ניתוח פנוטיפ שלד של מודל עכבר מחיקה מותנית Stat3
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה קנונית להבנת הגנים הקריטיים השולטים בפעילות אוסטאוקלסט ב- vivo. שיטה זו משתמשת במודל עכבר מהונדס וכמה טכניקות קנוניות כדי לנתח פנוטיפ השלד.
Abstract
מודלים מהונדסים של עכברים חזקים להבנת הגנים הקריטיים השולטים בהבחנה ובפעילות של אוסטאוקלסט, וללימוד מנגנונים וטיפולים תרופתיים באוסטיאופורוזיס. קטפסין K (Ctsk)-Cre עכברים כבר בשימוש נרחב עבור מחקרים פונקציונליים של osteoclasts. מתמר האות והפעיל של שעתוק 3 (STAT3) רלוונטי הומאוסטזיס העצם, אבל תפקידו osteoclasts ב vivo נשאר מוגדר היטב. כדי לספק את הראיות in vivo כי STAT3 משתתף בידול osteoclast ומטבוליזם העצם, יצרנו מודל עכבר מחיקה Stat3 ספציפי לאוסטאוקלסט (Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre) וניתח את פנוטיפ השלד שלו. סריקת מיקרו-CT ושחזור תלת-ממדי מרמזים על מסת עצם מוגברת בעכברי הנוקאאוט המותנים. כתמי H&E, כתמים כפולים בצבעי קלצין ואליזרין אדומים, וכתמי חומצה עמידים בפני טרטרט (TRAP) בוצעו לגילוי חילוף החומרים של העצם. בקיצור, פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות וטכניקות קנוניות כדי לנתח פנוטיפ השלד וללמוד את הגנים הקריטיים השולטים בפעילות אוסטאוקלסט ב vivo.
Introduction
עצם השלד היא האיבר נושא העומס העיקרי של גוף האדם והיא נמצאת תחת לחץ הן מהסביבה הפנימית והן מהסביבה החיצונית במהלך הליכה ופעילות גופנית1. לאורך כל חייו, העצמות עוברות ללא הרף התחדשות עצמית, המאוזנת על ידי אוסטובלסטים ואוסטיאוקלסטים. התהליך של osteoclasts ניקוי עצמות ישנות osteoblasts להרכיב עצם חדשה שומרת על הומאוסטזיס ותפקוד מכני של מערכת השלד2. הפרעה באיזון עלולה לגרום למחלות מטבוליות בעצמות, כגון אוסטאופורוזיס. אוסטאופורוזיס, אשר נגרמת על ידי פעילות אוסטאוקלסטית עודף, נפוץ ברחבי העולם וגורם הפסדים כלכליים משמעותיים לחברה2,3,4. על פי המספר המוגבל של תרופות זמינות לטיפול אוסטאופורוזיס ואת הסיכון שלהם תופעות לוואי4, חשוב לחשוף את הפרטים של היווצרות אוסטאוקלסט ופעילות.
Osteoclasts נגזר שושלת המונוציטים / מקרופאג hematopoietic יש גרעינים מרובים (אולי יש 2 עד 50 גרעינים) והם גדולים (בדרך כלל גדול מ 100 מיקרומטר קוטר)2. למרות חקר המנגנונים ואת ההקרנה של תרופות להפרעות אוסטאוקלסטיות שופרו באופן נרחב באמצעות תרבות אוסטאוקלסט במבחנה, התגובות האורגניות המורכבות הופכות ראיות vivo הכרחי לטיפול ממוקד. בשל קווי דמיון גנטיים ופתופיזיולוגיים בין עכברים לבני אדם, מודלים של עכברים מהונדסיםגנטיתמשמשים בדרך כלל לחקר המנגנונים והטיפולים התרופותיים של מחלות אנושיות ב vivo 6 . מערכת Cre-loxP היא טכנולוגיה בשימוש נרחב לעריכת גנים של עכבר ואיפשרה לחוקרים לחקור תפקודי גנים באופן ספציפי לרקמות /תאים 5. קטפסין K (CSTK) הוא פרוטאז ציסטאין המופרש על ידי אוסטאוקלסטים שיכולים להשפיל קולגןעצם 8. מקובל כי CTSK מתבטא באופן סלקטיבי אוסטאוקלסטים בוגרים; לכן, עכברי Ctsk-Cre נחשבים לכלי שימושי למחקרים פונקציונליים של אוסטאוקלסטים ושימשו6.
מתמר האות והפעיל של משפחת שעתוק (STAT) הוא קלאסי ומשמעותי מאוד בהתקדמות חסינות וסרטן ופיתוח7,8. בין שבעה STATs, STAT3 הוא דיווח להיות הרלוונטי ביותר הומאוסטזיסעצם 9,10. מספר מחקרים vivo דיווחו כי השבתה ספציפית של STAT3 ב osteoblasts מקטין היווצרותהעצם 9,10. עם זאת, ראיות מוצקות לגבי ההשתתפות של STAT3 היווצרות osteoclast ומטבוליזם העצם vivo עדיין מוגבל. לאחרונה, סיפקנו ראיות vivo עם מודל עכבר מחיקה Stat3 ספציפי אוסטאוקלסט (Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, להלן נקרא Stat3Ctsk) כי STAT3 משתתף בידול osteoclast ומטבוליזםהעצם 11. במחקר הנוכחי, אנו מתארים את השיטות והפרוטוקולים שבהם השתמשנו כדי לנתח את השינויים במסת העצם, היסטומורפולוגיה של העצמות, אנבוליזם בעצמות וקטבוליזם של עכברי Stat3Ctsk כדי לחקור את ההשפעה של מחיקת STAT3 ספציפית לאוסטאוקלסט על הומאוסטזיס של העצם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים עכבר מהונדסים גנטית משמשים בדרך כלל לחקר המנגנון וטיפול תרופתי של מחלה אנושית13. עכברי Ctsk-Cre היו בשימוש נרחב למחקרים פונקציונליים של אוסטאוקלסטים6. המחקר הנוכחי תיאר את הפרוטוקולים של השיטות לנתח פנוטיפ שלד וללמוד את הגנים הקריטיים השולטים בפעילות או?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפרופ’ וייגו זו וס. קאטו על ריאגנטים ועכברים ולחברי מעבדת זו על דיונים מועילים. אנו מודים גם למעבדה עבור מרכז סטומטולוגיה ומחקר דיגיטלי עבור אנומליות Craniofacial של בית החולים העממי התשיעי של שנגחאי לקבלת סיוע. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC) [81570950,81870740,81800949], פסגת שנגחאי & רמת דיסציפלינות, קרן SHIPM-mu ממכון שנגחאי לרפואה מדויקת, בית החולים העממי התשיעי של שנגחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי ג’יאו טונג [JC201809], פרויקט התמריצים של צוות חדשנות ברמה גבוהה עבור בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי ג’יאו טונג קרן המחקר הבין-תחומית של בית החולים העממי התשיעי בשנגחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי JiaoTong [JYJC201902]. ואל.ג’יי הוא חוקר של כישרונות רפואיים מצטיינים לנוער, שנגחאי “כוכבים עולים של כישרון רפואי” תוכנית פיתוח נוער ופרויקט “חן שינג” מאוניברסיטת שנגחאי Jiaotong.
Materials
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
- Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), 243-246 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
- Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
- Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
- Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
- Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
- Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
- Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
- Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
- Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
- Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
- Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
- Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
- Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
- Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
- Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
- Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).
