Summary
Her er fire metoder for generering av testikkelorganoider fra primære neonatale murine testikkelceller beskrevet, det vil vil at ekstracellulær matrise (ECM) og ECM-frie 2D- og 3D-kulturmiljøer. Disse teknikkene har flere forskningsapplikasjoner og er spesielt nyttige for å studere testikkelutvikling og fysiologi in vitro.
Abstract
Testicular organoider gir et verktøy for å studere testikkelutvikling, spermatogenese, og endokrinologi in vitro. Flere metoder er utviklet for å skape testikkelorganoider. Mange av disse metodene er avhengige av ekstracellulær matrise (ECM) for å fremme de novo vev montering, men det er forskjeller mellom metoder i form av biomimetisk morfologi og funksjon av vev. Videre er det få direkte sammenligninger av publiserte metoder. Her er en direkte sammenligning gjort ved å studere forskjeller i organoid generasjonsprotokoller, med gitte resultater. Fire arketypiske generasjonsmetoder: (1) 2D ECM-fri, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-fri, og (4) 3D ECM-kultur er beskrevet. Tre primære benchmarks ble brukt til å vurdere testikkelorganoid generasjon. Dette er cellulære selvmontering, inkludering av store celletyper (Sertoli, Leydig, bakterie og peritubular celler), og riktig compartmentalized vev arkitektur. Av de fire miljøene som ble testet, genererte 2D ECM og 3D ECM-frie kulturer organoider med interne morfologier som ligner mest på innfødte testiklene, inkludert de novo compartmentalization av rørformede versus interstitielle celletyper, utvikling av tubule-lignende strukturer og en etablert langsiktig endokrine funksjon. Alle metoder studert benyttet usortert, primære murine testicular celle suspensjoner og brukes allment tilgjengelig kultur ressurser. Disse testicular organoid generasjon teknikker gir en svært tilgjengelig og reproduserbar verktøykasse for forskningsinitiativer i testicular organogenese og fysiologi in vitro.
Introduction
Testicular organoider er en banebrytende teknikk for å studere testikkelutvikling, spermatogenese og fysiologi in vitro1,,2,,3,,4. Flere metoder har blitt utforsket for organoid generasjon; Disse inkluderer en rekke ekstracellulære matrise (ECM) og ECM-frie kultursystemer, i både todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) retninger. Ulike generasjonsmetoder kan fremme distinkte cellulære monteringsstrategier; dette resulterer i et høyt nivå av morfologiske og funksjonelle variasjoner mellom publiserte organoidmodeller. Formålet med denne artikkelen er å diskutere den nåværende tilstanden til in vitro testikkelmodeller, og å tjene som en mal for fremtidige etterforskere, når du utformer testikkelorganoide eksperimenter. I den nåværende studien er fire forskjellige kultursystemarketyper definert og karakterisert i eksperimentell prosess og biologisk utfall. Disse inkluderer: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free og 3D ECM kultur metoder. Strategiene som presenteres her, er ment å være enkle, tilgjengelige og svært reproduserbare mellom ulike laboratorier og forskningsgrupper.
Historisk for testis, betegnelsen "in vitro", har blitt brukt til flere forskjellige kulturmetoder for testikkelvev og celler. Disse inkluderer organotypisk vev / organ kultur metoder (det vil si explant kultur)5, isolert seminiferous tubule kultur6,testicular celle kultur7, og metoder for de novo vev morphogenesis (det vil si biologiske konstruksjoner og organoider)1. De første undersøkelsene av in vitro spermatogenese ble utført for ca 100 år siden, med kulturen av kanin testis explants i 19208, og senere i 1937 med musen explants9. Innenfor disse første forsøkene spermatogonia ble observert å i stor grad degenerere over den første uken av kultur, selv om noen meiotically differensiering celler ble identifisert. Som minner om disse historiske rapportene, testis explant kultur ble gjenopplivet og optimalisert i 2011 for å bli en mulig teknikk for å studere testis10. Siden 2011, explant kultur har produsert fruktbarhet kompetent sperm i flere rapporter11,12,13. Likevel, på grunn av explant kulturens avhengighet av eksisterende innfødte testis tubuli, disse siste fremskrittene er mer nøyaktig beskrevet som eksempler på "ex vivo" testicular funksjon og spermatogenese, vev funksjon som ble opprettholdt eller gjenopptatt ved fjerning fra kroppens kropp. Til tross for sin utbredelse i litteraturen, langsiktig bakteriecellevedlikehold og differensiering innen testikkel explants er utfordrendeå gjenskape 14,15,16,17,18, spesielt over tidsrammer lenge nok til å fullt ut observere in vitro spermatogenese (~ 35 dager i mus19 og 74 hos mennesker20). Det er spennende å sette pris på at mange av de samme utfordringene opplevd 100 år siden, er fortsatt opplevd innen ex vivo spermatogenesis i dag.
Forskjellig fra ex vivo tilnærminger, testicular organoider er de novo montert mikrotissuer generert helt in vitro fra cellulære kilder (f.eks. primære testikkelceller). Testicular organoider gir en kreativ strategi for å omgå feltets historiske avhengighet av eksisterende innfødt vev, og å rekafulere testikkelbiologi helt in vitro. Det er flere krav som deles av de fleste organoide vevsmodeller; disse inkluderer (1) in vivo-mimetic vev morfologi eller arkitektur, (2) flere store celletyper av representert vev, (3) selvmontering eller selvorganisme i sin generasjon, og (4) evnen til å simulere noen nivå av representert vev funksjon og fysiologi21,,22,,23,24. For testis, dette kan fanges i fire store kjennetegn: (1) inkludering av store testikkelcelletyper, bakterie, Sertoli, Leydig, peritubular og andre interstitielle celler, (2) celle-rettet vev montering, (3) hensiktsmessig compartmentalized celletyper i separate rørformede rom (bakterie og Sertoli) og interstitielle regioner (alle andre celletyper), og (4) en viss grad av vev funksjon (f.eks reproduktive hormon sekresjon eller vev svar, og bakterie celle vedlikehold og differensiering). Tatt i tanke på de historiske utfordringene med å opprettholde bakteriecelledilatering ex vivo og in vitro, er oppsummeringen av in vivo-mimetiske testikkelarkitekturer (f.eks. strukturer som ligner seminiferøse tubuli) med flere markører som antyder simulering av testikkelfysiologi (f.eks. endokrine funksjon), prioriterte milepæler mot generering av organoider som en dag kan opprettholde in vitro spermatogenesis.
