Summary
Detta protokoll beskriver en kanonisk metod för att förstå de kritiska gener som kontrollerar osteoclast verksamhet in vivo. Denna metod använder en transgen musmodell och vissa kanoniska tekniker för att analysera skelettet fenotyp.
Abstract
Transgena musmodeller är kraftfulla för att förstå de kritiska gener som styr osteoklas differentiering och aktivitet, och för att studera mekanismer och farmaceutiska behandlingar av osteoporos. Cathepsin K (Ctsk)-Cre möss har använts i stor utsträckning för funktionella studier av osteoklaster. Signalgivaren och aktivatorn för transkription 3 (STAT3) är relevant i benhomeostas, men dess roll i osteoclasts in vivo förblir dåligt definierad. För att tillhandahålla in vivo-bevis för att STAT3 deltar i osteoklas differentiering och benmetabolism genererade vi en osteoklaste specifik Stat3-borttagningsmusmodell (Stat3 fl / fl ; Ctsk-Cre) och analyserade sin skelett fenotyp. Micro-CT skanning och 3D återuppbyggnad underförstådd ökad ben massa i villkorade knockout möss. H&E färgning, calcein och alizarin röd dubbel färgning och tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) färgning utfördes för att upptäcka ben metabolism. Kort sagt, detta protokoll beskriver vissa kanoniska metoder och tekniker för att analysera skelettet fenotyp och att studera de kritiska gener som kontrollerar osteoclast verksamhet in vivo.
Introduction
Skelettben är människokroppens huvudsakliga bärande organ och är under tryck från både den inre och yttre miljön under gång och träning1. Under hela sitt liv går ben kontinuerligt igenom självförnyelse, som balanseras av osteoblaster och osteoklaster. Processen med osteoklaster som rensar gamla ben och osteoblaster som bildar nytt ben upprätthåller homeostas och mekanisk funktion i skelettsystemet2. Störningar i balansen kan inducera benmetabola sjukdomar, såsom osteoporos. Osteoporos, som orsakas av överdriven osteoklastisk aktivitet, är globalt utbredd och orsakar betydande ekonomiska förluster församhället 2,3,4. Enligt det begränsade antalet läkemedel som finns tillgängliga för osteoporosbehandling och deras risk för biverkningar4, är det viktigt att avslöja detaljerna om osteoklasbildning och aktivitet.
Osteoklaster som härrör från den monocyt/makrofag hematopoetiska härstamningen har flera atomkärnor (kan ha 2 till 50 atomkärnor) och är stora (vanligtvis större än 100 μm i diameter)2. Även om utforskningen av mekanismer och screening av läkemedel för osteoklastiska störningar har förbättrats kraftigt via in vitro osteoclast kultur, de komplicerade organiska reaktionerna gör in vivo bevis oumbärliga för den riktade terapin. På grund av genetiska och patofysiologiska likheter mellan möss och människor används genetiskt konstruerade musmodeller ofta för att studera mekanismerna och läkemedelsbehandlingarna av mänsklig sjukdom in vivo6. Cre-loxP-systemet är en allmänt använd teknik för musgenredigering och har gjort det möjligt för forskare att undersöka genfunktioner på ett vävnads-/cellspecifikt sätt5. Cathepsin K (CSTK) är en cysteinproteas utsöndrad av osteoklaster som kan bryta ner benkollage8. Det är väl accepterat att CTSK uttrycks selektivt i mogna osteoklaster; Därför anses Ctsk-Cre möss vara ett användbart verktyg för funktionella studier av osteoklaster och har använts6.
