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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/61403
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Summary

Ici, quatre méthodes pour générer des organoïdes testiculaires à partir des cellules testiculaires murines néonatales primaires sont décrites, c’est-à-dire la matrice extracellulaire (ECM) et les environnements de culture 2D et 3D exempts d’ECM. Ces techniques ont de multiples applications de recherche et sont particulièrement utiles pour étudier le développement testiculaire et la physiologie in vitro.

Abstract

Les organoïdes testiculaires fournissent un outil pour étudier in vitro le développement testiculaire, la spermatogenèse et l’endocrinologie. Plusieurs méthodes ont été développées afin de créer des organoïdes testiculaires. Beaucoup de ces méthodes reposent sur la matrice extracellulaire (ECM) pour favoriser l’assemblage des tissus de novo, cependant, il existe des différences entre les méthodes en termes de morphologie biomimétique et la fonction des tissus. En outre, il existe peu de comparaisons directes des méthodes publiées. Ici, une comparaison directe est faite en étudiant les différences dans les protocoles de génération organoïde, avec des résultats fournis. Quatre méthodes de génération archétypales : (1) sans ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) sans ECM 3D, et (4) culture ECM 3D sont décrites. Trois repères primaires ont été utilisés pour évaluer la génération organoïde testiculaire. Il s’est agi de l’auto-assemblage cellulaire, de l’inclusion des principaux types de cellules (Sertoli, Leydig, germes et cellules péritubulaires) et de l’architecture tissulaire compartimentée de façon appropriée. Des quatre environnements testés, les cultures 2D ECM et 3D sans ECM ont généré des organoïdes avec des morphologies internes les plus similaires aux testicules indigènes, y compris la compartimentation de novo des types tubulaires par rapport aux cellules interstitielles, le développement de structures tubules-like, et une fonction endocrinienne établie à long terme. Toutes les méthodes étudiées utilisaient des suspensions cellulaires testiculaires primaires non triées et utilisaient des ressources de culture couramment accessibles. Ces techniques testiculaires de génération d’organoïdes fournissent une boîte à outils hautement accessible et reproductible pour les initiatives de recherche sur l’organogenèse testiculaire et la physiologie in vitro.

Introduction

Organoïdes testiculaires sont une technique pionnière pour étudier le développement testiculaire, spermatogenèse, et la physiologie in vitro1,2,3,4. Plusieurs méthodes ont été explorées pour la génération organoïde; il s’agit notamment d’une variété de systèmes de culture extracellulaire (ECM) et sans ECM, dans les deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) orientations. Différentes méthodes de génération peuvent promouvoir des stratégies d’assemblage cellulaire distinctes; il en résulte un niveau élevé de variabilité morphologique et fonctionnelle entre les modèles organoïdes publiés. Le but de cet article est de discuter de l’état actuel des modèles testiculaires in vitro, et de servir de modèle pour les futurs chercheurs, lors de la conception d’expériences organoïdes testiculaires. Dans la présente étude, quatre archétypes différents du système culturel sont définis et caractérisés dans le processus expérimental et les résultats biologiques. Il s’agit notamment de: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, et 3D ECM méthodes de culture. Les stratégies présentées ici se veulent simples, accessibles et hautement reproductibles entre différents laboratoires et groupes de recherche.

Historiquement pour les testicules, la désignation « in vitro », a été utilisée pour plusieurs méthodes de culture différentes de tissus et de cellules testiculaires. Il s’agit notamment des méthodes organotypiques de culture des tissus et des organes (c.-à-d. la culture des explantations)5,de la culture isolée des tubules séminifères6,de la culture cellulaire testiculaire7et des méthodes de morphogenèse des tissus de novo (c.-à-d. constructions biologiques et organoïdes)1. Les premières investigations sur la spermatogenèse in vitro ont été réalisées il y a environ 100 ans, avec la culture des explants de testicules de lapin en 19208,et plus tard en 1937 avec des explants de souris9. Dans ces expériences initiales spermatogonia ont été observés pour dégénérer en grande partie au cours de la première semaine de culture, bien que certaines cellules meiotically différenciation ont été identifiés. Rappelant ces rapports historiques, la culture d’explantation de testis a été relancée et optimisée en 2011 pour devenir une technique réalisable pour étudier le testis10. Depuis 2011, la culture d’explant a produit le sperme compétent de fertilité dans les rapportsmultiples 11,,12,,13. Pourtant, en raison de la dépendance de la culture d’explantation sur les tubules indigènes préexistants de testicule, ces avances récentes sont plus exactement décrites comme exemples de fonction testiculaire « ex vivo » et de spermatogenèse, fonction tissulaire qui a été maintenue ou reprise lors de l’enlèvement du corps d’un organisme. En dépit de sa prédominance dans la littérature, le maintien et la différenciation à long terme de cellules germinales dans les explants testiculaires est difficilede reproduire 14,,15,,16,,17,,18,particulièrement au-dessus des périodes assez longues pour observer entièrement la spermatogenèse in vitro (~35 jours chez lessouris 19 et 74 chez l’homme20). Il est fascinant d’apprécier que bon nombre des mêmes défis rencontrés il ya 100 ans, sont encore expérimentés dans ex vivo spermatogenesis aujourd’hui.

Différents des approches ex vivo, les organoïdes testiculaires sont des microtissues assemblés de novo générés entièrement in vitro à partir de sources cellulaires (c.-à-d. cellules testiculaires primaires). Les organoïdes testiculaires fournissent une stratégie créative pour contourner la dépendance historique du champ à l’égard des tissus indigènes préexistants, et pour récapituler la biologie testiculaire complètement in vitro. Il existe de multiples exigences partagées par la plupart des modèles de tissus organoïdes; il s’agit notamment (1) de morphologie ou d’architecture des tissus in vivo-mimétiques, (2) de multiples types cellulaires majeurs du tissu représenté, (3) d’auto-assemblage ou d’auto-organisation dans leur génération, et (4) la capacité de simuler un certain niveau de la fonction et de la physiologie du tissureprésenté 21,22,23,24. Pour les testicules, cela peut être capturé en quatre grandes caractéristiques : (1) l’inclusion de principaux types de cellules testiculaires, germe, Sertoli, Leydig, cellules péritubulaires et autres cellules interstitielles, (2) assemblage de tissus dirigés par cellules, (3) types de cellules compartimentées de façon appropriée dans des compartiments tubulaires distincts (germe et Sertoli) et régions interstitielles (tous les autres types de cellules), et (4) un certain degré de fonction tissulaire (p. ex., sécrétion d’hormones reproductrices ou réponses tissulaires, et maintien et différenciation des cellules germinales). Compte tenu des défis historiques liés au maintien de la différenciation des cellules germinales ex vivo et in vitro, la récapitulation d’architectures testiculaires in vivo-mimétiques (c.-à-d. structures ressemblant à des tubules séminifères) avec des marqueurs supplémentaires suggérant la simulation de la physiologie testiculaire (p. ex., fonction endocrinienne), sont des étapes prioritaires vers la génération d’organoïdes qui pourraient un jour soutenir la spermatogenèse in vitro.

