdesi (MAP2-negatif/GFAP-negatif hücreler)7 gün kültür (A) astrosit zenginleştirilmiş kültür (B) nöron zenginleştirilmiş kültür ve (C) nöron-glia kültür ve map2 (yeşil) ve GFAP (kırmızı) için immünboyama gösteren temsili görüntüler. Toplam hücre sayısı, Hoechst 33342 etiketli çekirdeklerin pyknotnik olmayan morfolojisi (mavi) ile ölçülmesi yle değerlendirildi. Astrositle zenginleştirilmiş kortikal kültürdeki nöronların sayısının düşük olması nedeniyle, temsili görüntü MAP2-pozitif boyama göstermez. Veriler, üç boyutlu olarak gerçekleştirilen 3 bağımsız deney(A)ve 6 bağımsız deney(B, C)ortalama ± SEM olarak sunulur. Görüntüler 63x hedefi ile elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OGD döneminden sonra nöronal kaybın değerlendirilmesi.
(A, B) Nöron/alan (MAP2-pozitif hücreler) bir nöron-glia kültürü ve nöron-zenginleştirilmiş kültür ve (C)sayı astrositler / alan (GFAP-pozitif hücreler) ve MAP2 temsili görüntü (yeşil) ve GFAP (kırmızı) bir nöron-glia kültüründe immünboyama. Toplam hücre sayısı, Hoechst 33342 etiketli çekirdeklerin pyknotnik olmayan morfolojisi (mavi) ile ölçülmesi yle değerlendirildi. Nöron-glia ve nöron zenginleştirilmiş kültürler oksijen ve glikoz yoksunluğu (OGD) için 4 saat ve 6 saat süreyle sunuldu. Veriler, üç ay içinde gerçekleştirilen en az 3 bağımsız denemenin ortalama ± SEM olarak sunulur. Toplam hücre sayısı Hoechst 33342 etiketli çekirdeklerin ölçülmesi yle değerlendirildi. **p < 0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001 OGD 0 h (eşleşmemiş Öğrencit testi) ile karşılaştırıldığında bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntem sıçan embriyonik kortikal doku dan astrosit ve nöron izolasyon oluşur, nöron kurulması sağlayan- veya astrosit zenginleştirilmiş kültürler veya nöron-glia kültürleri. Bu bizim grup 5 bir önceki çalışmadan uyarlanmıştır5, kortikal nöron-glia ve nöron zenginleştirilmiş embriyonik kültürlerizolasyon tarif edildi ve iki kültür karakterize. Bu kültürleri kullanarak, Roque ve ark astrositbir iskemik hasara yanıt önemli bir rol oynadığını bulundu ve astrositler ve nöronlar arasındaki iletişim nörokoruma için gerekli olduğunu düşündürmektedir5. Mevcut protokolde, nöron-glia ve nöron zenginleştirilmiş kültürlerin hazırlanmasına ek olarak, biz de bize izole nöronlar ve astrositler üzerinde bir iskemik ortamın etkisini çalışma sağlar astrosit-zenginleştirilmiş kültürler elde edebiliyoruz.
İmmünositokimya verilerinin analizi, nöron la zenginleştirilmiş kültürdeki hücrelerin %18'inin ve nöron-glia kültürlerinde %20'sinin map2 ve GFAP için negatif olduğunu göstermiştir. Bu hücreler çekirdekleri non-pyknotic morfolojisi ile sundular. Kültürlerin embriyonik dokudan hazırlandığı göz önüne alındığında, hücrelerin bir kısmı henüz nöronal belirteci ifade etmeyebilir, daha fazla olgunlaşma ihtiyacı. Bu map2 ekspresyonunun nöronal olgunlukla arttığını ve MAP2-pozitif hücrelerin sayısının kültürde zamanla ve diseksiyon sırasında embriyoların yaşı yla arttığını gösteren önceki çalışmalarla uyumludur29,30. Daha önce nöron-glia kültüründe hücrelerin sadece% 0.7 mikroglial marker iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekül15için pozitif olduğunu göstermiştir. Nöron-glia kültürlerinde kullanılan kültür ortamı glial hücre büyümesi için gerekli beslenme desteğine sahip olmasına rağmen, 15-16 gün ile embriyoların korteksindeki mikroglia miktarı azalır ve kültür süresi azaldıkça bu hücre tipinin büyümesi sınırlıdır. Aynı nöron zenginleştirilmiş kültürler için de geçerlidir, ancak bu durumda glial hücrelerin büyümesi kültür ortamıhi-FBS yokluğu nedeniyle daha da sınırlıdır.
