Summary
Qui vengono descritti quattro metodi per generare organoidi testicolari da cellule testicolari murine neonatale primarie, cioè matrice extracellulare (ECM) e ambienti di coltura 2D e 3D senza ECM. Queste tecniche hanno molteplici applicazioni di ricerca e sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo testicolare e la fisiologia in vitro.
Abstract
Gli organoidi testicolari forniscono uno strumento per studiare lo sviluppo testicolare, la spermatogenesi e l'endocrinologia in vitro. Sono stati sviluppati diversi metodi per creare organoidi testicolari. Molti di questi metodi si basano sulla matrice extracellulare (ECM) per promuovere l'assemblaggio dei tessuti de novo, tuttavia, ci sono differenze tra i metodi in termini di morfologia biomimetica e funzione dei tessuti. Inoltre, vi sono pochi confronti diretti dei metodi pubblicati. Qui, viene effettuato un confronto diretto studiando le differenze nei protocolli di generazione organoide, con i risultati forniti. Vengono descritti quattro metodi di generazione archetipica: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free e (4) 3D ECM culture. Tre parametri di riferimento primari sono stati utilizzati per valutare la generazione organoide testicolare. Questi sono l'auto-assemblaggio cellulare, l'inclusione dei principali tipi di cellule (Sertoli, Leydig, germe e cellule peritubulari) e l'architettura dei tessuti opportunamente compartimentata. Dei quattro ambienti testati, le colture 2D ECM e 3D ECM-free hanno generato organoidi con morfologie interne più simili ai tester nativi, tra cui la compartimentazione de novo dei tipi di cellule tubolari rispetto a quelle interstiziali, lo sviluppo di strutture simili a tubuli e una funzione endocrina consolidata a lungo termine. Tutti i metodi studiati utilizzavano sospensioni cellulari testicolari murine primarie nonsortite e usavano risorse di coltura comunemente accessibili. Queste tecniche di generazione organoide testicolare forniscono un toolkit altamente accessibile e riproducibile per iniziative di ricerca sull'organogenesi testicolare e la fisiologia in vitro.
Introduction
Gli organoidi testicolari sono una tecnica pionieristica per lo studio dello sviluppo testicolare, della spermatogenesi e della fisiologia in vitro1,,2,,3,,4. Diversi metodi sono stati esplorati per la generazione organoide; questi includono una varietà di sistemi di coltura extracellulari (ECM) e senza ECM, sia negli orientamenti bidimensionali (2D) che tridimensionali (3D). Diversi metodi di generazione possono promuovere strategie di assemblaggio cellulare distinte; ciò si traduce in un alto livello di variabilità morfologica e funzionale tra i modelli organoidi pubblicati. Lo scopo di questo articolo è discutere lo stato attuale dei modelli testicolari in vitro e servire da modello per i futuri ricercatori, quando si progettano esperimenti organoidi testicolari. All'interno del presente studio, quattro diversi archetipi del sistema di coltura sono definiti e caratterizzati in processo sperimentale e risultato biologico. Questi includono: metodi di coltura 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free e 3D ECM. Le strategie qui presentate sono destinate ad essere semplici, accessibili e altamente riproducibili tra diversi laboratori e gruppi di ricerca.
Storicamente per il testicolo, la designazione "in vitro", è stata utilizzata per diversi metodi di coltura di tessuti e cellule testicolari. Questi includono metodi dicolturaorganotipico di tessuti/organi (cioè coltura di espianto) 5 , coltura isolata di tubuli seminiferi6,coltura cellulare testicolare7e metodi di morfogenesi dei tessuti de novo (cioè costrutti biologici e organoidi)1. Le prime ricerche sulla spermatogenesi in vitro sono state eseguite circa 100 anni fa, con la coltura di espianto di testicoli di coniglio nel 19208e successivamente nel 1937 con espianto di topi9. All'interno di questi esperimenti iniziali la spermatogonia è stata osservata degenerare in gran parte durante la prima settimana di coltura, sebbene siano state identificate alcune cellule meioticamente differenzianti. Ricordando questi rapporti storici, la cultura dell'espianto del testicolo è stata ripresa e ottimizzata nel 2011 per diventare una tecnica fattibile per lo studio del testicolo10. Dal 2011, la coltura di espianto ha prodotto sperma competente per la fertilità in piùrapporti11,12,,13. Tuttavia, a causa della dipendenza della coltura di espianto dai tubuli dei testicoli nativi preesistenziati, questi recenti progressi sono descritti più accuratamente come esempi di funzione testicolare "ex vivo" e spermatogenesi, funzione tissutale che è stata mantenuta o ripresa al momento della rimozione dal corpo di un organismo. Nonostante la sua prevalenza in letteratura, il mantenimento e la differenziazione a lungo termine delle cellule germinali all'interno delle espianto,testicolari è difficile da replicare14,,15,16,17,18, specialmente in tempi abbastanza lunghi da osservare pienamente la spermatogenesi in vitro (~ 35 giorni neitopi 19 e 74 nell'uomo20).15 È intrigante apprezzare che molte delle stesse sfide vissute 100 anni fa, sono ancora oggi vissute all'interno della spermatogenesi ex vivo.
Diversi dagli approcci ex vivo, gli organoidi testicolari sono microtissue assemblate de novo generate interamente in vitro da fonti cellulari (cioè cellule testicolari primarie). Gli organoidi testicolari forniscono una strategia creativa per aggirare la dipendenza storica del campo dal tessuto nativo preesiste e per ricapitolare la biologia testicolare completamente in vitro. Ci sono più requisiti condivisi dalla maggior parte dei modelli di tessuto organoide; questi includono (1) morfologia o architettura del tessuto in vivo-mimetico, (2) più tipi di cellule principali del tessuto rappresentato, (3) auto-assemblaggio o auto-organizzazione nella loro generazione e (4) la capacità di simulare un certo livello della funzione e della fisiologia del tessuto rappresentato21,22,23,24. Per il testicolo, questo può essere catturato in quattro segni distintivi principali: (1) l'inclusione dei principali tipi di cellule testicolari, germe, Sertoli, Leydig, cellule peritubulari e altre cellule interstiziali, (2) assemblaggio di tessuti diretti a cellule, (3) tipi di cellule opportunamente compartimentate in compartimenti tubolari separati (germe e Sertoli) e regioni interstiziali (tutti gli altri tipi di cellule) e (4) un certo grado di funzione tissutale (ad esempio, secrezione o risposte dei tessuti dell'ormone riproduttivo, mantenimento e differenziazione delle cellule germinali). Considerando le sfide storiche nel mantenimento della differenziazione delle cellule germinali ex vivo e in vitro, la ricapitolazione di architetture testicolari in vivo-mimetiche (cioè strutture simili a tubuli seminiferi) con marcatori aggiuntivi che suggeriscono la simulazione della fisiologia testicolare (ad esempio, la funzione endocrina), sono pietre miliari prioritarie verso la generazione di organoidi che un giorno potrebbero sostenere la spermatogenesi in vitro.