La majorité des méthodes organoïdes testiculaires publiées profitent de l’ECM disponible dans le commerce (p. ex., collagène ou formulations brevetées d’ECM)25,26,27 ou des ECM sur mesure (c.-à-d. hydrogels dérivés de testis décellularisés)28,29,30. L’ECM exogène favorise la formation de tissus de novo en fournissant un échafaudage de soutien à l’assemblage pour la génération de tissus. Les méthodes d’ECM ont offert un niveau impressionnant de formation de tissu, y compris une certaine présence de cellules germinales et la morphologie tissu-mimétique25,28. Toutefois, les ECM qu’ils utilisent ne sont pas toujours universellement disponibles (c.-à-d. hydrogels dérivés de l’ECM décellularisés), et certaines méthodes nécessitent des orientations sophistiquées en gel et en semis cellulaires (p. ex., gradients de 3 couches d’ECM et d’impression 3D)25,31,32. Les méthodes sans échafaudage (p. ex., chute suspendue et plaques de culture non hémorentes)33,34,35 ontégalement généré des organoïdes robustes et hautement reproductibles sans avoir besoin de gels ecm ou d’échafaudages. Cependant, la morphologie tissulaire de ces organoïdes sans échafaudage est souvent différente des testicules in vivo, et la plupart de ces rapports intègrent un additif biochimique ecm pour promouvoir la formationdes tissus 33,34,36, ou alternativement, compter sur la centrifugation pour l’agrégation cellulaire forcée et le compactage34, ce qui les rend moins idéal pour étudier la migration dirigée par cellules et l’auto-organisation.

Les quatre méthodes de génération organoïde présentées dans ce manuscrit comprennent à la fois des stratégies dépendantes de l’ECM et des stratégies indépendantes, chacune utilisant un ensemencement cellulaire simple qui permet l’observation de l’auto-assemblage organoïde conduit par cellules. Les quatre techniques peuvent être exécutées à partir des mêmes suspensions cellulaires ou peuvent faire usage de populations enrichies personnalisées et de type cellulaire. Une force de ces méthodes est la capacité d’observer les organoïdes s’auto-assembler en temps réel, et de comparer directement comment les structures testiculaires s’auto-assemblent entre différents microenvironnements de culture. Les différences phénotypiques entre ces quatre méthodes culturelles devraient être prises en considération pour leur impact sur la question de recherche ou le sujet de l’investigateur. Chaque méthode produit des constructions biologiques ou organoïdes dans les 24 h ou moins. En conclusion, les méthodes présentées ici fournissent une boîte à outils des techniques d’assemblage organoïde pour étudier l’assemblage organoïde testiculaire, le développement tissulaire, et la physiologie testiculaire in vitro.

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Protocol

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Northwestern, et toutes les procédures ont été effectuées en vertu des protocoles approuvés par l’IACUC.

1. Préparation de solutions enzymatiques de dissociation tissulaire

  1. Utilisez deux solutions enzymatiques différentes (Solution 1 et Solution 2), toutes deux fabriquées à l’aide d’une solution moyenne de culture basale (BM).
  2. Pour préparer la BM, ajouter le sérum et la pénicilline-streptomycine à des concentrations minimales essentielles moyennes à finales de 10 % et 1 % respectivement (voir tableau des matériaux pour les reagents spécifiques). Filtrez ensuite stérilement le BM à travers un filtre de 0,22 μm. Avant utilisation avec les cellules, pré-équilibrer bm stérile à un pH neutre en se distribuant dans un plat de culture et en plaçant dans un humidifié, incubateur de CO2 à 37 °C pour un minimum de 1 h.
    REMARQUE : BM peut être stocké à 4 °C jusqu’à 1 semaine, après quoi bm frais doit être fait.
  3. Pour préparer des solutions de stock de collagène I, dissoudre d’abord 100 mg de collagène I en 1 mL d’embryon stérile de qualité H2O (concentration finale de 10% m/v), inverser ou tourbillonner pour dissoudre, et stocker 20 aliquots μL à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Aliquots ne devrait être décongelé qu’une seule fois.
  4. Pour préparer des solutions de stock de désoxyribonuclease I (DNase I), ajoutez 20 mg de DNase I dans 1 mL d’embryon stérile de grade H2O (concentration finale de 2% m/v), inversez ou tourbillonnez pour dissoudre (ne pas vortex), et stockez 20 aliquots μL à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Aliquots ne devrait être décongelé qu’une seule fois.
  5. Pour les solutions de stock d’hyaluronidase, ajouter 30 mg dans 1 mL de saline tamponnée stérile de phosphate (PBS; concentration finale 3% m/v hyaluronidase dans PBS contenant Ca++/Mg++), inverser ou tourbillonner pour dissoudre, et stocker 100 aliquots μL à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Les aliquots peuvent être décongelés et regelés plusieurs fois sans perte d’activité enzymatique.
  6. Pour préparer la dissociation Solution 1, ajouter 10 μL collagène I et 10 μL DNase I en 1 mL de BM stérile et prééquilibré (concentrations finales : 1 mg/mL de collagène I et 5 μg/mL DNase I). Triturer délicatement à l’aide d’une pipette pour mélanger la solution et préchauffer à 37 °C avant de l’utiliser avec le tissu.
    REMARQUE : La solution 2 est préparée en ajoutant 33 μL d’hyaluronidase (préchaurmée à 37 °C) par 1 mL de solution 1 (à une concentration finale de 1 mg/mL). Ceci se produit à mi-chemin par dissociation enzymatique du tissu de testicules à l’étape 2.5 ci-dessous.

2. Dissociation des tissus Testis

REMARQUE : Toutes les souris étaient logées dans des cages en polypropylène et fournies avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Les animaux ont été nourris chow irradié qui ne contient pas de phytoestrogènes. Des souris juvéniles de CD-1, 5 jours post-partum (dpp), ont été employées pour toutes les expériences et anesthésiées avant l’euthanasie et la collecte de tissu, dans une chambre d’anesthésie attachée à un vaporisateur d’isoflurane (2.5 L/min dans O2). Des souris ont été confirmées pour l’anesthésie complète par l’absence d’une réponse au orteil-piqûre, après quoi les souris ont été euthanasiées par décapitation.

