조건부 Stat3 삭제 마우스 모델의 골격 표현형 분석
Summary
이 프로토콜은 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 이해하는 정식 방법을 설명합니다. 이 방법은 형질 형형과 일부 표준 기술을 사용하여 골격 표현형을 분석합니다.
Abstract
트랜스제닉 마우스 모델은 골세포 분화 및 활동을 제어하는 중요한 유전자를 이해하고 골다공증의 메커니즘 및 제약 치료를 연구하는 데 강력합니다. 카테핀 K (Ctsk)-Cre 마우스는 골세포의 기능적 연구에 널리 사용되어 왔다. 전사 3(STAT3)의 신호 변환기 및 활성화기는 뼈 항상성에서 관련이 있지만 생체 내의 골막세포에서의 역할은 제대로 정의되지 않습니다. STAT3가 골세포 분화 및 뼈 대사에 참여한다는 생체 내 증거를 제공하기 위해, 우리는 골세포별 Stat3 삭제 마우스모델(Stat3 fl/fl;; Ctsk-Cre)및 골격 표현형을 분석하였다. 마이크로 CT 스캐닝 및 3D 재구성은 조건부 녹아웃 마우스에서 골질량을 증가시묵화하였다. H&E 염색, 칼세인 및 알리자린 레드 더블 염색, 타르타르트 내성 산 인산인산(TRAP) 염색이 뼈 대사를 검출하기 위해 수행되었다. 요컨대, 이 프로토콜은 골격 표현형을 분석하고 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 연구하기 위해 몇 가지 표준 방법과 기술을 설명합니다.
Introduction
골격 뼈는 인체의 주요 하중 베어링 기관이며 걷기 및 운동 중 내부 및 외부 환경 모두에서 압력을 받고있다 1. 평생 동안 뼈는 계속해서 자체 재생을 거치며, 이는 골세포와 골세포에 의해 균형을 이룹니다. 새로운 뼈를 형성하는 오래된 뼈와 골세포를 지우는 골세포의 과정은 골격 시스템2의항상성 및 기계적 기능을 유지한다. 균형에 장애가 골다공증과 같은 뼈 대사 질환을 유발할 수 있습니다. 골다공증은 과도한 골세포 활성으로 인해 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 사회2,3,4에상당한 경제적 손실을 초래합니다. 골다공증 치료에 사용할 수 있는 약물의 제한된 수와 부작용의 그들의 위험4에따르면, 골다세포 형성 및 활동의 세부 사항을 공개 하는 것이 중요 하다.
단핵세포/대식세포 조혈 계보로부터 유래된 골세포는 다중 핵(2~50개의 핵을 가질 수 있음)을 가지며 큰(보통 직경 100 μm 이상)2. 기전의 탐구와 골세포 질환에 대한 약물의 검열은 체외 골세포 문화를 통해 널리 개선되었지만, 복잡한 유기 반응은 표적 치료에 필수적불가결한 생체 내 증거를 만듭니다. 마우스와 인간 사이의 유전적 및 병리학적 유사성으로 인해, 유전자 조작 마우스 모델은 일반적으로 생체 내에서 인간 질환의 메커니즘 및 약제 학적 치료를 연구하는 데 사용된다6. Cre-loxP 시스템은 마우스 유전자 편집을 위해 널리 사용되는 기술이며 연구자들이 조직/세포 별 방식으로 유전자 기능을 조사할 수 있게 해 주었다5. 카테프신 K(CSTK)는 골콜라겐8을저하시킬 수 있는 골세포에 의해 분비된 시스테인 프로테아제이다. CTSK가 성숙한 골세포에서 선택적으로 표현된다는 것은 잘 받아들여진다. 따라서, Ctsk-Cre 마우스는 골세포에 대한 기능적 연구를 위한 유용한 도구로 간주되고6.
전사(STAT) 제품군의 신호 트랜스듀서 및 활성화기는 면역 및 암 진행 및 개발7,8에서고전적으로 매우 유의하다. 7개의 STAT 중 STAT3는 뼈 항상성9,10과가장 관련이 있는 것으로 보고됩니다. 여러 생체 내 연구는 골세포에서 STAT3의 특정 불활성화가 뼈 형성9,10을감소시키는 것으로 보고되었다. 그럼에도 불구 하 고, osteoclast 형성및 생체 내 뼈 대사에 STAT3의 참여에 관한 확실한 증거는 여전히 제한. 최근에는 osteoclast-특정 Stat3 삭제 마우스모델(Stat3fl/fl;)과함께 생체 내 증거를 제공했습니다. Ctsk-Cre, 이하 Stat3Ctsk)라고불리는STAT3는 골세포 분화 및 뼈대사(11)에참여한다. 본 연구에서는, 뼈 집상성에 대한 골세포별 STAT3 삭제의 영향을 연구하기 위해 Stat3Ctsk 마우스의 뼈 질량, 뼈 조직화 및 뼈 분석및 이화작용의 변화를 분석하는 데 사용한 방법과 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유전자 조작 마우스 모델은 일반적으로 인간 질환의 메커니즘 및 약제 학적 치료를 연구하는 데사용된다(13). Ctsk-Cre 마우스는 골세포6의기능적 연구에 널리 사용되어 왔다. 본 연구는 골격 표현형을 분석하고 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 연구하는 방법의 프로토콜을 설명했다.
조직학적 분석은 뼈 대사를 감…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 시약과 마우스와 Zou 실험실의 구성원에 대한 Weiguo Zou 교수와 S. 카토 교수에게 감사유용한 토론을. 우리는 또한 상하이 아홉 번째 인민 병원의 두개 안면 이상을위한 디지털화 된 Stomatology 및 연구 센터에 대한 실험실에 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립자연과학재단(NSFC)[81570950,81870740,81800949]의 보조금으로 부분적으로 지원되었다. 상하이 서밋 & 고원 분야, 상하이 정밀 의학 연구소, 상하이 9인조 병원, 상하이 자오동 의과대학 [JC201809], 상하이 자오동 대학 의과대학 고원혁신팀 인센티브 프로젝트 상하이 제9인민병원 상하이자오퉁대학교의 학과 [JYJC201902]의 종합연구기금. L.J.는 우수 청소년 의료 인재, 상하이 “의학 재능의 떠오르는 별” 청소년 개발 프로그램 및 상하이 자오퉁 대학의 “첸 싱” 프로젝트의 학자입니다.
Materials
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
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