Summary
Strålingsinduceret DNA-skadesrespons, der aktiveres af neutronblandet stråle, og som anvendes til behandling med neutronfangsning (BNCT), er ikke fuldt ud klarlagt. Denne protokol giver en trin-for-trin procedure til påvisning af stråling-induceret foci (RIF) af reparation proteiner ved immunfluorescens farvning i human tyktarmskræft cellelinjer efter bestråling med neutron-blandet stråle.
Abstract
Formålet med manuskriptet er at give en trin-for-trin protokol til udførelse af immunfluorescens mikroskopi til undersøgelse af stråling-induceret DNA skade svar induceret af neutron-gamma blandet stråle, der anvendes i bor neutron capture terapi (BNCT). Specifikt anvendes den foreslåede metode til påvisning af aktivering af reparationsproteiner, som kan visualiseres som foci ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for DNA-dobbeltstrengede brud (DNA-DSBs). DNA reparation foci blev vurderet ved immunofluorescens i tyktarmskræft celler (HCT-116) efter bestråling med neutron-blandet stråle. DNA-DSBs er de mest genotoksiske læsioner og repareres i pattedyrceller af to store veje: ikke-homolog end-joining pathway (NHEJ) og homolog rekombinationsreparation (HRR). Frekvenserne af foci, immunokemisk farves, for almindeligt anvendte markører i radiobiologi som γ-H2AX, 53BP1 er forbundet med DNA-DSB-nummer og betragtes som effektive og følsomme markører til overvågning af induktion og reparation af DNA-DSBs. Det blev fastslået, at γ-H2AX foci tiltrækker reparationsproteiner, hvilket fører til en højere koncentration af reparationsfaktorer i nærheden af et DSB. For at overvåge DNA-skader på celleniveau, immunofluorescens analyse for tilstedeværelsen af DNA-PKcs repræsentative reparation protein foci fra NHEJ vej og Rad52 fra HRR vej var planlagt. Vi har udviklet og indført en pålidelig immunfluorescens farvning protokol til påvisning af stråling-induceret DNA-skade respons med antistoffer specifikke for reparation faktorer fra NHEJ og HRR veje og observeret stråling-induceret foci (RIF). Den foreslåede metode kan anvendes til undersøgelse af reparationsprotein, der er stærkt aktiveret i tilfælde af neutronblandet strålestråling, hvilket indikerer reparationsvejens dominans.
Introduction
Strålingsinduceret DNA-skadesrespons, der aktiveres af neutronblandet stråle, og som anvendes til behandling med neutronfangsning (BNCT), er ikke helt bestemt. Denne protokol giver en trinvis procedure til at udføre påvisning af stråling-induceret foci (RIF) af reparation proteiner ved immunofluorescence farvning f.eks i human tyktarmskræft cellelinje efter bestråling med neutron-blandet stråle.
Iiserende stråling (IR) inducerer en lang række forskellige typer af DNA-skader (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA base skader), hvoraf DNA dobbelt-streng pauser er de mest genotoksiske DNA læsioner1. Ureparerede pauser kan forårsage celledød, mens fejlreparerede pauser øger sandsynligheden for kromosomrearrangement, mutagenese og tab af afgørende genetisk information. De skadesreaktionsveje, der reagerer på DSBs, omfatter veje til DNA-reparation som ikke-homolog ende joining (NHEJ), enmekanisme, derkræver Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 og DNA-ligase IV som nøglefaktorer2,,3,4,5,6. Hos pattedyr, den anden vigtigste DNA reparation vej er homolog rekombination reparation (HRR) vej, som kræver centrale komponenter - Den Rad52 epistasis genfamilie- Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 og Rad587. Rad51 og Rad54 er vigtige menneskelige rekombinationsfaktorer, der er involveret i reparationsmekanismer i forbindelse med replikationsstress og DNA-brud i eukaryoter. Interessant, det blev observeret, at nedregulering af HRR vej forbedrer NHEJ vej, som er fejl-tilbøjelige peger på HR vej relevans for genomet stabilitet8.