La maggior parte dei metodi organoidi testicolari pubblicati sfrutta l'ECM disponibile in commercio (ad esempio, collagene o formulazioni ECM proprietarie)25,26,,27 o ECM di origine personalizzata (ad esempio, idrogel decellularizzati derivati da testis ECM)28,29,30. L'ECM esogeno promuove la formazione di tessuti de novo fornendo un'impalcatura di supporto all'assemblaggio per la generazione di tessuti. I metodi ECM hanno offerto un livello impressionante di formazione dei tessuti, tra cui una certa presenza di cellule germinali e morfologia tessuto-mimetica25,,28. Tuttavia, gli EMM che utilizzano non sono sempre universalmente disponibili (ad esempio, idrogel decellularizzati derivati da ECM) e alcuni metodi richiedono sofisticati orientamenti di semina in gel e cellule (ad esempio, gradienti a 3 strati di ECM e stampa 3D)25,,31,32. I metodi senza impalcature (ad esempio, caduta sospesa e piastre di coltura non aderenti)33,34,35 hanno anche generato organoidi robusti e altamente riproducibili senza la necessità di gel O impalcature ECM. Tuttavia, la morfologia tissutale di questi organoidi senza impalcature è spesso dissimile dai testi in vivo, e la maggior parte di questi rapporti incorpora un additivo biochimico ECM per promuovere laformazione dei tessuti 33,34,36o, in alternativa, fare affidamento sulla centrifugazione per l'aggregazione forzata delle cellule e lacompattazione 34,rendendoli meno ideali per studiare la migrazione e l'auto-organizzazione dirette dalle cellule.
I quattro metodi di generazione organoide presentati in questo manoscritto includono sia strategie dipendenti dall'ECM che strategie indipendenti, ognuna delle quali utilizza una semplice semina cellulare che consente l'osservazione dell'auto-assemblaggio organoide guidato dalle cellule. Tutte e quattro le tecniche possono essere eseguite dalle stesse sospensioni cellulari o possono utilizzare popolazioni arricchite personalizzate e di tipo cellulare. Un punto di forza di questi metodi è la capacità di osservare gli organoidi auto-assemblarsi in tempo reale e di confrontare direttamente come le strutture testicolari si auto-assemblano tra diversi microambientati di coltura. Le differenze fenotipiche tra questi quattro metodi di coltura dovrebbero essere prese in considerazione per il loro impatto sulla questione della ricerca o sull'oggetto dello sperimentatore. Ogni metodo produce costrutti biologici o organoidi entro 24 ore o meno. In conclusione, i metodi qui presentati forniscono un toolkit di tecniche di assemblaggio organoide per lo studio dell'assemblaggio organoide testicolare, dello sviluppo tissutale e della fisiologia testicolare in vitro.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Northwestern University, e tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli approvati dalla IACUC.
1. Preparazione di soluzioni enzimatiche di dissociazione tissutale
- Utilizzare due diverse soluzioni enzimatiche (Soluzione 1 e Soluzione 2), entrambe realizzate utilizzando una soluzione media di coltura basale (BM).
- Per preparare il BM, aggiungere siero e penicillina-streptomicina a concentrazioni minime essenziali medio-finali rispettivamente del 10% e dell'1% (vedi Tabella dei materiali per reagenti specifici). Quindi filtrare sterilemente il BM attraverso un filtro da 0,22 μm. Prima dell'uso con le cellule, pre-equilibrare il BM sterile in un pH neutro erogando in un piatto di coltura e posizionando all'interno di un incubatore di CO2 umidificato al 5% a 37 °C per un minimo di 1 h.
NOTA: Il BM può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 settimana, dopo di che deve essere prodotto un BM fresco. - Per preparare le soluzioni stock di collagenasi I, sciogliere prima 100 mg di collagenasi I in 1 mL di embrione sterile di grado H2O (concentrazione finale 10% m/v), invertire o ruotare per dissolversi e conservare 20 μL aliquote a -20 °C per un uso successivo. Le aliquote devono essere scongelate una sola volta.
- Per preparare soluzioni stock di deossiribonucleasi I (DNasi I), aggiungere 20 mg di DNasi I in 1 mL di embrione sterile di grado H2O (concentrazione finale 2% m/v), invertire o ruotare per dissolversi (non vortice) e conservare 20 μL aliquote a -20 °C per un uso successivo. Le aliquote devono essere scongelate una sola volta.
- Per le soluzioni di stock di ialuronidasi, aggiungere 30 mg in 1 mL di salina tamponata di fosfato sterile (PBS; concentrazione finale 3% m/v ialuronidasi in PBS contenente Ca++/Mg++), invertire o ruotare per dissolversi e conservare 100 aliquote μL a -20 °C per un uso successivo. Le aliquote possono essere scongelate e ri-congelate più volte senza perdita di attività enzimatica.
- Per preparare la dissociazione Soluzione 1, aggiungere 10 μL collagenasi I e 10 μL DNasi I in 1 mL di BM sterile pre-equilibrato (concentrazioni finali: 1 mg/mL collagenasi I e 5 μg/mL DNasi I). Triturare delicatamente con una pipetta per mescolare la soluzione e pre-riscaldare a 37 °C prima dell'uso con il tessuto.
NOTA: La soluzione 2 viene preparata aggiungendo 33 μL di ialuronidasi (preconventata a 37 °C) per 1 mL della soluzione 1 (ad una concentrazione finale di 1 mg/mL). Ciò avviene a metà strada attraverso la dissociazione enzimatica del tessuto testicolo al passaggio 2.5 sottostante.
