Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel
Summary
Dit protocol beschrijft een canonieke methode om de kritische genen te begrijpen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren. Deze methode maakt gebruik van een transgeen muismodel en enkele canonieke technieken om skeletfenotype te analyseren.
Abstract
Transgene muismodellen zijn krachtig voor het begrijpen van de kritische genen die osteoclastendifferentiatie en -activiteit beheersen, en voor het bestuderen van mechanismen en farmaceutische behandelingen van osteoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Cre muizen zijn veel gebruikt voor functionele studies van osteoclasten. De signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) is relevant bij bothomeostase, maar de rol ervan bij osteoclasten in vivo blijft slecht gedefinieerd. Om het in vivo bewijs te leveren dat STAT3 deelneemt aan osteoclastendifferentiatie en botmetabolisme, hebben we een osteoclastenspecifiek Stat3-deletiemuismodel gegenereerd (Stat3 fl/fl ; Ctsk-Cre) en analyseerde zijn skeletfenotype. Micro-CT-scanning en 3D-reconstructie impliceerden een verhoogde botmassa bij de voorwaardelijke knock-outmuizen. H&E-kleuring, calceïne en alizarine rode dubbele kleuring en tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring werden uitgevoerd om het botmetabolisme te detecteren. Kortom, dit protocol beschrijft enkele canonieke methoden en technieken om skeletfenotype te analyseren en de kritische genen te bestuderen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren.
Introduction
Skeletbot is het belangrijkste dragende orgaan van het menselijk lichaam en staat onder druk van zowel de interne als externe omgeving tijdens het lopen en sporten1. Gedurende iemands hele leven ondergaan botten voortdurend zelfvernieuwing, die wordt gecompenseerd door osteoblasten en osteoclasten. Het proces van osteoclasten die oude botten en osteoblasten die nieuw bot vormen, zuivert de homeostase en mechanische functie van het skeletsysteem2. Verstoring van het evenwicht kan botmetabole ziekten veroorzaken, zoals osteoporose. Osteoporose, die wordt veroorzaakt door overmatige osteoclastische activiteit, komt wereldwijd voor en veroorzaakt aanzienlijke economische verliezen voor de samenleving2,3,4. Volgens het beperkte aantal geneesmiddelen dat beschikbaar is voor osteoporosebehandeling en hun risico op bijwerkingen4, is het belangrijk om de details van osteoclastenvorming en -activiteit te onthullen.
Osteoclasten afgeleid van de monocyt/macrofaag hematopoietische afstamming hebben meerdere kernen (kunnen 2 tot 50 kernen hebben) en zijn groot (meestal groter dan 100 μm in diameter)2. Hoewel de exploratie van mechanismen en de screening van geneesmiddelen op osteoclastische aandoeningen sterk zijn verbeterd via in vitro osteoclastencultuur, maken de gecompliceerde organische reacties in vivo bewijs onmisbaar voor de gerichte therapie. Vanwege genetische en pathofysiologische overeenkomsten tussen muizen en mensen worden genetisch gemanipuleerde muismodellen vaak gebruikt voor het bestuderen van de mechanismen en de farmaceutische behandelingen van menselijke ziekten in vivo6. Het Cre-loxP-systeem is een veelgebruikte technologie voor het bewerken van muisgen en heeft onderzoekers in staat gesteld om genfuncties op een weefsel-/celspecifieke manier te onderzoeken5. Cathepsine K (CSTK) is een cysteïne protease uitgescheiden door osteoclasten die botcollageen kunnen afbreken8. Het is algemeen aanvaard dat CTSK selectief wordt uitgedrukt in volwassen osteoclasten; daarom worden Ctsk-Cre muizen beschouwd als een nuttig hulpmiddel voor functionele studies van osteoclasten en is gebruikt6.
De signaaltransducer en activator van transcriptie (STAT) familie is klassiek en zeer significant in immuniteit en kankerprogressie en ontwikkeling7,8. Van de zeven STATs is STAT3 naar verluidt het meest relevant voor bothomeostase9,10. Verschillende in vivo studies hebben gemeld dat specifieke inactivatie van STAT3 in osteoblasten de botvorming vermindert9,10. Niettemin is solide bewijs met betrekking tot de deelname van STAT3 aan osteoclastenvorming en botmetabolisme in vivo nog steeds beperkt. Onlangs hebben we in vivo bewijs geleverd met een osteoclastenspecifiek Stat3-deletiemuismodel (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, hierna Stat3Ctskgenoemd) dat STAT3 deelneemt aan osteoclastendifferentiatie en botmetabolisme11. In deze studie beschrijven we de methoden en protocollen die we gebruikten om de veranderingen in botmassa, bot histomorfologie en bot anabolisme en katabolisme van de Stat3Ctsk muizen te analyseren om de invloed van osteoclasten-specifieke STAT3 deletie op bothomeostase te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetisch gemanipuleerde muismodellen worden vaak gebruikt voor het bestuderen van het mechanisme en de farmaceutische behandeling van menselijke ziekten13. Ctsk-Cre muizen zijn veel gebruikt voor functionele studies van osteoclasten6. De huidige studie beschreef de protocollen van de methoden om skeletfenotype te analyseren en de kritische genen te bestuderen die de osteoclastische activiteit in vivo controleren.
Histologische analyse i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken prof. Weiguo Zou en S. Kato voor reagentia en muizen en de leden van het Zou laboratorium voor nuttige discussies. We danken ook het Laboratorium voor Gedigitaliseerde Stomatologie en Onderzoekscentrum voor Craniofaciale Anomalieën van het Shanghai Ninth People’s Hospital voor hulp. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, het SHIPM-mu fonds van het Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], het Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong , het cross-disciplinaire onderzoeksfonds van het Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai JiaoTong university School of Medicine [JYJC201902]. En L.J. is een geleerde van de Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai “Rising Stars of Medical Talent” Youth Development Program en het “Chen Xing” project van shanghai Jiaotong University.
Materials
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
- Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), 243-246 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
- Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
- Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
- Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
- Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
- Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
- Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
- Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
- Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
- Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
- Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
- Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
- Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
- Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
- Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
- Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).