Det første trin i DSBs-dannelsen er fosforylering af γ-H2AX histonen ved Ser-139 af Ataxia telangiectasia muteret kinase (ATM) fra PI3 kinase-familien7,8. Interessant, H2AX fosforylering kan visualiseres let ved immunfluorescens teknik som foci (γ-H2AX foci) ved hjælp af antistoffer specifikke for fosforyleret H2AX6. Der er en 1:1 sammenhæng mellem antallet af DSBs og γ-H2AX foci, derfor, DSB markør, γ-H2AX, undersøges grundigt gennem karakterisering af foci dannelse, størrelse og mængde6,7,8,9,10,11. Dannelse af γ-H2AX foci fører til rekruttering og akkumulering af DNA-skadesrespons (DDR) proteiner og kromatinmodificerende faktorer, såsom 53BP1 (p53 bindende protein 1), MDC1 (mediator af DNA-skade checkpoint), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, og mange andre reparation faktorer dermed danner stråling-induceret foci (RIF). Alle disse proteiner er lokaliseres sammen med γ-H2AX ved direkte eller indirekte binding1,11,12.
Det er vigtigt at opdage DNA-skader og reparere med en ordentlig følsom test, derfor er mere opmærksom på udviklingen af meget præcise teknikker13. I forbindelse med DNA-skades- og reparationsundersøgelser er metoden afgørende for følsom påvisning af dna-skader på genomet, beskrivelse af skadeskategori og kvantificering af DNA-skades- og reparationsmekanismer13. For at detektere enkelte celler med beskadiget DNA anvendes kometanalyse ofte i radiobiologiske undersøgelser14. Andre tilgængelige cytogenetiske metoder genkender kromosomale afvigelser, herunder dicentriske, omplantninger, acentriske fragmenter, ringe og kromatidtypeafvigelser og mikronukleuskromosomaleskader (Mn). Den hyppigst anvendte metode i radiobiologi, især i biologisk dosimetri, er den dicentriske kromosomanalyse på grund af dens høje specificitet forstråling 15. For eksempel, PCR, en klassisk molekylær metode, kan ikke genkende typen af opdaget DNA-skader. I dette tilfælde passerer de immunometriske metoder følsomhedsniveauet, fordi reaktionerne er specifikke mellem antigenet og antistoffet. Immunofluorescensbilleddannelse giver visuel dokumentation for udseendet af forskellige proteiner i forskellige foci som reaktion på DNA-skadelige stoffer som iiseringsstråling16. Aktiveringsniveauerne for skader og reparation af proteiners mRNA-niveauer kan dog let påvises ved pcr i realtid, som er en korrekt kvantitativ metode til yderligere molekylære undersøgelser i forbindelse medDNA-skadesrespons 17.
I betragtning af at γ-H2AX foci tiltrækkerreparationsfaktorer 18for at overvåge DNA-skader og reparation på celleniveau, har vi udviklet en pålidelig immunfluorescensfarvningsprocedure baseret på analyse af det repræsentative reparationsprotein foci fra NHEJ-vejen (DNA-pc'er) og Rad52 fra HRR-vejen.