Aynı hazırlıktan farklı kültür türlerinin elde edilmesine izin vermenin yanı sıra, burada açıklanan protokolün başka avantajları da vardır. Tek hücreli süspansiyon sadece mekanik sindirim ile elde edilir, enzimatik ve mekanik sindirim hem de kullanan diğer yöntemlerin aksine24,25,31,32; bu nedenle, daha hızlı ve daha ucuzdur. Başka bir avantajı da bu protokol diğer beyin bölgelerinden hücreleri hazırlamak için kullanılabilir, hipokampus veya orta beyin gibi, beynin farklı alanlarını etkileyen patolojilerin çalışma izin. Ayrıca, ortak kültürlerin kurulmasına olanak sağlayan alternatif prosedür, immünositokimya gibi yöntemler kullanarak ortak kültürde bulunan belirli hücre tiplerinde meydana gelen biyokimyasal ve morfolojik değişikliklerin analizini sağlar. Ortak kültürlerin kurulması için ortak bir model transwell sistemleri24,25,33,34. Parafin küreleri gibi küçük spacers kullanan bir ortak kültür sistemi ile meydana gelenin aksine, transwell co-kültür modelleri ortak kültür mevcut her iki hücre tipleri üzerinde immünositokimya gerçekleştirmek için izin vermez. Buna ek olarak, parafin küreler gibi spacers kullanarak co-kültürler basit ve düşük maliyetli.
OGD nöron zenginleştirilmiş veya nöron-glia kültürleri tabi iskemi için ortak bir in vitro modelidir, yine de diğer in vitro yöntemleri kullanılmıştır, yani kimyasal ve enzimatik yöntemler veya glutamat tarafından eksitotoksisite indüksiyon3,35. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, OGD iskemik inme sırasında meydana gelen iki fazSimülasyon sağlar, yani oksijen ve glikoz yoksunluğu ve reperfüzyon, bu bir avantajdır çünkü ne in vivooluşur taklit eder . Ayrıca, kimyasal ve enzimatik yöntemler hızlı yanıt ve uygulama kolaylığı nedeniyle yararlı olabilir rağmen, in vivo patolojik devlet alaka ile ilgili bir endişe var, kimyasal hipoksi anoksi daha serbest radikal üretimine yol açar çünkü, vivo gözlenenne aşan35. OGD protokolü ile ilgili olarak, bunun nöronal kayba yol açtığını ve deneysel gereksinimlere ulaşmak için OGD süresinin değiştirilerek lezyonun uzamasını düzeltebileceğimizi gözlemledik. Nöron zenginleştirilmiş kültürlerde ve nöron-glia kültürlerinde OGD döneminden sonra nöronal kayıpta gözlenen farklılıklar astrositlerin oynadığı koruyucu rolden kaynaklanabilir ve bu nedenle nöronal ölümü zayıflatmaktadır.