  1. Anesthésier les souris dans une chambre d’isoflurane, assurer l’anesthésie par l’intermédiaire d’une piqûre d’orteil, puis décapiter la souris à l’aide d’un ciseaux pointu. Placez la sulfpine de souris euthanasiée sur un tapis de dissection et stérilisez l’abdomen avec 70% d’éthanol. Tentez la peau du bas-ventre avec des forceps et ouvrez l’abdomen avec des ciseaux.
  2. Localiser les testicules dans les régions inguinales inférieures à gauche et à droite de l’abdomen. Couper leurs connexions aux déférents vas et tout tissu conjonctif d’ancrage, puis soulever l’ensemble des testicules (avec epididyme encore attaché) de l’animal. Placer les testicules dans une boîte de Pétri de BM pré-équilibrée.
  3. Sous un microscope à dissection et dans un champ stérile, faire une petite incision dans la tunica albuginea à une extrémité de chaque testicule avec soit un petit ciseaux de microdissection ou en déchirant doucement à l’aide de deux forceps fins.
    1. Puis, tout en tenant les testicules de l’extrémité opposée de l’incision, presser doucement les testicules avec des forceps fins et pousser dans un mouvement de balayage doux vers le trou dans la tunica; ceci libérera le tissu testiculaire comme pièce cohésive.
  4. Couper les testicules en petits morceaux (≤ 2 mm3) et les placer dans 1 mL de dissociation préchauffée (37 °C) solution 1.
    1. Incuber à 37 °C pendant 10 min.
    2. Pour plus de 10 testicules, augmenter le volume total de la solution de dissociation de 1 mL, assurant un minimum de 1 mL de solution de dissociation par 10 testicules (p. ex., 2 mL pour 20 testicules, 3 mL pour 30 testicules, etc.).
    3. Triturer délicatement les morceaux de testicules 50 fois (50x) dans la solution 1 à l’aide d’une pipette P1000. Assurez-vous que les tubules se séparent les uns des autres et des tissus interstitiels à ce stade. S’il reste des touffes, incuber pendant 5 minutes supplémentaires et triturer une fois de plus (50x).
  5. Ajouter 33 μL de solution de bouillon d’hyaluronidase (préchauffée à 37 °C, à partir de l’étape 1,5) par 1 mL de mélange de dissociation de solution 1 (contenant le tissu testiculaire partiellement dissocié et les tubules). Après avoir ajouté hyaluronidase, c’est ce qu’on appelle la solution 2.
    1. Triturate (50x) à l’aide d’un P1000 et incuber à 37 °C pendant 5 min.
    2. Triturate (50x) à l’aide d’une pipette P200.
    3. Assurez-vous qu’à ce stade, il n’y a pas de tubules visibles ou de touffes de cellules. Si les touffes persistent, incuber jusqu’à 5 minutes de plus, avec trituration supplémentaire à l’aide d’une pipette P200 (50x).
  6. Étancher les enzymes de dissociation en ajoutant le sérum bovin fœtal (FBS) à 10% du volume total de la solution 2. Triturer plusieurs fois à l’aide d’une pipette P200 pour s’assurer qu’il ne reste pas d’amas et filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour produire une suspension à cellule unique.
  7. Centrifugeuses à 100 x g pendant 7 min, jeter le supernatant, et resuspendre les cellules en BM frais.
  8. Comptez les concentrations cellulaires totales et viables à l’aide de l’exclusion bleue trypan sur un hémocytomètre. Ajouter 10 μL de 1:1 dilué, suspension cellulaire: trypan solution bleue, dans la chambre de comptage des cellules hemocytomètre (voir tableau des matériaux).
    1. Re-centrifugeuses cellules à 100 x g pendant 7 min et resuspendre en BM frais.
      REMARQUE : N’utilisez que des cellules viables pour calculer la concentration et le nombre de cellules. N’utilisez que des suspensions cellulaires ≥ une viabilité de 80 % pour la génération d’organoïdes.
    2. Préparer la suspension d’une seule cellule en concentrations cellulaires telles que décrites afin d’aliquot 280.000 cellules étant donné les volumes utilisés dans le protocole étapes spécifiques ci-dessous dans la section 3: 2D ECM-Libre - 0,56 x 106 cellules / mL, ECM 2D – 0,56 x 106 cellules/mL, 3D ECM-Free – 4,66 x 106 cellules/mL, ECM 3D – 2,8 x 106 cellules/mL.
      REMARQUE : Toutes les expériences de culture présentées ici commencent par 280 000 cellules ensemencées par culture bien. Ces chiffres sont appariés aux données représentatives de la figure 1, de la figure 2, de la figure 3 et de la figure 4.

3. Préparation de plats de culture organoïde et ensemencement de cellules

REMARQUE : Pour assurer un ECM homogène, prégelez les aliquots congelés d’ECM pendant la nuit avant l’expérimentation. Les aliquots ECM doivent être immergés dans un seau de glace dans un réfrigérateur de 4 °C ou une pièce froide pour garantir une augmentation lente et graduelle de la température. Tout ECM est utilisé lors d’une dilution finale 1:1 dans BM pour la culture. Gardez l’ECM décongelé et l’ECM dilué 1:1 sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient immédiatement avant utilisation, sinon l’ECM pourrait polymériser prématurément.

