Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

Kas glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, tüm vücut glikoz homeostazını korumak için önemlidir. Bu protokol, çeşitli fizyolojik müdahalelerin tüm vücut glikoz metabolizması üzerindeki etkisini tanımlarken, izole ve inkübe edilmiş olgun iskelet kasında insülin ve kontraksiyonla uyarılmış glikoz alımının değerlendirilmesini sunar.

Abstract

İskelet kası insüline duyarlı bir dokudur ve tipik olarak bir yemekten sonra kana giren glikozun çoğunu alır. Ayrıca, iskelet kasının egzersiz sırasında kandan glikoz ekstraksiyonunu dinlenme koşullarına kıyasla 50 kata kadar artırabileceği bildirilmiştir. Egzersiz ve insülin stimülasyonu sırasında kas glukoz alımındaki artış, glikoz taşıyıcı 4'ün (GLUT4) hücre içi bölmelerden kas hücresi yüzey zarına translokasyonuna ve ayrıca glikozun heksokinaz II tarafından glikoz-6-fosfata fosforilasyonuna bağlıdır. M. soleus ve m . extensor digitorum longus (EDL) gibi fare kaslarının izolasyonu ve inkübasyonu, insülin ve elektriksel olarak indüklenen kontraksiyonun (egzersiz için bir model) olgun iskelet kasında glikoz alımı üzerindeki etkilerini incelemek için uygun bir ex vivo modeldir. Böylece, ex vivo model, kas insülin duyarlılığının değerlendirilmesine izin verir ve kas glikoz alımının ölçümleri sırasında kas liflerinin düzgün bir şekilde alınmasını sağlayan kasılma sırasında kas kuvveti üretimini eşleştirmeyi mümkün kılar. Ayrıca, tarif edilen model, kas insülin duyarlılığı üzerinde etkisi olabilecek veya iskelet kası glikoz alımının düzenleyici karmaşıklığını tanımlamaya çalışırken yardımcı olabilecek farmakolojik bileşik testi için uygundur.

Burada, hücre dışı bir belirteç olarak radyoetiketli [3H]2-deoksi-D-glukoz ve [14C] mannitol kullanılarak farelerden izole edilmiş ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kas preparatlarında insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımının nasıl ölçüleceğine dair ayrıntılı bir protokol açıklıyor ve sunuyoruz. Bu, olgun iskelet kasındaki glikoz alımının, bozulmamış hayvan modeline müdahale edebilecek kafa karıştırıcı faktörlerin yokluğunda doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Ek olarak, inkübe edilmiş fare iskelet kasının metabolik canlılığı hakkında bilgi veriyoruz, bu da uygulanan yöntemin kas enerjisi metabolizmasını incelerken belirli koşullar altında bazı uyarılara sahip olduğunu düşündürmektedir.

Introduction

İskelet kası, insülin ve egzersize yanıt olarak hücre dışı boşluktan büyük miktarlarda glikoz çıkarma yeteneğine sahiptir. Bu, tüm vücut glikoz homeostazının korunmasına yardımcı olur ve yüksek enerji talebi zamanlarında glikoz arzını güvence altına alır. İskelet kası glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesinin genel sağlık ve fiziksel performans için önemli olduğu gösterildiğinden1,2, çeşitli koşullar sırasında kas glikozu alımının ölçümleri çok dikkat çekmiştir. İnsanlarda ve hayvanlarda, hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe, insülin duyarlılığını in vivo 3,4 değerlendirmek için altın standart teknik olarak kullanılmıştır. Oral glukoz tolerans testinden elde edilen bulguların aksine, hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe tekniği sağlam gastrointestinal fonksiyon veya pankreastan insülin sekresyonu gerektirmez ve bu nedenle insülin yanıtlarının gastro-intestinal ve / veya pankreas fonksiyonunda farklılıklar gösteren denekler arasında karşılaştırılmasına izin verir. İnsanlarda egzersiz sırasında in vivo kas glukozu alımının ölçümleri 1960'lardan beri sıklıkla yapılmaktadır5. İlk önce arteriyovenöz denge teknikleri6 kullanılarak ve daha sonra pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntülemenin pozitron yayan glikoz analoğu ile kombinasyon halinde kullanılmasıyla, örneğin 18F-Floro-deoksi-glukoz7. Kemirgenlerde, egzersizle uyarılan kas glukoz alımı in vivo olarak radyoaktif veya stabil izotop etiketli glikoz analogları 8,9,10 kullanılarak gerçekleştirilir.

Kas glukoz alımının in vivo ölçümlerine tamamlayıcı bir yöntem, küçük kasları kemirgenlerden izole etmek ve inkübe etmek ve daha sonra radyoaktif veya stabil izotop etiketli glikoz analogları11,12,13 kullanarak glikoz alımını ölçmektir. Bu yöntem, olgun iskelet kasında glikoz alım oranlarının doğru ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar ve çeşitli insülin konsantrasyonlarının varlığında ve elektriksel stimülasyonun neden olduğu kontraksiyon sırasında gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, izole edilmiş ve inkübe edilmiş iskelet kasında glikoz alımının ölçümleri, çeşitli müdahalelere (örneğin beslenme, fiziksel aktivite, enfeksiyon, terapötikler) maruz kalan farelerin kas metabolik fenotipini araştırırken önemlidir. İzole iskelet kası modeli aynı zamanda glikoz alımını kendi başına etkileyebilecek ve / veya insülin duyarlılığını değiştirebilecek farmakolojik bileşik testi için uygun bir araçtır12,14. Bu şekilde, kas glukoz metabolizmasını düzenlemek için tasarlanmış bileşiklerin etkinliği, klinik öncesi hayvan modellerinde daha sonra in vivo testlerden önce oldukça kontrollü bir ortamda test edilebilir ve değerlendirilebilir.

Bazı koşullar altında, metabolik canlılık, izole edilmiş ve inkübe edilmiş iskelet kası model sisteminde bir zorluk oluşturabilir. Gerçekten de, inkübe edilmiş kaslarda dolaşım sisteminin olmaması, substratların (örneğin oksijen ve besinler) verilmesinin tamamen kas lifleri ve çevresindeki ortam arasındaki basit difüzyona bağlı olmasını gerektirir. Bununla ilgili olarak, inkübe edilen kasların küçük ve ince olması ve bu nedenle inkübasyon sırasında oksijen difüzyonu için daha az bariyer oluşturması önemlidir15. Özellikle birkaç saat boyunca uzun süreli inkübasyonlar sırasında, kas enerjisinin tükenmesine neden olan yetersiz oksijen kaynağı nedeniyle hipoksik durumlar gelişebilir15. Her ne kadar inkübe edilmiş sıçan kasında metabolik canlılığın çeşitli belirteçleri, sıçan kas canlılığının korunmasına yardımcı olan önemli değişkenlerin tanımlanmasının yanı sıra daha önce bildirilmiş olsa da,15, küçük inkübe fare kaslarında metabolik canlılığın kapsamlı bir değerlendirmesi hala garanti edilmektedir. Bu nedenle, şu anda, glikojen içeriği esas olarak inkübe edilmiş fare iskelet kası16,17'de metabolik canlılığın bir belirteci olarak kullanılmıştır.

Burada, hücre dışı bir belirteç olarak radyoetiketli [3H]2-deoksi-D-glukoz ve [14C] mannitol kullanılarak farelerden izole edilmiş ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kasında bazal, insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için ayrıntılı bir protokol tanımlamaktayız. Bu çalışmada, glukoz alımı 10 dakikalık bir süre boyunca ölçülmüş ve yöntem, submaksimal ve maksimal etkili insülin konsantrasyonlarının yanı sıra tek bir kasılma protokolü kullanılarak sunulmuştur. Bununla birlikte, burada açıklanan protokoller inkübasyon süresi, insülin dozu ve elektriksel stimülasyon protokolü açısından kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, inkübe soleus ve EDL fare kasında metabolik canlılığın çeşitli belirteçlerinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlıyoruz. Sonuçlar, inkübasyon tamponuna glikoz takviyesinin, 1 saat boyunca inkübe edilen kasın metabolik canlılığını korumak için gerekli olduğunu göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Araştırma hayvanlarını içeren prosedürler, ilgili kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Bu çalışma için kullanılan tüm hayvan deneyleri, Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar için kullanılan Omurgalı Hayvanların Korunmasına İlişkin Avrupa Sözleşmesi'ne uygun ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği tarafından onaylanmıştır.

