Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional
Summary
Este protocolo descreve um método canônico para entender os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo. Este método utiliza um modelo de camundongo transgênico e algumas técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético.
Abstract
Modelos de camundongos transgênicos são poderosos para entender os genes críticos que controlam a diferenciação e atividade osteoclante, e para estudar mecanismos e tratamentos farmacêuticos da osteoporose. Os camundongos Cathepsin K (Ctsk)-Cre têm sido amplamente utilizados para estudos funcionais de osteoclatos. O transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) é relevante na homeostase óssea, mas seu papel nos osteoclas in vivo permanece mal definido. Para fornecer a evidência in vivo de que o STAT3 participa da diferenciação osteoclasta e do metabolismo ósseo, geramos um modelo de rato de exclusão Stat3 específico do osteoclasta(Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) e analisou seu fenótipo esquelético. A varredura microcsi tomografia e a reconstrução 3D implicaram aumento da massa óssea nos camundongos eliminatórios condicionais. Foram realizadas colorações de H&E, re coloração dupla de calceína e alizarina vermelha e coloração de fosfattase de ácido resistente a tartaratos (TRAP) para detectar o metabolismo ósseo. Em suma, este protocolo descreve alguns métodos e técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético e estudar os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo.
Introduction
O osso esquelético é o principal órgão portador de carga do corpo humano e está sob pressão do ambiente interno e externo durante a caminhada e o exercício1. Ao longo de sua vida, os ossos passam continuamente pela auto-renovação, que é equilibrada por osteoblastos e osteoclartos. O processo de osteoclasstos limpando ossos velhos e osteoblastos formando novos ossos mantém a homeostase e a função mecânica do sistema esquelético2. A perturbação no equilíbrio pode induzir doenças metabólicas ósseas, como a osteoporose. A osteoporose, causada pelo excesso de atividade osteoclástica, é globalmente prevalente e causa perdas econômicas substanciais para a sociedade2,3,4. De acordo com o número limitado de medicamentos disponíveis para o tratamento da osteoporose e seu risco de efeitos adversos4, é importante desvendar os detalhes da formação e atividade do osteoclato.
Os osteoclatos derivados da linhagem hematopoiética monócito/macrófago têm múltiplos núcleos (podem ter de 2 a 50 núcleos) e são grandes (geralmente maiores que 100 μm de diâmetro)2. Embora a exploração de mecanismos e a triagem de medicamentos para distúrbios osteoclásticos tenham sido amplamente melhoradas através da cultura osteoclasta in vitro, as complicadas reações orgânicas tornam a evidência in vivo indispensável para a terapia-alvo. Devido às semelhanças genéticas e fisiopacionológicas entre camundongos e humanos, modelos de camundongos geneticamente modificados são comumente utilizados para estudar os mecanismos e os tratamentos farmacêuticos da doença humana in vivo6. O sistema Cre-loxP é uma tecnologia amplamente utilizada para edição de genes de camundongos e permitiu que os pesquisadores investigassem funções genéticas de forma específica de tecido/célula5. Cathepsin K (CSTK) é uma protease de cisteína secretada por osteoclartos que pode degradar colágeno ósseo8. É bem aceito que o CTSK seja expresso seletivamente em osteoclastos maduros; portanto, os camundongos Ctsk-Cre são considerados uma ferramenta útil para estudos funcionais de osteoclatos e tem sido utilizado6.
O transdutor de sinal e ativador da família de transcrição (STAT) é clássico e altamente significativo em imunidade e progressão e desenvolvimento do câncer7,8. Entre os sete STATs, o STAT3 é relatado como o mais relevante para a homeostaseóssea 9,10. Vários estudos in vivo relataram que a inativação específica do STAT3 nos osteoblastos diminui a formaçãoóssea 9,10. No entanto, as evidências sólidas sobre a participação do STAT3 na formação de osteoclatos e metabolismo ósseo in vivo ainda são limitadas. Recentemente, fornecemos evidências in vivo com um modelo de mouse de exclusão Stat3 específico do osteoclasta(Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, a partir de agora chamado Stat3Ctsk) que o STAT3 participa da diferenciação osteoclasta e do metabolismo ósseo11. No presente estudo, descrevemos os métodos e protocolos que utilizamos para analisar as alterações na massa óssea, histomorfologia óssea e anabolismo ósseo e catabolismo dos camundongos Stat3Ctsk, a fim de estudar a influência da exclusão STAT3 específica do osteoclato na homeostase óssea.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos de camundongos geneticamente modificados são comumente usados para estudar o mecanismo e o tratamento farmacêutico da doença humana13. Os camundongos Ctsk-Cre têm sido amplamente utilizados para estudos funcionais de osteoclatos6. O presente estudo descreveu os protocolos dos métodos para analisar o fenótipo esquelético e estudar os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo.
A análise histológica é o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Prof. Weiguo Zou e à S. Kato pelos reagentes e ratos e aos membros do laboratório Zou por discussões úteis. Agradecemos também ao Laboratório de Estomatologia Digitalizada e Centro de Pesquisa de Anomalias Craniofaciais do Hospital do Nono Povo de Xangai pela assistência. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, o fundo SHIPM-mu do Instituto de Medicina de Precisão de Xangai, Shanghai Nona Escola Popular de Medicina, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], o Projeto de Incentivo da Equipe de Inovação de Alto Nível para a Escola de Medicina da Universidade de Xangai Jiao Tong , o Fundo de Pesquisa Interdisciplinar do Hospital do Nono Povo de Xangai, Shanghai JiaoTong University School of Medicine [JYJC201902]. E L.J. é um estudioso dos Talentos Médicos Da Juventude, Shanghai “Rising Stars of Medical Talent” Youth Development Program e o projeto “Chen Xing” da Universidade de Xangai Jiaotong.
Materials
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
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