Her foreslår vi brug af immundetektion for disse proteiner som den effektive og følsomme procedure til overvågning af DNA-DSB induktion og reparation. Indtil nu har der ikke været tilgængelige data på DNA-DSBs baseret på foci af reparationsproteiner på celleniveau efter neutronen blandet strålebestråling for BNCT, undtagen γ-H2AX og 53BP1 markører19. Vi foreslår tilpasning af HCT-116 tyktarmskræft cellelinje, da det er rigt sig i DSBs foci, som en standard cellelinje for DNA-skade analyse, fordi RIFs er let påviselige. Denne klæbende cellelinje er nem at vedligeholde og korrekt for bestrålingsprocedurer. Den foreslåede procedure er baseret på en enorm mængde af tidligere undersøgelser i forbindelse med den generelle immunfluorescens procedure af γ-H2AX farvning. Den indeholder dog alle detaljer vedrørende valget af passende antistoffer med testede fortyndinger for hvert repræsentativt protein, der tilhører hver reparationsvej. Desuden beskriver det udnyttelsen af en unik neutron-blandet stråle, der anvendes i BNCT terapi. Vi anbefaler dog, at undersøgelserne udvides med begge metoder, immunfluorescensfarvning først og derefter, med dyre molekylære analyser som udført tidligere4,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af cellekultur og eksperimentel set-up
- Opretholde humane tyktarmskræft celler, HCT-116 som anbefalet af leverandøren, i monolag i 75 cm2 kultur kolber, der indeholder 10 ml af formuleret McCoy's 5a Medium Modificeret, suppleret med 10% føtal kvæg serum og 1% antibiotika antimykotisk opløsning.
- Dyrk cellerne i et befugtet 5% CO2-miljø ved 37 °C indtil 70% af sammenløbet med medium fornyelse hver 2 til 3 dage.
- For at få BNCT stråle (f.eks neutronstråle plus 10BPA) og BNCT effekt af drab kræftceller som tunge partikler og til at deponere det meste af deres energi i bor-holdige kræftceller, dagen før bestråling, der tilsættes borleveringsmiddel til cellekulturmediet – fx 10BPA, 4-Borono-L-phenylalanin (10 μg 10B/ml, 0,925 mM endelig) 12-16 h (maksimal optagelse af bor) før bestrålingen, som tidligere undersøgt for tyktarmskræftceller ogkræftceller ne 20,21.
BEMÆRK: Hvis du bruger en anden cellelinje, for hvilken der ikke findes data i tilfælde af BNCT-undersøgelse, skal du teste boroptagelsen for hver cellelinje for at opnå optimal borkoncentration. 10BPA-cellulære optagelsesoptagelsen måles ved hjælp af induktivt koblet plasmaoptisk emissionsspektroskopi (ICP-OES) som udført af Dagrosa gruppe21. - Efter 12-16 timer af bor levering, aspirere mediet og vask cellerne med 10 ml 1x PBS. Så prøvpsinize cellerne ved at tilføje 2 ml Trypsin-EDTA opløsning til cellerne og inkubere i 5 min ved 37 °C for at forbedre celleløsning. Når cellerne begynder at løsne sig, skal du stoppe trypsinhandlingen ved at tilføje 10 ml komplet medie.
- Cellesuspensionen indstælles i 15 ml-røret, og cellerne tælles ved hjælp af en automatiseret celletæller ved at tilsætte 10 μL 0,4% prøveområde blå til 10 μL celler, blandes og aquoting 10 μL på et tælledias. Cellesuspensionen fortyndes til en koncentration på 1 x10 6 celler/ml af mediet. Aliquot 1 ml af cellesuspensionen pr. kryorør.
- Termoluminescerende dosimetre (TLD' er) til måling af gammastråledoser og guldforer for neutronfluencies og fastgør TD'er til kryorør eller cellekulturhør i før bestrålingen.
- Bestråle 1 x 106 celler/ml med neutronblandet stråle ved anbefalet minimal termisk neutronfrænksing på 5,9 x 1011 (n/cm-2 min−1)4 i kulturkolber eller kryorør afhængigt af anlæggets kapacitet.
BEMÆRK: Indstil tidspunktet for bestråling før for at opnå anbefalet neutronfrug. - Efter bestråling frø 1 ml bestrålede celler (1 x 106 celler/ml) på 22 x 22 mm overtrækslip i 35 mm petriskåle eller 6 brøndplader, supplere med 2 ml af det krævede medium. Cellerne inkuberes i højst 3 timer ved 37 °C i et befugtet 5 % CO2-miljø, så de kan fastgøres til overtrækslippene. Overhold fastgørelse af celler fra tid til anden under et omvendt mikroskop med 20x mål.