Signalgivaren och aktivatorn av transkription (STAT) familjen är klassisk och mycket signifikant i immunitet och cancer progression och utveckling7,8. Bland sju STATs rapporteras STAT3 vara den mest relevanta för benhomeostas9,10. Flera in vivo-studier har rapporterat att specifik inaktivering av STAT3 i osteoblaster minskarbenbildningen 9,10. Fasta bevis för stat3 deltagande i osteoklas bildas och benmetabolism in vivo är dock fortfarande begränsad. Nyligen tillhandahöll vi in vivo-bevis med en osteoklaslastspecifik Stat3-borttagningsmusmodell (Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, härefter kallat Stat3Ctsk) det STAT3 deltar i osteoclast differentiering och benmetabolism11. I den aktuella studien beskriver vi de metoder och protokoll som vi använde för att analysera förändringarna i benmassa, ben histomorfologi och ben anabola och katabolism av Stat3Ctsk möss för att studera påverkan av osteoclast-specifika STAT3 borttagning på ben homeostas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som rör de djur som beskrivs här godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
1. Uppfödning av osteoklaste specifika Stat3 borttagningsmöss
OBS: Stat3fl/fl möss erhölls kommersiellt. Ctsk-Cre möss tillhandahölls av S. Kato (University of Tokyo, Tokyo, Japan12). Mössen uppföddes och bibehölls under särskilda patogenfria (SPF) förhållanden i den institutionella djuranläggningen under standardiserade förhållanden.
- Para ihop en sexuellt mogen manlig mus med två kvinnliga möss i samma ålder. Efter 18 dagar, kontrollera dagliga kontroller för nyfödda. Separera de gravida kvinnliga mössen och håll den ensam om det behövs. Byt manliga möss bland olika avelsburar om honmössen inte var gravida inom 1 månad efter parningen.
- Korsa Stat3fl/fl möss till Ctsk-Cre möss (F0). Klipp svansarna för genotypning och håll hanen Stat3fl/+; Ctsk-Cre möss tills de är sexuellt mogna, vilket är cirka 6 veckors ålder (F1). Använd följande primers: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTCGTTCGTTC.
- Cross 6 veckor gammal hane Stat3fl/+; Ctsk-Cre möss med kvinnliga Stat3fl/fl möss. Klipp svansarna för genotypning och behåll den manliga Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre möss tills de är sexuellt mogna, vilket är cirka 6 veckors ålder (F2).
- Kors 6 veckor gammal manlig Stat3 fl/ fl; Ctsk-Cre möss med kvinnliga Stat3fl/fl möss (F3). Klipp svansarna för genotypning och ersätt de gamla avelsmössen med yngre möss i tid (F3+N).
2. Insamling av prover
- Avliva sex par 8 veckor gamla hane Stat3fl/fl och Stat3Ctsk kullkamrater möss separat med koldioxid kvävning.
OBS: CO2-flödet förskjuter 30% av burvolymen per minut (t.ex. för 45 cm x 30 cm x 30 cm bur är CO2-flödeshastigheten 40 L/min). - Placera mössen i ett överläge. Rubb flytta de bilaterala höftlederna försiktigt för hand. Använd oftalmisk sax för att skära av huden vertikalt från den distala skenbenet och dissekera sedan hela huden från bakbenen.
- Skär av ledbandet i höger höftled och knäled med sax för att separera bakbenet. Skär trochantern och korsningen av vadbenet och sänk sedan ner bakbenet i 4% paraformaldehyd. Håll höger bakben för steg 3. Skär benet i båda ändarna för att helt fördjupa och fixera benmärgen med 4% paraformaldehyd.
- Skär ledbandet i vänster höftled och knäled med sax, ta försiktigt bort mjukvävnaden och separera försiktigt skenbenet och lårbenet. Sänk ner skenbenet och lårbenet separat i 75% etanol. Behåll femora för steg 4 och skenben för steg 6. Se till att hålla byxtern intakt.
3. Förberedelser av paraffinsektioner
- Fixera höger bakben i 4% paraformaldehyd vid 4 °C i 48 timmar.
- Avkalka: Tvätta försiktigt proverna med 1x PBS i 10 min 3 gånger. Avkalka proverna i 15% EDTA (150 g EDTA i 800 ml ddH2O och 100 ml 10x PBS) med ultraljudsavkalkningsmedel i 3 till 4 veckor tills benen kan böjas. Byt ut med färsk avkalkningsvätska varannan dag.