De fleste publiserte testikkelorganoidmetoder drar nytte av kommersielt tilgjengelige ECM (f.eks. kollagen eller proprietære ECM-formuleringer)25,,26,,27 eller spesialutlede ECM-er (f.eks. decellulariserte tester ECM-avledede hydrogeler)28,,29,,30. Eksogen ECM fremmer de novo vevdannelse gjennom å gi et monteringsstøttende stillas for vevsgenerering. ECM metoder har gitt et imponerende nivå av vevdannelse, inkludert noen bakteriecelle tilstedeværelse og vev-mimetisk morfologi25,28. EcMs de benytter er imidlertid ikke alltid universelt tilgjengelige (f.eks. decellulariserte ECM-avledede hydrogeler), og noen metoder krever sofistikerte gel- og cellesåingsretninger (f.eks. 3-lags graderinger av ECM og 3D-utskrift)25,,31,,32. Stillasfrie metoder (f.eks. hengende dråpe og ikke-adhegerent kulturplater)33,34,35 har også generert robuste og svært reproduserbare organoider uten behov for ECM geler eller stillas. Imidlertid er vevmorfologien til disse stillasfrie organoidene ofte forskjellige fra in vivo testiklene, og de fleste av disse rapportene inkluderer et biokjemisk ECM-additiv for å fremmevevsdannelse 33,34,,36eller alternativt stole på sentrifugering for tvungen celleaggregasjon ogkomprimering 34,noe som gjør dem mindre ideelle for å studere cellerettet migrasjon og selvorganisering.
De fire organoidgenerasjonsmetodene som presenteres i dette manuskriptet inkluderer både ECM-avhengige og uavhengige strategier, som hver bruker enkel cellesåing som muliggjør observasjon av celledrevet organoid selvmontering. Alle fire teknikkene kan utføres fra de samme cellesuspensjonene eller kan gjøre bruk av tilpassede og celle-type berikede populasjoner. En styrke av disse metodene er evnen til å observere organoider selvmontering i sanntid, og å direkte sammenligne hvordan testikkelstrukturer selv monterer mellom ulike kulturmikromiljøer. De fenotypiske forskjellene mellom disse fire kulturmetodene bør vurderes for deres innvirkning på forskningsspørsmålet eller gjenstand for utprøver. Hver metode produserer biologiske konstruksjoner eller organoider innen 24 timer eller mindre. Til slutt gir metodene som presenteres her en verktøykasse med organoide monteringsteknikker for å studere testikkelorganoid montering, vevsutvikling og testikkelfysiologi in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museeksperimenter ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Northwestern University, og alle prosedyrer ble utført under IACUC-godkjente protokoller.
1. Tilberedning av enzymatiske vevdissosiasjonsløsninger
- Bruk to forskjellige enzymatiske løsninger (løsning 1 og løsning 2), begge laget ved hjelp av en basalkulturmediumløsning (BM).
- For å forberede BM, tilsett serum og penicillin-streptomycin til minimum essensielle middels til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 10 % og 1 %(se Materialtabell for spesifikke reagenser). Deretter sterilt filter BM gjennom en 0,22 μm filter. Før bruk med celler, pre-likevekt steril BM til en nøytral pH ved å dispensere inn i en kulturrett og plassere innenfor en fuktet, 5% CO2 inkubator ved 37 °C i minst 1 time.
MERK: BM kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke, hvor etter som frisk BM skal lages. - For å forberede kollagennase lager jeg løsninger, først oppløse 100 mg kollagennase I i 1 ml steril embryo klasse H2O (endelig konsentrasjon 10% m / v), invertere eller virvle for å oppløse, og lagre 20 μL aliquots ved -20 ° C for senere bruk. Aliquots bør tines bare én gang.
- For å forberede deoksyribonukleærer I (DNase I) lagerløsninger, tilsett 20 mg DNase I i 1 ml steril embryoklasse H2O (endelig konsentrasjon 2% m/v), inverter eller virvle for å oppløse (ikke vortex), og oppbevar 20 μL aliquots ved -20 °C til senere bruk. Aliquots bør tines bare én gang.
- For hyaluronidase lagerløsninger, tilsett 30 mg i 1 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS; endelig konsentrasjon 3% m/ v hyaluronidase i PBS som inneholder Ca++/ Mg++), inverter eller virvler for å oppløse, og lagre 100 μL aliquots ved -20 ° C for senere bruk. Aliquots kan tines og fryses på ny flere ganger uten tap av enzymatisk aktivitet.
- For å forberede dissosiasjonsløsning 1,tilsett 10 μL kollagennase I og 10 μL DNase I i 1 ml steril, pre-likevektet BM (Endelige konsentrasjoner: 1 mg / ml kollagenase I og 5 μg / ml DNase I). Triturre forsiktig med en pipette for å blande løsningen, og forvarm til 37 °C før bruk med vevet.
MERK: Oppløsning 2 fremstilles ved å tilsette 33 μL hyaluronidase (førkrigs til 37 °C) per 1 ml oppløsning 1 (til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml). Dette skjer midtveis gjennom enzymatisk dissosiasjon av testisvev i trinn 2,5 nedenfor.