BEMÆRK: For HCT-116 celler er minimum tæthed 600.000 celler til frø. For hurtig yderligere farvning procedure bruge kammer dias, reducere celletætheden i overensstemmelse hermed.
2. Fiksering af celler
- Efter bestråling og inkubation af celler fjernes mediet fra de vedlagte celler, og cellerne vaskes én gang med 2,5 ml PBS.
- Fastgør celler med 1 ml 70% ethanol i 10 min ved RT.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge 1%-3,7% paraformaldehyd (PFA) til fiksering som tidligereanbefalet 19. Protokollen er sat på pause her. Opbevar faste celler i ethanol i en fryser ved -20 °C i højst et par uger til yderligere analyse og immunfluorescensfarvning.
3. Permeabilisering af celler
- Efter fiksering fjernes ethanol fra petriskålen og vaskes med 2,5 ml 1x PBS.
BEMÆRK: Lad ikke cellerne tørre mellem skylletrinene. - Tilsæt forsigtigt 1 ml 0,2% af Triton X-100/PBS for at dække overtrækslips med celler i petriskåle.
- Inkuber i 5 minutter på RT.
- Cellerne vaskes 3x med 2,5 ml 1x PBS.
BEMÆRK: Forøg procentdelen af Triton X-100 i PBS op til 0,5%, hvis det er nødvendigt (mere foci detekterbart, afhængigt af den testede cellelinje). Udfør yderligere vaske med PBST (PBS med 0,5% Tween) for at undgå uspecifik binding. - Blokpermeabiliseringstrin med 1 ml BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) fortyndet i PBS og inkuber i mindst 30 min eller 1 time med 1% BSA.
BEMÆRK: Dette trin kan udelades og afhænger af den anvendte type antistof. Alternativt kan du bruge 5% FBS som anbefalet i ref4.
4. Immunofluorescens farvning
- Tilsæt den korrekte mængde primært antistof (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs og Anti-Rad52), fortyndet i PBS med BSA (2% Bovin Serum Fraktion V albumin) som anbefalet (se tabel 1 med anbefalede fortyndinger) (100 μL er nødvendig pr. prøve).
| Primært antistof | Funktion | Anbefalet fortynding | opbevaring [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | påvisning af DNA-DSBs | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-pc'er | påvisning af RIFs af DNA-PKcs protein, der tilhører NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | påvisning af RIFs af Rad52-protein, der tilhører HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Sekundært antistof | I blinde | ||
| anti-mus IgG FITC | ɣ-H2AX foci | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Ged anti-kanin IgG H&L (Alexa Fluor 488) | for NHEJ og HRR reparation proteiner foci | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabel 1: Anbefalede fortyndinger og noter til brug af antistoffer, der anvendes i afsnit 4.
- Petriskålen dækkes for at holde luftfugtigheden i en plastkasse med fugtbekanneret lignin med destilleret vand og inkuberes i 30 min. ved 37 °C i inkubatoren.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Inkubation kan udføres ved 4 °C natten over. - Efter inkubation udføres 3 vasker med 2,5 ml PBS.
BEMÆRK: Lad ikke glideningen tørre under skylningstrinene. - Tilsæt den korrekte mængde sekundært antistof (antimuse IgG FITC, Ged anti-kanin IgG (Alexa Fluor 488) fortyndet i PBS med BSA (se tabel 1) (100 μL er nødvendig pr. prøve). Til dette og de følgende trin arbejde i mørke.
- Petriskålen tildækkes igen for at opretholde luftfugtigheden i en plastkasse med fugtholdende lignin og inkuberes i mindst 30 min. ved 37 °C i inkubatoren.
- Efter inkubation udføres 3 vasker med 2,5 ml PBS.
- Der tilsættes 100 μL DAPI fortyndet i PBS til en endelig koncentration på 1 μg/ml for at modvirke kernen.