2. Dissociazione tissutale di Testis
NOTA: Tutti i topi erano alloggiati all'interno di gabbie di polipropilene e dotati di cibo e acqua ad libitum. Gli animali venivano nutriti con chow irradiato che non contiene fitoestrogeni. Topi CD-1 giovanili, 5 giorni dopo parto (dpp), sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti e anestetizzati prima dell'eutanasia e della raccolta dei tessuti, all'interno di una camera di anestesia attaccata a un vaporizzatore di isoflurane (2,5 L/min in O2). I topi sono stati confermati per l'anestesia completa attraverso l'assenza di una risposta alla puntura di piedi, dopo di che i topi sono stati eutanasiati tramite decapitazione.
- Anestetizzare i topi in una camera isoflurana, garantire l'anestesia tramite una puntura di punta e quindi decapitare il topo usando una forbice affilata. Posizionare la supina di topo eutanasiata su un tappetino di dissezione e sterilizzare l'addome con il 70% di etanolo. Tenda la pelle dell'addome inferiore con le forcep e apri l'addome con le forbici.
- Individuare i teste nelle regioni inguinali in basso a sinistra e a destra dell'addome. Tagliare le loro connessioni ai deferenti vas e a qualsiasi tessuto connettivo ancorante, quindi sollevare l'intero testicolo (con epididimo ancora attaccato) dall'animale. Posizionare i tester in una piastra di Petri di BM pre-equilibrato.
- Al microscopio a dissezione e all'interno di un campo sterile, fare una piccola incisione nella tunica albuginea su un'estremità di ogni testicolo con una piccola forbice a microdisezione o strappando delicatamente usando due forcep sottili.
- Quindi, tenendo il testicolo dall'estremità opposta dell'incisione, spremere delicatamente il testicolo con forcep fini e spingere in un delicato movimento di spazzamento verso il foro nella tunica; questo rilascerà il tessuto testicolare come un unico pezzo coeso.
- Tagliare i tester in pezzi più piccoli (≤ 2 mm3) e metterli in 1 mL di dissociazione preri warmed (37 °C) Soluzione 1.
- Incubare a 37 °C per 10 minuti.
- Per più di 10 teste, aumentare il volume totale della soluzione di dissociazione di 1 mL, garantendo un minimo di 1 mL di soluzione di dissociazione per 10 teste (ad esempio, 2 mL per 20 teste, 3 mL per 30 teste, ecc.).
- Triturare delicatamente i pezzi di testicolo 50 volte (50x) nella soluzione 1 utilizzando una pipetta P1000. Assicurarsi che i tubuli si separino l'uno dall'altro e dal tessuto interstiziale a questo punto. Se rimangono grumi, incubare per altri 5 minuti e triturare ancora una volta (50x).
- Aggiungere 33 μL di soluzione di stock di ialuronidasi (prerifavolato a 37 °C, dal passo 1.5) per 1 mL di miscela di dissociazione della soluzione 1 (contenente il tessuto testicolare parzialmente dissociato e i tubuli). Dopo aver aggiunto l'ialuronidasi, questa è chiamata soluzione 2.
- Triturato (50x) utilizzando un P1000 e incubare a 37 °C per 5 min.
- Triturato (50x) utilizzando una pipetta P200.
- Assicurarsi che a questo punto non siano presenti tubuli o grumi visibili di cellule. Se i grumi persistono, incubare fino a 5 minuti in più, con ulteriore triturazione utilizzando una pipetta P200 (50x).
- Dissetare gli enzimi di dissociazione aggiungendo siero bovino fetale (FBS) al 10% del volume totale della soluzione 2. Triturare più volte utilizzando una pipetta P200 per garantire che non rimangano grumi e filtrare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per produrre una sospensione a cella singola.
- Centrifugare le cellule a 100 x g per 7 minuti, scartare il supernatante e rimescolare le cellule in BM fresco.
- Contare le concentrazioni cellulari totali e vitali utilizzando l'esclusione blu del tripano su un emocitometro. Aggiungere 10 μL di 1:1 diluito, sospensione cellulare: soluzione blu tripano, nella camera di conteggio delle celle dell'emocitometro (vedi Tabella dei materiali).
- Ri-centrifugare le cellule a 100 x g per 7 minuti e rimosi in BM fresco.
NOTA: Utilizzare solo cellule vitali per calcolare la concentrazione e il numero delle cellule. Utilizzare solo sospensioni cellulari di ≥'80% di vitalità per la generazione di organoidi. - Preparare la sospensione a cella singola in concentrazioni cellulari come descritto al fine di aliquota di 280.000 celle dati i volumi utilizzati nei passaggi specifici del protocollo riportati di seguito nella sezione 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 celle/mL, ECM 2D – 0,56 x 106 celle/mL , 3D ECM-Free – 4,66 x 106 celle/mL, 3D ECM – 2,8 x 106 celle/mL.
NOTA: Tutti gli esperimenti di coltura presentati qui iniziano con 280.000 cellule sementi per coltura bene. Questi numeri corrispondono ai dati rappresentativi della figura 1, figura 2, figura 3 e figura 4.
- Ri-centrifugare le cellule a 100 x g per 7 minuti e rimosi in BM fresco.
3. Preparazione di piatti di coltura organoide e semina di cellule
NOTA: Per garantire un ECM omogeneo, pre-scongelare le aliquote congelate di ECM durante la notte prima della sperimentazione. Le aliquote ECM devono essere immerse all'interno di un secchio di ghiaccio all'interno di un frigorifero a 4 °C o di una cella frigorifere per garantire un lento e graduale aumento della temperatura. Tutti gli ECM vengono utilizzati in una diluizione finale 1:1 in BM per la cultura. Mantenere l'ECM scongelato e l'ECM diluito 1:1 sul ghiaccio fino a immediatamente prima dell'uso, altrimenti l'ECM potrebbe polimerizzare prematuramente.
- Per la coltura priva di ECM 2D, non è necessaria alcuna preparazione speciale, sospensioni a cella singola a piastre (500 μL di 0,56 x 106 celle / mL in BM) direttamente su scivoli a camera a 4 pozzi e posizionare in un incubatore a 35 °C per la coltura.
NOTA: Le cellule devono aderire al fondo del piatto di coltura entro le prime 24 ore di coltura e possono presentare alcuni piccoli cluster di cellule 3D in questo stesso periodo. - Per la coltura 2D ECM, erogare 100 μL di mezzo a matrice basale extracellulare diluito a freddo 1:1 in uno scivolo a camera a 4 porri, assicurando che il gel copra l'intero fondo del piatto.
- Posizionare lo scivolo della camera in un incubatore a 35 °C per un minimo di 30 minuti per consentire all'ECM di polimerizzare in un gel.