- Tvätta försiktigt proverna 3x med 1x PBS och sänk sedan ned dem i 75% etanol vid 4 °C över natten.
- Dehydrera: På andra dagen nedsänker sekventiellt exemplaren i 95% etanol, 100% etanol och xylen, var och en i 1 timme två gånger.
- Sänk ner proverna i 1/2 xylen 1/2 paraffin i 30 min. Sänk ner proverna i paraffin vid 65 °C över natten.
- Inbäddning: Välj en lämplig inbäddningstank för inbäddning. Placera skenbenet jämnt under. Placera lårbenet och skenbenet i 90° vinkel. När paraffinet har svalnat och stelnat helt, ta bort det från inbäddningstanken. Numrera proverna och förvara dem vid -20 °C över natten.
- Skär 5 μm tjocka sektioner kontinuerligt med hjälp av mikrotomen. Klipp 20–40 sektioner. Sprid sektionerna på 37 °C vatten, fäst dem på mikroskoprutschbanor och grädda vid 42 °C över natten.
4. Mikro-CT skanning och analys
- Skanna den vänstra femora med en mikro-CT skanner. Upplösning: 10 μm; Spänning: 70 kV; Ström: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Rotationssteg: 0,5°.
- Rekonstruera 3D-bilder av kortikalbenet och trabekulärt ben med hjälp av skannerns stödjande programvara enligt tillverkarens instruktioner. ROIs är i en total 1 mm bredd av trabecular ben nära den distala tillväxt plattan och totalt 1 mm bred del av när ben i mitten av femora.
- Beräkna de kvantitativa mikroarchitecture parametrarna: ben mineralisk densitet (BMD), ben volym fraktion (BV/TV), trabecular tjocklek (Tb.Th.), trabecular nummer (Tb.N.), trabecular separation (Tb.Sp.) och när ben tjocklek (Ct.Th.).
5. TRAP färgning
- Grädda paraffinsektionerna vid 65 °C i 30 min.
- Dewax: Sänk ner sektionerna i xylen i 10 minuter. Utför det här steget 3x med färsk xylen.
- Rehydrera: Sänk ned sektionerna sekventiellt i 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol och ddH2O, var och en i 5 min två gånger.
- Förbered färglösningen med TRAP-färgningssatsen enligt tillverkarens instruktioner och värm till 37 °C.
OBS: TRAP färgningslösning ska beredas ny omedelbart före varje analys. - Tillsätt 50–100 μL färglösning till varje prov och inkubera i en fuktig kammare på 37 °C i 20–30 minuter. Kontrollera osteoklasternas färgningsstatus under ett lätt mikroskop var 5:e minut tills röda flerkärnade osteoklaster kan ses. Avsluta reaktionen med ddH2O.
- Mothåller i hematoxylinlösning i 30 s. Skapa en stabil blå färg genom nedsänkning i 1% ammoniaklösning i 1 min. Skölj i långsamt rinnande kranvatten.
- Montera sektionerna med täcken med neutral balsam och torka över natten.
- Fånga 3–5 intressefält med ett mikroskop. Analysera den trabekulära omkretsen med bild J: mät skalstångens längd (Ls) med verktyget "raklinje " som L1 och mät sedan längden på trabekulär omkrets med hjälp av verktyget "segmenterad linje" som L2, den fysiska längden (Lp)= Ls * L2 / L1). Räkna antalet TRAP-positiva celler med mer än tre atomkärnor.
6. Calcein och alizarin röd dubbelmärkning
- Provberedning: Injicera 20 mg/kg kalcein intraperitoneally (1 mg/ml i 2% NaHCO3-lösning) dag 0 och 25 mg/kg alizarinrött S (AL, 2 mg/ml i H2O) dag 4. Offra möss dag 7. Ta försiktigt avstånd från skenbenet och fixera i 4% paraformaldehyd vid 4 °C i 48 timmar.