2. Testis vev dissosiasjon
MERK: Alle mus ble plassert i polypropylenbur og utstyrt med mat og vann ad libitum. Dyr ble matet bestrålt chow som ikke inneholder fytoøstrogener. Juvenile CD-1 mus, 5 dager etter partum (dpp), ble brukt til alle eksperimenter og bedøvet før eutanasi og vev samling, i et anestesikammer festet til en isofluran fordamper (2,5 l / min i O2). Mus ble bekreftet for full anestesi via fravær av respons på tå-stikk, hvor etter hvilke mus ble eutanisert via halshugging.
- Bedøve mus i et isoflurankammer, sikre anestesi via en tå-prikk, og halshugge musen ved hjelp av en skarp saks. Plasser den eutaniserte musen liggende på en disseksjonsmatte og steriliser magen med 70% etanol. Telt huden i underlivet med tang og åpne magen med saks.
- Finn testiklene i nedre venstre og høyre inngangsregioner av magen. Klipp sine forbindelser til vas deferens og eventuelle forankring bindevev, løft deretter hele testis (med epididymis fortsatt festet) fra dyret. Plasser testiklene i en petriskål med forhåndsutjevn BM.
- Under et disseksjonsmikroskop og innenfor et sterilt felt, gjør et lite snitt i tunikaalbuginea på den ene enden av hver testis med enten en liten mikrodisseksjonsaks eller ved å rive forsiktig ved hjelp av to fine tang.
- Deretter, mens du holder testis fra motsatt ende av snittet, klem forsiktig testis med fine tang og skyv i en mild feiende bevegelse mot hullet i tunikaen; dette vil frigjøre testikkelvevet som ett sammenhengende stykke.
- Skjær testiklene i mindre biter (≤ 2 mm3) og plasser dem i 1 ml forhåndsoppvarmet (37 °C) dissosiasjonsløsning 1.
- Inkuber ved 37 °C i 10 min.
- For mer enn 10 testiklene kan du øke det totale dissosiasjonsløsningsvolumet med 1 ml, noe som sikrer minst 1 ml dissosiasjonsløsning per 10 testikler (f.eks. 2 ml for 20 testiklene, 3 ml for 30 testiklene osv.).
- Triturat testis stykker 50 ganger (50x) i løsning 1 ved hjelp av en P1000 pipette. Sørg for at tubuli atskilt fra hverandre og fra interstitiell vev på dette punktet. Hvis klumper gjenstår, inkuber i ytterligere 5 min og triturere igjen (50x).
- Tilsett 33 μL hyaluronidase lageroppløsning (forvarmet ved 37 °C, fra trinn 1,5) per 1 ml oppløsning 1 dissosiasjonsblanding (som inneholder delvis dissosiert testikkelvev og tubuli). Etter å ha lagt hyaluronidase, kalles dette løsning 2.
- Triturat (50x) ved hjelp av en P1000 og inkuber ved 37 °C i 5 min.
- Triturat (50x) ved hjelp av en P200 pipette.
- Sørg for at det på dette punktet ikke finnes synlige tubuli eller klumper av celler. Hvis klumper vedvarer, inkuber i opptil 5 min, med ytterligere triturasjon ved hjelp av en P200 pipette (50x).
- Slukke dissosiasjonsenzymene ved å tilsette føtal storfeserum (FBS) til 10 % av det totale volumet av oppløsning 2. Triturre flere ganger ved hjelp av en P200 pipette for å sikre at ingen klumper gjenstår, og filtrere gjennom en 40 μm celle sil for å produsere en encellede suspensjon.
- Sentrifugeceller ved 100 x g i 7 min, kast supernatanten og gjenoppliv cellene i frisk BM.
- Tell de totale og levedyktige cellekonsentrasjonene ved hjelp av trypan blå eksklusjon på et hemocytometer. Tilsett 10 μL 1:1 fortynnet, cellefjæring: trypan blå oppløsning, i hemocytometeret celletellingskammeret (se Materialtabell).
- Re-sentrifugeceller ved 100 x g i 7 min og resuspend i frisk BM.
MERK: Bruk kun levedyktige celler til beregning av cellekonsentrasjon og tall. Bruk bare cellesuspensjoner på ≥ 80% levedyktighet for å generere organoider. - Forbered enkeltcellesuspensjonen i cellekonsentrasjoner som beskrevet for å aliquot 280.000 celler gitt volumene som brukes i protokollen spesifikke trinnene nedenfor i avsnitt 3: 2D ECM-Free - 0,56 x 106 celler / ml, 2D ECM – 0,56 x 106 celler/ ml, 3D ECM-Free – 4,66 x 106 celler/ml, 3D ECM – 2,8 x 106 celler/ml.
MERK: Alle kultureksperimenter som presenteres her starter med 280.000 celler sådd per kultur godt. Disse tallene samsvarer med de representative dataene i figur 1, figur 2, figur 3 og figur 4.
- Re-sentrifugeceller ved 100 x g i 7 min og resuspend i frisk BM.
3. Utarbeidelse av organoid kultur retter og såing av celler
MERK: For å sikre en homogen ECM, pre-tin frosne aliquots av ECM over natten før eksperimentering. ECM aliquots bør senkes ned i en bøtte med is i et 4 ° C kjøleskap eller kaldt rom for å garantere en langsom, gradvis økning i temperaturen. All ECM brukes på en 1:1 endelig fortynning i BM for kultur. Hold tint ECM og 1:1 fortynnet ECM på is til umiddelbart før bruk, ellers kan ECM polymerisere for tidlig.
- For 2D ECM-fri kultur er det ikke nødvendig med spesielle preparater, plate enkeltcellesuspensjoner (500 μL på 0,56 x 106 celler/ml i BM) direkte på 4-brønnkammersklier, og plasser i en 35 °C inkubator for kultur.
MERK: Celler bør holde seg til bunnen av kulturretten i løpet av de første 24 timer av kultur og kan vise noen små 3D-celleklynger innen samme tid. - For 2D ECM kultur, dispensere 100 μL kald 1:1 fortynnet ekstracellulær kjeller matrise medium i en 4 brønnkammer lysbilde, slik at gelen dekker helheten av parabolen bunnen.