- Aggiungere la sospensione cellulare (500 μL di 0,56 x 106 celle/mL in BM) direttamente sulla parte superiore del gel 2D una volta polimerizzata.
NOTA: le celle devono raggrupparsi per formare piccoli cluster 3D all'interno delle prime 24 ore di coltura.
- Per la coltura senza ECM 3D, preparare gli inserti della piastra di Petri 3D ad agarosio prima di iniziare la coltura cellulare.
- In primo luogo, autoclave 1,5 g di polvere di agarosio in un becher da 100 mL, quindi aggiungere 75 mL di acqua sterile distillata e microonde per produrre agarosio fuso al 2% per la fusione di piastre di Petri 3D.
- All'interno di uno spazio di lavoro sterile, distribuire l'agarosio fuso nello stampo della piastra di Petri 3D fino a quando il menisco non è livellato con i lati dello stampo.
- Lasciare raffreddare e solidificare l'agarosio. Quando è solido, capovolgere lo stampo e flettere delicatamente ripetutamente fino a quando la piastra di Petri 3D di agarosio non cade libera dallo stampo.
NOTA: A questo punto, è possibile preparare molte piastre di Petri 3D ad agarosio e conservarle in H2O sterile o DPBS a 4 °C per un mese in su. - Prima di coltivare, mettere i piatti di Petri 3D di agarosio in un piatto da 24 po 'di coltura e coprirli con 1 mL di BM. Lasciare che le piastre 3D Petri equilibrano in BM per almeno 30 minuti all'interno di un incubatore di coltura a 37 °C. Scartare il BM e ripetere ancora una volta l'equilibrazione con BM fresco da 1 mL. Dopo l'equilibrazione delle piastre di Petri 3D in BM, appariranno dello stesso colore del BM (cioè rosa).
- Per prepararsi alla semina cellulare, rimuovere tutto il BM dal pozzo e erogare 200 μL di BM fresco intorno, ma non all'interno della rientranza centrale della piastra di Petri 3D. Inoltre, raccogliere l'eventuali BM rimanenti dall'interno della rientranza centrale di semina cellulare dell'inserto microwell.
- Erogare la sospensione a cella singola (4,66 celle/mL in 60 μL di BM) nella rientranza centrale della piastra di Petri 3D di agarosio. Triturare delicatamente su e giù per mescolare le cellule e garantire una sospensione a singola cella all'inizio della coltura.
- Mettere in un incubatore umidificato a 35 °C per la coltura. Il giorno seguente, rimuovere i 200 μL di BM dall'inserto del microwell e sostituirli con 1 mL di BM fresco. Questo porterà il livello del liquido sopra il piano dell'inserto, immergendo l'intera coltura.
- Rimuovere/aggiungere lentamente e con cura i supporti dall'esterno della piastra di Petri 3D agarosio. Gli organoidi avrebbero dovuto compattarsi durante la notte, permettendo loro di riposare sul fondo e consentendo ai cambiamenti dei supporti di lasciare gli organoidi indisturbati.
- Per le impostazioni cultura 3D ECM, preparare una sospensione a cella singola combinando, in parti uguali, la sospensione cellulare in BM con ECM freddo pre-scongelato (concentrazione finale = 2,8 x 106 celle/mL).
- Erogare immediatamente la miscela cell-ECM in uno scivolo a camera a 4 po porsi, assicurando che la miscela copra l'intero fondo della piastra.
- Posizionare la camera scivola a 35 °C in un incubatore e lasciare che il suo contenuto si polimerizzi. Questo dovrebbe richiedere almeno 30 minuti. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 500 μL di BM sulla parte superiore della coltura.
NOTA: Le celle dovrebbero essere raggruppate per formare piccoli aggregati 3D all'interno delle prime 24 ore di coltura.
4. Manutenzione organoide
- Coltura tutti i tipi di modello organoide a 35 °C. Per tutti i tipi di cultura scambia metà dei loro supporti con BM fresco ogni 2 giorni. Per assicurarsi che gli organoidi non vengano raccolti accidentalmente durante lo scambio di mezzi, raccogliere sempre i supporti lentamente da un angolo della piastra di scorrimento della camera e da un punto esterno al di fuori delle piastre di Petri 3D di agarosio. Tutti i supporti possono essere conservati a -20 °C per l'uso con immunoanalisi o altre analisi in seguito (cioè quantificazione di ormoni riproduttivi secreti o citochine).
- Dopo 7 giorni in coltura, utilizzare BM contenente ormone follicolo stimolante (concentrazione finale 20 mIU/mL) e gonadotropina corionica umana (concentrazione finale 4.5 UI/mL). Questo vale per tutti i tipi di coltura organoide.
- Immagine di routine di tutte le colture organoidi (ad esempio, imaging time-lapse) per caratterizzare la formazione organoide e quantificare metriche di auto-assemblaggio, sviluppo e crescita nel tempo.
5. Collezione Organoide
NOTA: Tutti gli organoidi possono essere fissati con paraformaldeide al 4% in PBS per l'immunoetichettatura a valle e le analisi istologiche. Fissare per 2 ore a temperatura ambiente con rotazione o pernottamento a 4 °C.
- Per le colture senza ECM 2D, sciacquare prima il campione con PBS fresco, quindi aggiungere il fissatore direttamente sopra i costrutti aderenti.
- Per i metodi di coltura ECM (2D e 3D), sciacquare una volta con PBS, quindi aggiungere fissatore direttamente sulla parte superiore del campione organoide ECM (per fissare insieme il gel ECM e gli organoidi) o, in alternativa, pipettare delicatamente gli organoidi su e giù per liberarli dall'ECM circostante e trasferirli in un tubo separato per la fissazione.
- Per una coltura priva di ECM 3D, pipettare delicatamente gli organoidi su e giù all'interno della rientranza centrale della piastra di Petri 3D di agarosio; questo sciacqua gli organoidi facilitandone la facile raccolta con una pipetta. Quindi trasferire gli organoidi in un tubo separato per la fissazione.
- Prima di lavorare in paraffina, incorporare molti organoidi (≥ 20) all'interno di un piccolo volume (~ 30 μL) di gel per la lavorazione dei tessuti; questo aiuta ad orientare e concentrare gli organoidi in una piccola area all'interno di blocchi di paraffina, facilitando l'osservazione durante la sezione e una più facile identificazione visiva all'interno delle sezioni di paraffina.
NOTA: Gli organoidi possono essere difficili da identificare dopo l'incorporamento e la sessatura della paraffina su un microtomo.