  1. Pour une culture sans ECM 2D, aucune préparation spéciale n’est nécessaire, plaquez les suspensions à cellule unique (500 μL de 0,56 x 106 cellules/mL en BM) directement sur les glissières de chambre de 4 puits et placez-les dans un incubateur de 35 °C pour la culture.
    REMARQUE : Les cellules doivent adhérer au fond du plat de culture dans les 24 premières heures de la culture et peuvent présenter quelques petits groupes de cellules 3D dans ce même temps.
  2. Pour la culture 2D ECM, distribuez 100 μL de liquide matriciel extracellulaire dilué froid 1:1 dans une glissière de chambre de 4 puits, en veillant à ce que le gel couvre l’ensemble du fond du plat.
    1. Placez la glissière de chambre dans un incubateur de 35 °C pendant au moins 30 min pour permettre à l’ECM de polymériser dans un gel.
    2. Ajouter la suspension cellulaire (500 μL de 0,56 x 106 cellules/mL en BM) directement sur le dessus du gel 2D une fois qu’il a polymérisé.
      REMARQUE : Les cellules doivent se regrouper pour former de petits clusters 3D dans les 24 premières heures de la culture.
  3. Pour une culture 3D sans ECM, préparez des inserts de boîtes de Pétri 3D agarose avant de commencer la culture cellulaire.
    1. Tout d’abord, autoclave 1,5 g de poudre d’agarose dans un bécher de 100 mL, puis ajouter 75 mL stérile, l’eau distillée et micro-ondes pour produire fondu 2% agarose pour la coulée de boîte de Pétri 3D.
    2. Dans un espace de travail stérile, distribuez l’agarose fondue dans le moule de boîte de Petri 3D jusqu’à ce que le ménisque soit nivelé avec les côtés du moule.
    3. Laisser refroidir et solidifier l’agarose. Lorsqu’il est solide, tourner le moule à l’envers et fléchir doucement à plusieurs reprises jusqu’à ce que la boîte de Pétri 3D agarose tombe libre du moule.
      REMARQUE: À ce stade, on peut préparer de nombreux plats de Pétri 3D agarose et les stocker dans stérile H2O ou DPBS à 4 °C pendant plus d’un mois.
    4. Avant de la culture, placez les boîtes de Pétri 3D agarose dans un plat 24 bien cultivé, et couvrez-les avec 1 mL de BM. Laissez les boîtes de Pétri 3D s’équilibrer en BM pendant au moins 30 min dans un incubateur culturel de 37 °C. Jetez le BM, et répétez l’équilibrage une fois de plus avec 1 mL de BM frais. Après l’équilibrage des boîtes de Pétri 3D en BM, elles apparaîtront de la même couleur que la BM (c.-à-d. rose).
    5. Pour préparer l’ensemencement cellulaire, retirez tous les BM du puits et distribuez 200 μL de BM frais autour, mais pas à l’intérieur de l’évidement central de la boîte de Pétri 3D. En outre, recueillir tout BM restant de l’intérieur de la cavité centrale d’ensemencement cellulaire de l’insert de microwell.
    6. Distribuez la suspension à cellule unique (4,66 cellules/mL dans 60 μL de BM) dans l’évidement central de la boîte de Pétri 3D agarose. Triturer doucement de haut en bas pour mélanger les cellules et garantir une suspension cellulaire unique au début de la culture.
    7. Placer dans un incubateur humidifié de 35 °C pour la culture. Le lendemain, retirez les 200 μL de BM autour de l’insert de microwell, et remplacez-les par 1 mL de BM frais. Ceci apportera le niveau liquide au-dessus du plan de l’insert, vantant toute la culture.
    8. Retirez/ajoutez lentement et soigneusement les supports de l’extérieur de la boîte de Pétri 3D agarose. Les organoïdes devraient s’être compactés pendant la nuit, ce qui leur permet de se reposer au fond et de permettre aux changements des médias de laisser les organoïdes intacts.
  4. Pour la culture ecm 3D, préparer une suspension cellulaire unique en combinant, à parts égales, la suspension cellulaire en BM avec ecm froid et prégelé (concentration finale = 2,8 x 106 cellules/mL).
    1. Distribuez immédiatement le mélange cellule-ECM dans une glissière de chambre de 4 puits, en veillant à ce que le mélange couvre tout le fond de la plaque.
    2. Placez les glissières de chambre à 35 °C dans un incubateur et laissez son contenu polymériser. Cela devrait prendre au moins 30 min. Après la polymérisation, ajouter 500 μL de BM sur le dessus de la culture.
      REMARQUE : Les cellules auraient dû se regrouper pour former de petits agrégats 3D dans les 24 premières heures de la culture.

4. Entretien organoïde

  1. Culture tous les types de modèles organoïdes à 35 °C. Pour tous les types de culture échanger la moitié de leurs médias avec BM frais tous les 2 jours. Pour s’assurer que les organoïdes ne sont pas collectés accidentellement lors de l’échange moyen, toujours recueillir les médias lentement à partir d’un coin de la boîte de diapositives de chambre, et à partir d’un point externe à l’extérieur des plats agarose 3D Petri. Tous les supports peuvent être stockés à -20 °C pour être utilisés avec des immunoassays ou d’autres analyses ultérieures (c.-à-d. quantification d’hormones reproductrices sécrétées ou de cytokines).
  2. Après 7 jours dans la culture, employer BM contenant l’hormone stimulante de follicule (concentration finale 20 mIU/mL) et la gonadotropine chorionique humaine (concentration finale 4.5 IU/mL). Cela s’applique à tous les types de culture organoïde.
  3. Imagez régulièrement toutes les cultures organoïdes (c.-à-d. imagerie en accéléré) pour caractériser la formation organoïde et quantifier les mesures de l’auto-assemblage, du développement et de la croissance au fil du temps.

5. Collection Organoïde

REMARQUE : Tous les organoïdes peuvent être fixés avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS pour l’immunolabeling en aval et les analyses histologiques. Fixer à 2 h à température ambiante avec rotation, ou toute la nuit à 4 °C.

  1. Pour les cultures sans ECM 2D, rincez d’abord l’échantillon avec du PBS frais, puis ajoutez du fixatif directement au-dessus des constructions adhérentes.
  2. Pour les méthodes de culture ECM (2D et 3D), rincer une fois avec PBS, puis soit ajouter fixatif directement sur le dessus de l’échantillon ECM-organoïde (pour fixer le gel ECM et organoïdes ensemble), ou alternativement, pipette doucement les organoïdes de haut en bas pour les libérer de l’ECM environnant, et transférer dans un tube séparé pour la fixation.
  3. Pour une culture 3D sans ECM, pipette doucement les organoïdes de haut en bas dans l’encastrement central de la boîte de Pétri 3D agarose; ceci rincera les organoïdes dehors facilitant leur collection facile avec une pipette. Transférer ensuite les organoïdes dans un tube séparé pour la fixation.
  4. Avant de se transformer en paraffine, intégrer de nombreux organoïdes (≥ 20) dans un petit volume (~ 30 μL) de gel de traitement des tissus; cela aide à orienter et à concentrer les organoïdes dans une petite zone à l’intérieur des blocs de paraffine, facilitant une observation plus facile lors de la section et une identification visuelle plus facile dans les sections de paraffine.
    REMARQUE : Les organoïdes peuvent être difficiles à identifier après l’intégration de la paraffine et la section sur une microtome.