- Inkuberes om kort tid, i højst 2 min ved RT.
- Efter inkubation udføres 3 vasker med 2,5 ml PBS.
- Fjern PBS og forsigtigt sætte en overtrækslip på toppen af monteringsmediet, undgå dannelsen af luftbobler og forsegle kanter af coversstem med neglelak. Vent, indtil lakken tørrer, og mal dækslet rundt.
- Vent på hærdning af monteringsmediet (op til 3 timer) før billedanalyse under fluorescensmikroskopi.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Opbevar glasglas i en plastkasse ved 4 °C i mørke.
5. Erhvervelse og analyse af image
- Erhverve billeder med en fluorescens mikroskop under 100x mål med nedsænkning olie.
- Analyser foci i kerner med et fluorescensmikroskop udstyret med følgende filtre til: Alexa Fluor 488: excitation⁄emission (nm): 496/519, emissionsfarve grøn; DAPI: excitation⁄emission (nm): 358⁄461, emissionsfarve blå.
BEMÆRK: Analyse af DSB'er langs enkeltpartikelspor kan kræve avanceret mikroskopi som konfostscanningsmikroskopi med højere opløsning.
- Analyser foci i kerner med et fluorescensmikroskop udstyret med følgende filtre til: Alexa Fluor 488: excitation⁄emission (nm): 496/519, emissionsfarve grøn; DAPI: excitation⁄emission (nm): 358⁄461, emissionsfarve blå.
- Gem erhvervede billeder og proces med passende billedbehandling software f.eks ImageJ eller Image Pro3,20.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge individuelle makroer og plugins, der er udviklet til automatisk analyse eller udvikling/køb af individuel bioinformatisk software. - Hvis du bruger Image-Pro-software til foci-analyse, skal du behandle billeder i TIFF-filer: Vælg Tæl/størrelsesknap, og klik derefter på Typer [vælg måletypen (f.eks. diameter eller område)], klik på Områder [indstillet måleområde], klik på Opdel objekter, hvis det er nødvendigt. Hvis du vil justere lysstyrken, skal du klikke på Bright [juster treshold]. Klik derefter på Tæl [rød knap].
- Hvis du vil eksportere data, skal du klikke på Datatabel | Statistikker | Eksporter til Excel. I regnearkssoftwaren skal du tegne grafer med den nødvendige statistiske analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første udførte vi en analyse af en standardmarkør for påvisning af DNA-DSBs, γH2AX foci i tyktarmskræftceller, ikke-udstrålede og bestrålet med neutronblandet stråle. γ-H2AX foci fremstår som særskilte fluorescerende prikker og viser dannelsen af DNA-DSBs (da hver γ-H2AX fluorescerende prik repræsenterer en enkelt DSB) (se figur 1).
Figur 1: Repræsentative billeder af mønstre af γ-H2AX foci i tyktarmskræftceller i cellelinjen HCT-116 (uden stråling) og efter neutronblandet strålebestråling. Neutronblandet strålebestråling blev udført med en dosis på 2,6 Gy i celler behandlet dagen før med BPA (N+BPA). (A) Det venstre panel repræsenterer DAPI-farvning af kerner. Den højre panel, grøn foci (Alexa 488), svarer til immundefekt af γ-H2AX. Den gule pil angiver spor af α-partikel, der krydser kernen (skalabjælke = 10 μm). (B) Repræsentative diagrammer, der illustrerer den observerede stigning i størrelsen af radioinduceret foci. Gennemsnittet af γ-H2AX foci diameter blev udført automatisk af Image-Pro software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Interessant, i bestrålede celler med neutron-blandet stråle (N + BPA) ved en dosis på ca 2,6 Gy (1,33 Gy (γ) + 1,26 Gy (N)), observerede vi højere diameter niveauer af γ-H2AX foci (Figur 1B). Desuden blev der fundet et enkelt spor af høj LET α-partikel (på grund af BNCT-nuklear reaktion), der krydsede kerner i cellen (gul pil) (Figur 1A). Forskellige typer af stråling kan forårsage forskellige virkninger: jo højere LET stråling, jo mere komplekse DNA-DSBs, jo større γ-H2AX foci og de højere område niveauer af reparation proteiner synlige som stråling-induceret foci18.