- Plasser kammeret lysbildet i en 35 ° C inkubator i minst 30 min for å tillate ECM å polymerisere i en gel.
- Tilsett cellefjæringen (500 μL på 0,56 x 106 celler/ml i BM) direkte på toppen av 2D-gelen når den har polymerisert.
MERK: Celler skal klynge seg sammen for å danne små 3D-klynger i løpet av de første 24 timer av kulturen.
- For 3D ECM-fri kultur, forberede agarose 3D Petri parabolen innsatser før du starter cellekulturen.
- Først autoklav 1,5 g agarose pulver i en 100 ml beger, deretter legge 75 ml sterilt, destillert vann og mikrobølgeovn for å produsere smeltet 2% agarose for 3D Petri parabolen støping.
- Innenfor et sterilt arbeidsområde, dispensere smeltet agarose inn i 3D Petri parabolen mold til menisken er på nivå med sidene av formen.
- La agarose avkjøles og stivne. Når den er fast, snu formen opp ned og bøy forsiktig gjentatte ganger til den agarose 3D Petri parabolen faller fri fra formen.
MERK: På dette punktet kan man tilberede mange agarose 3D Petri retter og lagre dem i sterile H2O eller DPBS ved 4 ° C for oppover på en måned. - Før du dyrker, legg agarose 3D Petri retter i en 24 brønn kulturrett, og dekk dem med 1 ml BM. La 3D Petri retter likevekt i BM i minst 30 min innen en 37 ° C kultur inkubator. Kast BM, og gjenta likevekten igjen med 1 ml frisk BM. Etter likevekt av 3D Petri retter i BM, vil de vises i samme farge som BM (det vil vilørre rosa).
- For å forberede cellesåing, fjern all BM fra brønnen og dispenser 200 μL fersk BM rundt, men ikke inne i midtre fordypning av 3D Petri-parabolen. Samle også eventuelle gjenværende BM fra innsiden av den midterre celleseedede utsparingsfordypningen av mikrobrønninnsatsen.
- Dispenser enkeltcellesuspensjonen (4,66 celler/ml i 60 μL BM) inn i midtre fordypning av agarose 3D Petri-parabolen. Triturre opp og ned forsiktig for å blande celler og garantere en enkelt celle suspensjon i begynnelsen av kulturen.
- Plasser i en fuktet 35 °C inkubator for kultur. Neste dag fjerner du 200 μL BM fra rundt mikrobrønninnsatsen, og skift ut med 1 ml frisk BM. Dette vil bringe væskenivået over flyet av innsatsen, neddykking hele kulturen.
- Fjern langsomt og forsiktig/tilsett medier fra utsiden av den agarose 3D Petri parabolen. Organoidene skal ha komprimert over natten, slik at de kan hvile nederst og gjøre det mulig for medieendringer å forlate organoider uforstyrret.
- For 3D ECM kultur, forberede en enkelt celle suspensjon ved å kombinere, i like deler, celle suspensjon i BM med kald, pre-tint ECM (endelig konsentrasjon = 2,8 x 106 celler / ml).
- Utfør umiddelbart celle-ECM-blandingen i et 4-brønnkammersklie, slik at blandingen dekker hele bunnen av platen.
- Plasser kammeret lysbilder på 35 ° C i en inkubator og la innholdet polymerisere. Dette bør ta minst 30 min. Etter polymeriseringen legger du til 500 μL BM på toppen av kulturen.
MERK: Celler skal ha gruppert seg sammen for å danne små 3D-aggregater i løpet av de første 24 timer av kulturen.
4. Organoid vedlikehold
- Kultur alle organoid modelltyper ved 35 °C. For alle kulturtyper utveksler halvparten av mediene sine med fersk BM annenhver dag. For å sikre at organoider ikke samles ved et uhell mens du bytter medium, samler du alltid medier sakte fra et hjørne av kammerets skyvefat, og fra et eksternt punkt utenfor agarose 3D Petri-retter. Alle medier kan oppbevares ved -20 °C for bruk med immunanalyser eller andre analyser senere (det vil si kvantifisering av utskillede reproduktive hormoner eller cytokiner).
- Etter 7 dager i kulturen, bruk BM som inneholder follikkelstimulerende hormon (endelig konsentrasjon 20 mIU / ml) og humant choriongonadotropin (endelig konsentrasjon 4,5 IE / ml). Dette gjelder alle organoide kulturtyper.
- Avbild rutinemessig alle organoide kulturer (det vil vil vil at tidsforløp) for å karakterisere organoiddannelse og kvantifisere beregninger av selvmontering, utvikling og vekst over tid.
5. Organoid Samling
MERK: Alle organoider kan fikses med 4 % paraformaldehyd i PBS for nedstrøms immunolabeling og histologiske analyser. Fest i 2 timer ved romtemperatur med rotasjon, eller over natten ved 4 °C.
- For 2D ECM-frie kulturer må du først skylle prøven med fersk PBS, og legg deretter til fikseringsmiddel direkte på toppen av de vedslutne konstruksjonene.
- For ECM (2D og 3D) kultur metoder, skyll en gang med PBS, og deretter enten legge fikseringsmiddel direkte på toppen av ECM-organoid prøven (for å fikse ECM gel og organoider sammen), eller alternativt, forsiktig pipette organoider opp og ned for å frigjøre dem fra den omkringliggende ECM, og overføre til et eget rør for fiksering.
- For 3D ECM-fri kultur, forsiktig pipette organoider opp og ned i midten fordypningen av agarose 3D Petri parabolen; Dette vil skylle organoidene ut tilrettelegge for deres enkle samling med en pipette. Deretter overfører organoider til et eget rør for fiksering.