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Representative Results
La generazione organoide è stata considerata non riuscita se le cellule testicolari non si sono auto-assemblate entro 72 ore dalla coltura, tuttavia, tutti i metodi qui presentati si assemblano entro 24 ore quando si utilizzano cellule murine giovanili (5 dpp). Fallimento della generazione di costrutti biologici presentato come una continuazione di cellule liberamente sospese (colonna 0 h nella figura 1) anche dopo una coltura estesa (72 h). In assenza di auto-assemblaggio dei tessuti, tutti gli ammassi cellulari apparenti si disperdono facilmente in singole cellule su una manipolazione anche delicata (cioè pipettazione). I tessuti generati con successo sono stati inizialmente osservati come "cluster" di cellule 3D (frecce gialle nella colonna 6 h della figura 1). All'interno di ambienti senza ECM (2D e 3D), questi costrutti sembravano visibilmente "compatti" nelle prime 24 ore di coltura, specialmente quando nelle piastre di Petri di agarosio 3D(Figura 1A,C). Negli ambienti ECM i cluster di celle (2D e 3D) possedevano margini chiari tra il cluster e l'ambiente circostante (Figura 1B,D). Si è anche osservato che i cluster di celle migrano attraverso l'ECM e si fondono insieme formando cluster più grandi (frecce rosse nella figura 1B). È stato misurato il tempo necessario per apprezzare strutture autoassemblate separate e non è stata richiesta alcuna differenza significativa di tempo tra le condizioni libere da ECM 2D e 3D e L'ECM 2D, tuttavia, la cultura ECM 3D ha richiesto molto più tempo per assemblare strutture de novo rispetto a tutti glialtri metodi di coltura (Figura 1E). Le impostazioni cultura ECM 2D ECM e 3D hanno generato cluster di celle con dimensioni significativamente inferiori rispetto ai metodi di coltura 2D ECM e 3D ECM-free; La coltura priva di ECM 3D produceva i cluster più grandi con un unico cluster grande e compatto all'interno di ogni pozzo della piastra di Petri di agarosio 3D(Figura 1C,F). In sintesi, questi dati dimostrano la facilità con cui produrre costrutti biologici testicolari da cellule primarie di topo giovanile in quattro ambienti di coltura archetipica ed evidenziare diversi fenotipi di assemblaggio diretti dalle cellule all'interno di questi diversi ambienti di coltura.
Un obiettivo di tutti i modelli organoidi è quello di ricapitolare una morfologia interna mimetica del tessuto nativo. Per valutare questo risultato, i costrutti biologici assemblati all'interno di ciascuna condizione di coltura sono stati coltivati per 72 ore e quindi sondati per marcatori specifici delle cellule e visualizzati con immunofluorescenza (Figura 2). La variabilità nella morfologia dei tessuti è stata osservata tra diversi metodi di coltura. Organoidi senza ECM 2D presentati come ammassi di cellule sertoli (SOX9 e βCatenina) con alcune cellule germinali (DDX4, un marcatore di cellule germinali pan) aderenti sopra uno strato confluente basale 2D contenente molte cellule somatiche, tra cui Sertoli, peritubulare (αSMA) e cellule di Leydig (3βHSD)(Figura 2A-D). Si noti che la Figura 2B-D sono immagini epifluorescenti dell'intero campione privo di ECM 2D, non una sezione di 5 μm; ciò consente la visualizzazione sia dello strato cellulare somatico basale che degli aggregati orientati in modo superiore di Sertoli e delle cellule germinali. Al contrario, la cultura 2D ECM presentava un fenotipo in gran parte diverso, poiché strutture biologiche chiare con confini distinti erano facilmente individuabili sopra il gel basale ECM (Figura 2E). Queste strutture possedevano una complessa morfologia interna con compartimentazione de novo dei tipi di tubuli contro cellule interstiziali del testicolo, e così furono considerate organoidi di successo. Le regioni tubolari contenevano sertoli, cellule peritubulari e germinali, e le regioni interstiziali contenevano Leydig, cellule peritubulari e cellule non etichettate (Figura 2F-H). Allo stesso modo, gli organoidi liberi da ECM 3D possedevano anche una morfologia interna compartimentata e quindi erano considerati organoidi di successo. In particolare, gli organoidi senza ECM 3D sono stati distinti per regioni tubolari contenenti cellule peritubulari che si sono specificamente orientate attorno a gruppi di Sertoli e cellule germinali adalta fedeltà( Figura 2I-L). Le strutture assemblate in ECM 3D non possedevano una morfologia sofisticata, ma erano invece osservate come ammassi di cellule di Sertoli, con cellule occasionali germinali e leydig. In questi campioni, molte cellule Sertoli e non etichettate sono rimaste sospese tra organoidi con un orientamento "stroma-like" (Figura 2M-P). Insieme, questi dati evidenziano la variabilità nei fenotipi morfologici che i diversi metodi di generazione organoide producono e supportano l'uso di due specifici ambienti di assemblaggio organoide, 2D ECM e 3D ECM-free, per la generazione di organoidi testicolari con una morfologia interna altamente mimetica di compartimentazione testicolare.