Derfor testede vi niveauer af repræsentative reparationsproteiner af DNA-pc'er (fra NHEJ repair pathway) og Rad52 (fra HR-vej) ved immunfluorescensmikroskopi under de samme forhold, som ikke blev udført før i tilfælde af BNCT-stråle. Vi var i stand til at detektere den høje middelværdi af foci diameteren af DNA-PKcs ved DNA-brud efter en neutron-blandet i sammenligning med kontrolceller (ingen stråling) (se figur 2).
Figur 2: Repræsentative billeder af mønstre af DNA-pc'er og Rad52 reparation foci i tyktarmskræft celler i cellelinjen HCT-116 (uden stråling) og efter neutron-blandet stråle bestråling. Neutronblandet strålebestråling blev udført med en dosis på 2,6 Gy i celler behandlet dagen før med BPA (N+BPA). (A) Det venstre panel repræsenterer DAPI-farvning af kerner. Den midterste panel repræsenterer påvisning af stråling-induceret foci. Det højre panel er det flettede billede. (B) Repræsentative diagrammer, der illustrerer den observerede stigning i størrelsen af radioinduceret foci. Gennemsnittet af Rad52 og DNA-PKcs foci diameter blev udført automatisk ved hjælp af billedanalyse software. Klik her for at se en større version af dette tal.
I dette tilfælde har vi observeret grupperet DNA-DSBs i bestrålede HCT-116 celler af neutronblandet stråle, da DNA-PKcs er specifik for mere komplekse foci. I bestrålede celler blev disse foci kun observeret i celle kernen som mere komplekse, større og grupperet med højere intensitet (figur 2A,B). I tilfælde af Rad52 var effekten ikke så stærk som for DNA-pc'er, hvilket indikerer NHEJ-vejens dominans i denne type stråling. Desuden er komplekse DSB'er på grundlag af litteraturdata langsomt repareret, og DNA-pc'er rekrutteres kun til længere levetid komplekse DSB'er, hvilket indikerer, at den neutronblandet stråle fører til dannelsen af komplekse DSB'er og repareres gennem DNA-pc'er, men der er behov for mere forskning på molekylært niveau for at bekræfte disse tidligere opnåede resultater22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frekvenserne af foci, immunokemisk plettet for γ-H2AX og 53BP1 er almindeligt anvendt i radiobiologi og er forbundet med DNA-DSB-nummer og betragtes som effektive og følsomme markører til overvågning af induktion og reparation af DNA-DSBs19. Co-farvningsproceduren for γ-H2AX og 53BP1 er en standardprocedure til påvisning af DNA-DSBs. Dannelse af γ-H2AX foci er forbundet med rekruttering af 53BP1, en regulator afDNA-skadesrespons 23. Forskellige cellelinjer kan dog variere i baggrundsniveauerne γ-H2AX /53BP1 foci 11. Det er blevet påvist, at γ-H2AX foci tiltrækker reparationsfaktorer18, hvilket akkumulerer en højere koncentration af reparationsproteiner tæt på et DSB-anlæg. Jo mere komplekse DNA-DSBs, jo større γ-H2AX foci og jo højere niveauer af reparation proteiner. Det aktiverer en kaskade af reparationsveje, hvis reparationsfaktorer akkumuleres i en højere koncentration på et DSB-sted, kan de let påvises ved hjælp af specifikke antistoffer, og den foreslåede protokol gør det nemt at visualisere dem. Her demonstrerer vi en metode til at studere de biologiske virkninger på celleniveau for BNCT terapi virkningen af neutron-blandet stråle på DNA reparation ved hjælp af immunfluorescens teknik i humane tyktarmskræft celler. Forfatterne udviklede og introducerede trin-for-trin pålidelig protokol med specifikke antistoffer til påvisning af DNA reparation veje baseret på immunofluorescent farvning med et antistof specifikt for reparation faktorer fra NHEJ og HRR vej og observerede stråling-induceret foci (RIF). Desuden forfatterne foreslår brugen af HCT-116 tyktarmskræft cellelinje som en standard cellelinje for DNA-skader analyse og som en kontrol celle linje til test af DNA reparation antistoffer, fordi denne celle linje er selv rig på DSBs foci. DNA-DSBs er let påviselige, og forskellige cellelinjer, især kræftceller som livmoderhalskræft cellelinjen repræsenterer forskellige baggrundsniveauer af H2AX foci, og intensitet24.