- Dehydrera: Efter fixering, tvätta försiktigt skenbenet 3x med 1x PBS. Sänk i 95% etanol, 100% etanol och xylen i 5 minuter två gånger separat.
- Sänk ner proverna i aceton i 12 timmar, i 1/2 aceton 1/2 harts i 2 timmar och i rent harts i en torkugn över natten.
OBS: Hartset har framställts med kommersiellt tillgängligt harts (t.ex. Bädda in 812 harts) enligt tillverkarens instruktioner. - Inbäddning: Tillsätt rent harts i en lämplig kiselgelinbäddningstank och placera proverna försiktigt för att undvika bubblor. Polymerisera hartset i en torkugn vid 60 °C i 48 timmar.
- Skär proverna i 5 μm tjocka sektioner kontinuerligt med en roterande mikrotom. Förvara resten av proverna med torkmedel vid rumstemperatur.
- Följ sektionerna med pincett i en droppe av 75% alkohol. Montera sektionerna med täckglas med neutral balsam. Fånga röd och grön fluorescensmärkning med ett fluorescensmikroskop.
- Mät bredden mellan två märkningslinjer (Ir.L.Wi), enmärkt trabekulär omkrets (sL.Pm), dubbelmärkt trabekulär omkrets (dL.Pm) och total trabekulär omkrets (Tb.Pm). Beräkna mineralappositionshastigheten (MAR) och benbildningshastigheten (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/intervalldagar. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll genererades osteoclast specifika Stat3 borttagning möss för att studera påverkan av STAT3 borttagning på osteoclast differentiering. Stat3Ctsk möss och deras wildtype (WT) kullkamrater uppföddes och hölls efter genotypning. Benmärgsmakrofager isolerades och odlades till osteoklaster, och STAT3-borttagning i Stat3Ctsk möss visades (Figur 1).
Femorarekonstruktion och kvantitativ analys av mikro-CT visade att benmassan hos Stat3Ctsk-mössen ökade jämfört med WT-möss (figur 2).
Hanstomorfologi hos femora från WT- och Stat3Ctsk-möss undersöktes via H&E-färgning (Figur 3).
Osteoclastogenic aktivitet hos mössen upptäcktes av TRAP färgning. Osteoklaster var TRAP+ (vinröda eller lila) celler med flera atomkärnor och stor storlek (Figur 4A). Antalet TRAP+ osteoklaster var lägre hos Stat3Ctsk möss jämfört med WT möss ( Figur4B), vilket indikerar att STAT3 brist nedsatt osteoclast bildas.
Osteogenes hos möss representeras av mineralappositionshastigheten (MAR) och mättes med calcein och alizarin röd dubbelmärkning (Figur 5). Calcein och alizarin röd var sekventiellt intraperitoneally injiceras. Därför representerar området mellan calcein (grön) och alizarin röd (röd) fluorescenslinjer nybildat ben under fyra dagar. Som visas i figur 5, raderade STAT3 i osteoklaster påverkade inte benaboli.