1. Deney aparatlarının ve dikiş ilmeklerinin hazırlanması

NOT: Bu çalışma için, izole edilmiş fare iskelet kaslarını inkübe etmek için özelleştirilmiş inkübasyon kancalarına sahip entegre bir kas şeridi miyograf sistemi kullanın (Şekil 1). Bu sistem, kasın sürekli oksijenasyon (% 95O2 ve% 5 CO2) ve sabit sıcaklıkta fizyolojik bir çözelti içinde yıkanmasını sağlar. Kas dokusu banyosu, kasılma sırasında kas kuvveti üretiminin ölçülmesi için bir kuvvet dönüştürücüsüne bağlanır. Kasılma sırasında miyo-mekanik tepkileri ortaya çıkarmak ve kaydetmek için, sırasıyla bir elektrik darbe uyarıcısı ve bir veri toplama programı kullanın. Kuluçkaya yatırılan kasları, merkezi olarak ve kasın her iki tarafına yerleştirilmiş platin elektrotlarla kasılmaya teşvik edin.

  1. Miyograf sistemini ve sıcak odaları 30 ° C'ye kadar açın. Miyograf sistemi ile uyumlu açık veri toplama yazılımı ve veri kümeleri arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için kuvvet dönüştürücüleri kalibre edin.
  2. Emilemeyen cerrahi naylon süürün ~16 cm'lik tellerini keserek başlayın. Tek bir iplikçikten yaklaşık 0,4 cm çapında bir döngü oluşturmak için forseps kullanın. Yeterli döngü üretilene kadar bunu tekrarlayın. Her kasın iki döngüye ihtiyacı vardır - biri proksimal ve diğeri distal tendon için.

2. Çözeltilerin ve inkübasyon ortamının hazırlanması

  1. Bazal inkübasyon ortamının hazırlanması
    1. Aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlayın: 2,5 M sodyum klorür (NaCl, 250 mL), 0,5 M sodyum bikarbonat (NaHCO3, 250 mL), 0,5 M potasyum klorür (KCl, 50 mL), 0,25 M kalsiyum klorür (CaCl 2, 50 mL), 0,25 M potasyum dihidrojen fosfat (KH2 PO 4, 50 mL), 0,25 M magnezyum sülfat (MgSO4, 50 mL), 110 mM sodyum piruvat (Na-Piruvat, 100 mL), 500 mM D-mannitol (100 mL), 1 M 2-deoksi-D-glikoz (4 mL), Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) tamponuna karşı diyalize edilmiş% 15 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi (aşağıda adım 4'te açıklanmıştır) (100 mL).
      NOT: İstirahat ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için iki çözüm gereklidir. Ayrıca, insülin ile uyarılmış glikoz alımını değerlendirmek için kullanılan her bir insülin konsantrasyonu iki çözüm gerektirir. Bu nedenle, izole fare iskelet kasında bazal, submaksimal insülin, maksimal insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için toplam altı farklı çözeltiye ihtiyaç vardır. Aşağıda, 'bazal inkübasyon ortamı', insülin veya radyoaktif izleyicileri olmayan ortamları ifade eder. 'İnkübasyon ortamı' insülin içeren medyayı ifade eder. 'Glikoz alım inkübasyon ortamı', 'inkübasyon ortamında' kullanılanla aynı konsantrasyonda insüline ek olarak 2-deoksi-D-glikoz ve radyoaktif izleyiciler içeren medyayı ifade eder.
    2. Ultra saf suyu (ddH 2 O) NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl 2 (2,5 mM), KH 2 PO 4 (1,2mM) ve MgSO4 (1,2mM) ile destekleyerek bir KRH tamponu hazırlayın. Daha sonra, KRH tamponunu en az 10 dakika boyunca% 95O2 ve% 5 CO2 ile gazlayın. KRH tamponunun istenen pH'ı 30 °C'de 7,35-7,45 arasında olmalıdır. pH ayarı oda sıcaklığında yapılırsa, KRH tamponunun pH'ı 7.25-7.35 arasında olmalıdır.
    3. Bazal inkübasyon ortamını tamamlamak için gazlı ve pH ayarlı KRH tamponuna BSA (% 0.1), Na-Piruvat (2 mM) ve D-mannitol (8 mM) ekleyin. O2 ve CO2'nin gazdan arındırılmasını en aza indirmek için bazal inkübasyon ortamını kapalı bir kapta saklayınve ortamı 30 °C'ye yerleştirin.
      NOT: Tipik olarak, KRH takviyelerinin ozmolaritesi (yani Na-Piruvat, D-Mannitol ve D-glikoz), kas hücrelerinin büzülmesini veya genişlemesini önlemek için tüm deney boyunca sabit tutulur. Burada açıklanan protokol, KRH takviyeleri için 10 mM'lik bir ozmolarite kullanır. Glikoz içeren bir tampona ihtiyaç duyulursa, ihtiyaçları karşılamak için KRH takviyelerini değiştirin, örneğin 5 mM D-glikoz ve 5 mM D-mannitol.
    4. Kuluçka tamponunda BSA ile ilişkili olası kirleticileri önlemek için, BSA'yı KRH'ye karşı çevirin.
      1. KRH tamponuna karşı diyalize edilmiş %15'lik bir BSA stok çözeltisi yapmak için, 300 g analitik sınıf yağsız BSA'yı 900 mL KRH tamponunda çözerek başlayın. Daha sonra, diyaliz tüpünü, boru yumuşayana kadar yeniden damıtılmış suda kaynatın.
      2. Boruyu BSA-KRH çözeltisi ile doldurun ve boru uçlarını sabitleyin. BSA-KRH ile boruyu 5 L KRH tamponuna yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de bırakın. Ertesi gün KRH tamponunu değiştirin ve boruyu BSA-KRH ile birlikte 4 ° C'de gece boyunca KRH tamponunda bırakın.
      3. Son olarak, BSA-KRH çözeltisini borudan toplayın ve KRH tamponunu 2 L'lik bir son hacme ekleyin (yani,% 15 BSA-KRH stok çözeltisi). %15 BSA-KRH stok çözeltisini alikotlara bölün ve ~-20 °C'de dondurucuda saklayın.
  2. İnsülin içeren inkübasyon ortamının hazırlanması
    1. Submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonu içeren inkübasyon ortamı için, bazal inkübasyon ortamının mL'si (100 μU / mL insülin) başına 100 mU / mL insülin stok çözeltisinden 1 μL ekleyin.
    2. Maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu içeren inkübasyon ortamı için, bazal inkübasyon ortamının mL'si (10 mU / mL insülin) başına 10 U / mL insülin stok çözeltisinden 1 μL ekleyin.
  3. Glikoz alım inkübasyon ortamının hazırlanması
    DİKKAT: Radyoaktif maddelerin taşınmasına sadece yetkili personel tarafından kısıtlı ve kontrollü bir alanda izin verilmekte olup, bazı üniversiteler, araştırma kurumları ve şirketler "Radyoaktivite Kullanım İzni" alınmasını talep edebilir. Malzeme ve atıklar uygun yerel prosedürlere, yönergelere ve mevzuata göre ele alınmalıdır.
    1. Bölüm 2.1.2'de açıklanan prosedürün aynısını uygulayın.
    2. Gazlı ve pH ayarlı KRH tamponuna BSA (% 0.1), Na-Piruvat (2 mM), D-mannitol (7 mM) ve 2-deoksi-D-glikoz (1 mM) ekleyin.
    3. Glikoz alım inkübasyon ortamını tamamlamak için takviye edilen KRH tamponuna [3H]2-deoksi-D-glukoz (0.028 MBq/mL) ve [14C]mannitol (0.0083 MBq/mL) ekleyin. 30 °C'de saklayın. [3H]2-deoksi-D-glukoz ve [14C]mannitol etanol içinde çözülürse, kullanımdan önceN2 aracılı buharlaşma ile etanol çıkarılır.
    4. Submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonu içeren glikoz alım inkübasyon ortamı için, mL glikoz alım inkübasyon ortamı (100 μU / mL insülin) başına 1 μL 100 mU / mL insülin stok çözeltisi ekleyin.
    5. Maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu içeren glikoz alım inkübasyon ortamı için, mL glikoz alım inkübasyon ortamı (10 mU / mL insülin) başına 10 U / mL insülin stok çözeltisinden 1 μL ekleyin.