Der er to store kritiske trin i protokollen, fiksering af celler, og immunsindsenende procedure. Forfatterne anbefaler fiksering af celler i 70% ethanol, da det bevarer celler i lang tid, og det er inkuberet i fryseren ikke mere end et par uger. Dette trin er også kritisk, da dette kan være pausepunkt, efter at bestrålingsproceduren udføres, f.eks. Et andet kritisk skridt er den korrekte koncentration af antistoffet. Forfatterne har vedhæftet de testede koncentrationer af primære og sekundære antistoffer i tabellen.
Den præsenterede procedure giver en trinvis protokol for at opnå pålidelige resultater, men nogle parametre kan ændre resultaterne af forsøgene, ligesom det korrekte valg af anvendte antistoffer, forskellige reagenser, der anvendes til fiksering og permeabiliseringstrin, inkubationstid, kritisk procentdel af reagenser, vasketrin, arbejde i mørke og det korrekte fluorescerende mikroskop. Forfatterne forklare, hvordan man får pålidelige og repeterbare resultater i noterne.
En mindre begrænsning af denne teknik er at have adgang til kilden til stråling som neutron kilde, men protokollen kan bruges som en generel protokol til påvisning af DNA reparation veje opnået efter forskellige typer af stråling og kan behandles som universel protokol for forskellige typer af stråling f.eks, sammenligne lav-LET og høj-LET stråling reparation veje aktivering.
Vi leverer en universel, klar-til-brug metode, der kan bruges på celleniveau til at analysere biologiske effekter i forbindelse med BNCT terapi. I BNCT bestråles ikke-radioaktivt bor-10 (f.eks. efter behandling med 4-Borono-L-phenylalanin, BPA – borleveringsmiddel) med termiske lavenergi neutroner, og som følge af den nukleare reaktions alfapartikler og lithium-7 kerner med høj LET produceres25,26. Derfor kan vores protokol være nyttig til analyse af biologiske virkninger på celleniveau også for stråling repræsenteret ved andre høje LET bjælker som protoner, der anvendes i proton strålebehandling27,og kulstof-ioner, der anvendes i hadron terapi28. Vi har observeret, at der er behov for mere detaljeret forskning inden for høj-LET-stråling og blandede bjælker, og viden om DNA-reparationsprocessen er nødvendig for at udvikle effektive anti-cancer behandlinger, derfor har vi udviklet en protokol, der gør det muligt at forske stråling-induceret DNA-skade respons aktiveret af neutron-blandet stråle. Desuden kan immunfluorescensmetoden til påvisning af DNA-skadesrespons og DNA-reparation være en potentiel metode til vurdering og påvisning af tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Neutronblandet stråle bestående af neutron-/gammastråling blev åbnet fra Maria-forskningsreaktoren i Det Nationale Center for Nuklear Forskning i Polen. K.M.O. blev støttet af National Science Centre, Polen (Miniatura 2) #2018 tilskud nr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , Springer. Tokyo. 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M.
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , geaa011 (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), Basel. 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), Basel. 66 (2017).
