Skelett fenotyp analys av en villkorlig Stat3 borttagning mus modell
Summary
Detta protokoll beskriver en kanonisk metod för att förstå de kritiska gener som kontrollerar osteoclast verksamhet in vivo. Denna metod använder en transgen musmodell och vissa kanoniska tekniker för att analysera skelettet fenotyp.
Abstract
Transgena musmodeller är kraftfulla för att förstå de kritiska gener som styr osteoklas differentiering och aktivitet, och för att studera mekanismer och farmaceutiska behandlingar av osteoporos. Cathepsin K (Ctsk)-Cre möss har använts i stor utsträckning för funktionella studier av osteoklaster. Signalgivaren och aktivatorn för transkription 3 (STAT3) är relevant i benhomeostas, men dess roll i osteoclasts in vivo förblir dåligt definierad. För att tillhandahålla in vivo-bevis för att STAT3 deltar i osteoklas differentiering och benmetabolism genererade vi en osteoklaste specifik Stat3-borttagningsmusmodell (Stat3 fl / fl ; Ctsk-Cre) och analyserade sin skelett fenotyp. Micro-CT skanning och 3D återuppbyggnad underförstådd ökad ben massa i villkorade knockout möss. H&E färgning, calcein och alizarin röd dubbel färgning och tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) färgning utfördes för att upptäcka ben metabolism. Kort sagt, detta protokoll beskriver vissa kanoniska metoder och tekniker för att analysera skelettet fenotyp och att studera de kritiska gener som kontrollerar osteoclast verksamhet in vivo.
Introduction
Skelettben är människokroppens huvudsakliga bärande organ och är under tryck från både den inre och yttre miljön under gång och träning1. Under hela sitt liv går ben kontinuerligt igenom självförnyelse, som balanseras av osteoblaster och osteoklaster. Processen med osteoklaster som rensar gamla ben och osteoblaster som bildar nytt ben upprätthåller homeostas och mekanisk funktion i skelettsystemet2. Störningar i balansen kan inducera benmetabola sjukdomar, såsom osteoporos. Osteoporos, som orsakas av överdriven osteoklastisk aktivitet, är globalt utbredd och orsakar betydande ekonomiska förluster församhället 2,3,4. Enligt det begränsade antalet läkemedel som finns tillgängliga för osteoporosbehandling och deras risk för biverkningar4, är det viktigt att avslöja detaljerna om osteoklasbildning och aktivitet.
Osteoklaster som härrör från den monocyt/makrofag hematopoetiska härstamningen har flera atomkärnor (kan ha 2 till 50 atomkärnor) och är stora (vanligtvis större än 100 μm i diameter)2. Även om utforskningen av mekanismer och screening av läkemedel för osteoklastiska störningar har förbättrats kraftigt via in vitro osteoclast kultur, de komplicerade organiska reaktionerna gör in vivo bevis oumbärliga för den riktade terapin. På grund av genetiska och patofysiologiska likheter mellan möss och människor används genetiskt konstruerade musmodeller ofta för att studera mekanismerna och läkemedelsbehandlingarna av mänsklig sjukdom in vivo6. Cre-loxP-systemet är en allmänt använd teknik för musgenredigering och har gjort det möjligt för forskare att undersöka genfunktioner på ett vävnads-/cellspecifikt sätt5. Cathepsin K (CSTK) är en cysteinproteas utsöndrad av osteoklaster som kan bryta ner benkollage8. Det är väl accepterat att CTSK uttrycks selektivt i mogna osteoklaster; Därför anses Ctsk-Cre möss vara ett användbart verktyg för funktionella studier av osteoklaster och har använts6.
Signalgivaren och aktivatorn av transkription (STAT) familjen är klassisk och mycket signifikant i immunitet och cancer progression och utveckling7,8. Bland sju STATs rapporteras STAT3 vara den mest relevanta för benhomeostas9,10. Flera in vivo-studier har rapporterat att specifik inaktivering av STAT3 i osteoblaster minskarbenbildningen 9,10. Fasta bevis för stat3 deltagande i osteoklas bildas och benmetabolism in vivo är dock fortfarande begränsad. Nyligen tillhandahöll vi in vivo-bevis med en osteoklaslastspecifik Stat3-borttagningsmusmodell (Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, härefter kallat Stat3Ctsk) det STAT3 deltar i osteoclast differentiering och benmetabolism11. I den aktuella studien beskriver vi de metoder och protokoll som vi använde för att analysera förändringarna i benmassa, ben histomorfologi och ben anabola och katabolism av Stat3Ctsk möss för att studera påverkan av osteoclast-specifika STAT3 borttagning på ben homeostas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetiskt konstruerade musmodeller används ofta för att studera mekanismen och läkemedelsbehandlingen av mänsklig sjukdom13. Ctsk-Cre möss har använts i stor utsträckning för funktionella studier av osteoklaster6. I den aktuella studien beskrivs protokollen till metoderna för att analysera skelettet fenotyp och för att studera de kritiska gener som styr osteoklaste aktivitet in vivo.
Histologisk analys är den bästa intuitiva …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar prof. Weiguo Zou och S. Kato för reagenser och möss och medlemmarna i Zou-laboratoriet för användbara diskussioner. Vi tackar också laboratoriet för digitaliserad stomatologi och forskningscenter för kraniofacial anomalier i Shanghai Nionde folkets sjukhus för hjälp. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, SHIPM-mu-fonden från Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Nine People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], incitamentsprojektet för innovation på hög nivå för Shanghai Jiao Tong University School of Medicine , Den tvärvetenskapliga forskningsfonden i Shanghai Nine People’s Hospital, Shanghai JiaoTong university School of Medicine [JYJC201902]. Och L.J. är en forskare i Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai “Rising Stars of Medical Talent” Youth Development Program och “Chen Xing” -projektet från Shanghai Jiaotong University.
Materials
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
- Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), 243-246 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
- Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
- Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
- Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
- Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
- Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
- Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
- Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
- Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
- Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
- Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
- Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
- Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
- Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
- Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
- Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).
