Analyse du phénotype squelettique d’un modèle murin de suppression conditionnelle de Stat3
Summary
Ce protocole décrit une méthode canonique pour comprendre les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo. Cette méthode utilise un modèle murin transgénique et certaines techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique.
Abstract
Les modèles murins transgéniques sont puissants pour comprendre les gènes critiques contrôlant la différenciation et l’activité de l’ostéoclaste, et pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques de l’ostéoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Crémeurs ont été largement utilisés pour les études fonctionnelles des ostéoclastes. Le transducteur de signal et activateur de transcription 3 (STAT3) est pertinent dans l’homéostasie osseuse, mais son rôle dans les ostéoclastes in vivo reste mal défini. Pour fournir la preuve in vivo que STAT3 participe à la différenciation des ostéoclastes et au métabolisme osseux, nous avons généré un modèle murin de délétion Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) et analysé son phénotype squelettique. Le balayage de Micro-CT et la reconstruction 3D ont impliqué la masse accrue d’os chez les souris knockout conditionnelles. La souillure de H&E, la double souillure rouge de calcein et d’alizarin, et la souillure acide tartrate-résistante de la phosphatase (PIÈGE) ont été exécutées pour détecter le métabolisme d’os. En bref, ce protocole décrit quelques méthodes et techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.
Introduction
L’os squelettique est le principal organe porteur du corps humain et est sous la pression de l’environnement interne et externe pendant la marche et l’exercice1. Tout au long de la vie, les os passent continuellement par l’auto-renouvellement, qui est équilibré par les ostéoblastes et les ostéoclastes. Le processus d’élimination des ostéoclastes des os anciens et de la formation de nouveaux os par les ostéoblastes maintient l’homéostasie et la fonction mécanique du système squelettique2. Une perturbation de l’équilibre peut induire des maladies métaboliques osseuses, telles que l’ostéoporose. L’ostéoporose, qui est causée par une activité ostéoclastique excessive, est répandue à l’échelle mondiale et entraîne des pertes économiques substantielles pour la société2,3,4. Selon le nombre limité de médicaments disponibles pour le traitement de l’ostéoporose et leur risque d’effets indésirables4, il est important de dévoiler les détails de la formation et de l’activité de l’ostéoclaste.
Les ostéoclastes dérivés de la lignée hématopoïétique monocyte/macrophage ont des noyaux multiples (peuvent avoir de 2 à 50 noyaux) et sont grands (généralement supérieurs à 100 μm de diamètre)2. Bien que l’exploration des mécanismes et le criblage des drogues pour des désordres osteoclastic aient été largement améliorés par l’intermédiaire de la culture osteoclast in vitro, les réactions organiques compliquées rendent l’évidence in vivo indispensable pour la thérapie visée. En raison des similitudes génétiques et physiopathologiques entre les souris et les humains, les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques des maladies humaines in vivo6. Le système Cre-loxP est une technologie largement utilisée pour l’édition de gènes de souris et a permis aux chercheurs d’étudier les fonctions des gènes d’une manière spécifique aux tissus/cellules5. La cathepsine K (CSTK) est une cystéine protéase sécrétée par des ostéoclastes qui peuvent dégrader le collagène osseux8. Il est bien accepté que CTSK soit sélectivement exprimé dans les osteoclasts mûrs ; par conséquent, les souris Ctsk-Cre sont considérées comme un outil utile pour les études fonctionnelles des ostéoclastes et ont été utilisées6.
La famille des transducteurs de signaux et activateurs de transcription (STAT) est classique et très importante dans l’immunité et la progression et le développement du cancer7,8. Parmi les sept STATs, STAT3 est signalé comme le plus pertinent pour l’homéostasie osseuse9,10. Plusieurs études in vivo ont rapporté que l’inactivation spécifique de STAT3 dans les ostéoblastes diminue la formation osseuse9,10. Néanmoins, les preuves solides concernant la participation de STAT3 à la formation d’ostéoclastes et au métabolisme osseux in vivo sont encore limitées. Récemment, nous avons fourni des preuves in vivo avec un modèle murin de suppression Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3fl/ fl; Ctsk-Cre, ci-après appelé Stat3Ctsk) que STAT3 participe à la différenciation ostéoclaste et au métabolisme osseux11. Dans la présente étude, nous décrivons les méthodes et les protocoles que nous avions l’habitude d’analyser les changements de la masse d’os, de l’histomorphologie d’os, et de l’anabolisme et du catabolisme d’os des souris Stat3Ctsk afin d’étudier l’influence de la suppression STAT3 osteoclast-spécifique sur l’homéostasie d’os.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier le mécanisme et le traitement pharmaceutique des maladies humaines13. Les souris Ctsk-Cre ont été largement utilisées pour les études fonctionnelles des ostéoclastes6. La présente étude a décrit les protocoles des méthodes pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Professeur Weiguo Zou et S. Kato pour les réactifs et les souris et les membres du laboratoire Zou pour leurs discussions utiles. Nous remercions également le Laboratoire de stomatologie numérisée et le Centre de recherche sur les anomalies craniofaciales du neuvième hôpital populaire de Shanghai pour son aide. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, du fonds SHIPM-mu de l’Institut de médecine de précision de Shanghai, du Neuvième Hôpital populaire de Shanghai, de l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai [JC201809], du projet d’incitation de l’équipe d’innovation de haut niveau pour l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai , le Fonds de recherche interdisciplinaire du neuvième hôpital populaire de Shanghai, École de médecine de l’université JiaoTong de Shanghai [JYJC201902]. Et L.J. est un chercheur du programme de développement des jeunes talents médicaux exceptionnels, du programme de développement des jeunes « Rising Stars of Medical Talent » de Shanghai et du projet « Chen Xing » de l’Université Jiaotong de Shanghai.
Materials
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
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