3. Hayvanlar ve kuluçka için fare soleus ve EDL kasının diseksiyonu

NOT: Araştırma hayvanlarını içeren prosedürler, ilgili kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Tarif edilen prosedür, çeşitli suşlara ve genetik geçmişlere sahip, şirket içinde yetiştirilmiş veya ticari olarak temin edilebilen erkek ve dişi farelerle kullanılabilir. Beslenen dişi C57Bl/6J fareler için aşağıdaki prosedür sağlanmıştır. Ortalama olarak, fareler 19 haftalıktı ve 25 g ağırlığındaydı. Fareler, standart kemirgen chow ve suya serbest erişim ile 12: 12 saatlik bir açık-karanlık döngüsünde tutuldu. Hayvan deneyleri yerel saatle 09:00'da başlatıldı ve tüm hayvanlar 2 saatlik bir süre içinde kurban edildi.

  1. Her bir inkübasyon odasına 4 mL önceden ısıtılmış (30 ° C) bazal inkübasyon ortamı ekleyin ve bazal inkübasyon ortamının% 95O2 ve% 5 CO 2 ile sürekli oksijenlendiğinden eminolun.
  2. Fareleri intraperitoneal pentobarbital enjeksiyon (10 mg / 100 g vücut ağırlığı) veya diğer mevcut anestezi (örneğin tribromoetanol) ile anestezi altına alın.
    NOT: Bazı ülkelerde pentobarbital ve diğer anestezik ilaçları kullanmak için bir lisansın gerekli olabileceğini unutmayın. Kas diseksiyonu başlatılmadan önce, her hayvanın anestezisi uygun şekilde indüklenmelidir. Bunu sağlamak için kuyruk ve bacak refleksleri test edilir. En iyi sonuçlar için, çıkarma sırasında kaslara zarar vermemek için diseksiyon iyi uygulanmalıdır.
  3. Anesteziye eğilimli fareleri bir diseksiyon tepsisine (örneğin strafor kapak) yerleştirin ve gerektiğinde bir iğne kullanarak ön ve arka pençeleri sabitleyin.
  4. Cildi alt bacaktan çıkarın ve hem Aşil tendonunun hem de diz ekleminin görünür olduğundan emin olun.
    1. Soleus kasının diseksiyonu için, Aşil tendonuna tek bir dikiş halkası bağlayarak başlayın. Dikiş döngüsünün distal olarak Aşil tendonuna bir bezelye forseps sabitleyin ve soleus ve gastroknemius kaslarını pençeden serbest bırakmak için kesin. Bezelye forsepslerini fare boyunca dikkatlice kaydırın, böylece soleus kasını açığa çıkarın.
    2. Bezelye forsepslerini sabitleyin ve soleus kasının proksimal tendonunun etrafına ikinci bir dikiş halkası yerleştirin. Daha sonra, proksimal tendonu kesin ve soleus'u (bağlı iki dikiş halkası dahil) gastroknemius kasından arındırılmış olarak disseke edin. Her bir dikiş halkasını ilgili kancalara bağlayarak soleus kasını inkübasyon odasına hızlı bir şekilde yerleştirin.
  5. Forseps kullanarak m. tibialis anterior (TA) kaplayan fasyayı çıkarın. Doğru yapılırsa, TA ve EDL kaslarının distal tendonları açık beyaz ve görünür olmalıdır; ve birbirinden ayrıldı.
  6. TA kasının distal tendonunu kesin ve daha sonraki analizler için kası diseke edin (örneğin genotipleme). Forseps kullanarak, EDL kasını çevreleyen dokulardan nazikçe serbest bırakın, ancak kası sağlam bırakın ve tendonları kesmeyin. Distal tendonun etrafına bir sütür döngüsü ve EDL'nin proksimal tendonunun etrafına ikinci bir sütür döngüsü yerleştirin.
  7. Daha sonra, EDL kasını serbest bırakan tendonları iki bağlı dikiş ilmeği ile kesin ve her bir dikiş halkasını ilgili kancalara bağlayarak kası inkübasyon odasına hızlı bir şekilde yerleştirin. Kuluçka sırasında ve özellikle soleus ve EDL kaslarının elektriksel olarak indüklenen kasılması sırasında gerginliği kaybetmemek için, tendonların etrafındaki dikiş halkalarının sıkı düğümlerle sabitlenmesi büyük önem taşımaktadır.
  8. Son olarak, hayvanı örneğin servikal çıkık ile ötenazileştirin.
  9. Kaslar diseke edildiğinde ve inkübasyon odalarına yerleştirildiğinde, her kasın dinlenme gerginliğini ~ 5 mN'ye ayarlayın ve deneysel protokolü başlatmadan önce kasları en az 10 dakika önceden inkübe edin.

4. İzole fare iskelet kasında insülin ile uyarılmış glikoz alımı

  1. Adım 3.9'u takiben, bazal inkübasyon ortamını insülin içermeyen (bazal inkübasyon ortamı), submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonu veya maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu içeren inkübasyon ortamı ile değiştirin ve 20 dakika boyunca inkübasyon odalarında bırakın. Her inkübasyon odasını 1 dakika ayırın, böylece kasların sonraki hasadı için zaman kazanın.
  2. 20 dakikalık stimülasyon süresinin sonunda, inkübasyon ortamını aynı konsantrasyonda insülin içeren glikoz alım inkübasyon ortamı ile değiştirin ve yine her bir inkübasyon odası arasında 1 dakikalık boşluk bırakarak 10 dakika boyunca inkübasyon odalarında bırakın.
  3. Glikoz alım inkübasyon ortamında 10 dakikalık inkübasyondan sonra, inkübasyon odalarındaki kasları nazikçe çıkarın ve buz gibi soğuk bazal inkübasyon ortamında yıkayın. Daha sonra, dikiş halkaları çıkarılmadan ve kaslar sıvı azotta dondurulmadan önce kasları filtre kağıdı üzerinde hızla kurulayın. Glikoz alımına ek olarak çeşitli hücre içi metabolitleri ve protein sinyallerini araştırmak isteniyorsa, inkübe edilmiş kasların hızlı bir şekilde toplanması zorunludur.
  4. Her inkübasyon odasından glikoz alım inkübasyon ortamının 100 μL'sini toplayın ve -20 ° C'de saklayın. Bu örneklerdeki radyoaktivite miktarı, kas glikoz alımının hesaplanmasına dahil edilecektir.

5. İzole fare iskelet kasında kasılma ile uyarılmış glikoz alımı

NOT: İzole edilmiş fare iskelet kasının kasılmasını indüklemek için aşağıdaki protokolü kullanın: 1 tren / 15 s, her tren 1 s uzunluğunda 100 Hz'de verilen 0,2 ms darbelerden oluşur. Bununla birlikte, izole edilmiş fare iskelet kasının kasılmasını sağlayan diğer benzer protokoller de muhtemelen işe yarayacaktır. Önemli olarak, voltaj, deney düzeneğine bağlı olan inkübe edilmiş kasın maksimum kuvvet gelişimini sağlamak için ayarlanmalıdır. Bu sağlanmazsa, kasın tüm liflerinin kasılmaması riskini taşıyabilirsiniz. Buna karşılık, bu veri kümesinde önyargıya neden olabilir.

