Скелетный фенотип анализ условной модели удаления Stat3 мыши
Summary
Этот протокол описывает канонический метод для понимания критических генов, контролирующих активность остеокласта in vivo. Этот метод использует трансгенную модель мыши и некоторые канонические методы для анализа скелетного фенотипа.
Abstract
Трансгенные модели мыши являются мощными для понимания критических генов, контролирующих дифференциацию и активность остеокласта, а также для изучения механизмов и фармацевтических методов лечения остеопороза. Катепсин K (Ctsk)-Cre мышей были широко использованы для функциональных исследований остеокластов. Препонент сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) актуален в гомеостазе костей, но его роль в остеокластах in vivo остается плохо определенной. Чтобы обеспечить in vivo доказательства того, что STAT3 участвует в дифференциации остеокласта и метаболизма костей, мы создали остеокласт конкретных Stat3 удаления мыши модели (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) и проанализировал его скелетный фенотип. Микро-КТ сканирование и 3D реконструкция подразумевает увеличение костной массы у условного нокаут мышей. Для обнаружения метаболизма костей были выполнены окрашивание, кальциин и ализарин красного двойного окрашивания, а также тартратостойкий кислотный фосфатаза (TRAP). Короче говоря, этот протокол описывает некоторые канонические методы и методы для анализа скелетного фенотипа и изучения критических генов, контролирующих активность остеокласта in vivo.
Introduction
Скелетная кость является основным несущим органом человеческого тела и находится под давлением как внутренней, так и внешней среды во время ходьбы и физическихупражнений 1. На протяжении всей своей жизни, кости постоянно проходят через самообувека, которая уравновешивается остеобластов и остеокластов. Процесс очистки остеокластов старых костей и остеобластов, образующих новую кость, поддерживает гомеостаз и механическую функцию скелетнойсистемы 2. Нарушение баланса может вызвать заболевания костного обмена веществ, такие как остеопороз. Остеопороз, вызванный избыточной остеокластической активностью, широко распространен во всем мире и наносит существенныеэкономические потери обществу 2,3,4. В соответствии с ограниченным числом препаратов, доступных для леченияостеопороза и их риск побочных эффектов 4, важно раскрыть детали формирования остеокласта и деятельности.
Остеокласты, полученные из моноцитов / макрофаг гематопоэтической линии имеют несколько ядер (может иметь от 2 до 50 ядер) и большие (обычно больше, чем 100 мкм в диаметре)2. Хотя изучение механизмов и скрининг препаратов на остеокластические расстройства были широко улучшены с помощью культуры остеокласта in vitro, сложные органические реакции делают in vivo необходимым доказательством для целенаправленной терапии. Из-за генетического и патофизиологического сходства между мышами и людьми, генетически модифицированные модели мыши обычно используются для изучения механизмов и фармацевтических методов лечения заболеваний человека in vivo6. Система Cre-loxP является широко используемой технологией для редактирования генов мыши и позволила исследователям исследовать генные функции в тканевой/клеточной манере5. Катепсин K (CSTK) является протеазы цистеина выделяется остеокластов, которые могут ухудшить костного коллагена8. Хорошо известно, что CTSK избирательно выражается в зрелых остеокластов; таким образом, Ctsk-Cre мышей считаются полезным инструментом для функциональных исследований остеокластов и был использован6.
Сигнал превудактор и активатор транскрипции (STAT) семьи является классическим и весьма значительным в иммунитете и прогрессиирака и развития 7,8. Среди семи STATs, STAT3, как сообщается, наиболее актуальным для кости гомеостаза9,10. Несколько исследований in vivo сообщили, что специфическая инактивация STAT3 при остеобластах уменьшаетформирование костей 9,10. Тем не менее, веские данные об участии STAT3 в формировании остеокласта и метаболизме костей в виво по-прежнему ограничены. Недавно мы предоставили доказательства in vivo с остеокластом конкретных Stat3 удаления мыши модели (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, далее называется Stat3Ctsk), что STAT3 участвует в дифференциации остеокласта и метаболизма костей11. В настоящем исследовании мы описываем методы и протоколы, которые мы использовали для анализа изменений в костной массе, костной гистоморфологии, костной анаболии и катаболизма мышей Stat3Ctsk для изучения влияния остеокласт-специфического удаления STAT3 на гомеостаз костей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генетически модифицированные модели мыши обычно используются для изучения механизма и фармацевтического лечения болезни человека13. Мышей Ctsk-Cre широко используются для функциональных исследований остеокластов6. В настоящем исследовании описаны протоко…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим профессора Вайгуо Цзоу и С. Като за реагенты и мышей, а также сотрудников лаборатории Цзоу за полезные дискуссии. Мы также благодарим Лабораторию оцифровке стоматологии и научно-исследовательский центр краниофациальных аномалий Шанхайской девятой народной больницы за помощь. Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (81570950,81870740,81800949), Шанхайская встреча на высшем уровне – Плато Дисциплины, ФОНД SHIPM-mu от Шанхайского института точной медицины, Шанхайская девятая населения больница, Шанхайская школа медицины Университета Цзяо Тонга (JC201809), проект стимулирования команды высокого уровня инноваций для Школы медицины Шанхайского университета Цзяо Тонг , Междисциплинарный исследовательский фонд Шанхайской девятой народной больницы, Шанхайская школа медицины университета ЦзяоТанг (JYJC201902). И Л.Д. является ученым выдающихся молодых медицинских талантов, Шанхай “Восходящие звезды медицинского таланта” Программа развития молодежи и “Чэнь Син” проекта из Шанхайского университета Цзяотун.
Materials
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
- Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), 243-246 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
- Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
- Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
- Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
- Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
- Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
- Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
- Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
- Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
- Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
- Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
- Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
- Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
- Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
- Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
- Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).