Per valutare ulteriormente la funzione organoide testicolare, sono stati selezionati organoidi assemblati senza ECM 3D per un'analisi più approfondita a lungo termine. Per questo studio, questi organoidi sono stati coltivati per 14 giorni e quindi sondati per marcatori specifici di cellule e strutture. Dopo un'analisi immunofluorescente a 14 giorni, sono stati osservati organoidi senza ECM 3D che contengono strutture simili a tubuli (TLS) e un'architettura tissutale notevolmente simile ai teste in vivo(Figura 3A-D). Le cellule interstiziali erano posizionate in modo appropriato in regioni separate dal TLS. Le sezioni tissutali sono state quindi sondate per il marcatore della cellula germinale pan, DDX4, marcatore di cellule staminali spermatogoniali, SALL4 e marcatore di meiosi, SCP3 (Figura 3E-G). Sono state osservate rare cellule DDX4 positive e SALL4-positive, tuttavia, non è stato identificato alcun segnale SCP3. Dopo una più profonda caratterizzazione del TLS, sono stati osservati contenere uno spazio che appare lume circondato da cellule sertoli polarizzate e un monostrato esterno di cellule peritubulari (Figura 3I-L). Le cellule di Sertoli mostravano anche strette giunzioni tra loro, come visualizzato con microscopia elettronica a trasmissione e con etichettatura contro ZO-1, una proteina giunzionale e componente della barriera ematico-testicolo (Figura 3H,L). Successivamente, gli organoidi senza ECM 3D sono stati studiati per la funzione endocrina in 12 settimane di coltura a lungo termine con stimolazione della gonadotropina (Figura 4). Testosterone e inibina B, ormoni riproduttivi rispettivamente dalle cellule di Leydig e Sertoli, sono stati identificati e quantificati da mezzo condizionato organoide (Figura 4A). Nel corso di 12 settimane di coltura, entrambi gli ormoni sono stati misurati per rispondere in modo significativo al completamento delle gonadotropine FSH e hCG (la freccia rossa denota l'inizio del completamento, durante le settimane 2 - 12). Al termine, è stato eseguito un test per determinare se la reattività endocrina è stata preservata. Le gonadotropine sono state rimosse per 48 ore, durante le quali sia il testosterone che le concentrazioni di inibina B sono diminuite significativamente in concentrazione. Dopo 48 ore, le gonadotropine sono state restituite alla coltura ed entrambe le concentrazioni ormonali sono aumentate significativamente di nuovo nell'ultimo 24 ore, dimostrando una corretta reattività endocrina (Figura 4B). Collettivamente, questi risultati del saggio istologico ed endocrino dimostrano che gli organoidi testicolari sono un modello utile per studiare lo sviluppo testicolare (cioè la compartimentazione de novo e la tubulogenesi) e la funzione testicolare cellulare somatica in vitro (ad esempio, formazione stretta della giunzione e funzione endocrina).
Figura 1: Gli organoidi si autoassemblano in condizioni di coltura 2D e 3D, ECM ed ECM free.
5 cellule testicolari murine dpp sono state coltivate in quattro diverse condizioni: 2D ECM-free (riga A),2D ECM (riga B),3D ECM-free (riga C) e 3D ECM (riga D). Gli elementi grafici che rappresentano il metodo delle impostazioni cultura vengono forniti nella colonna di sinistra. I montaggi rappresentativi delle immagini sono stati assemblati da immagini time-lapse catturate durante la cultura dal vivo. I punti di tempo per ogni immagine sono etichettati al margine superiore. Il tempo 0 h è prima che si sia verificato qualsiasi assemblaggio organoide, il tempo 3 h è durante l'assemblaggio organoide in corso guidato dalle cellule e le volte 6 h e 9 h dimostrano organoidi rappresentativi e formati con successo. Le frecce gialle contrassegnano i cluster di celle e le frecce rosse contrassegnano le posizioni in cui i cluster di celle separati sono stati migrati e uniti tra loro. Per ogni condizione sono state registrate tutte le barre di scala = 1 mm . (E) Tempo necessario prima che gruppi di celle separati potessero essere visibilmente apprezzati. 2DF = 2D ECM-free; 2DE = ECM 2D; 3DF = 3D ECM-free; 3DE = ECM 3D. (F) L'area per cluster è stata misurata per ciascuna condizione di coltura. Le immagini sono state selezionate tra n= 3 - 5 esperimenti separati. ANOVA uni-way con il test di confronto multiplo di Tukey è stato utilizzato per determinare il significato in 1E e 1F; i grafici sono stati assemblati con mezzi di n=4 esperimenti separati. Questa cifra è stata modificata da Edmonds e Woodruff37. © IOP Publishing. Riprodotto con autorizzazione. Tutti i diritti riservati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gli organoidi coltivati 2D ECM e 3D ECM-free mostrano compartimentazione dei tipi di cellule tubolari e interstiziali.
Immagini rappresentative a campo luminoso e immunofluorescenti di organoidi auto-assemblati dopo 72 ore di coltura. Campioni senza ECM 2D sono stati con l'immagine dell'intero supporto, tutti gli altri campioni sono stati imageati in sezioni di tessuto da 5 μm. (A – D) Cultura senza ECM 2D. (E – H) coltura ECM 2D. (I – L) Cultura senza ECM 3D. (M – P) coltura ECM 3D. I marcatori specifici delle cellule utilizzati per l'analisi sono etichettati sul margine superiore: nuclei cellulari Sertoli (SOX9) e corpi cellulari (βCatenina), cellule germinali (DDX4, un marcatore di cellule germinali pan), cellule di Leydig (3βHSD) e cellule peritubulari (αSMA). Tutti i campioni fluorescenti sono stati co-macchiati per il DNA con DAPI. Le frecce gialle puntano verso le cellule germinali contrassegnate con DDX4 nella seconda colonna da sinistra, le frecce rosse puntano ai cluster di celle Sertoli nelle due colonne destra. Barre di scala di campo luminose = 400 μm, barre di scala fluorescenti = 100 μm. Questa cifra è stata modificata da Edmonds e Woodruff37. © IOP Publishing. Riprodotto con autorizzazione. Tutti i diritti riservati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gli organoidi sviluppano strutture simili a tubuli popolate da rare cellule germinali.
Gli organoidi assemblati senza 3D-ECM sono stati coltivati per 14 giorni. (A–D) Immagini rappresentative H&E e immunofluorescenti che descrivono in dettaglio i tipi di cellule e le caratteristiche tissutali attorno a strutture simili a tubuli (TLS); lo stesso organoide è raffigurato in sezioni tissutali adiacenti che consentono il confronto fianco a fianco delle caratteristiche morfologiche: cellule di Leydig (3βHSD), cellule peritubulari (αSMA), corpi cellulari Sertoli (βCatenina), membrana di collagene (COL IV) e nuclei cellulari Sertoli (SOX9); barre di scala = 100 μm. (E – G) L'etichettatura immunofluorescente è stata eseguita contro le cellule germinali, tra cui un marcatore di cellule germinali pan (DDX4), marcatore di cellule staminali spermatogoniche (SALL4) e spermatociti meioticamente attivi (SCP3). Gli inserti altamente ingranditi sono delineati da pannelli gialli in 3E e 3F. I triangoli verdi puntano a celle etichettate DDX4; Le frecce rosse puntano alle celle etichettate SALL4. (H) Micrografia elettronica a trasmissione rappresentativa (TEM) di una stretta giunzione tra le cellule di Sertoli all'interno di un organoide; Barra di scala TEM = 100 nm. (I – L) Immagini rappresentative ad alto ingrandimento di un TLS etichettato per le caratteristiche chiave dell'epitelio seminifero tra cui giunzioni strette (ZO1) e laminina. Lo stesso TLS è raffigurato in sezioni tissutali adiacenti nei pannelli I – L. Tutti i campioni fluorescenti sono stati co-macchiati per il DNA con DAPI. Le immagini sono state selezionate tra n=7 esperimenti biologici separati. Questa cifra è stata modificata da Edmonds e Woodruff37. © IOP Publishing. Riprodotto con autorizzazione. Tutti i diritti riservati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Gli organoidi secernono testosterone e inibina B per 12 settimane di coltura in risposta alle gonadotropine FSH e hCG.