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Representative Results

La génération organoïde a été considérée comme infructueuse si les cellules testiculaires ne se sont pas auto-assembler dans les 72 h de culture, cependant, toutes les méthodes présentées ici se réunissent dans les 24 h lors de l’utilisation de cellules murines juvéniles (5 dpp). Échec de la génération de construction biologique présentée comme une continuation des cellules librement suspendues (colonne de 0 h dans la figure 1)même après culture étendue (72 h). En l’absence d’auto-assemblage tissulaire, les grappes cellulaires apparentes se dispersent facilement en cellules individuelles même lors d’une manipulation douce (c.-à-d. pipetage). Les tissus générés avec succès ont d’abord été observés sous forme de « grappes » de cellules 3D (flèches jaunes dans la colonne de 6 h de la figure 1). Dans des environnements sans ECM (2D et 3D), ces constructions semblaient visiblement « compactes » à travers les 24 premières heures de culture, surtout lorsqu’en 3D s’agacé dans les boîtes de Pétri(figure 1A,C). Dans les environnements ECM (2D et 3D), les grappes cellulaires possédaient des marges claires entre le cluster et leur environnement environnant(figure 1B,D). On a également observé que les grappes cellulaires migrent à travers l’ECM et fusionnent ensemble formant de plus grands amas (flèches rouges de la figure 1B). Le temps nécessaire pour apprécier des structures auto-assemblées distinctes a été mesuré, et il n’y avait aucune différence significative dans le temps requis entre les conditions 2D et 3D sans ECM et ecm 2D, cependant, la culture ECM 3D a nécessité beaucoup plus de temps pour assembler des structures de novo que toutes les autres méthodes de culture (Figure 1E). La culture ECM 2D sans ECM et 3D a généré des clusters cellulaires avec des tailles significativement plus petites que les méthodes de culture 2D ECM et 3D sans ECM; La culture sans ECM 3D a produit les plus grands amas avec un seul cluster grand et compact dans chaque puits de la boîte de Pétri agarose 3D (Figure 1C,F). En résumé, ces données démontrent la facilité avec laquelle produire des constructions biologiques testiculaires à partir de cellules primaires de souris juvéniles dans quatre environnements de culture archétypale et mettent en évidence différents phénotypes d’assemblage dirigés par cellules dans ces différents environnements culturels.

Un but de tous les modèles organoïdes est de récapituler un mimétique de morphologie interne du tissu indigène. Pour évaluer ce résultat, les constructions biologiques assemblées dans chaque condition de culture ont été cultivés pendant 72 h, puis sondés pour des marqueurs spécifiques aux cellules et visualisés avec l’immunofluorescence (figure 2). La variabilité de la morphologie tissulaire a été observée entre différentes méthodes de culture. Organoïdes exempts d’ECM 2D présentés comme des grappes de cellules Sertoli (SOX9 et βCatenin) avec quelques cellules germinales (DDX4, marqueur de cellules germinales pan) adhéraient au-dessus d’une couche confluente basale 2D contenant de nombreuses cellules somatiques, y compris Sertoli, péritubulaire (αSMA) et cellules Leydig (3βHSD)(figure 2A-D). Notez que la figure 2B-D sont des images épifluorescentes de l’échantillon 2D exempt d’ECM, et non d’une section de 5 μm; cela permet de visualiser à la fois la couche cellulaire somatique basale et les agrégats orientés de façon supérieure de Sertoli et des cellules germinales. En revanche, la culture ecm 2D s’est présentée avec un phénotype largement différent, car des structures biologiques claires avec des frontières distinctes ont été facilement discernées au-dessus du gel basal d’ECM (figure 2E). Ces structures ont possédé une morphologie intérieure complexe avec la compartimentation de novo des types de cellules tubules contre interstitielles du testicule, et ainsi ont été considérées organoïdes réussies. Les régions tubulaires contenaient sertoli, cellules péritubulaires et germinales, et les régions interstitielles contenaient le Leydig, les cellules péritubulaires et les cellules non étiquetées (figure 2F-H). De même, les organoïdes sans ECM 3D possédaient également une morphologie interne compartimentée et étaient donc considérés comme des organoïdes réussis. En particulier, les organoïdes sans ECM 3D se distinguaient par des régions tubulaires contenant des cellules péritubulaires qui se sont spécifiquement orientées autour de groupes de Sertoli et de cellules germinales avec une haute fidélité (Figure 2I-L). Les structures assemblées par ECM 3D ne possédaient pas de morphologie sophistiquée, mais on a plutôt observé qu’il s’agissait de grappes de cellules sertoli, avec des cellules germinales occasionnelles et des cellules leydig. Dans ces échantillons, de nombreux Sertoli et cellules non étiquetées sont restés suspendus entre organoïdes dans une orientation « stroma-like »(figure 2M-P). Ensemble, ces données mettent en évidence la variabilité des phénotypes morphologiques que les différentes méthodes de génération organoïde produisent et soutiennent l’utilisation de deux environnements spécifiques d’assemblage organoïde, 2D ECM et 3D ECM-free, pour la génération d’organoïdes testiculaires avec une morphologie interne hautement mimétique de compartimentation testiculaire.

Pour évaluer davantage la fonction organoïde testiculaire, des organoïdes assemblés sans ECM 3D ont été choisis pour une analyse plus profonde à long terme. Pour cette étude, ces organoïdes ont été cultivés pendant 14 jours, puis sondés pour des marqueurs spécifiques de cellules et de structure. Lors de l’analyse immunofluorescente à 14 jours, on a observé que les organoïdes sans ECM 3D contenaient des structures tubule-like (TLS) et une architecture tissulaire remarquablement semblable aux testicules in vivo(figure 3A-D). Les cellules interstitielles ont été convenablement situées dans des régions séparées de TLS. Des sections de tissu ont alors été sondées pour le marqueur de cellules germinales de casserole, DDX4, marqueur spermatogonial de cellules souches, SALL4, et marqueur de méiose, SCP3 (figure 3E-G). Des cellules rares DDX4-positives et SALL4-positives ont été observées, cependant, aucun signal de SCP3 n’a été identifié. Lors d’une caractérisation plus profonde du TLS, on a observé qu’ils contenaient un espace apparaissant comme lumen entouré de cellules sertoli polarisées et d’un monocouche externe de cellules péritubulaires (figure 3I-L). Les cellules sertoli présentaient également des jonctions étroites entre eux, telles que visualisées avec la microscopie électronique de transmission et avec l’étiquetage contre ZO-1, une protéine jonctionnelle et composant de la barrière de testicules sanguins (figure 3H,L). Ensuite, des organoïdes sans ECM 3D ont été étudiés pour la fonction endocrinienne dans la culture à long terme de 12 semaines avec la stimulation de gonadotropine (figure 4). La testostérone et l’inhibine B, hormones reproductrices des cellules De Leydig et sertoli respectivement, ont été identifiées et quantifiées du milieu conditionné organoïde(figure 4A). Plus de 12 semaines de culture, les deux hormones ont été mesurées pour répondre de manière significative à la supplémentation des gonadotropines FSH et hCG (flèche rouge indique le début de la supplémentation, pendant les semaines 2 - 12). À la fin, un test a été effectué pour déterminer si la réactivité endocrinienne a été préservée. Les gonadotropines ont été enlevées pendant 48 h, au cours de laquelle les concentrations de testostérone et d’inhibine B ont significativement diminué en concentration. Après 48 h, les gonadotropines ont été retournées à la culture et les deux concentrations d’hormones ont augmenté de façon significative à nouveau au cours d’une dernière 24 h, démontrant une bonne réactivité endocrinienne (figure 4B). Collectivement, ces résultats d’analyse histologique et endocrinien démontrent que les organoïdes testiculaires sont un modèle utile pour étudier le développement testiculaire (c.-à-d. compartimentation et tubulogenèse de novo) et la fonction testiculaire de cellules somatiques in vitro (p. ex., formation de jonction serrée et fonction endocrinienne).