- Før behandling i parafin, bygg inn mange organoider (≥ 20) i et lite volum (~ 30 μL) av vevsbehandling gel; Dette bidrar til å orientere og konsentrere organoider i et lite område innenfor parafinblokker, noe som letter enklere observasjon ved snitting og enklere visuell identifikasjon innenfor parafinseksjoner.
MERK: Organoider kan være utfordrende å identifisere etter parafininnbygging og snitting på en mikrotom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoid generasjon ble ansett mislykket hvis testikkelceller ikke selv-montere innen 72 timer av kultur, men alle metoder presentert her montere innen 24 h ved bruk av juvenile (5 dpp) murine celler. Svikt i biologisk konstruksjonsgenerering presentert som en videreføring av fritt suspenderte celler (0 h kolonne i figur 1) selv etter utvidet kultur (72 h). I fravær av vev selvmontering, noen tilsynelatende celle klynger lett spredt i individuelle celler ved selv mild manipulasjon (det vil vilå pipettering). Vellykket generert vev ble opprinnelig observert som 3D-celle "klynger" (gule piler i 6 t kolonne av figur 1). Innenfor ECM-frie miljøer (2D og 3D) syntes disse konstruksjonene synlig å "komprimere" over de første 24 timene av kultur, spesielt når i 3D oppsto Petri retter (Figur 1A, C). I ECM-miljøer (2D og 3D) hadde celleklynger klare marger mellom klyngen og omgivelsene (figur 1B,D). Celleklynger ble også observert å migrere over ECM og smelte sammen danner større klynger (røde piler i figur 1B). Tiden det tar å sette pris på separate selvmonterte strukturer ble målt, og det var ingen signifikant forskjell i tid som kreves mellom både 2D og 3D ECM-frie forhold og 2D ECM, men 3D ECM kultur krevde betydelig mer tid til å montere de novo strukturer enn alle andre kulturmetoder (Figur 1E). 2D ECM-fri og 3D ECM-kultur genererte celleklynger med betydelig mindre størrelser enn 2D ECM og 3D ECM-frie kulturmetoder; 3D ECM-fri kultur produserte de største klyngene med en enkelt stor og kompakt klynge i hver brønn av 3D agarose Petri parabolen (Figur 1C, F). Oppsummert viser disse dataene hvor lett å produsere testikkeliske konstruksjoner fra unge mus primærceller i fire arketypiske kulturmiljøer og markere ulike cellerettede monteringsfenotyper innenfor disse forskjellige kulturmiljøene.
Et mål med alle organoidmodeller er å rekafulere en indre morfologi mimetisk av innfødt vev. For å vurdere for dette utfallet ble biologiske konstruksjoner satt sammen innenfor hver kulturtilstand dyrket i 72 timer og deretter undersøkt for cellespesifikke markører og visualisert med immunofluorescence (figur 2). Variabilitet i vevsmorfologi ble observert mellom ulike kulturmetoder. 2D ECM-frie organoider presentert som klynger av Sertoli-celler (SOX9 og βCatenin) med noen bakterieceller (DDX4, en pankimcellemarkør) festet på toppen av et 2D basalsammenhenglag som inneholder mange somatiske celler, inkludert Sertoli, peritubular (αSMA) og Leydig celler (3βHSD) (Figur 2A-D). Merk at figur 2B-D er epifluorescerende bilder av hele 2D ECM-fri prøven, ikke en 5 μm seksjon; Dette muliggjør visualisering av både basal somatisk cellelag og de overlegne orienterte aggregatene av Sertoli- og bakterieceller. I motsetning, 2D ECM kultur presentert med en stort sett forskjellig fenotype, som klare biologiske strukturer med forskjellige grenser ble lett skjelnet på toppen av basal ECM gel (Figur 2E). Disse strukturene hadde en kompleks indre morfologi med de novo compartmentalization av tubule vs interstitielle celletyper av testis, og så ble ansett som vellykkede organoider. Rørformede områder inneholdt sertoli-, peritubulære og bakterieceller, og interstitielle regioner inneholdt Leydig, peritubularceller og ikke-merkede celler (figur 2F-H). På samme måte hadde 3D ECM-frie organoider også en kompartalisert indre morfologi og ble derfor ansett som vellykkede organoider. Spesielt var 3D ECM-frie organoider preget av rørformede regioner som inneholder peritubulære celler som spesifikt orienterte rundt grupper av Sertoli- og bakterieceller med høy gjengivelse (figur 2I-L). 3D ECM montertstrukturer hadde ikke en sofistikert morfologi, men i stedet ble observert å være klynger av Sertoli celler, med sporadiskkim og Leydig celler. I disse prøvene forble mange Sertoli og umerkede celler suspendert mellom organoider i en "stromalignende" orientering (figur 2M-P). Sammen fremhever disse dataene variasjonen i morfologiske fenotyper som ulike organoidgenerasjonsmetoder produserer og støtter bruk av to spesifikke organoide monteringsmiljøer, 2D ECM og 3D ECM-fri, for generering av testikkelorganoider med en indre morfologi svært mimetisk av testikulær compartmentalization.