I supporti condizionati raccolti da organoidi 3D-ECM-free sono stati misurati per testosterone e inibina B tramite saggio immunoassorbente legato agli enzimi (ELISA). (A) Gli organoidi sono stati coltivati per dodici settimane, con completamento FSH e hCG durante le settimane 2 - 12 (l'inizio dell'integrazione è contrassegnato da una freccia rossa sull'asse x); tutti i valori sono stati confrontati con il giorno 7 della coltura per i test statistici. (B) Grafico ingrandito di un "test di ristimolazione" per determinare se la reattività endocrina è stata preservata dopo 12 settimane. Il periodo del test è delineato dalla casella grigia in 4A. Al termine di 12 settimane di coltura, le gonadotropine furono rimosse per 48 ore e poi ri-integrate per una finale di 24 ore di cultura. Gli ormoni sono stati misurati a 0, 2, 6, 12 e 24 ore dopo la ristimolazione della gonadotropina; le aree ombreggiate di colore rosso designano i periodi di tempo durante la coltura con FSH e hCG, le aree non ombreggiate designano periodi di tempo senza FSH e hCG; i valori p noti sono relativi a 2 ore dopo la ristimolazione. ANOVA a due strade con il test di confronto multiplo di Tukey è stato utilizzato per determinare il significato per tutti i dati endocrini, n =5 esperimenti biologici separati. Questa cifra è stata modificata da Edmonds e Woodruff37. © IOP Publishing. Riprodotto con autorizzazione. Tutti i diritti riservati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Con il completamento di questo protocollo di generazione organoide, l'utente avrà a disposizione quattro diverse tecniche di coltura per assemblare costrutti testicolari e organoidi in ambienti privi di ECM o ECM. È importante sottolineare che tutti e quattro i metodi consentono al ricercatore di osservare in modo non invasivo l'auto-assemblaggio organoide nel tempo attraverso l'imaging time-lapse o la registrazione video, e di raccogliere in modo non invasivo mezzi condizionati per l'analisi di ormoni e citochine secreti, senza disturbare i tessuti durante la coltura. In tutti i metodi, nel corso di 24 ore, uno sperimentatore può generare fino a diverse centinaia di costrutti organoidi / testicolari, come i numeri di cellulare lo consentono. Questi metodi promuovono l'auto-assemblaggio dei tessuti in costrutti con diverse dimensioni e morfologie; la dimensione organoide dipende dal numero di cellule e dalla concentrazione utilizzati nelle coltura, come si vede in altre relazioni organoidi34. Ridurre le dimensioni o il diametro organoide potrebbe aiutare a ridurre lo sviluppo di regioni interne di necrosi che a volte si presentano in organoidi più grandi. Una particolare forza dei metodi di protocollo 2D ECM e 3D ECM-free sono la loro capacità di generare organoidi testicolari morfologicamente mimetici, contenenti compartimentazione de novo dei tipi di cellule tubolari rispetto a quelle interstiziali. Inoltre, gli organoidi assemblati senza ECM 3D forniscono un modello per la tubulogenesi de novo del TLS seminifero, con Sertoli opportunamente compartimentati e orientati e cellule peritubulari. Questo è un fenotipo importante per lo studio degli organoidi testicolari, ed è ancora un risultato variabile tra diversi rapporti organoidi testicolari; molti altri rapporti mancano di compartimentazione tubulo contro interstizio e alcuni sviluppano persino un fenotipo "tubulo interno-out"32,,33,,34,,38. Mentre nessuno dei metodi di generazione organoide presentati nel presente manoscritto era caratterizzato per mantenere grandi popolazioni di cellule germinali per lunghi giorni di coltura, poiché le cellule germinali erano raramente osservate già a 72 ore, sia i metodi 2D ECM che 3D ECM-free potrebbero fornire uno strumento utile per studiare la tubulogenesi in vitro e la componente cellulare somatica di un ambiente di nicchia spermatogoniale. Con questo obiettivo in mente, gli organoidi testicolari forniscono una potenziale piattaforma per ottimizzare i protocolli futuri per migliorare il mantenimento delle cellule staminali germinali in vitro, la progressione meiotica e la differenziazione.
Un altro vantaggio di questi protocolli è la possibilità di personalizzare e scalare la generazione organoide. Popolazioni cellulari personalizzate, trattate con farmaci o ingegnerizzate possono sostituire o essere utilizzate in aggiunta alle cellule testicolari primarie del mouse37. Se le sospensioni cellulari sono di bassa vitalità (<80 %), si dovrebbero adottare metodi per migliorare la vitalità cellulare della sospensione cellulare. Questi possono includere la riduzione del tempo trascorso nei mezzi di dissociazione e la riduzione al minimo della triturazione durante la digestione dei tessuti (passaggi 2.4.1 - 2.5.2), l'aumento del numero di lavaggi dopo la dissociazione o la rimozione delle cellule morte dopo la dissociazione con kit di smistamento cellulare o etichettatura di cellule morte. Tuttavia, nessuna di queste misure era necessaria per produrre i dati rappresentativi condivisi nella presente relazione. Per i metodi di coltura ECM 2D e 3D, questi protocolli possono essere utilizzati con altre matrici strutturali di biomateriali a base proteica oltre a quelle utilizzate per gli studi qui presentati. Questi altri biomateriali includono collagene, gelatina, estratti ECM disponibili in commercio e idrogel decellularizzati derivati da ECM su misura25,,26,,28. Ci sono alcuni puntatori per l'erogazione del gel ECM che spara problemi e la creazione di inserti per piastre di Petri 3D in agarosio di alta qualità. Quando si lanciano gel ECM su piastre da camera, assicurarsi di lavorare rapidamente e utilizzare punte di pipetta fredda per prevenire la polimerizzazione prematura dell'ECM all'interno di un tubo o di una punta di pipetta prima di erogare nel piatto di coltura. Quando si lancia l'agarosio fuso negli stampi della piastra di Petri 3D (per la coltura priva di ECM 3D), utilizzare solo agarosio caldo e non caldo per garantire una colata di alta qualità degli inserti con variazione minima e verificare che l'agarosio si sia completamente raffreddato a temperatura ambiente e solidificato prima di tentare di rimuovere dallo stampo. Le piastre Agarose 3D Petri sono maneggiate al meglio delicatamente con forcep fini. Quando si raccolgono organoidi per la fissazione, assicurarsi di lavorare al microscopio a dissezione per visualizzare la raccolta di tutti gli organoidi. Gli organoidi possono attenersi al lato plastico dei piatti di coltura e all'interno delle punte delle pipette; pipette di vetro presentano meno aderenza organoide rispetto alla plastica. Fissare gli organoidi mentre sono ancora incapsulati all'interno o sopra ECM è un processo più impegnativo e delicato rispetto alla loro rimozione da ECM prima della fissazione. Il gel per la lavorazione dei tessuti può essere gettato sopra il costrutto organoide ECM prima della rimozione dalla camera di coltura per aiutare a rinforzare il gel prima dellafissazione 39. La fissazione deve essere eseguita a temperatura ambiente per recuperare gli idrogel ECM in quanto è probabile che si depolio polimerizzino se abbassati a 4 °C. Inoltre, la glutaraldeide dello 0,1 - 1,0 % può essere aggiunta alla soluzione pfa al 4 % per contribuire a collegare ulteriormente l'ECM; tuttavia, questo metodo aumenta l'autofluorescenza di fondo del campione.