Figure 1
Figure 1 : Les organoïdes s’auto-assemblent dans des conditions de culture 2D et 3D, ECM et ECM.
5 cellules testiculaires murines dpp ont été cultivés dans quatre conditions différentes : 2D ECM-free (ligne A),ECM 2D (ligne B),3D ECM-libre (ligne C),et ECM 3D (ligne D). Des graphiques représentant la méthode de culture sont fournis dans la colonne de gauche. Des montages d’images représentatifs ont été assemblés à partir d’images en accéléré capturées au cours de la culture en direct. Les points de temps pour chaque image sont étiquetés à la marge supérieure. Le temps 0 h est avant n’importe quel assemblage organoïde s’est produit, le temps 3 h est pendant l’assemblage organoïde cellulaire continu, et les temps 6 h et 9 h démontrent représentant, organoïdes avec succès formés. Les flèches jaunes marquent les grappes cellulaires et les flèches rouges marquent les endroits où des grappes cellulaires distinctes ont migré et fusionné. Toutes les barres d’échelle = 1 mm.(E) Letemps nécessaire avant que des grappes cellulaires séparées puissent être visiblement appréciées a été enregistré pour chaque condition. 2DF = sans ECM 2D; 2DE = ECM 2D; 3DF = sans ECM 3D; 3DE = ECM 3D. (F) La superficie par grappe a été mesurée pour chaque condition de culture. Les images ont été sélectionnées à partir de n= 3 – 5 expériences distinctes. ANOVA à sens unique avec le test de comparaisons multiples de Tukey a été utilisé pour déterminer l’importance dans 1E et 1F; graphiques ont été assemblés à partir des moyens d’expériences distinctes n=4. Ce chiffre a été modifié à partir d’Edmonds et Woodruff37. ©'IOP Publishing. Reproduit avec permission. Tous les droits réservés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Les organoïdes cultivés sans ECM 2D et 3D présentent une compartimentation des types de cellules tubulaires et interstitielles.
Images représentatives de champ lumineux et immunofluorescentes d’organoïdes auto-assemblés après 72 h de culture. Des échantillons sans ECM 2D ont été photographiés sur la monture entière, tous les autres échantillons ont été photographiés en sections de tissu de 5 μm. (A – D) culture sans ECM 2D. (E – H) 2D ECM culture. (I – L) culture sans ECM 3D. (M – P) culture ECM 3D. Les marqueurs spécifiques aux cellules utilisés pour l’analyse sont étiquetés sur la marge supérieure : noyaux cellulaires sertoli (SOX9) et corps cellulaires (βCatenin), cellules germinales (DDX4, marqueur des cellules germinales pan), cellules Leydig (3βHSD) et cellules péritubulaires (αSMA). Tous les échantillons fluorescents ont été co-tachés pour l’ADN avec DAPI. Les flèches jaunes pointent vers les cellules germinales marquées DDX4 dans la deuxième colonne à partir de la gauche, les flèches rouges pointent vers les grappes cellulaires sertoli dans les deux colonnes droites. Barres d’échelle de champ lumineux = 400 μm, barres fluorescentes = 100 μm. Ce chiffre a été modifié à partir d’Edmonds et Woodruff37. ©'IOP Publishing. Reproduit avec permission. Tous les droits réservés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Les organoïdes développent des structures en forme de tubule peuplées de cellules germinales rares.
Les organoïdes assemblés sans 3D-ECM ont été cultivés pendant 14 jours. (A-D) Des images représentatives H&E et immunofluorescentes détaillant les types de cellules et les caractéristiques tissulaires autour des structures en type tubule (TLS); le même organoïde est représenté dans les sections tissulaires adjacentes permettant une comparaison côte à côte des caractéristiques morphologiques : cellules de Leydig (3βHSD), cellules péritubulaires (αSMA), corps cellulaires sertoli (βCatenin), membrane de collagène (COL IV) et noyaux cellulaires sertoli (SOX9); barres à l’échelle = 100 μm. (E - G) L’étiquetage immunofluorescent a été exécuté contre des cellules germinales, y compris un marqueur de cellules germinales de casserole (DDX4), marqueur spermatogonial de cellules souches (SALL4) et spermatocytes méiotically actifs (SCP3). Les insets fortement magnifiés sont décrits par des panneaux jaunes en 3E et 3F. Les triangles verts indiquent les cellules étiquetées DDX4; Les flèches rouges pointent vers les cellules étiquetées SALL4. (H) Micrographe électronique de transmission représentatif (TEM) d’une jonction serrée entre les cellules sertoli dans un organoïde; Barre d’échelle TEM = 100 nm. (I - L) Images représentatives de grossissement élevé d’un TLS étiqueté pour les caractéristiques clés de l’épithélium séminifère, y compris les jonctions serrées (ZO1) et laminine. Le même TLS est représenté dans les sections de tissu adjacentes dans les panneaux I - L. Tous les échantillons fluorescents ont été co-tachés pour l’ADN avec DAPI. Les images ont été sélectionnées à partir d’expériences biologiques distinctes n=7. Ce chiffre a été modifié à partir d’Edmonds et Woodruff37. ©'IOP Publishing. Reproduit avec permission. Tous les droits réservés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Les organoïdes sécrètent de la testostérone et de l’inhibine B pendant plus de 12 semaines de culture en réponse aux gonadotropines FSH et hCG.
Les médias conditionnés recueillis à partir d’organoïdes sans 3D-ECM ont été mesurés pour la testostérone et l’inhibine B par l’intermédiaire de l’essai immunosorbent enzyme-lié (ELISA). (A) Organoïdes ont été cultivés pendant douze semaines, avec FSH et supplémentation hCG pendant les semaines 2 - 12 (début de la supplémentation est marquée par une flèche rouge sur l’axe x); toutes les valeurs ont été comparées au jour 7 de la culture pour les tests statistiques. (B) Graphique grossi d’un « test de restimulation » pour déterminer si la réactivité endocrinienne a été préservée après 12 semaines. La période du test est décrite par la boîte grise en 4A. À l’achèvement de 12 semaines dans la culture, les gonadotropines ont été enlevées pendant 48 h, puis re-complétées pour une dernière 24 h de culture. Les hormones ont été mesurées à 0, 2, 6, 12, et 24 h après la re-stimulation de gonadotropine ; les zones ombragées rouges désignent les périodes de temps pendant la culture avec FSH et hCG, les zones non ombragées désignent des périodes de temps sans FSH et hCG ; les valeurs p notées sont relatives à 2 h après la restimulation. ANOVA dans les deux sens avec le test de comparaison multiple de Tukey a été utilisé pour déterminer l’importance de toutes les données endocriniennes, n = 5 expériences biologiques distinctes. Ce chiffre a été modifié à partir d’Edmonds et Woodruff37. ©'IOP Publishing. Reproduit avec permission. Tous les droits réservés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Avec l’achèvement de ce protocole de génération organoïde, l’utilisateur aura quatre techniques de culture différentes à leur disposition pour l’assemblage de constructions testiculaires et organoïdes dans des environnements ECM ou ECM-free. Fait important, les quatre méthodes permettent au chercheur d’observer de façon non invasive l’auto-assemblage organoïde au fil du temps par imagerie ou enregistrement vidéo en accéléré, et de recueillir non invasivement des supports conditionnés pour l’analyse des hormones sécrétées et des cytokines, sans perturber les tissus pendant la culture. Dans toutes les méthodes, au cours de 24 h, un expérimentateur peut générer jusqu’à plusieurs centaines d’organoïdes / constructions testiculaires, comme le nombre de cellules le permettent. Ces méthodes favorisent l’auto-assemblage des tissus en constructions de tailles et de morphologies différentes; la taille organoïde dépend du nombre et de la concentration cellulaires utilisés dans la culture, comme on le voit dans d’autres rapportsorganoïdes 34. La réduction de la taille ou du diamètre organoïde pourrait aider à réduire le développement des régions intérieures de nécrose qui sont parfois présente dans les organoïdes plus grands. Une force particulière des méthodes de protocole 2D ECM et 3D ECM-free sont leur capacité à générer des organoïdes testiculaires morphologiquement mimétiques, contenant la compartimentation de novo des types tubulaires contre interstitiels de cellules. En outre, les organoïdes assemblés sans ECM 3D fournissent un modèle pour de novo tubulogenesis de TLS séminifère, avec sertoli et cellules péritubulaires convenablement compartimentés et orientés. C’est un phénotype important pour étudier des organoïdes testiculaires, et est toujours un résultat variable parmi différents rapports organoïdes testiculaires ; plusieurs autres rapports manquent de tubule par rapport à la compartimentation interstitium et certains développent même un phénotype32 , 33,,3434,38. Bien qu’aucune des méthodes de génération organoïde présentées dans le présent manuscrit n’aient été caractérisées pour maintenir de grandes populations de cellules germinales pendant de longues journées de culture, car les cellules germinales étaient rarement observées dès 72 h, les méthodes 2D ECM et 3D sans ECM pourraient fournir un outil utile pour étudier la tubulogenèse in vitro et la composante cellulaire somatique d’un environnement de niche spermatogonial. Avec cet objectif à l’esprit, organoïdes testiculaires fournissent une plate-forme potentielle pour optimiser les protocoles futurs pour améliorer l’entretien des cellules souches germinales in vitro, la progression méiotique, et la différenciation.