  1. 3.9 adımını takiben, platin elektrotları merkezi olarak ve kasların her iki tarafına yerleştirin. Bazal inkübasyon ortamını glikoz alım inkübasyon ortamı ile değiştirdikten hemen sonra kasların kasılmasını başlatın. Mümkünse, her bir inkübasyon odasını 1 dakika ayırın, böylece kasların sonraki hasadı için zaman kazanın. Her inkübe edilmiş kastan kuvvet üretimini kaydetmeyi unutmayın.
  2. Glikoz alım inkübasyon ortamında 10 dakikalık kasılmadan sonra, platin elektrotları çıkarın, kasları inkübasyon odalarından yavaşça toplayın ve buz gibi soğuk bazal inkübasyon ortamında yıkayın. Daha sonra, dikiş halkaları çıkarılmadan ve kaslar sıvı azotta dondurulmadan önce kasları filtre kağıdı üzerinde hızla kurutun. Tüm kas hasadı prosedürü mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır.
  3. Her inkübasyon odasından glikoz alım inkübasyon ortamının 100 μL'sini toplayın ve -20 ° C'de saklayın. Bu örneklerdeki radyoaktivite miktarı, kas glikoz alımının hesaplanmasına dahil edilecektir.

6. İskelet kası homojenizasyonu ve işlenmesi

NOT: Kas homojenizasyonu için aşağıda verilen prosedür, aynı kas örnekleri setinde batı lekelenmesi ile hem glikoz alımını hem de miyosellüler sinyalizasyonu belirlemeyi mümkün kılar.

  1. Her bir kası, %10 gliserol, 20 mM sodyum-pirofosfat, %1 IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenilmetilsülfonilflorür (izopropanol içinde çözünmüş), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-gliserofosfat, 10 mM sodyum florür (NaF), 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1 mM glikoleteriamintetraasetik asit (EGTA), 10 μg/ml aprotinin içeren pH 7.5 ile 400 μL buz gibi soğuk tamponda homojenize edin, Çelik boncuklar ve bir dokusallaştırıcı (30 Hz'de 2 x 45 s) kullanılarak 10 μg / mL leupeptin, 3 mM benzamidin ve 2mM sodyum-ortovanadat kullanılır. Tüm homojenleri 4 °C'de 1 saat boyunca uçtan uca döndürün, ardından 4 °C'de 20 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj edilir. Kas glikoz alımını belirlemek için kullanılan lizatı (süpernatant) toplayın.

7. Radyoaktif işaretli 2-deoksiglukoz ve mannitol tayini

  1. 2 mL sıvı sintilasyon sıvısı içeren sıvı sintilasyon sayma şişelerini ayırmak için her bir kas lizatının 150 μL'sini ve her bir inkübasyon odasından glikoz alım inkübasyon ortamının 25 μL'sini ekleyin. Ayrıca, sadece 3 mL sıvı sintilasyon sıvısı içeren iki kör kontrol şişesi hazırlayın. Tüm şişeleri kapatın ve her şişeyi ~ 5 s boyunca vorteksleyerek iyice karıştırın.
  2. Şişeleri bir sıvı sintilasyon sayacına yerleştirin ve üreticinin yönergelerine göre [3H]2-deoksi-D-glikoz ve [14C] mannitolün radyoaktivitesini ölçün. Her sıvı sintilasyon şişesi için DPM'yi (dakika başına parçalanma) kaydedin.

8. Kas glukoz alım oranlarının hesaplanması

  1. Standart protein niceleme yöntemlerini (örneğin, Bicinchoninic acid veya Bradford tahlilleri) kullanarak her kas örneğindeki toplam protein konsantrasyonunu ölçmek için adım 6.1'den itibaren lizatı kullanın. Her bir sintilasyon şişesine eklenen protein miktarını (mg) hesaplayın.
    NOT: Her kas örneği için glikoz alım hızı, hücre dışı bir belirteç olarak [14C] mannitol kullanılarak kas numunesindeki toplam [3 H]2-deoksi-D-glikoz miktarından hücre dışı boşlukta bulunan [3H]2-deoksi-D-glikoz miktarının çıkarılmasıyla hesaplanır. [3H]2-deoksi-D-glukoz ve [14C]mannitolün inkübasyon sırasında kas dokusunda benzer difüzyon özellikleri sergilediği varsayılmaktadır. Aşağıdaki hesaplamaları gerçekleştirin:
  2. Tüm kas ve ortam örneklerinden kör denetim örneklerinin [3H] ve [14C] DPM'sini çıkararak başlayın.
  3. μL (μL-ECS) cinsinden kas hücre dışı boşluğunu belirleyin:
    [14C] DPMkası / ([14C]DPMortamı / Mvol)
  4. Kas hücre dışı alanındaki [3 H]DPM miktarını hesaplayın ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMortamı / Mvol)
  5. Kas hücre içi boşluğundaki [3 H]DPM miktarını hesaplayın ([3H]DPMICS):
    [3Saat] DPMkası− [3H]DPMECS
  6. Kas glikoz alım oranını hesaplayın (μmol / g protein / saat):
    [3Saat] DPMICS / ([3H]DPMortamı / Mvol) / [2-deoksi-D-glukoz])) / mg protein) / Th
    NOT: Yukarıdaki tüm denklemler için,
    [14C] DPMkası , bir kas örneğindeki [14C] mannitol radyoaktivitesinin miktarıdır;
    [14C] DPMmedyası , bir ortam örneğindeki [14C]mannitol radyoaktivite miktarıdır;
    [3Saat] DPMkası, bir kas örneğindeki [3H]2-deoksi-D-glukoz radyoaktivitesi miktarıdır;
    [3Saat] DPMortamı, bir ortam örneğindeki [3H]2-deoksi-D-glukoz radyoaktivitesi miktarıdır;
    [3Saat] DPMECS , kas hücre dışı boşluğundaki [3H]2-deoksi-D-glukoz radyoaktivitesi miktarıdır;
    [3Saat] DPMICS , kas hücre içi boşluğundaki [3H]2-deoksi-D-glukoz radyoaktivitesi miktarıdır;
    μL-ECS, μL'deki kas hücre dışı boşluğudur;
    Mvol , sintilasyon sayımı için kullanılan inkübasyon ortamının hacmidir (μL) (örneğin, yukarıda belirtildiği gibi '25');
    T h, saat başına alım oranlarını hesaplamak için kullanılan zaman faktörüdür (yani, kasları 10 dakika boyunca glikoz alım ortamı ile inkübe ederken '1/6')
  7. Bu örnek hesaplamayı dikkate alın. Kör denetim örneklerinin [3H] ve [14C] DPM'si (sırasıyla 17 ve 6) aşağıda belirtilen DPM değerlerinden çıkarılmıştır.
    [14C] DPMkası: 343
    [14C] DPMmedyası: 11846
    [3Saat] DPMkası: 4467
    [3Saat] DPMmedyası: 39814
    Mhacim: 25
    mg protein: 0.396 (150 μL kas proteini lizatında)
    [2-deoksi-D-glukoz]: 1 (mM)
    T h: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3Saat] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3Saat] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Glikoz alımı: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0.396 mg protein) / (1/6 saat) = 31.53 μmol / g protein / saat

9. SDS-PAGE ve western blot analizleri

  1. Laemmli tamponunda soleus ve EDL kas lizatları hazırlayın ve 96 ° C'de 5 dakika ısıtın.
  2. Kendinden dökümlü jeller üzerinde SDS-PAGE ile eşit miktarda kas proteinini ayırın ve proteinleri yarı kuru lekeleme ile poliviniliden florür membranlarına aktarın.
  3. Daha sonra, %0.05 Tween 20 ve %2 yağsız süt içeren Tris tamponlu salin içindeki membranları ve ilgili birincil ve ikincil antikorlara sahip prob membranlarını inkübe edin.
  4. Kemilüminesanslı proteinleri tespit edin ve dijital bir görüntüleme sistemi ile görselleştirin.