I risultati ottenuti con i metodi di generazione organoide sopra presentati limitazioni specifiche delle cellule germinali rappresentano aree prioritarie per l'innovazione futura. Le cellule germinali sono scarsamente supportate su una coltura estesa, sono facilmente osservabili solo durante i primi giorni di coltura e sono raramente osservate entro la fine della prima settimana di coltura e in tempi successivi. Mentre la spermatogonia indifferenziata può essere mantenuta all'interno della coltura cellulare in vitro mantenendo la loro capacità di ripristinare la spermatogenesi al momento del trapianto in tubuli in vivo40, il microambiente somatico tubulo (cioè, interazioni cellulari sertoli dirette) è ipotizzato come un prerequisito per differenziare le cellule germinali pre-meiotiche in e attraverso la meiosi e la spermiogenesi in vitro1,,5,,40,41. Gli organoidi testicolari contenenti spermatogonia nei primi punti di tempo all'interno di un TLS strutturalmente mimetico potrebbero consentire al campo di studiare in modo non invasivo le interazioni somatico-somatiche e le cellule somatiche-germinali interamente in vitro. L'ottimizzazione degli additivi multimediali e la preparazione cellulare prima della coltura (ad esempio, l'incorporazione di agenti utilizzati per la coltura di cellule staminali spermatogoniali in vitro)42,43 potrebbero aumentare la resa delle cellule germinali negli studi futuri, specialmente nei periodi di coltura più lunghi di diversi giorni. Inversamente, i metodi per re-introdurre la spermatogonia dopo la formazione di TLS, come la microiniezione, rappresentano un'interessante opportunità per ripristinare le cellule germinali all'interno degli organoidi e testare la capacità degli ambienti somatici organizzati in vitro di mantenere le cellule germinali. Altri fattori biologici hanno influenzato la coltura ex vivo delle espianto, tra cui l'età/maturità45 e le differenze genetichedi fondo 17. Queste stesse variabili devono ancora essere studiate direttamente nel campo della biologia organoide testicolare. Tuttavia, è plausibile che diversi gruppi, morfologia e fenotipi funzionali possano risultare quando gli organoidi sono generati da cellule isolate da animali di età diversa (cioè neonatali, giovani, adulti) o animali di diversa origine genetica (ad esempio, diversi ceppi di topi).
In sintesi, le tecniche condivise in questo manoscritto forniscono quattro modelli utili per studiare l'auto-assemblaggio del costrutto testicolare guidato dalle cellule, la generazione di due modelli organoidi testicolari strutturalmente mimetici separati e l'importante risultato dello sviluppo di TLS e della funzione endocrina reattiva agli ormoni in vitro. Questi modelli comprendono orientamenti spaziali 2D e 3D in ambienti ECM ed ECM con supporti di coltura minimamente complessi e completamente definiti. Ogni metodo è altamente riproducibile e utilizza solo risorse cultura comunemente disponibili. Questi metodi possono rivelarsi vantaggiosi per lo studio della morfogenesi testicolare in vitro e per l'ottimizzazione delle future condizioni di coltura per la spermatogenesi in vitro. Inoltre, i metodi 2D ECM e 3D ECM-free forniscono un nuovo strumento per studiare il processo della compartimentazione dei tessuti de novo unico per il testicolo, la tubulogenesi in vitro e le interazioni somatico-somatico e somatico-germe-germe. Gli organoidi testicolari offrono un'opportunità flessibile e scalabile per indagare lo sviluppo e la regolazione dei segni fisiologici testicoli somatici; compresa la barriera ematico-testicolo e la produzione e la risposta endocrina; e, inoltre, uno strumento utile per sviluppare modelli di tessuto di ricerca traslizionale di nuova generazione. Questi includono l'integrazione di ormoni riproduttivi in modelli più grandi a livello di sistema, come tissue-on-a-CHIP e piattaforme microfisiofisioiche45,46. Altri obiettivi traslazionali verso i quali un giorno potrebbero essere applicati organoidi testicolari includono la tossicologia riproduttiva e il test delle barriere immunologiche, lo sviluppo contraccettivo maschile e l'innovazione della tecnologia riproduttiva assistita.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, dal National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 e 4UH3ES029073-03 e dalla Cattedra commemorativa di Thomas J. Watkin.
Gli autori ringraziano Eric W. Roth per la loro assistenza nella microscopia elettronica a trasmissione. Questo lavoro ha fatto uso della struttura BioCryo del NUANCE Center della Northwestern University, che ha ricevuto il supporto della risorsa soft and hybrid nanotechnology experimental (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); il programma MRSEC (NSF DMR-1720139) presso il Centro ricerche materiali; l'Istituto Internazionale di Nanotecnologia (IIN); e lo Stato dell'Illinois, attraverso l'IIN. Ha anche fatto uso dell'apparecchiatura CryoCluster, che ha ricevuto supporto dal programma MRI (NSF DMR-1229693). La grafica nella figura 1 è stata progettata utilizzando BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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