For ytterligere å vurdere testikkelorganoid funksjon ble 3D ECM-frie monterte organoider valgt for en dypere langsiktig analyse. For denne studien ble disse organoidene dyrket i 14 dager og deretter undersøkt for celle- og strukturspesifikke markører. Ved immunofluorescerende analyse ved 14 dager ble 3D ECM-frie organoider observert å inneholde tubulelignende strukturer (TLS) og en vevsarkitektur som ligner bemerkelsesverdig på in vivo testiklene (figur 3A-D). Interstitielle celler var riktig plassert i separate regioner fra TLS. Vevseksjoner ble deretter undersøkt for pankimcellemarkøren, DDX4, spermatogonial stamcellemarkør, SALL4 og meiosemarkør, SCP3 (figur 3E-G). Sjeldne DDX4-positive og SALL4-positive celler ble observert, men ingen SCP3-signal ble identifisert. Ved dypere karakterisering av TLS ble de observert å inneholde et lumen-vises rom omgitt av polariserte Sertoli celler og en ekstern monolayer av peritubular celler (Figur 3I-L). Sertoli celler viste også tette veikryss mellom hverandre, som visualisert med overføring elektron mikroskopi og med merking mot ZO-1, et junctional protein og komponent i blod-testis barrieren (Figur 3H, L). Deretter ble 3D ECM-frie organoider studert for endokrin funksjon i 12-ukers, langsiktig kultur med gonadotropinstimulering (figur 4). Testosteron og inhibin B, reproduktive hormoner fra Leydig og Sertoli celler henholdsvis, ble både identifisert og kvantifisert fra organoid betinget medium (figur 4A). Over 12-uker med kultur, begge hormoner ble målt for å reagere betydelig på tilskudd av gonadotropins FSH og hCG (rød pil betegner begynnelsen av tilskudd, i løpet av uker 2 – 12). Ved ferdigstillelse ble det utført en test for å avgjøre om endokrin respons ble bevart. Gonadotropiner ble fjernet i 48 timer, der både testosteron og inhibin B konsentrasjoner betydelig redusert i konsentrasjon. Etter 48 timer ble gonadotropiner returnert til kultur og begge hormonkonsentrasjonene økte betydelig igjen over en endelig 24 timer, noe som viste riktig endokrine respons (figur 4B). Samlet viser disse histologiske og endokrine analyseresultatene at testikkelorganoider er en nyttig modell for å studere testikkelutvikling (f.eks. de novo compartmentalization og tubulogenesis) og somatisk celle testikkelfunksjon in vitro (f.eks. tett koblingsdannelse og endokrin funksjon).
Figur 1: Organoider selvmontering i 2D og 3D, ECM og ECM-frie kulturforhold.
5 dpp murine testicular celler ble dyrket i fire forskjellige forhold: 2D ECM-fri (rad A),2D ECM (rad B),3D ECM-fri (rad C)og 3D ECM (rad D). Grafikk som viser kulturmetoden er gitt i venstre kolonne. Representative bildemontasjer ble satt sammen fra tidsforløpsbilder tatt under den levende kulturen. Tidspoeng for hvert bilde er merket med toppmargen. Tid 0 h er før noen organoid montering har skjedd, tid 3 h er under pågående celledrevet organoid montering, og ganger 6 h og 9 h demonstrere representative, vellykket dannet organoider. Gule piler markerer celleklynger og røde piler markerer plasseringer der separate celleklynger overføres og slås sammen. Alle skalastenger = 1 mm. (E) Tid som kreves før separate celleklynger kunne verdsettes synlig, ble registrert for hver betingelse. 2DF = 2D ECM-fri; 2DE = 2D ECM; 3DF = 3D ECM-fri; 3DE = 3D ECM. (F) Areal per klynge ble målt for hver kulturtilstand. Bilder ble valgt fra n = 3 - 5 separate eksperimenter. Enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest ble brukt til å bestemme betydning i 1E og 1F; grafer ble satt sammen ved hjelp av n=4 separate eksperimenter. Dette tallet er endret fra Edmonds og Woodruff37. © IOP-publisering. Gjengitt med tillatelse. Alle rettigheter reservert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 2D ECM og 3D ECM-frie kultiverte organoider viser compartmentalization av rørformede og interstitielle celletyper.
Representative brightfield og immunofluorescent bilder av selvmonterte organoider etter 72 timer kultur. 2D ECM-frie prøver ble avbildet hele braketten, alle andre prøver ble avbildet i 5 μm vevsseksjoner. (A - D) 2D ECM-fri kultur. (E – H) 2D ECM kultur. (I – L) 3D ECM-fri kultur. (M – P) 3D ECM kultur. Cellespesifikke markører som brukes til analyse er merket på toppmargen: Sertoli cellekjerner (SOX9) og cellelegemer (βCatenin), bakterieceller (DDX4, en pankimcellemarkør), Leydig-celler (3βHSD) og peritubulære celler (αSMA). Alle fluorescerende prøver ble co-farget for DNA med DAPI. Gule piler peker på DDX4-merkede bakterieceller i den andre kolonnen fra venstre, røde piler peker på Sertoli-celleklynger i de to høyre kolonnene. Lyse feltskalastenger = 400 μm, fluorescerende skalastenger = 100 μm. Dette tallet er endret fra Edmonds og Woodruff37. © IOP-publisering. Gjengitt med tillatelse. Alle rettigheter reservert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Organoider utvikler tubulelignende strukturer befolket av sjeldne bakterieceller.
3D-ECM-frie monterte organoider ble dyrket i 14 dager. (A-D) Representative H&E- og immunofluorescerende bilder som beskriver celletyper og vevsfunksjoner rundt tubulelignende strukturer (TLS); samme organoid er avbildet i tilstøtende vevsseksjoner som muliggjør side-ved-side sammenligning av morfologiske egenskaper: Leydig celler (3βHSD), peritubulære celler (αSMA), Sertoli cellelegemer (βCatenin), kollagenmembran (COL IV) og Sertoli cellekjerner (SOX9); skala stenger = 100 μm. (E - G) Immunofluorescerende merking ble utført mot bakterieceller, inkludert en pankimcellemarkør (DDX4), spermatogonial stamcellemarkør (SALL4) og meiotically aktive spermatocytter (SCP3). Svært forstørrede innsetter er skissert av gule paneler i 3E og 3F. Grønne trekanter peker på DDX4-merkede celler; Røde piler peker på SALL4-merkede celler. (H)Representativ overføring elektronmikrograf (TEM) av et tett knutepunkt mellom Sertoli-celler i en organoid; TEM vektstangen = 100 nm. (I - L) Høye forstørrelsesrepresentanter bilder av en TLS merket for viktige funksjoner i det seminiferøse epitelet, inkludert tette veikryss (ZO1) og laminin. Den samme TLS er avbildet i tilstøtende vev seksjoner i paneler I – L. Alle fluorescerende prøver ble co-farget for DNA med DAPI. Bilder ble valgt fra n=7 separate biologiske eksperimenter. Dette tallet er endret fra Edmonds og Woodruff37. © IOP-publisering. Gjengitt med tillatelse. Alle rettigheter reservert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Organoider utskiller testosteron og inhibin B over 12-ukers kultur som svar på gonadotropiner FSH og hCG.