Figur 1: Illustration av osteoklastisk specifik Stat3 borttagning mus modell generation och genetiskt konstruerade möss. (A) Schematiskt diagram över Stat3 borttagning i cathepsin K (Ctsk)-uttrycker osteoklaster via Cre-loxP systemet. B)Avelsframsteg för osteoklastiska specifika Stat3-borttagningsmöss. Stat3fl/fl möss korsades till Ctsk-Cre möss (F0) för att generera heterozygous Stat3fl/+; Ctsk-Cre möss (F1). Manlig Stat3fl/+; Ctsk-Cre möss hölls och korsades till kvinnliga Stat3fl /fl möss för att generera homozygous Stat3fl/fl; Ctsk-Cre möss (F2). Manlig Stat3fl/fl; Ctsk-Cre möss hölls och korsades till kvinnliga Stat3fl / fl möss för att generera Stat3 fl /fl; Ctsk-Cre möss och Stat3fl/fl möss. C)Genotypning för olika genotyper av möss. Stat3 mutant: 187 bp, Stat3 wildtype: 146 bp, Cre: 200 bp. (D) Western blot of STAT3 i osteoklaster odlade med benmärgsmakrofager från Stat3fl/fl och Stat3Ctsk möss. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Tredimensionell rekonstruktion och kvantitativ mikroarchitecture parameteranalys i femora av möss med mikro-CT skanning. (A) Tredimensionellt rekonstruerade mikro-CT bilder av trabekulär ben av femora från 8 veckor gamla WT och Stat3Ctsk möss. Regionen av intresse (ROI) var i en total 1 mm bredd av trabecular ben nära den distala tillväxt plattan. (B) 3D rekonstruerade mikro-CT bilder av när ben av femora från 8 veckor gamla WT och Stat3Ctsk möss. ROI var i en total 1 mm bred sektion av när ben från mitten av femora. (C–H) Kvantitativa mikroarchitecture parametrar av micro-CT: ben mineralisk densitet (BMD), ben volym fraktion (BV/TV), trabekulär tjocklek (Tb.Th.), trabecular nummer (Tb.N.), trabecular separation (Tb.Sp.) och när ben tjocklek (Ct.Th.). Felstaplar representerar medelvärdet ± SD, n=4, *P<0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Histomorfologi av femora från WT- och Stat3Ctsk-möss som ställs ut via H&E-färgning. M-formad prickad kurva indikerar ett broskskikt. Relativt hög effekt fält av när ben boxas med prickade linjer och visas nedan. Relativt hög effekt fält av trabekulär ben är inringade med prickade linjer och uppvisade längst ner. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Osteoclastogenesis hos femora möss representerade via TRAP-färgning. (A) TRAP färgning av femora från 8 veckor gamla WT och Stat3Ctsk möss. TRAP+ flerkärnade osteoklaster indikeras av svarta trianglar. Relativt hög effekt fält av osteoklaster cirklade med prickade linjer visas nedan, visar flera atomkärnor och en enorm storlek. (B) Antalet TRAP+ flerkärnade osteoklaster räknades. Felstaplar representerar medelvärdet ± SD, n=5, *P<0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Osteogenes i femora av möss representerade via calcein och alizarin röd dubbelmärkning. ( A) Sju veckor gamla möss injicerades sekventiellt med kalcein dag 0, med alizarinrött dag 4, och offrades sedan på dag 7. Området mellan calcein (grön) och alizarin röd (röd) fluorescens linjer representerar nybildade när ben över fyra dagar. (B) Mineralappositionshastighet (MAR) och benbildningshastighet (BFR/BS) beräknad med avståndet mellan de två linjerna representerar det närbenens osteogena aktivitet. C)Området mellan kalcein (grön) och alizarinröda (röda) fluorescenslinjer representerar nybildat trabekulärt ben på fyra dagar. D)MAR och BFR/BS representerar trabekulärbenets osteogena aktivitet. Felstaplar representerar medelvärdet ± SD, n=5, *P<0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetiskt konstruerade musmodeller används ofta för att studera mekanismen och läkemedelsbehandlingen av mänsklig sjukdom13. Ctsk-Cre möss har använts i stor utsträckning för funktionella studier av osteoklaster6. I den aktuella studien beskrivs protokollen till metoderna för att analysera skelettet fenotyp och för att studera de kritiska gener som styr osteoklaste aktivitet in vivo.
Histologisk analys är den bästa intuitiva metoden för att upptäcka benmetabolism. Och kvaliteten på paraffinsektionerna är basen för den histologiska analysen. Tillräckligt med tid för fullständig fixering och avkalkning av benvävnaden är extremt viktigt eftersom benvävnader kan fragmenteras. Forskare med fokus på femora och skenben bör placera lårbenet och skenbenet i en 90° vinkel i inbäddningssteget. För att genomföra tillförlitlig och högkvalitativ histologisk analys valde vi sagittal paraffinsektioner där broskskiktet var symmetriskt och visade en tydlig M-formad linje i H&E-färgning, vilket representerar lämplig vinkel och djup för dessa kontinuerliga sektioner. Å andra sidan, om du behöver observera knälederna och intilliggande ledband, ska lårbenet och skenbenet placeras i 120° vinkel.