10. Kas glikojeni, nükleotitler, laktat, kreatin ve fosfokreatin

  1. EDL ve soleus kas örneklerini çıkarmak için perklorik asit kullanın.
  2. Daha sonra, numuneleri nötralize edin ve daha önce tarif edildiği gibi laktat, kreatin ve fosfokreatin için analiz edin18.
  3. EDL ve soleus kasındaki nükleotid içeriğini, perklorik asitte ekstraksiyonu takiben ters fazlı HPLC ile analiz edin.
  4. Daha önce tarif edildiği gibi florometrik bir yöntemle asit hidrolizinden sonra tüm kas homojenatındaki kas glikojen içeriğini glikozil birimleri olarak belirleyin18.

11. İstatistik

  1. İstatistiksel analiz yazılımı ile istatistiksel analizler gerçekleştirebilir.
  2. Tablo 1'de sunulan değerler arasındaki istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için iki yönlü bir varyans analizi (ANOVA) testi kullanın.
  3. Şekil 2'de sunulan her grupta EDL ve soleus arasındaki glikoz alımındaki istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için eşlenmemiş Student t testlerini kullanın. Verileri ortalamanın standart hatası (SEM) ± araç olarak sunmak. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2'de gösterildiği gibi, bazal glikoz alım oranları, dişi farelerden izole soleus ve EDL kası arasında benzerdi. Bu da12,13,19,20'den önce birkaç kez bildirilmiştir. Glikoz alımı, submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonuna (100 μU / mL) yanıt olarak, soleus ve EDL kasında sırasıyla 12 ve 9 μmol / g protein / s'ye ulaşan ~ 0.8 ve ~ 0.6 kat artmıştır. Bu artış, kaslar maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu (10 mU / mL) ile uyarıldığında daha da yüksekti (soleus ve EDL kasında sırasıyla 33 ve 19 μmol / g protein / s'ye ulaşan ~4 ve ~2 kat). Ayrıca, soleus kasında hem submaksimal hem de maksimal insülin ile uyarılmış glukoz alımının anlamlı derecede yüksek olması, soleus kasının EDL kasına kıyasla artmış insülin duyarlılığı ve yanıtı sergilediğini göstermektedir. Bu, glukoz taşıyıcı 4'ün (GLUT4) daha yüksek ekspresyonunun yanı sıra soleus kasındaki insülin sinyal dönüştürücü protein kinaz B'nin (Akt) EDL kası10,21,22,23,24'e kıyasla daha yüksek ekspresyonu ile ilişkili olabilir.

Kasılmaya bağlı glukoz alımı, EDL kasında soleus kasına kıyasla anlamlı derecede yüksekti (Şekil 2) ve daha önce 13,19'da da bildirilmiştir. Böylece, glikoz alımı, elektriksel olarak indüklenen kasılmalara yanıt olarak, soleus ve EDL kasında sırasıyla 14 ve 22 μmol / g protein / saate ulaşan ~ 2 ve ~ 2.5 kat artmıştır. Şekil 3, 10 dakikalık stimülasyon periyodu boyunca soleus ve EDL kasında maksimum kas kuvveti üretimini göstermektedir. Görüldüğü ve daha önce bildirilen19 gibi, EDL kası, stimülasyon periyodunun ilk bölümünde daha fazla kuvvet üretir (EDL'de 225 mN ve soleus'ta 150 mN). Öte yandan, EDL kası, stimülasyon döneminde daha sonra soleus kasına kıyasla kuvvet üretiminde daha hızlı bir düşüş gösterir. Bu bulgular muhtemelen soleus (tip 1 > tip 2) ve EDL (tip 2 > tip 1) kas25 arasındaki lif tipi dağılımındaki farktan kaynaklanmaktadır, çünkü tip 2 lifler tip 1 liflere kıyasla daha fazla kuvvet üretir, ancak daha hızlı yorulur26,27.

İzole soleus ve EDL kasında insülin ve kontraksiyonun hücre içi sinyalizasyon üzerindeki etkisini değerlendirmek için batı blotlama tekniği ile Akt Thr308, TBC1 domain ailesi üyesi 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 ve asetil-CoA karboksilaz (ACC) Ser212 fosforilasyonu yapılmıştır (Şekil 4). Beklendiği gibi, submaksimal ve maksimal etkili insülin konsantrasyonu, Akt Thr308 ve TBC1D4 Ser588'in fosforilasyonunda bir artışa neden olurken, kasılma AMPKα Thr172 ve ACC Ser212'nin fosforilasyonunda bir artışa neden oldu. Ne insülin ne de kasılma, soleus ve EDL kasında Akt2, TBC1D4, AMPKα2 ve ACC'nin toplam protein içeriğinde bir değişikliğe yol açmamıştır (Şekil 4).

Kuluçkalanmış soleus ve EDL kasının metabolik canlılığının çeşitli belirteçlerini inceleyerek, inkübe edilmemiş kaslara kıyasla kasların piruvat veya glikoz varlığında inkübe edilip edilmediğine bakılmaksızın, adenozin nükleotidlerinin (ATP, ADP, AMP) (~% 15-25) ve kreatin (~% 10-35) seviyelerinde genel bir azalma gözlemledik (Tablo 1 ). Öte yandan, piruvat ile inkübe edilen soleus ve EDL kaslarında gözlenen glikojen seviyelerindeki düşüş, kasların glikoz ile inkübe edilmesi durumunda önlenmiştir. İlginç bir şekilde, inosin monofosfat (IMP) seviyelerinin birkaç kat arttığını, ancak sadece inkübe edilmiş soleus kasında olduğunu gözlemledik. IMP seviyeleri tipik olarak şiddetli metabolik stres sırasında kaslarda artar, çünkü kas, ATP / ADP oranını korumak için AMP'yi IMP'ye dönüştürerek AMP birikimini önlemeye çalışır28. Bu, soleus kasının inkübasyon sırasında EDL kasına kıyasla metabolik olarak biraz daha stresli olduğunu gösterir. Bu kavram, piruvat ile inkübe edilen soleus kasında yüksek AMPKα Thr172 ve ACC Ser212 fosforilasyon bulguları ile de desteklenmektedir (Şekil 5). Önemli olarak, IMP seviyelerinin yanı sıra AMPKα Thr172 ve ACC Ser212 fosforilasyonunda gözlenen artış, soleus kası glikoz ile inkübe edildiğinde azalır. Bu nedenle, adenozin nükleotidlerindeki dalgalanmaları en aza indirmek ve kaslar uzun süre inkübe edildiğinde kas glikojen düşüşünü önlemek için izole iskelet kasını glikoz içeren bir tamponda inkübe etmek avantajlı görünmektedir. 2-deoksiglukoz alımı ile ilgili olarak, piruvat varlığında 6 ila 8 saat boyunca kasların inkübe edilmesinin bazal / istirahat glikoz alım oranlarını artıracağını gösteren kanıtlarımız vardır. Glikoz içeren bir ortamdaki kasların kuluçkalanması, glikoz alımındaki bu artışı önlüyor gibi görünmektedir (yayınlanmamış veriler).

Figure 1
Şekil 1: Kuluçka sistemi. (A) Dört adet tek inkübasyon odasına sahip miyograf sistemi. (B) Özelleştirilmiş inkübasyon kancaları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farelerden izole edilmiş olgun iskelet kasında glukoz alımı. 2-deoksiglukoz alımı, submaksimal etkili insülin konsantrasyonuna (100 μU / mL), maksimum etkili bir insülin konsantrasyonuna (10 mU / mL) ve elektriksel olarak indüklenen kasılmalara (0.2 ms nabız, 100 Hz, 1 s / 15s) yanıt olarak izole soleus (siyah çubuklar) ve EDL (gri çubuklar) kaslarında belirlendi. 30 V, 10 dk). Veriler her gruptaki Student t testi ile analiz edilmiştir. ###p<0.001, ##p<0.01 vs soleus kası. Değerler, SEM ± ortalamadır. n = grup başına 4-6. h, saat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Elektrik kaynaklı kasılmalara yanıt olarak kas kuvveti eğrileri. Elektriksel stimülasyon sırasında pik kuvvet üretimi, soleus (siyah noktalar) ve EDL (gri noktalar) kası için hesaplandı. Her bir değer, her 1-s stimülasyon periyodunun son 500 ms'sinin ortalamasına karşılık gelir. Değerler, SEM'± ortalamadır. n = grup başına 5-6. s, ikincisi. mN, mili-Newton. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Resim 4: Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 ve ACC Ser212 fosforilasyonunun yanı sıra Akt2, TBC1D4, AMPKα2 ve ACC proteininin temsili batı lekeleri. Western blot analizleri Şekil 2'de tarif edilen fare soleus ve EDL kas örnekleri üzerinde yapıldı. B, bazal. S, submaksimal etkili insülin. M, maksimum etkili insülin. C, kasılma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Resim 5: AMPKα Thr172 ve ACC Ser212 fosforilasyonunun yanı sıra AMPKα2 ve ACC proteininin temsili batı lekeleri. Tablo 1'de tarif edilen fare soleus ve EDL kas örnekleri üzerinde Western leke analizleri yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