Besamlede medier samlet inn fra 3D-ECM-frie organoider ble målt for testosteron og inhibin B via enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA). (A) Organoider ble dyrket i tolv uker, med FSH og hCG tilskudd i uke 2 - 12 (begynnelsen av tilskudd er merket med en rød pil på x-aksen); alle verdier ble sammenlignet med kulturdag 7 for statistiske tester. (B) Forstørret graf av en "re-stimuleringstest" for å avgjøre om endokrin respons ble bevart etter 12 uker. Perioden for testen er skissert av den grå boksen i 4A. Ved ferdigstillelse av 12-uker i kultur, gonadotropins ble fjernet i 48 timer og deretter re-supplert for en endelig 24 timer kultur. Hormoner ble målt ved 0, 2, 6, 12 og 24 timer etter gonadotropin restimulering; rødskyggede områder angir tidsperioder under kultur med FSH og hCG, ikke-skyggelagte områder angir tidsperioder uten FSH og hCG; bemerket p-verdier er i forhold til 2 timer etter re-stimulering. Toveis ANOVA med Tukeys test for flere sammenligninger ble brukt til å bestemme betydning for alle endokrine data, n=5 separate biologiske eksperimenter. Dette tallet er endret fra Edmonds og Woodruff37. © IOP-publisering. Gjengitt med tillatelse. Alle rettigheter reservert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med ferdigstillelse av denne organoid generasjon protokollen, brukeren vil ha fire forskjellige kultur teknikker tilgjengelig for dem for montering testicular konstruksjoner og organoider i enten ECM eller ECM-frie miljøer. Viktigere, alle fire metoder tillate forskeren å ikke-invasivt observere organoid selvmontering over tid gjennom time-lapse imaging eller videoopptak, og å ikke-invasivt samle inn betinget media for analyse av utskillede hormoner og cytokiner, uten forstyrrende vev under kultur. I alle metoder, i løpet av 24 timer, kan en eksperimenterer generere så mange som flere hundre organoider / testikkelkonstruksjoner, som celletall tillater. Disse metodene fremmer vev selvmontering i konstruksjoner med forskjellige størrelser og morfologier; organoid størrelse avhenger av cellenummer og konsentrasjon som brukes i kultur, som sett i andre organoid rapporter34. Redusere organoid størrelse eller diameter kan bidra til å redusere utviklingen av indre områder av nekrose som noen ganger finnes i større organoider. En spesiell styrke på 2D ECM og 3D ECM-frie protokollmetoder er deres evne til å generere morfologisk mimetiske testikkelorganoider, som inneholder de novo compartmentalization av rørformede versus interstitielle celletyper. Videre gir 3D ECM-frie monterte organoider en modell for de novo tubulogenesis av seminiferøs TLS, med riktig compartmentalized og orienterte Sertoli og peritubular celler. Dette er en viktig fenotype for å studere testikkelorganoider, og er fortsatt et variabelt resultat blant ulike testikkelorganoide rapporter; flere andre rapporter mangler tubule versus interstitium compartmentalization og noen selv utvikle en "inside-out tubule" fenotype32,33,34,38. Mens ingen av organoid generasjon metoder presentert i dagens manuskript var preget for å opprettholde store bakteriecellepopulasjoner over lengre dager med kultur, som bakterieceller ble sjelden observert så tidlig som 72 h, både 2D ECM og 3D ECM-frie metoder kan gi et nyttig verktøy for å studere in vitro tubulogenesis og den somatiske cellekomponenten i en spermatogonial nisje miljø. Med dette målet i tankene gir testikkelorganoider en potensiell plattform for å optimalisere fremtidige protokoller for å forbedre in vitro germline stamcellevedlikehold, meiotisk progresjon og differensiering.
En annen fordel med disse protokollene er evnen til å tilpasse og skalere organoid generasjon. Tilpassede, legemiddelbehandlede eller konstruerte cellepopulasjoner kan erstatte, eller brukes i tillegg til primærmustestikkceller37. Hvis cellesuspensjoner har lav levedyktighet (<80 %), bør det tas metoder for å forbedre cellebrukbarheten til cellulær suspensjon. Disse kan omfatte å redusere tiden brukt i dissosiasjonsmedier og minimere triturasjon under vevsfordøyelse (trinn 2.4.1 – 2.5.2), øke antall vasker etter dissosiasjon, eller fjerne døde celler etter dissosiasjon med cellesortering eller dødcellemerkingssett. Ingen av disse trinnene var imidlertid nødvendige for å produsere de representative dataene som ble delt i denne rapporten. For 2D- og 3D ECM-kulturmetoder kan disse protokollene brukes sammen med andre strukturelle proteinbaserte biomaterialer i tillegg til de som brukes til studiene som presenteres her. Disse andre biomaterialene inkluderer kollagen, gelatin, kommersielt tilgjengelige ECM-ekstrakter og skreddersydde decellulariserte ECM-avledede hydrogeler25,,26,,28. Det er noen tips for feilsøking ECM gel dispensering og skape høy kvalitet agarose 3D Petri parabolen innsatser. Når du kaster ECM geler på kammerplater, sørg for å arbeide raskt og bruke kalde pipettespisser for å forhindre for tidlig polymerisering av ECM i et rør eller pipettespiss før du dispenserer i kulturfatet. Ved støping av smeltet oppsto i 3D Petri-parabolen former (for 3D ECM-fri kultur), bruk bare varm og ikke varm agarose for å sikre høy kvalitet støping av innsatsene med minimal variasjon, og kontroller at agarose har helt avkjølt til romtemperatur og størknet før du prøver å fjerne fra formen. Agarose 3D Petri retter håndteres best forsiktig med fine tang. Når du samler organoider for fiksering, sørg for å jobbe under et disseksjonsmikroskop for å visualisere samlingen av alle organoider. Organoider kan holde seg til plastsiden av kulturretter og innsiden av pipettespisser; glasspipetter viser mindre organoid etterlevelse enn plast. Å fikse organoider mens de fortsatt er innkapslet i eller på toppen av ECM er en mer utfordrende og delikat prosess enn å fjerne dem fra ECM før fiksering. Vevsbehandling gel kan kastes over ECM-organoid konstruere før fjerning fra kulturkammeret for å bidra til å forsterke gelen før fiksering39. Fiksering bør utføres ved romtemperatur for å hente ECM hydrogeler som de er sannsynlig å de-polymerisere hvis senket til 4 ° C. I tillegg kan 0,1 % - 1,0 % glutaraldehyd legges til 4 % PFA-løsningen for å bidra til å kryss-koble ECM ytterligere; Denne metoden øker imidlertid autofluorescence av prøven.