TRAP har i årtionden fungerat som en biokemisk markör för osteoklaste funktion14, eftersom det främst uttrycks iosteoklaster 15,16. Två substrat används vanligtvis för att bedöma syrafosfatasaktivitet. Naphthol-ASBI fosfat (N-ASBI-P) är ett utmärkt substrat för osteoclast-specifika TRAP isoform 5b. Paranatrofenylfosfat (pNPP) kan dock också hydrolyseras med icke-typ 5 TRAPs17. Därför är naphthol-ASBI fosforsyra-pararosanilin metod för histokemisk demonstration av TRAP mycket specifik ivävnad avsnitt 17,18,19. Makrofagfosfatas (surfosfatas) har ett pH optimalt 5,0–6,0, där det mestadels är tartratbeständigt20. Således rekommenderar vi att i protokollet av TRAP färgning analys, vävnad avsnitt återfärgade av hematoxylin bör inte avfärgas med saltsyra. Viktigt, även om osteoblaster och osteocyter nära ben ombyggnad områden också uttrycker TRAP21, endast stora TRAP-positiva celler med mer än tre atomkärnor ansågs som osteoklaster. I denna studie visade Stat3Ctsk möss hämmad osteoklasaktivitet (Figur 4).
Calcein är en fluorokrom (grön fluorescens) som används ofta för att indikera skeletttillväxt under förkalkning. Det kan binda till kalcium och införlivas i de nybildade kalciumkarbonatkristallerna22. På samma sätt byggdes calcein, alizarinrött (röd fluorescens) och tetracyklin (gul fluorescens) in i benet för att uppskatta tillväxten frånexponeringstiden 23,24. Många studier tidigare har använt enstaka fluorokromer (vanligtvis calcein) för att märka ben, men observatörer kan lätt förväxlas mellan det nybildade benet och det gamla benet, särskilt i oregelbundet trabekulärt ben. Därför föreslår vi att forskare injicerar två olika typer av fluorokromer i möss för att skilja det nyare benet från det äldre benet. Enligt våra tester, calcein i kombination med alizarin kan uppnå den mest tillräckliga och bestående kontrasten. I denna studie användes calcein-alizarin röd märkning för att upptäcka den osteogena frekvensen av benvävnad och det visade sig att osteoblastaktivitet inte påverkades hos Stat3Ctsk möss (Figur 5).
Kort sagt, för att förstå de kritiska gener som styr osteoklaste aktivitet, beskriver detta protokoll en kanonisk metod för att generera en transgen mus modell. Detta protokoll beskriver också några typiska tekniker för att analysera skelettet fenotyp. I denna studie, borttagning av STAT3 nedsatt osteoclast bildas och ökad ben massa. Dessa tekniker kan vara intressanta för dem som är nya inom skelettvävnadsforskning. Fler egenskaper hos skelettsystemet berörs dock för ytterligare studier, såsom mekanisk egenskap25. Och vi måste alltid hålla ögonen på utvecklingen av nya tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar prof. Weiguo Zou och S. Kato för reagenser och möss och medlemmarna i Zou-laboratoriet för användbara diskussioner. Vi tackar också laboratoriet för digitaliserad stomatologi och forskningscenter för kraniofacial anomalier i Shanghai Nionde folkets sjukhus för hjälp. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, SHIPM-mu-fonden från Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Nine People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], incitamentsprojektet för innovation på hög nivå för Shanghai Jiao Tong University School of Medicine , Den tvärvetenskapliga forskningsfonden i Shanghai Nine People's Hospital, Shanghai JiaoTong university School of Medicine [JYJC201902]. Och L.J. är en forskare i Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program och "Chen Xing" -projektet från Shanghai Jiaotong University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J.
- Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
- Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
- Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
- Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
- Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
- Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
- Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
- Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
- Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
- Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
- Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
- Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
- Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
- Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
- Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
- Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).