Beklendiği gibi, nöron-glia kültürlerde astrositler OGD hasarı nöronlar ile karşılaştırıldığında hem 4 saat ve 6 saat daha düşüktü. Astrositlerin OGD'ye karşı yüksek direnci birçok yönden atfedilir. Onlar iskemi sırasında nöronlar daha uzun ATP düzeylerini korumak edebiliyoruz, ve şiddetli iyonik disregülasyon daha yavaş ilerler36: öncelikle nöronlar iyonik kanalların daha yüksek yoğunlukve iyonik gradyanları korumak için bir sonucu daha fazla enerji talebi var çünkü; ve ikinci olarak beyindeki glikojen depolarının çoğuastrosit36bulunur çünkü . Ayrıca, astrositler nöronlar daha iyonotropik glutamat reseptörlerinin düşük seviyelerde ifade ve daha iyi iyonik tamponlama ve antioksidan kapasiteye sahip36. Bu özellikler muhtemelen astrositler üzerinde nöronların iyi bilinen seçici kaybı altında yatan36.
Burada önerilen protokolün sınırlamaları ile ilgili olarak, en önemlisi, in vivo sisteminde meydana gelen etkileşimlerin karmaşıklığından yoksun bir in vitro modele dayanmasıdır, bu da in vivo duruma geçirilebilirlik sorunlarına neden olabilir. Ancak, hücre kültürleri ile ilgili avantajları sunar, yani basitlik, manipülasyon kolaylığı, belirli bir hücre popülasyonunun belirli bir hakarete nasıl tepki verdiği hakkında temel ayrıntılı bilgi sağlama yeteneği3. In vitro hastalık modelleri in vivo modellere göre daha az zaman alıcı ve bakımı daha az pahalıdır. Daha spesifik olarak, iskemik inme modelleme için, bir in vitro modeli de in vivo alternatifleri ile karşılaştırıldığında glikoz ve oksijen düzeylerini kontrol etmek için daha kolay olmanın avantajına sahip34. Ayrıca, bir dokuda bulunan farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimi incelemek için izin, karmaşıklık daha yüksek bir düzeyde verebilir co-kültürlerin kullanımını öneriyoruz.
Protokolü yürütürken daha fazla dikkat gerektiren bazı kritik adımlar vardır. Astrositlerin besin gereksinimi nedeniyle, nöron-glia kültürleri elde etmek için kullanılan NBM HI-FBS içeren büyüme faktörlerinin% 10 ile takviye edilmelidir, amino asitler ve yağ asitleri. Bu takviyesi nöron-glia kültürünü nöron zenginleştirilmiş kültürden ayıran şeydir. Bir astrosit zenginleştirilmiş kültür hazırlamak için nöronal büyüme için gerekli takviyeleri yoksun bir orta, B27 gibi, kullanılmalıdır. Mevcut protokolde, astrositzenginleştirilmiş kültür için seçim aracı MEM oldu. Farklı hücre tiplerinin ihtiyaçlarının temas edildiğinde sağlanması da çok önemlidir. Bu amaçla hem astrositler hem de nöronlarla uyumlu bir kültür ortamı, yani B27 ve HI-FBS ile desteklenen NBM kullanılabilir. OGD protokolü ile ilgili olarak, ana kritik adımlar, OGD dönemine başlamadan önce tüm O2'nin hazneden çıkarılması ve hbss'li hücrelerin glikozsuz düzgün yıkanması dır.
Sonuç olarak, burada basit, hızlı, ucuz ve tekrarlanabilir bir şekilde kurulan iskemik inme incelemek için bir in vitro modeli salıyoruz. Ayrıca, açıklanan yöntem aynı zamanda nöron uygulamak için izin verir- ve astrosit zenginleştirilmiş birincil kültürlerin değil, aynı zamanda nöron-glia kültürleri, böylece çeşitli beyin hastalıkları modelleme için büyük bir in vitro model sağlayan, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve saf nöronal veya glial kültürlerdaha karmaşıklık daha yüksek bir düzeyde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar Fundação para a Ciência e a Tecnologia tarafından Projeler UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 ve burs SFRH/BD/135936/2018 jp aracılığıyla fon desteği kabul, tarafından ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" proje centro-01-0145-FEDER-000013 ve Proje POCI-01-0145-FEDER-022122 ile BioImaging PPBI-Portekizplatformu finansman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