Un autre avantage de ces protocoles est la capacité de personnaliser et d’échelle la génération organoïde. Les populations cellulaires personnalisées, traitées par la drogue ou modifiées peuvent remplacer ou être utilisées en plus des cellules testiculaires primaires de souris37. Si les suspensions cellulaires sont de faible viabilité (<80 %), des méthodes devraient être prises pour améliorer la viabilité cellulaire de la suspension cellulaire. Il peut s’agir de réduire le temps passé dans les supports de dissociation et de minimiser la trituration pendant la digestion des tissus (étapes 2.4.1 - 2.5.2), d’augmenter le nombre de lavages après la dissociation, ou d’enlever les cellules mortes après la dissociation avec des kits de tri cellulaire ou d’étiquetage des cellules mortes. Toutefois, aucune de ces étapes n’était nécessaire pour produire les données représentatives partagées dans le présent rapport. Pour les méthodes de culture 2D et 3D ECM, ces protocoles peuvent être utilisés avec d’autres matrices biomatériales structurelles à base de protéines en plus de celles utilisées pour les études présentées ici. Ces autres biomatériaux comprennent le collagène, la gélatine, les extraits d’ECM disponibles dans le commerce et les hydrogels dérivés de l’ECM décellulariséssur mesure 25,26,28. Il y a quelques pointeurs pour la distribution de gel ECM de dépannage et la création d’inserts de boîte de Pétri 3D agarose de haute qualité. Lorsque vous jetant des gels ECM sur des plaques de chambre, assurez-vous de travailler rapidement et d’utiliser des pointes de pipette froides pour empêcher la polymérisation prématurée de l’ECM dans un tube ou une pointe de pipette avant de distribuer dans le plat de culture. Lors de la coulée de l’agarose fondue dans les moules à vaisselle 3D Petri (pour la culture sans ECM 3D), n’utilisez que de l’agarose chaude et non chaude pour assurer un moulage de haute qualité des inserts avec une variation minimale, et vérifiez que l’agarose a complètement refroidi à la température ambiante et solidifié avant de tenter d’enlever du moule. Les boîtes de Pétri 3D Agarose sont mieux manipulées délicatement avec des forceps fins. Lors de la collecte des organoïdes pour la fixation, assurez-vous de travailler sous un microscope de dissection pour visualiser la collection de tous les organoïdes. Les organoïdes peuvent coller au côté en plastique des plats de culture et à l’intérieur des pointes de pipette ; les pipettes en verre présentent moins d’adhérence organoïde que le plastique. La fixation des organoïdes tout en étant encore encapsulée à l’intérieur ou au-dessus de l’ECM est un processus plus difficile et délicat que de les retirer de l’ECM avant la fixation. Le gel de traitement des tissus peut être coulé au-dessus de la construction ECM-organoïde avant l’enlèvement de la chambre de culture pour aider à renforcer le gel avant la fixation39. La fixation doit être effectuée à température ambiante pour récupérer les hydrogels ECM car ils sont susceptibles de dé-polymériser s’ils sont abaissés à 4 °C. En outre, 0,1 % à 1,0 % de glutaraldehyde peut être ajouté à la solution PFA de 4 % pour aider à relier davantage l’ECM; toutefois, cette méthode augmente l’autofluorescence de fond de l’échantillon.