inkübe edilmemiş Piruvat ile 1 saat inkübe edilmiş Glikoz ile 1 saat inkübe edilmiş Ana etkiler Etkileşim
Arjantin cesaret Arjantin cesaret Arjantin cesaret
Laktat 1.00 ± 0.01 1.00 ± 0.02 0.96 ± 0.03 0.98 ± 0.02 1.05 ± 0.01 0.99 ± 0.01 - -
Cr 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.06 0.64 ± 0.07 ### 0.76 ± 0.05 ### 0.76 ± 0.07 ## 0.88 ± 0.09 ## p < 0,001 -
PCr 1.00 ± 0.19 1.00 ± 0.06 0.80 ± 0.12 1.13 ± 0.14 0.65 ± 0.31 0.75 ± 0.08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1.00 ± 0.20 1.00 ± 0.07 1.17 ± 0.11 1.25 ± 0.12 0.78 ± 0.36 0.92 ± 0.11 - -
ATP 1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 0.72 ± 0.03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0.81 ± 0.06 ### 0.85 ± 0.04 ## - p < 0,001
ADP 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.04 0.75 ± 0.05 ### 0.92 ± 0.03 ### 0.84 ± 0.04 ## 0.86 ± 0.03 ## p < 0,001 -
AMP 1.00 ± 0.11 1.00 ± 0.12 0.85 ± 0.15 0.79 ± 0.13 0.84 ± 0.18 0.75 ± 0.13 - -
IMP 1.00 ± 0.17 1.00 ± 0.30 4.43 ± 0.67 ####,§§§ 0.72 ± 0.29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1.08 ± 0.01 - p < 0,001
AMP/ATP oranı 1.00 ± 0.12 1.00 ± 0.13 1.18 ± 0.22 0.81 ± 0.16 1.06 ± 0.23 0.90 ± 0.19 - -
Glikojen 1.00 ± 0.08 1.00 ± 0.12 0,74 ± 0,07 (#),* 0,80 ± 0,12 (#),* 1.12 ± 0.10 1.10 ± 0.03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1.55 ± 0.27 1.68 ± 0.19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1,00 ± 0,18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0.58 ####,**,§§ 0.96 ± 0.21 0.99 ± 0.15 0.83 ± 0.09 - p = 0,030

Tablo 1: 2 mM piruvat veya 5 mM glikoz varlığında 1 saat boyunca inkübe edilen fare soleus ve EDL kaslarının metabolik canlılığının karşılaştırılması. Kuluçkaya yatmayan kaslar, sıvı azotta dondurulmadan önce anestezi altına alınmış ve beslenen hayvanlardan diseke edildi. Ayrı kaslar, BSA (% 0.1), Na-piruvat (2 mM) ve D-mannitol (8 mM) ile takviye edilmiş KRH tamponunda 1 saat boyunca inkübe edilirken, diğerleri sıvı azotta dondurulmadan önce BSA (% 0.1), D-glikoz (5 mM) ve D-mannitol (5 mM) ile desteklenmiş KRH tamponunda 1 saat inkübe edildi. Veriler, metabolik canlılığın çeşitli belirteçlerinde gözlenen değişiklikleri vurgulamak için göreceli birimlere dönüştürüldü. Kuluçkaya yatmamış fare soleus ve EDL kaslarından mutlak değerler aşağıda verilmiştir. Laktat (mmol/kg w.w): 137.53soleus; 139.05EDL. Cr (mmol/kg w.w): 9.35soleus; 8.98EDL. PCr (mmol/kg w.w): 1,50soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13,98soleus; 37.30EDL. ATP (mmol/kg w.w): 3,07soleus; 4.24EDL. ADP (mmol/kg w.w): 0,60soleus; 0.51EDL. AMP (mmol/kg w.w): 0,18soleus; 0.08EDL. IMP (mmol/kg w.w): 0,07soleus; 0.14EDL. AMP/ATP oranı: 0,06soleus; 0.02EDL. Glikojen (pmol/μg proteini): 77.01soleus; 67.56EDL. Veriler her grupta iki yönlü ANOVA ile analiz edildi. ###p<0.001, ##p<0.01 ve #p<0.05 ile inkübe edilmemiş. p<0.001, **p<0.01 ve *p<0.05 vs glikoz ile 1 saat inkübe edildi. §§§p<0.001, §§p<0.01 ve §p<0.05 vs EDL. Değerler SEM'± ortalamadır. n= 12, inkübe edilmemiş gruplarda n=4-6. Cr, Kreatin; PCr, Fosfokreatin; w.w, ıslak ağırlık; h, saat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İskelet kasında glikoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, genel sağlığın korunması için önemlidir1. Bu nedenle, kas glukozu alımının araştırılması, çeşitli sağlık değiştirici müdahaleleri değerlendirirken genellikle birincil okuma görevi görür. Burada, insülin ve elektriksel olarak indüklenen kasılmalara yanıt olarak farelerden izole ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kasında glikoz alımını ölçmek için bir ex vivo yöntemi tanımlamaktayız. Yöntem hızlı ve güvenilirdir ve kanda bulunabilecek hormonların ve substratların potansiyel olarak kafa karıştırıcı etkisinden izole edilen kas glikoz alım oranlarının doğru bir şekilde araştırılmasına izin veren inkübe edilmiş kasın çevresindeki çevrenin hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. Yöntem birçok çalışmada birkaç yıldır kullanılmaktadır ve kas araştırma topluluğu tarafından yaygın olarak benimsenmiştir.