Det er betydelige bakteriecellespesifikke begrensninger for resultatene oppnådd ved organoidgenerasjonsmetodene som presenteres ovenfor, som representerer prioriterte områder for fremtidig innovasjon. Bakterieceller er dårlig støttet over utvidet kultur, observeres bare lett i løpet av de første dagene av kulturen og observeres sjelden ved slutten av den første uken av kultur og senere tidspunkter. Mens udifferentierte spermatogonia kan opprettholdes innenfor in vitro cellekultur samtidig som de opprettholder deres evne til å gjenopprette spermatogenese ved transplantasjon til in vivo tubuli40, tubuli somatisk mikromiljø (f.eks. direkte Sertoli celle interaksjoner) er hypotetisk å være en forutsetning for differensiering pre-meiotic bakterieceller i og gjennom meiose og spermiogenese in vitro1,5,40,41. Testicular organoider som inneholder spermatogonia på tidlige tidspunkter innenfor en strukturelt mimetisk TLS kan gjøre det mulig for feltet å ikke-invasivt studere somatisk-somatisk-somatiske, og somatiske-bakteriecelleinteraksjoner helt in vitro. Optimalisering av tilsetningsstoffer og celleforberedelser før kultur (f.eks. inkorporering av midler som brukes til in vitro spermatogonial stamcellekultur)42,43 kan øke utbyttet av bakterieceller i fremtidige studier, spesielt over kulturperioder lenger enn flere dager. Omvendt har metoder for å gjeninnføre spermatogonia etter TLS dannet, for eksempel gjennom mikroinjeksjon, en interessant mulighet til å gjenopprette bakterieceller i organoider, og teste evnen til in vitro organiserte somatiske miljøer for å opprettholde bakterieceller. Andre biologiske faktorer har blitt observert for å påvirke ex vivo explant kultur, inkludert alder / modenhet45 og genetiske bakgrunnsforskjeller17. De samme variablene har ennå ikke blitt direkte undersøkt innen testikkelorganoid biologi. Det er imidlertid sannsynlig at ulike monterings-, morfologi og funksjonelle fenotyper kan oppstå når organoider genereres fra celler isolert fra forskjellige eldre dyr (det vil si neonatal, juvenil, voksen), eller dyr med varierende genetisk bakgrunn (f.eks. forskjellige musestammer).
Oppsummert gir teknikkene som deles i dette manuskriptet fire nyttige modeller for å studere celledrevet testikkelkonstruksjon selvmontering, generering av to separate strukturelt mimetiske testikkelorganoidmodeller, og den viktige oppnåelsen av TLS-utvikling og hormonresponsiv endokrine funksjon in vitro. Disse modellene omfatter 2D- og 3D-romlige orienteringer i ECM- og ECM-miljøer med minimalt komplekse, fullstendig definerte kulturmedier. Hver metode er svært reproduserbar og bruker bare allment tilgjengelige kulturressurser. Disse metodene kan være en fordel for å studere testicular morphogenesis in vitro og optimalisere fremtidige kulturforhold for in vitro spermatogenese. Mer så, 2D ECM og 3D ECM-frie metoder gir et nytt verktøy for å studere prosessen med de novo vev compartmentalization unik for testis, in vitro tubulogenesis, og somatisk-somatiske og somatiske-bakterie celle interaksjoner. Testicular organoider gir en fleksibel og skalerbar mulighet til å undersøke utvikling og regulering av somatiske testikkelfysiologiske kjennetegn; inkludert blod-testis barriere og endokrine produksjon og respons; og også et nyttig verktøy for å utvikle neste generasjons translasjonelle forskningsvevsmodeller. Disse inkluderer innlemme reproduktive hormoner i større systemer-nivå modeller, som vev-on-a-CHIP og mikro-fysiologiske plattformer45,,46. Andre translasjonelle mål som testicular organoider kan en dag brukes inkluderer reproduktiv toksikologi og immunologisk barriere testing, mannlig prevensjonsmiddel utvikling, og assistert reproduktiv teknologi innovasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 og 4UH3ES029073-03, og Thomas J. Watkins memorial professorship.
Forfatterne vil gjerne takke Eric W. Roth for deres hjelp med overføring elektron mikroskopi. Dette arbeidet benyttet seg av BioCryo-anlegget ved Northwestern University's NUANCE Center, som har fått støtte fra Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); MRSEC-programmet (NSF DMR-1720139) ved Materials Research Center; Det internasjonale institutt for nanoteknologi (IIN); og delstaten Illinois, gjennom IIN. Det gjorde også bruk av CryoCluster utstyr, som har fått støtte fra MR-programmet (NSF DMR-1229693). Grafikk i figur 1 ble designet ved hjelp av BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