Il existe des limites considérables spécifiques aux cellules germinales aux résultats obtenus par les méthodes de génération organoïdes présentées ci-dessus, qui représentent des domaines prioritaires pour l’innovation future. Les cellules germinales sont mal soutenues sur une culture étendue, ne sont facilement observées que pendant les premiers jours de culture et sont rarement observées à la fin de la première semaine de culture et à des moments ultérieurs. Tandis que le spermatogonia indifférencié peut être maintenu dans la culture in vitro de cellules tout en maintenant leur capacité de reconstituer la spermatogenèse lors de la transplantation dans les tubules in vivo40,le microenvironnement somatique de tubule (c.-à-d., les interactions cellulaires directes de Sertoli) sont supposées être une condition préalable à la différenciation des cellules germinales préméiotiques dans et par méiose et spermiogenèse in vitro1,5,40,41. Les organoïdes testiculaires contenant de la spermatogonie à des moments précoces dans un TLS structurellement mimétique pourraient permettre au champ d’étudier de façon non invasive les interactions somatiques-somatiques et somatiques-germinales entièrement in vitro. Optimisation des additifs médiatiques et de la préparation cellulaire avant la culture (p. ex., incorporation d’agents utilisés pour la culture in vitro des cellules souches spermatogoniales)42,43 pourraient augmenter le rendement des cellules germinales dans de futures études, en particulier sur des périodes de culture plus longues que plusieurs jours. Inversement, les méthodes de réintroduire la spermatogonie après la formation de TLS, par exemple par microinjection, constituent une occasion intéressante de restaurer les cellules germinales dans les organoïdes et de tester la capacité des environnements somatiques organisés in vitro à maintenir les cellules germinales. D’autres facteurs biologiques ont été observés pour affecter la culture ex vivo explant, y compris l’âge/maturité45 et les différences génétiques de fond17. Ces mêmes variables n’ont pas encore été directement étudiées dans le domaine de la biologie organoïde testiculaire. Cependant, il est plausible que différents phénotypes d’assemblage, de morphologie et fonctionnels puissent résulter lorsque des organoïdes sont générés à partir de cellules isolées d’animaux d’âge différent (c.-à-d. néonatals, juvéniles, adultes) ou d’animaux d’origine génétique variable (p. ex., différentes souches de souris).

En résumé, les techniques partagées dans ce manuscrit fournissent quatre modèles utiles pour étudier l’auto-assemblage des constructions testiculaires à cellules, la génération de deux modèles organoïdes testiculaires structurellement mimétiques distincts, et l’importante réalisation du développement de TLS et de la fonction endocrinienne hormono-réactive in vitro. Ces modèles englobent les orientations spatiales 2D et 3D dans les environnements ECM et ECM avec des supports culturels minimalement complexes et complètement définis. Chaque méthode est hautement reproductible et n’utilise que les ressources culturelles couramment disponibles. Ces méthodes peuvent s’avérer avantageuses pour étudier la morphogenèse testiculaire in vitro et optimiser les conditions de culture futures pour la spermatogenèse in vitro. Plus encore, les méthodes 2D ECM et 3D sans ECM fournissent un nouvel outil pour étudier le processus de compartimentation des tissus de novo unique aux testicules, à la tubulogenèse in vitro et aux interactions somatiques-somatiques et somatiques-germinales. Les organoïdes testiculaires offrent une occasion flexible et évolutive d’étudier le développement et la régulation des caractéristiques physiologiques testiculaires somatiques; y compris la barrière de testicules sanguins et la production et la réponse endocriniennes; et, aussi, un outil utile pour développer des modèles de tissus de recherche translationnelle de prochaine génération. Il s’agit notamment d’incorporer des hormones reproductrices dans des modèles plus grands au niveau des systèmes, tels que les plates-formes tissulaires sur puce et micro-physiologiques45,46. D’autres objectifs translationnels vers lesquels les organoïdes testiculaires pourraient un jour être appliqués incluent la toxicologie de la reproduction et le test de barrière immunologique, le développement de contraceptifs masculins et l’innovation en matière de technologie de reproduction assistée.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par les National Institutes of Health, le National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, le National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 et 4UH3ES029073-03, et le Thomas J. Watkin’s Memorial Professorship.

Les auteurs remercient Eric W. Roth pour leur aide à la microscopie électronique de transmission. Ces travaux ont fait usage de l’installation BioCryo du NUANCE Center de l’Université Northwestern, qui a reçu le soutien de la Ressource expérimentale en nanotechnologie douce et hybride (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); le programme MRSEC (NSF DMR-1720139) au Materials Research Center; l’Institut international de nanotechnologie (IIN); et l’État de l’Illinois, par l’intermédiaire de l’IIN. Il a également utilisé l’équipement CryoCluster, qui a reçu le soutien du programme d’IRM (NSF DMR-1229693). Les graphiques de la figure 1 ont été conçus à l’aide BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 um Media Sterile Filters Millipore Sigma scgpu05re For sterile filtering media
3βHSD primary antibody Cosmo Bio Co K0607 Leydig cell marker, 1:500 dilution
AlexaFluor 568 α-Mouse Thermo Fisher Scientific A-21202 Fluorescence-tagged secondary antibody
AlexaFluor 568 α-Rabbit Thermo Fisher Scientific A10042 Fluorescence-tagged secondary antibody
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific 11-095-080 Base of culture media
Collagenase I Worthington Bio LS004197 For dissociation solution 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free Corning 354234 Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels
Countess Cell counter Thermo Fisher Scientific C10227 Autmated cell counter (hemacytometer machine)
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228 Hemacytometer slide for use with Countess automated counter
DDX4 primary antibody Abcam 138540 Spermatogonia marker, 1:500 dilution
Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) Worthington Bio LS002140 For dissociation solution 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl Thermo Fisher Scientific 14040182 For reconstituting Hyaluronidase
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg Thermo Fisher Scientific 14040117 PBS
Embryo Grade H2O MIllipore Sigma W1503 For reconstituting Collagenase I and Dnase I
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 For quencing enzyme dissocation solutions
Follicle stimulating hormone Abcam ab51888 For long-term organoid culture
Human chorionic gonadotropin Millipore Sigma C1063 For long-term organoid culture
Hyaluronidase, from bovine testes Millipore Sigma H4272 For dissociation solution 2
Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay Ansh Labs AL-107 Inhibin B ELISA Kit
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028 Serum source for Basal media
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) Millipore Sigma Z764051 For 3D ECM-Free organoid fabrication
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well Thermo Fisher Scientific 12-565-7 For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15-140-122 Antibiotic for media
Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 For aiding paraffin embedding
SOX9 primary antibody Millipore Sigma AB5535 Sertoli Marker, 1:500 dilution
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) Teklad Global 2920 Mouse food without phytoestrogens
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) Teklad Global 2916 Mouse food without phytoestrogens
Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay Calbiotech TE373S Testosterone ELISA Kit
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 For cell counting
αSMA primary antibody Millipore Sigma A2547 Peritubular marker, 1:500 dilution
βCatenin primary antibody BD Biosciences 610154 Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution

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References

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Biologie du développement Numéro 164 testicules organoïde testiculaire matrice extracellulaire 2D 3D assemblage tubule fonction endocrinienne
Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids
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Edmonds, M. E., Forshee, M. D., Woodruff, T. K. Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids. J. Vis. Exp. (164), e61403, doi:10.3791/61403 (2020).

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