Exvivo inkübasyon modeli genellikle iskelet kasında glikoz alımından ziyade glikoz taşıma kapasitesini değerlendirmek için bir yöntem olarak kabul edilmiştir. Kuluçkaya yatırılan kaslardaki glikoz taşıma kapasitesi, bir süre boyunca biriken D-glikozun ölçülmesiyle belirlenebilir. Bununla birlikte, D-glukoz alımı takiben kas hücresinde hızla metabolize edildiğinden bu bir sorun teşkil eder. Bu sorunu atlatmak için, glikoz analoğu 3-O-Metil-D-glikoz (3-MG), glikoz taşıma kapasitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü 3-MG, hücre yüzey zarı boyunca taşındıktan sonra hücre içinde daha fazla metabolize edilmez. Bu nedenle, hücre içi biriken 3-MG'nin başlangıç hızı, glikoz metabolik yollarındaki diğer adımlardan etkilenmediği için kendi başına hücresel glikoz taşıma kapasitesinin bir indeksi olarak işlev görür. Bununla birlikte, 3-MG kullanımı bir sorun oluşturabilir, çünkü 3-MG birikecek, böylece 3-MG için transmembran gradyanı azaltılacak ve daha sonra daha fazla alımı azaltacaktır. Bu nedenle, membran taşıma kapasitesinin bir ölçüsünü elde etmek için, 3-MG alımının başlangıç oranı tahmin edilmelidir. Özellikle taşıma kapasitesi yüksek olduğunda,29,30 kasından 3-MG'lik efflux nedeniyle bir sorun oluşturabilir. 3-MG efflux ile ilgili potansiyel sorun, 2-deoksi-D-glukoz (2-DG) kullanılarak önlenebilir. İskelet kasına taşındıktan sonra, 2-DG, hekzokinaz II tarafından 2-deoksi-D-glukoz-6-fosfata (2-DG-6P) fosforile edilir. İskelet kası glikoz-6-fofatozdan yoksun olduğundan ve GLUT4 fosforile 2-DG'yi taşıyamadığından, 2-DG-6P kas hücresi içinde sıkışıp kalacaktır. Glukoz-6-fosfatın aksine, 2-DG-6P, 2-DG için transmembran gradyanının korunmasına yardımcı olan hekzokinaz II30'un çok zayıf bir allosterik inhibitörüdür. Bu nedenle, gözlemler, inkübe edilmiş (sıçan) kastaki 2-DG alımının, hücre içi 2-DG-6P konsantrasyonu, hekzokinaz II aktivitesini 30 düşüren bir konsantrasyon olan30 mM'yi geçene kadar doğrusal kaldığını göstermiştir. Ayrıca, inkübe edilmiş fare iskelet kasında 2-DG alımı, inkübasyon tamponlarının sıcaklıkları 37 ° C veya daha az31 olduğunda ~ 30 dakika boyunca doğrusal kalır. Bu, 2-DG-6P konsantrasyonlarının çok yüksek olduğu durumlar dışında, inkübe edilmiş kaslarda glikoz alımından ziyade glikoz taşıma kapasitesini ölçmek için 2-DG'nin kullanılabileceğini düşündürmektedir (örneğin, inkübasyonlar sırasında gözlenen >2 saat 1 mM 2-DG ve maksimum insülin konsantrasyonu29,30). 2-DG alımının muhtemelen glikoz taşıma kapasitesini yansıttığı fikri, maksimum insülin ile uyarılmış 2-DG alımının, vahşi tip farelerden ve heksokinaz II32'yi aşırı eksprese eden farelerden inkübe edilmiş kaslarda benzer olduğunu gösteren bulgularla da desteklenmektedir. Kasılma sırasında kas glukoz taşıma ölçümleri için 2-DG kullanıldığında potansiyel bir endişe, yüksek glikojenoliz oranına bağlı olarak hücre içi glikoz-6-fosfat konsantrasyonundaki artıştır. Bununla birlikte,29 zaman içinde kasılma sırasında (sıçan) kas 2-DG alımında doğrusal bir artış gözlendiğinden, bu, kasılma sırasında glikojen parçalanmasından glikoz-6-fosfat birikiminin hekzokinaz II aktivitesine ve dolayısıyla 2-DG alım oranlarına müdahale etmediğini gösterir. Buna dayanarak, 2-DG, 3-MG'nin sınırlamaları göz önüne alındığında, insülin ve kasılma sırasında izole iskelet kasında glikoz transportunun ölçümleri için çok uygun görünmektedir.

Genel olarak 2-DG'nin hekzokinaz II tarafından fosforilasyondan sonra daha fazla metabolize edilmediği varsayılsa da, bazı 2-DG'lerin kas glikojenine yönlendirildiği ve dahil edildiği bildirilmiştir. Böylece, sıçanlarda 2 saatlik bir normoglisemik hiperinsülinemik kelepçe sırasında, iskelet kası tarafından alınan 2-DG'nin ~% 30'u glikojen33'e dahil edilir. Bu nedenle, glikojen içinde 2-DG birikimi ihmal edilirse, inkübe iskelet kasında insülin ile uyarılmış 2-DG alım oranlarının hafife alındığı düşünülebilir. Daha önce inkübe edilmiş iskelet kasında 2-DG alım oranlarının sonraki analizleri için kas lizatlarının (süpernatant) nasıl hazırlanacağına dair burada açıklanan protokolün, 2-DG'nin glikojene potansiyel katılımından etkilenmediğini belirledik. Glikojenin, 2-DG alım ölçümleri için lizat üretmek üzere tüm kas homojenatını santrifüj ederken pelette biriktiği söylenebilir. Bununla birlikte, insülin ile uyarılmış tüm kas homojenatındaki radyoaktivite seviyelerini lizat ile karşılaştırırken, önemli bir fark tespit etmiyoruz (yayınlanmamış veriler). Bu, fare kasının 1 mM'lik 2-DG'de 10 dakika boyunca inkübe edilmesinin, glikojende 2-DG'nin saptanabilir bir birikimine neden olmadığını göstermektedir.

İskelet kası 2-DG alımının, 2-DG'nin hem hücre dışı hem de hücre içi boşlukta dağıldığı dikkate alınmadan belirlenmesi, 2-DG alımının abartılmasına yol açacaktır. Bunu atlatmak için, L-glukoz hücre dışı bir belirteç olarak kullanılmalıdır, çünkü bu hücre zarı boyunca taşınmaz, aksi takdirde kütle, çözünürlük, pasif difüzyon, bağlanma vb. dahil olmak üzere D-glikoz ile benzer özellikler gösterir. Aşırı üretim maliyetleri ve dolayısıyla L-glikoz satın alma nedeniyle, mannitol tipik olarak hücre dışı bir belirteç olarak kullanılır, çünkü mannitol kas hücresi tarafından alınmaz, nispeten ucuzdur ve glikoz ve 2-DG34 ile biraz benzer bir hücre dışı dağılım hacmine sahip olduğu tahmin edilmektedir.

İçsel hücresel ve moleküler saatler, tüm vücut metabolizmasının ve enerji homeostazının düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır35. Çekirdek saat geni Bmal1'in kaslara özgü nakavtının, izole fare iskelet kası36'da insülin ile uyarılmış glikoz alımını bozduğu gözlenmiştir. Ayrıca, izole iskelet kasının submaksimal insülin ile uyarılmış glukoz alımı, sırasıyla açık ve koyu fazın ortasında en düşük ve en yüksek insülin yanıtı ile sirkadiyen ritim sergiler, sırasıyla37. Bu nedenle, bu bulgulara dayanarak, verilerin tekrarlanabilirliğini artırmak için hayvan kurban etme zamanını deneysel tasarıma dahil etmek önemlidir.

Exvivo yöntemin en büyük dezavantajı, izole kastaki kılcal akımın olmamasıdır. Bu, çeşitli substratların verilmesi ve çıkarılmasının tamamen kas lifleri ve çevresindeki ortam arasındaki basit difüzyona bağlı olduğu anlamına gelir. Sonuç olarak, izole kas inkübe edilmiş ex vivo'nun metabolik canlılığının doğrulanması, oksijenin yüzeysel ve derin kas liflerine difüzyon sınırlamalarına odaklanmıştır. Bu nedenle, inkübe edilmiş kas, özellikle de yüksek metabolik fare kası, glikojen parçalanmasının meydana geldiği hipoksik çekirdekler geliştirme eğilimindedir16,17,38. Bonen ve meslektaşları15 tarafından yapılan ayrıntılı bir derlemede, inkübe edilmiş kasın hipoksik çekirdeklerinin, özellikle ≥ 37 ° C sıcaklıklarda inkübe edilirken, uygun şekilde oksijenlenemeyecek kadar kalın kasları inkübe ederken geliştiği öne sürülmüştür. Bu, hipoksik çekirdeklerin gelişmesini önlemek için soleus ve EDL gibi sadece ince ve silindirik fare kaslarının 25-30 ° C'de inkübasyonlar için kullanılması gerektiği önerisine yol açtı. Bu, kütleden ziyade kalınlık ve geometrinin, fare iskelet kaslarını inkübe ederken göz önünde bulundurulması gereken önemli faktörler olduğunu gösterir. Ek olarak, inkübasyon sıcaklığının, kas kalınlığının yanı sıra ATP, fosfokreatin ve glikojen içeriği ve / veya laktat salınımının ölçülmesi ve inkübe edilen kas15'in canlılığını değerlendirmek için rutin olarak rapor edilmesi önerilmiştir. Bildiğimiz kadarıyla, inkübe edilmiş kasın bu tür tam analizleri esas olarak sıçan kası 39,40,41,42 için ve sadece sınırlı bir ölçüde fare kası 16,17 için bildirilmiştir. Kuluçkalanmış fare iskelet kasında canlılığın çeşitli metabolik belirteçleri hakkındaki anlayışı arttırmak için, glikoz veya piruvat takviyeli KRH tamponunda 1 saatlik inkübasyonun ardından soleus ve EDL kasında laktat, kreatin, fosfokreatin, adenozin nükleotitleri, glikojen ve AMPK sinyalizasyonunun hücre içi içeriğindeki olası değişiklikleri değerlendirdik. Kuluçkalanmış fare soleus ve EDL kası17'deki önceki bulgulara benzer şekilde, kaslar glikozsuz ortamlarda inkübe edildiğinde glikojen seviyelerinin azaldığını gözlemledik. Bu, inkübasyon sırasında glikoz yokluğunun glikojen parçalanmasını ve ardından glikoz-6-fosfatın, özellikle oksijen arzı yetersizse, ATP üretimini güvence altına almak için hareket edebilecek glikolize girmesini teşvik ettiğini gösterir. Ayrıca, inkübe soleus ve EDL kasındaki ATP ve ADP nükleotid havuzlarında genel bir azalma bulduk. Bu, oksijen arzının, glikozun hem varlığında hem de yokluğunda inkübe edilmiş fare kası talebini karşılamak için tamamen yeterli olmadığı anlamına gelebilir. Oksidatif soleus kası, glikolitik EDL kasına kıyasla ATP üretimi için oksijene daha fazla dayandığından, bu, soleus kasının inkübasyon prosedüründen daha büyük ölçüde etkilendiğini düşündürmektedir. Anlaşmada, hücre içi IMP seviyelerinin yanı sıra AMPK sinyalizasyonunun, glikoz yokluğunda inkübe edildiğinde EDL kasına kıyasla soleusta belirgin şekilde arttığını bulduk. Bu, soleus kasının inkübasyon sırasında daha yüksek derecede metabolik stres sergilediğini gösterir ve bu da ex vivo fare kas modelinden elde edilen verileri değerlendirirken dikkate alınmalıdır.

Ölümsüzleştirilmiş L6 ve C2C12 dahil olmak üzere kültürlenmiş kas hücrelerinin yanı sıra birincil insan miyotüpleri, çeşitli genetik ve farmakolojik manipülasyonların insülin ile uyarılmış kas glikoz alımı üzerindeki etkilerini incelemek için olgun iskelet kası için bir vekil olarak yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli şekillerde kültürlenmiş kas hücreleri olgun iskelet kasına benzemez ve iki model sistemi karşılaştırırken çok sayıda farklılık ortaya çıkar. Bunlar arasında protein ekspresyonu, boyutsal yapı, çevredeki ortam, proliferasyon ve farklılaşma durumu, lif tipi kompozisyon, metabolik süreçler ve fonksiyonel özellikler43 farklılıklar bulunur ve bunların hepsi kas hücresinin çeşitli uyaranlara yanıt olarak glikoz alımını nasıl düzenlediğini etkileyebilir. Tipik olarak, insülinin glikoz alım oranları üzerindeki daha büyük göreceli etkileri, kültürlenmiş kas hücrelerine kıyasla olgun iskelet kasında gözlenir 44 Bu, kültürlenmiş kas hücrelerinin, bir dereceye kadar, insüline duyarlı glikoz taşıyıcısıGLUT4 43'ün yüksek bir ekspresyon seviyesi de dahil olmak üzere, glikoz alım oranlarını düzenlemekten sorumlu mekanizmadan yoksun olduğunu gösterebilir. . Kültürlenmiş kas hücrelerinin ve izole iskelet kasının kullanımıyla ilişkili sınırlamalar ve uyarılar göz önüne alındığında, glikoz alımı gibi çeşitli kas metabolik süreçlerini incelerken kombine bir yaklaşım benimsemek muhtemelen avantajlıdır.

Soleus ve EDL kasları tipik olarak sırasıyla yavaş ve hızlı seğirme kaslarının temsilcisi olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu kas tipleri, kas kuvvetini ve yorgunluk gelişimini etkileyen müdahaleleri araştırmak isteyen mekanik çalışmalar için idealdir. Ayrıca, soleus kasının tipik olarak EDL kasına kıyasla insülin duyarlılığının ve duyarlılığının arttığı ve bu nedenle kas insülin duyarlılığını hedefleyen müdahalelerin soleus ve EDL'yi farklı şekilde etkileyebileceği bildirilmektedir. Ek olarak, farklı AMPK komplekslerinin göreceli dağılımı, AMPK aktive edici bileşiklerin kas glikoz alımını arttırma yeteneğini etkileyen soleus ve EDL kası arasında farklılık gösterir. Bu nedenle, kas glikoz alımının düzenlenmesine ilişkin en büyük içgörü, ex vivo inkübasyon modeli ile yapılan deneyler sırasında hem soleus hem de EDL kaslarının kullanılması durumunda elde edilir.

Burada açıklanan yöntem, glikoz alımını, homojenizasyondan sonra her kas örneğinde belirlenen toplam protein bolluğu miktarıyla ilişkilendirir. Kas ağırlığı yerine kas proteini miktarı başına glikoz alımı ile ilgili olarak varyasyonun azaldığı deneyimlerimizdir (yayınlanmamış veriler). Ayrıca, çeşitli biyokimyasal tahliller için kullanılan bir tamponda kas örneklerinin homojenizasyonu, aynı numune preparatında hem glikoz alımını, hem de miyosellüler sinyalizasyonu ve enzim aktivitelerini belirlemeyi mümkün kılar45,46. Bu genellikle bir çalışma için kullanılan fare miktarını azaltacaktır. Bununla birlikte, glikoz alımı, sodyum hidroksit (NaOH) içinde ısıtılarak çözülen iskelet kası örneklerinde kolayca belirlenebilir ve ardından hidrojen klorür20 ile nötralize edilebilir. Kasın NaOH ile tedavisi, toplam kas protein konsantrasyonunun ölçümlerine müdahale ettiğinden, bu prosedürle ölçülen glikoz taşınması kas ağırlığı ile ilişkili olmalıdır.

Çeşitli optimizasyonlara dayanarak, glikoz alım inkübasyon tamponumuz 0.028 MBq / mL [3H]2-deoksi-D-glikoz ve 0.0083 MBq / mL [14C] Mannitol'ün spesifik bir aktivitesini içerir. Bir yandan, bu, yeterli ve güvenilir radyoaktivite ölçümleri elde etmek için gereken lizat miktarını (400 μL'den 150'si) düşürür. Öte yandan, her deney için gerekli olan radyoaktif [3H]2-deoksi-D-glikoz ve [14C] mannitol miktarını arttırır ve bu da deneysel maliyetleri arttırır. Bu nedenle, herhangi bir deney düzeni için, glikoz alım inkübasyon ortamında kullanılan radyoaktivite miktarını, belirli gereksinimlere uyacak şekilde düzenlemek mümkündür. Bununla birlikte, inkübasyon tamponundaki radyoaktivite miktarının, radyoaktivite ölçümlerini güvenilmez kılacak ölçüde azaltmamasına özen gösterilmelidir. Bu, numunelerdeki radyoaktivitenin, kullanılan sıvı sintilasyon sayma makinesinin belirtilen tespit sınırlarından daha yüksek tutulmasıyla sağlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Acknowledgments

Bu çalışma, Danimarka Bağımsız Araştırma Konseyi - Tıp Bilimleri (FSS8020-00288B) ve Novo Nordisk Vakfı'ndan (NNF160C0023046) gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Novo Nordisk Vakfı tarafından finanse edilen Danimarka Diyabet Akademisi'nden Rasmus Kjøbsted'e NNF17SA0031406 hibe numaralı bir araştırma hibesi ile desteklendi. Yazarlar, yetenekli teknik yardımları için Karina Olsen, Betina Bolmgren ve Irene Bech Nielsen'e (Kopenhag Üniversitesi Fen Fakültesi Beslenme, Egzersiz ve Spor Bölümü) teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Tags

Biyoloji Sayı 171 iskelet kası glukoz taşınması glukoz alımı insülin duyarlılığı kasılma eksplant ex vivo in vitro inkübasyon radyoaktif glukoz izleyicileri 2-deoksi-D-glukoz
Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter