Summary
Driedimensionale (3D) cellulaire systemen zijn relevante modellen voor het onderzoeken van organogenese. Een hydrogel-gebaseerde methode voor biliaire cysten productie en hun karakterisering wordt voorgesteld. Dit protocol ontrafelt de barrières van 3D-karakterisering, met een eenvoudige en betrouwbare methode om de efficiëntie, maten en grootte van cystevorming te beoordelen en hun functionaliteit te testen.
Abstract
Cholangiocyten, de epitheelcellen die de galwegen in de lever line-up, toezicht houden op galvorming en modificatie. In de afgelopen twintig jaar zijn in de context van leverziekten 3-dimensionale (3D)-modellen op basis van cholangiocyten ontstaan, zoals cysten, sferoïden of buisachtige structuren om weefseltopologie na te bootsen voor organogenese, ziektemodellering en onderzoeken naar geneesmiddelenscreening. Deze structuren zijn voornamelijk verkregen door het inbedden van cholangiocyten in een hydrogel. Het belangrijkste doel was om zelforganisatie te bestuderen door epitheliale polariteit, functionele en morfologische eigenschappen aan te pakken. Echter, zeer weinig studies richten zich op cyste vorming efficiëntie. Wanneer dit het geval is, wordt de efficiëntie vaak gekwantificeerd uit afbeeldingen van een enkel vlak. Functionele testen en structurele analyse worden uitgevoerd zonder de potentiële heterogeniteit van cystedistributie als gevolg van hydrogelpolymerisering heterogeniteiten en bijwerkingen weer te vertegenwoordigen. Daarom kan de kwantitatieve analyse, wanneer gedaan, niet worden gebruikt voor vergelijking van het ene artikel naar het andere. Bovendien staat deze methode geen vergelijkingen toe van 3D-groeipotentieel van verschillende matrices en celtypen. Bovendien is er geen melding gemaakt van de experimentele probleemoplossing voor immunostaining cysten. In dit artikel bieden we een betrouwbare en universele methode om aan te tonen dat de initiële celverdeling gerelateerd is aan de heterogene verticale verdeling van cystevorming. Cholangiocyte cellen ingebed in hydrogel worden gevolgd met Z-stacks analyse langs de hydrogel diepte in de tijd van 10 dagen. Met deze methode wordt een robuuste kinetiek van cystevormingsefficiëntie en -groei verkregen. We presenteren ook methoden om cyste polariteit en secretoire functie te evalueren. Tot slot worden aanvullende tips gegeven voor het optimaliseren van immunostaining protocollen om cyste-instorting voor beeldvorming te beperken. Deze aanpak kan worden toegepast op andere 3D-celkweekstudies, waardoor de mogelijkheden worden geopend om het ene systeem met het andere te vergelijken.
Introduction
In de afgelopen drie decennia is het gebied van in vitro onderzoek gevorderd in de richting van 3D-cultuursystemen. Er zijn een aantal protocollen opgedoken voor het kweken van cellen in 3D als sferoïden of aggregaten in aanwezigheid of afwezigheid van een steiger/matrix, in een druppel, in agitatie, in microfluïde apparaten of drijvend1. Het gebruik van 3D-cultuurmethoden heeft zijn voordelen bewezen ten opzichte van 2-dimensionale (2D) culturen, met name voor epitheliale cellen, waarvan werd aangetoond dat ze zichzelf organiseren in 3D-structuren, cysten of acini. In dit geval vormen de cellen een monolaag die een lumen omringt, waar cellen hun volledige epitheliale fenotype verwerven met verbeterde fysiologische specifieke functies2.
Talrijke studies hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van methoden voor de vorming van deze epitheliale organoïden in natuurlijke matrices. Dit heeft het mogelijk om te recapituleren in vivo cel-cel en cel-micro-omgeving interacties, om de oprichting en de stabiliteit van de epitheel fenotype3,4,5,6,7. Onlangs, en met name met het oog op de ontwikkeling van transplanteerbare organoïden en het ontcijferen van de eis van de micro-omgeving voor het orkestreren van het epitheliale programma, synthetische hydrogels zijn ontwikkeld om de vorming van epitheel acini8,9,10te verbeteren . Helaas rapporteren deze studies over kwalitatieve gegevens, of presenteren ze berekeningsmethoden met behulp van interne referenties, zoals de verhouding tussen cysten en niet-cysten in een 2D-vlak8,9,10. Dit sluit elke vergelijking tussen verschillende studies in termen van efficiëntie, stabiliteit, of morfologische en fysiologische karakterisering van de epitheel organoïden.
Micro-inkapseling van epitheelcellen in kralen met behulp van microfluïde apparaten heeft gezorgd voor meer realistische kwantitatieve en vergelijkende resultaten. Met behulp van deze technologie werden organoïden van verschillende celtypen gevormd en gedifferentieerd op basis van de morfologie tussen verschillende 3D cellulaire structuren11,12. Deze technologie is echter niet eenvoudig om mee te werken en vereist het gebruik van schone ruimten om de microfluïde apparaten te produceren. Deze technologie is opgezet voor een paar soorten hydrogels, maar vereist technische aanpassing toe te passen aan andere hydrogels, het beperken van de veelzijdigheid. Daarom zijn de meeste studies bedoeld om epitheliale organoïden te ontwikkelen afhankelijk van de inbedding van epitheliale cellen in een hydrogel bulk. Bij deze methoden wordt de hoge heterogeniteit van gelstructuratie en celverdeling in de hele 3D-cultuur vaak verwaarloosd. Daarom hebben de meeste analyses betrekking op enkele 2D-beelden, die slechts zeer ruwweg de verdeling van de verschillende cellulaire objecten in het hele 3D-volume vertegenwoordigen.
Ziekten die galwegen beïnvloeden, zoals cholangiocarcinoom, galatresie, primaire sclerosing cholangitis, onder andere, zijn een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit. Behalve voor levertransplantatie, zijn er geen effectieve behandelingen voor deze aandoeningen13. Inspanningen om galkanaalvorming, ziekteoorzaken en progressie te onderzoeken, zullen de ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk maken14.
Biliaire organotypic modellen van cysten, sferoïden of buisachtige structuren met behulp van normale of patiënt-afgeleide, gedifferentieerde, of voorloper afgeleide cholangiocyten cellijnen zijn ontwikkeld15,16,17,18,19,20. Verschillende studies hebben samengevat cholangiocyte polariteit, expressie van cholangiocyte markers, aanwezigheid van trilharen, cholangiocyte secretory en reabsorptief vermogen, en lumen vorming en obstructie; die allemaal belangrijke kenmerken van cholangiocyten fenotype, morfologie en functie15,17,19vertegenwoordigen . Anderen hebben gemeld onderhoud van patiënt-afgeleide galorganoïden voor langere tijd20. Onlangs onderzochten we de rol van biochemische en biofysische signalen op galcysten organogenese21. Belangrijk is dat de pathogenese van galatresie werd bestudeerd in galvormige sferoïden en buizen7,22. Bovendien werden de belangrijkste kenmerken van primaire scleroserende cholangitis zoals cholangiocytenscentie, afscheiding van pro-inflammatoire cytokinen en macrofaagwerving met succes onderzocht met behulp van galsferoïden15,20. Echter, reproduceerbare in vitro 3D kwantitatieve modellen die fysiologisch moduleren cholangiocyte fenotype, fysiologie, en micro-omgeving waar deze vragen kunnen worden aangepakt zijn nog steeds nodig. Bovendien hebben slechts weinig publicaties melding gemaakt van cystevorming efficiëntie21,23. Dit is een belangrijk punt vast te stellen, met name bij het onderzoeken van organogenese, ziekte oorzaak, en correlatie van de reacties van geneesmiddelen met cholangiocyte functie en polarisatie. Bovendien, met verschillen in steiger / matrix gebruikt van protocol tot protocol, is het moeilijk te vergelijken tussen systemen. Om deze problemen op te lossen, stellen we een kwantitatieve, betrouwbare en universele methode voor om galcysten te genereren die de vorming van lumen, cholangiocytepolarisatie en cholangiocytensecretoire functie nabootsen. Belangrijk is dat we een systematische analyse presenteren die langs de Z-as over de 3D-gel wordt uitgevoerd bij de evaluatie in de tijd, cystevormingsefficiëntie, grootte, levensvatbaarheid, polarisatie en functionaliteit. Verder gebruikten we een natuurlijke hydrogel en normale rattencholangiocyten (NRC)s, als voorbeeld voor het protocol, maar andere natuurlijke of synthetische hydrogels, evenals epitheelcellen kunnen worden gebruikt voor de vorming van 3D-cystische structuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van cysten
OPMERKING: Dit protocol kan worden uitgevoerd met elk type hydrogel, als de gelatie het mogelijk maakt inbedding van cellen.
- Hydrogel coating
OPMERKING: Een goede hydrogelcoating van de kamerdia is een kritieke stap om de vorming van 2D-cellagen op de bodem van de put te voorkomen, die de daaropvolgende cystebeeldvorming kunnen verstoren en de berekening van cystevormingsefficiëntie kunnen aantasten.- Om de homogeniteit van de geloplossing te garanderen, ontdooit u de hydrogel 's nachts bij 4 °C (O/N).
- Precool pipettips op ijs of O/N bij -20 °C en een 8-put kamer schuif bij -20 °C O/N.
- Plaats de hydrogel en de 8-well kamer glijbaan op een ijsemmer gevuld met ijs.
- Bereid in een conische buis van 15 mL een oplossing met 40% hydrogel (V/V) in koud NRC compleet medium (zie Tabel van Materialen)en plaats de buis op ijs.
- Om een kamerglijbaan te coaten, met behulp van koude pipettips, voeg je 50 μL hydrogeloplossing toe aan het midden van elke put en verspreid over het hele oppervlak met behulp van een pipetpunt, terwijl je de kamerglijbaan op ijs houdt(figuur 1A).
LET OP: Spreid de hydrogeloplossing zo gelijkmatig mogelijk uit om bellen te vermijden. - Om de hydrogel te polymeriseren, moet de schuifruimte minstens 15 minuten bij 37 °C, 5% CO2 uitbroeden.
- Celvoorbereiding
- Verwarm NRC complete medium, fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsine-ethyleenediamine tetraatisch zuur (trypsine-EDTA) in een waterbad voorverwarmd tot 37 °C.
- Terwijl de hydrogel polymeriseert, moet u ervoor zorgen dat NRC's tot 70% samenvloeiing worden geteeld in een kolf met collageencoating van25 cm2 . Was de cellen één keer met voorverwarmde 1x PBS.
- Broed de NRC's uit met 5 ml voorverwarmde 1x PBS (voor een T-25 cm2 kolf) gedurende 20 minuten bij 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: Deze stap, die de incubatietijd verkort met trypsin-EDTA is instrumenteel in het behouden van de zelforganiserende eigenschappen van cellen. - Gooi de PBS weg, voeg 1 mL trypsin-EDTA toe en broed gedurende 5-10 min bij 37 °C, 5% CO2.
- Neutraliseren met 4 mL van voorverwarmd compleet NRC-medium. Verzamel en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 mL en draai gedurende 4 minuten op 150 x g.
- Gooi het medium weg en verhoog de celpellet opnieuw in 5 mL voorverwarmd medium.
- Met behulp van een 40 μm celzeef filtert u de celoplossing in een conische buis van 50 mL en tel de cellen.
OPMERKING: Het doorgeven van de cellen door een zeef is een kritieke stap voor de kwantitatieve resultaten reproduceerbaar te zijn, dat wil zeggen, om bijna dezelfde grootte van cel aggregaten worden ingebed.
- Inbedding van celsuspensie in hydrogeloplossing
- Bereid een oplossing voor van 1.600 μL van 80% hydrogel (V/V) in koud compleet NRC-medium (buis 1); in het ijs te houden. Verdun 5 x 105 cellen/mL in 1.600 μL koud volledig NRC-medium (buis 2) en houd in ijs.
OPMERKING: Deze stap moet snel worden uitgevoerd om polymerisatie van de hydrogel te voorkomen terwijl deze wordt gemengd met de celsuspensie en om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. - Om een celzaaioplossing van 2,5 x 105 cellen/mL in 40% hydrogel (V/V) voor te bereiden, meng buis 1 en buis 2. Voeg 400 μL van de celoplossing toe aan elke put van de met hydrogel gecoate kamerglijbaan die bellen vermijdt (figuur 1B).
- Houd de schuifruimte in een couveuse op 37 °C met 5% CO2 tot de media veranderen.
- Na 2 dagen in cultuur, verwijder 250 μL van het medium uit een hoek van elke put, wees voorzichtig om de hydrogel niet uit te pipetten. Voeg vervolgens langzaam 250 μL van het kweekmedium toe. Verander het medium om de 2 dagen.
OPMERKING: Minimaliseer de beweging van de kamerglijbaan, vooral tijdens de cyste-initiatie.
- Bereid een oplossing voor van 1.600 μL van 80% hydrogel (V/V) in koud compleet NRC-medium (buis 1); in het ijs te houden. Verdun 5 x 105 cellen/mL in 1.600 μL koud volledig NRC-medium (buis 2) en houd in ijs.
2. Cystkwantificering
- Cyste beeldvorming
OPMERKING: Deze sectie moet snel worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cel niet in gevaar te brengen als de microscoop niet is uitgerust met een verwarmingskamer om CO2 en temperatuur te regelen. Om een consistente kwantificering te garanderen, representatief voor de cystenverdeling in het volledige hydrogelvolume, worden cysten afgebeeld via fasecontrastmicroscopie en seriële beeldvorming (Z-stacks), met vooraf gedefinieerde parameters in verschillende tijdstippen.- Neem een Z-stack langs de diepte van de hydrogel voor elk tijdstip(figuur 1C, D). In dit voorbeeld worden Z-stacks genomen op de dagen 1, 2, 4, 7 en 10.
OPMERKING: Controleer of de initiële celverdeling uniform is in de hydrogel om de toepasbaarheid van deze methode te garanderen.- Met een fase-contrastmicroscoop uitgerust met een beeldacquisitiesoftware, selecteert u de 10x objectieve vergroting in het handmatige neus-stuk padvenster (figuur 2B(1)).
- Schakel de witte lamp in en selecteer de brightfield-weergaveoptie.
- Schakel de camera in door de knopAfspelenin het submenu van de balk te selecteren. Focus op een gebied van cysten en stel de belichtingstijd in(figuur 2B(2)). Open het venster Automatisch vastleggen van afbeeldingen voor een automatische besparing van afbeeldingen(figuur 2B(3).
- Open het capture Z-serie venster en definieer met de Z schroef de boven- en onderkant van de Z-stack (dezelfde XY coördinaten, maar verschillende Z gescreend). Pas de Z-stap aan afhankelijk van de doelstelling, het resolutieniveau en druk op de knop "Nu uitvoeren" om de overname te starten (figuur 2B(4).
OPMERKING: In dit voorbeeld worden cysten verspreid over een hydrogeldikte van 520 μm. 26 beelden worden langs de hydrogeldiepte verworven met een interval van 20 μm Z-stap. Afhankelijk van het doel moet de Z-stap worden aangepast om geen cyste te missen en om de detectie van enkele cellen en aggregaten te garanderen. - Neem minstens 3 niet-overlappende Z-stacks per put.
OPMERKING: Deze bemonstering is noodzakelijk wanneer cysten, zoals in dit voorbeeld, talrijker zijn in de diepte van de gel dan aan de randen als gevolg van heterogeniteiten in de hydrogelpolymeerisatie. - Om een representatieve gegevensset te laten herhalen stap 2.1.1.5. voor 3 putten in totaal.
OPMERKING: De heterogene verdeling van cysten is afhankelijk van het type hydrogel, de polymerisatie en de cellijn. Gezien drie Z-stacks per put en drie putten per experiment, zijn minimaal 200 cysten afgebeeld over negen Z-stacks om cystevorming en cystegroei op elk moment te karakteriseren.
- Neem een Z-stack langs de diepte van de hydrogel voor elk tijdstip(figuur 1C, D). In dit voorbeeld worden Z-stacks genomen op de dagen 1, 2, 4, 7 en 10.
- Beeldverwerking
OPMERKING: In een hydrogel kunnen NRC's worden gevonden als enkele cellen, cysten of aggregaten. Cysten worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van een ronde en dunne contrasterende celshell die een lumen omsluit, terwijl celaggregaten een onregelmatige vorm vertonen en geen lumen hebben. Aggregaten en enkele cellen hebben een dichte en contrasterende uitstraling(figuur 3B( 4)).- Open de Fiji-software, open de Z-stack en ga naar het Fiji-menu en klik op Bestand | Openen (Aanvullendefiguur 1). Selecteer de Z-stack die u wilt analyseren. Selecteer indien nodig de optie" Virtuele stapel"en klik op' Ja' voor opening (figuur 3A(1).
- Dupliceer de stapel via afbeelding | Dupliceren. Klik op het vak "Dubbele stapel" en klik op "OK" ( Aanvullendefiguur 2).
OPMERKING: In dit voorbeeld zijn Z-stacks in .nd2-bestandsindeling gecodeerd in 16 bits. - Maak een minimale intensiteitsprojectie van de gedupliceerde stapel. Ga naar het menu Afbeelding | Stapels | Z Project. Selecteer Projectietype "Min Intensiteit" en klik op "OK" (Figuur 3A(2)(Aanvullende figuur 3).
- Trek de achtergrond van de projectie af. Ga naar het menu Proces | Achtergrond aftrekken. Typ 500,0 pixels met een rolballenstraal en klik op "lichte achtergrond" om cysten meer contrasterend te maken dan de achtergrond (figuur 3A(3)(Aanvullende figuur 4).
OPMERKING: De straal van de rollende bal definieert de grootte van het gebied waarop achtergrondaftrekken wordt gebruikt. Deze parameter moet zijn ingesteld op de grootte van het grootste object dat u wilt identificeren. - Als contrastverbetering nodig is, gaat u naar het menu Afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast | Auto | Solliciteer. Fiji optimaliseert automatisch de helderheid en het contrast. In (Figuur 3A(3)werden de lagere en bovenste grijze waarden vastgesteld op respectievelijk 49702 en 65452 (aanvullende figuur 5).
OPMERKING: Als de projectie niet is gekalibreerd, gaat u naar het menu Analyseren | Stel schaal in en typ de bijbehorende kalibratie μm/pixelverhouding (Aanvullende figuur 6).
- Cyst counting en cyste grootte metingen
- Om de geschatte cystediameter te meten, selecteert u het gereedschap Rechte lijn in het Fiji-menu en trekt u een lijn over de diameter van elke cyste op de uiteindelijke projectie(figuur 3B(4). Voeg de nieuwe regio van belang (ROI) die voor elke cyste is gemaakt toe aan de ROI-manager: druk op de "t" snelkoppeling op het toetsenbord voor het sneller tellen en openen van de ROI-manager. Klik op" Alles weergeven "om de getelde cysten te zien ( Aanvullende figuur7)
- Controleer of er geen cyste is achtergelaten zonder te tellen door de ingestelde ROI's uit de projectie op de Z-stack te overhouden. Klik hiervoor op het venster Z-stack om het te selecteren. Klik in de ROI Manager op'Alles weergeven'en verplaats de cursor langs de Z-stack om die afbeelding per afbeelding te controleren, alle cysten zijn geteld(aanvullende figuur 8).
- Zodra nieuwe cysten zijn geteld en ROI's zijn toegevoegd op stap 2.3.1., selecteert u de ROI-set en slaat u deze op via het venster ROI Manager door op Meer te klikken | Sparen (aanvullend figuur 9).
- Selecteer alle ROI's in de ROI Manager en klik op 'Meten'in de ROI Manager om de grootte van elke cyste te krijgen. Dit opent een nieuw venster met de naam "Resultaten" die elke cyste en de geschatte grootte nummeren. Sla vervolgens op in .csv-indeling door te klikken op het venster" Resultaten" en via het menu: Bestand | Opslaan als (aanvullend cijfer 10).
OPMERKING: Er kan een macro worden gemaakt om stapels semi-automatisch te verwerken, cysteaantal/maten te schatten uit de projecties en de gegevens op te slaan voor een snellere telprocedure. Selecteer hiervoor het gereedschapOpnemenin het balkmenu door op Plug-ins te klikken | Macro's | Record.
- Kwantificering van cystevorming efficiëntie
- Tel het aantal cysten op dag Y,
op een projectie (Y=1, 2, 4, 7 of 10). - Om de cystenvormingsefficiëntie voor 1000 cellen op dag Y te berekenen, deelt u het aantal cysten dat op dat moment werd geteld door het aantal cellen dat op dag 0 is ingezaaid, afgeleid van het hydrogelvolume en vermenigvuldigt u met 1000(figuur 3C, figuur 4).
- Tel het aantal cysten op dag Y,
op een projectie (Y=1, 2, 4, 7 of 10).
3. Levensvatbaarheid van cellen
- Bereid een voorraadoplossing van fluoresceïnediacetaat (FDA) voor op 5 mg/mL door 5 mg FDA op te lossen in 1 mL aceton en op te slaan bij -20 °C.
- Bereid een voorraadoplossing van propidiumjodide (PI) voor bij een concentratie van 2 mg/mL in gedeïmiseerd water (dH2O) en bewaar bij 4 °C.
- Bereid NRC medium voor zonder foetaal kalfsserum (FCS).
- Voeg voor de FDA/PI-kleuroplossing 4 μL FDA-voorraadoplossing (8 μg/mL eindconcentratie) en 25 μL PI-voorraadoplossing (20 μg/mL eindconcentratie) toe in 2,5 mL van NRC-medium zonder FCS.
- Haal het medium uit de kamerdia, voeg 250 μL kleuroplossing toe in elke put en broed 4-5 min in het donker bij 37 °C, 5% CO2. Pipette de kleuroplossing voorzichtig uit en was één keer met 250 μL 1x PBS.
- Voeg voorzichtig 250 μL van compleet NRC-medium toe aan elke put en maak foto's met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met Texas rood en fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) filters. Levende cellen zullen groen zijn en dode cellen zullen rood zijn(figuur 5A).
OPMERKING: Om levende/dode cellen te kwantificeren, moet u Z-stacks na stap 2 over het hydrogelvolume nemen en de beeldverwerkingsmethode voor fluorescentie aanpassen.
4. Afscheidingsactiviteit
OPMERKING: De afscheidingsactiviteit door het apicale membraan van de cholangiocyten wordt beoordeeld door de afscheiding van fluoresceïne in het lumen. De specificiteit ervan kan worden geëvalueerd door het doen van dezelfde test met Verapamil, een multi-resistente (MDR) transporter remmer24.
- Voeg 0,83 μL hoechst-voorraadoplossing (15 mg/mL voorraadconcentratie in dH2O) toe in 2,5 mL van NRC-medium zonder FCS om een kleuroplossing van Hoechst 33258 voor te bereiden op 5 μg/mL.
- Voeg 250 μL Hoechst-oplossing toe in elke put en broed op 37 °C, 5% CO2 gedurende 15 minuten.
- Verwijder de Hoechst-oplossing en voeg 250 μL FDA-oplossing (8 μg/mL eindconcentratie) toe in elke put. Incubeer 4-5 min bij 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: Zodra cellen worden blootgesteld aan FDA kleuring oplossing, de follow-up van fluoresceïne secretie kinetiek kan nuttig zijn om de tijd die nodig is voor cysten te scheiden kalibreren. Om dit te doen, foto's nemen elke min voor 1 uur via time-lapse imaging. In dit voorbeeld is de tijd die nodig is om NRC te observeren die cysten in de hydrogel afscheidt ongeveer 15-20 min. - Maak foto's met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop 5 min na het spoelen met medium zonder FCS. Gebruik 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en FITC filters om kernen etikettering en fluoresceïne accumulatie in het lumen (Figuur 6A) onthullen. Om het aantal afscheidende cysten te kwantificeren, neem je Z-stacks zoals in stap 2 en pas je de beeldverwerkingsstappen aan fluorescerende beelden aan.
OPMERKING: Voor de Verapamil-test gaat u vooraf aan het vorige proces (stap 4.3. tot en met 4.4.) door een incubatie met Verapamil, volgens de volgende voorwaarden: - Bereid een voorraadoplossing van 10 mM Verapamil in dimethylsulfoxide (DMSO) voor. Om 10 μM werkoplossing voor te bereiden, meng je 2,5 μL Verapamil stockoplossing met 2,5 mL cultuurmedium zonder FCS.
- Om te beoordelen dat de fluorescentie in het lumen het gevolg is van MDR-afscheiding, neemt u een andere dia en voegt u 250 μL Verapamil-werkoplossing toe in elke put en 20 min incubeer bij 37°C, 5% CO2
- Verwijder de oplossing en voeg 250 μL FDA-oplossing (8 μg/mL uiteindelijke concentratie) toe aan elke put. Incubeer 4-5 min in het donker bij 37 °C, 5% CO2. Was vervolgens met 250 μL 1x PBS, voordat beeldvorming(figuur 6B, C).
5. Epithelial polariteitsbeoordeling door immunofluorescentie
- Om de bevestigingsoplossing voor te bereiden, mengt u 4% formaldehyde met 5% sacharose, in 1x PBS, pH 7.4 en incubeer in een voorverwarmd waterbad bij 37 °C.
- Om de cellen te repareren, voorzichtig pipette uit de cultuur medium uit de put zonder beschadiging van de matrix. Voeg langzaam 400 μL van de bevestigingsoplossing toe aan de zijkant van de putten. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
LET OP: Laat altijd 25 μL van de vloeistof boven de matrix om schade te voorkomen. - Verwijder voorzichtig de bevestigingsoplossing en was 3x met 400 μL 1x PBS bij (RT).
- Pipette uit de PBS, voeg 400 μL permeabilisatieoplossing (0,5% Triton X-100 in 1x PBS) en incubeer 10 min bij RT.
- Verwijder voorzichtig de permeabilisatieoplossing, gevolgd door 3 snelle wasbeurten met 400 μL 1x PBS en een lange wasstap van 30 min bij RT.
LET OP: Bij deze stap kan de dia 2 dagen lang bij 4 °C worden bewaard. Verzegel in dit geval de glijbaan met een paraffinefilm om verdamping en matrixdrogen te voorkomen. - Verwijder de PBS, voeg 400 μL blokkeeroplossing toe met 0,1% runderserum albumine (BSA) en 10% geitenserum in 1x PBS en incubate gedurende 60 min bij RT.
LET OP: Concentraties van BSA hoger dan 0,1% zullen leiden tot intrekking van lumen en verdere instorting van de cyste (zie sectie Representatieve resultaten) (figuur 7A). - Pipette de blokkeringsoplossing uit en was één keer met 400 μL PBS/0,05% Tween 20 en gooi het weg.
- Voeg 150 μL van de antilichaamoplossing toe, bijvoorbeeld E-cadherineantilichaam verdund 1:400 en Phalloidin 568 (16,2 nM eindconcentratie) in 1x PBS en incubate gedurende 90 min bij RT.
OPMERKING: Deze verdunning van E-cadherine wordt hetzelfde gebruikt als in een standaard 2D-immunofluorescentieprotocol. - Was het monster met 400 μL PBS/0,05% Tween 20, 3x; telkens het monster gedurende 10 minuten uitbroeden bij RT.
- Voeg 150 μL van het secundaire antilichaam (geitantikonijn IgG Alexa Fluor Plus 647), verdund 1:500 in 1x PBS en incubate 60 min bij RT toe.
- Was 3x met 400 μL PBS/0,05% Tween 20, telkens als het monster 10 minuten uitbroedt bij RT.
- Was 3x met 400 μL 1x PBS, telkens het monster 10 minuten uitbroeden bij RT.
- Gooi de PBS van de laatste wasbeurt weg en bereid de kamerdia voor op visualisatie via confocale microscopie volgens een van de twee onderstaande opties.
- Voeg 400 μL 1x PBS en 50 μL DAPI per put toe. De monsters kunnen worden onderzocht via de bodem van de put zonder de noodzaak van montage met een coverslip (Figuur 7B).
- Voeg 100 μL per put antifade reagens met DAPI toe en laat de slide drogende O/N bij RT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vorming en karakterisering van cysten
3D-celkweeksystemen zijn een belangrijk instrument om organogenese en ziektemodellering te bestuderen25. Helaas zijn de meeste van deze methoden kwalitatieve of gebruik interne kwantificering uitgevoerd op een enkel vlak door het vergelijken van het aantal cysten versus niet-cysten, in variabele en vaak niet-gespecificeerde volumes, het voorkomen van een vergelijking in termen van cyste vorming efficiëntie tussen de verschillende studies7,8,9,10,15,18,23. De in dit protocol voorgestelde methode, door het gehele aantal cysten en hun respectieve grootte gedurende de tijd van het experiment vast te leggen, maakt de analyse van de evolutie van cystevorming en -groei mogelijk(figuur 4).
Op basis van fasecontrastbeelden worden op dag 0, 8 uur na celzaaien meestal kleine celaggregaten gevonden die in de hydrogel zijn ingebed. Op dag 1 zijn kleine cysten met een mediane diameter van 42,95 (26,53, 50,47) (eerste, derde kwartiel) μm en fusie van cysten verspreid over de hydrogel merkbaar. Op dag 4 is het gebruikelijk om geaggregeerde structuren en cysten met een mediane diameter van 75 (56,48, 97,97) μm in acht te nemen. In dag 7 en 10 bereikte de mediane cystediameter respectievelijk 108,67 (75,31, 141,76) μm en 186,46 (113,98, 278,29) μm (figuur 4A-C). Interessant is dat de efficiëntie van de cystevorming toeneemt van 70,03 ± 5,05 cysten/1000 cellen op dag 1 tot 99,83 ± 12.81 cyste cellen op dag 4 blijven constant tot dag 10 (Figuur 4B), wat suggereert dat cysten zich hoofdzakelijk vormen uit celaggregaten die aanwezig zijn op het moment van de inbedding of die vorm tijdens de volgende 48u; celmigratie of de fusie van kleine celaggregaten. Met betrekking tot de evolutie van de cystegrootte, terwijl de gemiddelde grootte een langzame en regelmatige helling volgt, neemt de grootteverdeling sterk toe langs de cultuurtijd, wat illustreert dat de verschillende cysten niet met dezelfde snelheid groeien. Interessant is dat dit kan worden gekoppeld aan onze observatie (niet aangetoond) dat cysten niet gelijkmatig worden verdeeld in de hydrogel, de grootste cysten die in het midden van het hydrogelvolume liggen. Aangezien de toename van de cystediameter voornamelijk afhankelijk is van de afscheidingsactiviteit (aangezien het celdelingspercentage beperkt is in door NRC afgeleide cysten), kan worden afgeleid dat deze activiteit sterk afhankelijk is van de hydrogel-eigenschappen die niet homogeen zijn in het celcultuurvolume.
Vervolgens bevestigden we de levensvatbaarheid van cellen na het inbedden van hen in de hydrogel (dag 0) en cysten op dag 10 met behulp van FDA / PI live kleuring(Figuur 5A). FDA is een niet-fluorescerend molecuul dat alleen levende cellen, door middel van een enzymatische reactie, in staat zijn om te zetten in de groene tl-verbinding fluoresceïne26. PI is een niet-permeant molecuul voor levende cellen die intercaleert in het DNA van necrotische cellen27. Interessant is dat dode cellen die minder dan 3% van de hele cellen in het kweekvolume vertegenwoordigen op dag 10, meestal buiten de cysten worden gevonden, als geïsoleerde cellen of een deel van kleine aggregaten. We merkten echter dat puin van necrotische cellen zich ophoopt in sommige grote cysten op dag 10(figuur 5B). Daarom wordt voor het behoud van cystische culturen het doorgeven van cysten aanbevolen vóór 10 dagen in die omstandigheden.
Functionele beoordeling
In fysiologische omstandigheden is de belangrijkste functie van cholangiocyten het wijzigen van kanaalgalen via absorptieve en secretoire mechanismen waarvan het MDR-kanaal een belangrijke speler is28. Om de functionaliteit van cysten te beoordelen, hebben we dag 10 cysten geïncubeerd met FDA/Hoechst en waargenomen vorming van fluoresceïne en de afscheiding ervan van de basale in de apicale luminale ruimte(figuur 6A,B). Dus, bevestigen dat NRC's in cysten behouden hun secretoire functies. Bovendien werd de afscheiding van fluoresceïne geremd door voorbehandeling van cysten met de MDR-remmer Verapamil (Figuur 6C),waaruit bleek dat de accumulatie van fluorescentie FDA in het lumen te wijten was aan de afscheiding via MDR-transporter en niet door lekken uit de intercellulaire ruimte.
Beoordeling van cystepolariteit
Om polarisatie van de NRC-cysten tot stand te brengen, hebben we een reeks optimalisatiestappen uitgevoerd in het immunofluorescentieprotocol. Een belangrijke belemmering bij het onderzoek van epitheliale celpolariteit bij de cysten is de frequente ineenstorting van de organoïde architectuur tijdens het immunofluorescentieproces, als gevolg van het lekken van de vloeistof in het lumen. Om dit probleem te omzeilen, is elke stap van het immunofluorescentieprotocol geëvalueerd door te testen hoe verschillende omstandigheden het onderhoud van de cystestructuur kunnen beïnvloeden. We ontdekten dat het moduleren van de fixatie (formaldehyde (2-4%) + sacharose (5-10%)) of permeabilisatieomstandigheden (0,1-1% van zowel Triton X-100 als sacharose) niet veel invloed had op de cyste-architectuur. Deze bereiken kunnen worden gebruikt om de cholangiocyten sterk vast te stellen en zachtjes te doordrenken(figuur 7A). We merkten echter op dat het houden van BSA op 0,1% of minder tijdens verzadiging een belangrijke stap is in het handhaven van cyste-integriteit, omdat hogere concentraties resulteren in cyste-intrekking en lumeninstorting(figuur 7A).
Cholangiocyte functies zijn afhankelijk van hun juiste apico-basolaterale polariteit29. Om te controleren of de NRC-cysten zelf in hydrogel verzamelen als gepolariseerde structuren, hebben we de apicale en basolaterale lokalisatie van respectievelijk F-actine en E-cadherin bevestigd. E-cadherine expressie in onze cysten geeft ook aan dat NRC's hun epitheel fenotype in hydrogel(figuur 7B)gedurende ten minste 10 dagen behouden.
Figuur 1: Experimentele workflow van cystevorming en karakterisering. (A) Hydrogel coating van de kamer schuif. (B) Celinbedding in de hydrogel. (C) Microscopie van cystevorming. (D) Een 10-daagse follow-up beoordeling van cyste groei, levensvatbaarheid, functionaliteit, en polarisatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Beeldacquisitiemethode. (A) Workflow van de Z-stack acquisitie uitgevoerd langs de hydrogel diepte van dag 1 tot 10: Z-stack acquisitie (1) beeldverwerking van de Z-stack (2) generatie van een minimale intensiteit projectie en cyste kwantificering (3). (B) Screenshots van beeldacquisitiesoftware met de selectie van de doelstelling (1), de aanpassing van parameters (2), het automatisch opslaan van afbeeldingen (3) en de Z-stack kalibratie (4). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Methode voor de kwantificering van cystegrootte en cystevormingsefficiëntie. (A) Beeldverwerking lay-out beeltenis: Z-stacks te analyseren (1), de minimale intensiteit Z-projectie (2), de uiteindelijke Z-projectie na achtergrond aftrekken (3) gebruikt voor cyste tellen en cyste grootte schatting. (B) Cyste-identificatie op de projectie (A3) met een zoom van de projectie (4) om de identificatie van cysten gekenmerkt door een donkere cel shell omsluiten van een helderder lumen, die zich onderscheiden door blauwe lijnen uitgezet voor diameter meting vs aggregaten met een donkere en onregelmatige verschijning gericht door rode pijlen. (C) De formule voor de berekening van cystevorming efficiëntie voor 1.000 cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Cystevorming efficiëntie en cyste grootte distributie in de hydrogel. (A) Time-lapse met representatieve fasecontrastbeelden op de dagen 0, 1, 2, 4, 7 en 10 van de 3D-culturen. (B) Plotgrafiek met de kinetiek van gemiddelde cystevormingsefficiëntie ± SEM (n=3). (C) Doos en snorharen plot met de cyste grootte verdeling over de tijd van de cultuur. Zwarte balken vertegenwoordigen het eerste kwartiel, de mediaan en het derde kwartiel; lijnen vertegenwoordigen de breedte van de verdeling; zwarte stippen vertegenwoordigen het minimum en het maximum van de verdeling, n=3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Levensvatbaarheid van NRC-cysten in de hydrogel. (A) Representatieve fluorescerende live beelden van culturen op dag 0 en op dag 10, bevlekt met FDA (green=live) en PI (red=dead). Merk op dat de rode fluorescentie werd voornamelijk geassocieerd met enkele cellen. (B) Representatief fluorescerend levend beeld van een necrotische cyste op dag 10, waar de dode cellen (in rood) werden gezien accumuleren in het lumen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Functionaliteit van NRC cysten in de hydrogel. (A) Representatieve fluorescerende live beelden van een 10-daagse cyste waar de cel laag werd onthuld door kernen etikettering met Hoechst (blauw) en het lumen door de afgescheiden FDA (groen). (B) Representatieve fase contrast / fluorescerende live beelden na een afscheidingstest met de FDA, die werd getoond verzameld in het lumen. (C) Na de expositie naar Verapamil, een MDR-remmer, representatieve fase contrast / fluorescerende live beelden van cysten waaruit blijkt dat de FDA werd bewaard in de laag van de cel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Immunofluorescentie van NRC-cysten in de hydrogel. (A) Optimalisatie van het immunofluorescentieprotocol met heldere veldbeelden die representatieve cystevormen tonen bij elke stap van het protocol. Van links naar rechts: (Levende cyste) een levende cyste in volledig medium voor fixatie, (Fixatie) een cyste na fixatie, (Permeabilisatie) een andere cyste na permeabilisatie, (Verzadiging) een cyste na de verzadiging stap en (Labeling) een cyste op de immunolabeling stap. (B) (1-2): Confocale beelden van een sectie door een cyste met de apicale oppervlaktemarkering F-actin (rood-oranje), de basolaterale marker E-cadherin (groen) en de kernen bevlekt met DAPI (blauw). (3): 3D reconstitutie van een set cysten met de volgende etiketteringen: rood-oranje voor F-actine en groen voor E-cadherine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Opening van een stapel. Screenshot vangt van de software die de procedure afbeeldt om een Z-stack te openen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 2: Stapelduplicatie. Schermafbeelding van de software met het proces om een Z-stack te dupliceren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3: Generatie van een minimale intensiteitsprojectie. Screenshot vangt van de software ter illustratie van de procedure om een minimale intensiteit projectie van de gedupliceerde Z-stack te creëren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 4: Achtergrondverwijdering. Screenshot vangt van de software portretteren van de methode om de achtergrond te verwijderen uit de Z-stack projectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 5: Contrastverbetering. Screenshot vangt van de software waarin de stappen om het contrast van de Z-stack projectie te verbeteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 6: Beeldkalibratie. Screenshot vangt van de software afbakenen van het proces om de Z-stack en de Z-stack projectie kalibreren in micron. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 7: Cyste tellen. Screenshot vangt van de software die de procedure afbeeldt om cysten op de Z-stack projectie te tellen met het rechte lijngereedschap. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 8: Cyste telcontrole. Screenshot vangt van de software waarin de methode om het aantal cysten geteld op de Z-stack projectie en de Z-stack te vergelijken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 9: ROI besparing. Screenshot vangt van de software laten zien hoe de ROI-set gedefinieerd door de tellingen op te slaan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 10: Cystegrootte en getalmetingen. Screenshot vangt van de software detaillering hoe te meten en te besparen cyste grootte en cyste nummer van de Z-stack projectie en de Z-stack. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om organogenese en het onderhoud van 3D cellulaire structuren te bestuderen, zijn verschillende weefsels gemodelleerd, met behulp van verschillende cellulaire oorsprong, maar ook verschillende soorten extracellulaire matrices, waaronder synthetische hydrogels8,9,10,21. Echter, als gevolg van gebrek aan 3D kwantitatieve analyse die het mogelijk maakt voor vergelijkingen tussen methoden in termen van organoïden vorming of functionaliteit7,8,9,10,15,18, verdere standaardisatie voor hydrogel of drug screening blijft buiten bereik.
Om deze tekortkomingen aan te pakken, stellen we een hydrogel-gebaseerd, reproduceerbaar en gestandaardiseerd protocol voor om epitheliale cel-afgeleide cysten te genereren. Hier illustreerden we het met de vorming van galcysten in een basale lamina afgeleide hydrogel, uit een verwijzing naar cholangiocytecellijn. Om de beperking van 3D-kwantificering te ontgrendelen, wordt cystevormingsefficiëntie berekend ten opzichte van het totale aantal cellen dat in de hydrogel wordt gezaaid en cystegroeikinetiek wordt gemeten over een constant hydrogelvolume.
We bieden een reeks systematische stappen om cysten te genereren en te karakteriseren, om relevante cyste-kwantitatieve analyse mogelijk te maken. Daartoe zijn speciale inspanningen geleverd om een uniforme verdeling van celaggregaten te genereren op het moment dat hydrogel de heterogeniteit van de structuur van de hydrogel omzeilt, wat van invloed is op de vorming van cysten door de voorwaarden vast te stellen om een representatief monster voor cystetelling te hebben.
Experimentele reproduceerbaarheid wordt aangepakt door middel van kritieke stappen, zoals het filteren van celsuspensies om de grootte van de celaggregaat en de pre-coating van de kamerdia's voorafgaand aan de toevoeging van celhydrogel te beperken om 2D-laagvorming te voorkomen wanneer cellen het oppervlak van het kweekvat bereiken. Consistente kwantificering wordt opgelost met het maken van foto's langs de Z-as van de hydrogel met een constante set parameters in verschillende monsters en experimenten.
Cystevorming efficiëntie en cyste groei kinetiek worden geschat op basis van het totale aantal cellen gezaaid in de hydrogel. Daarom wordt een aanpasbaar algoritme voor beeldverwerking voorgesteld om afbeeldingen te segmenteren voor cysttel- en cystegroottemetingen. De nieuwigheid van de voorgestelde methode is dat het tellen en metingen worden gedaan op Z-stack projecties. Na het verwijderen van de specifieke achtergrond, het aantal beelden te analyseren is beperkt, waardoor voor een aanzienlijke winst van de tijd en het beperken van de verzadiging van de harde schijf. Immunofluorescentie is een belangrijk instrument om 3D-culturen te analyseren op structureel niveau, met name polarisatie, sleutel in de juiste epitheliale celfunctie4. Zo hebben we de taak op ons genomen om de fixatie, permeabilisatie en het blokkeren van stappen van het immunofluorescentiegedeelte van ons protocol zorgvuldig te optimaliseren; het oplossen van BSA-concentratie om te voorkomen dat cyste intrekking en verdere lumen instorten.
Al met al opent de voorgestelde methode de weg naar het genereren van een eenvoudig, reproduceerbaar en kostbaar effectief protocol, 3D cellulaire culturen en het onderzoeken van kwalitatieve en kwantitatieve parameters. Bovendien maakt deze methode vergelijkingen mogelijk tussen verschillende soorten matrices: met behulp van dezelfde methode met poly(ethyleenglycol) (PEG)-afgeleide hydrogels kunnen we aantonen dat lumenvorming en -groei kritisch afhankelijk zijn van de hydrogelstijfheid en kleefkracht, respectievelijk21. Dit protocol is ook van toepassing voor het vergelijken van vorming en functie van sferoïden afkomstig van verschillende cellen, die kunnen deelnemen aan de standaardisatie van weefselspecifieke epitheelsferoïde modellen. Echter, een beperking is dat de optimalisatie van de cultuur voorwaarden zoals cultuur media, initiële cel zaaien, en de tijd die nodig is voor cyste vorming nodig zou kunnen zijn voor andere celtypes. In het galkanaalveld kan dit werk bijdragen aan het beantwoorden van vragen over galkanaalorganogenese, evenals moleculaire paden van ziekten en medicijntests. Dit protocol zal ook zijn limiet vinden wanneer het wordt toegepast op een hoge doorvoeranalyse, omdat sommige stappen zoals cyst counting en imaging processing nog niet geautomatiseerd zijn, hoewel we macro's voorstellen voor het semi-automatiseren van het beeldvormingsproces dat verder kan worden ontwikkeld voor automatisering. De beperking tot automatische verwerking in dit geval is de afbeelding achtergrond. Dit is te wijten aan heterogene structuur van natuurlijke complexe hydrogels zoals kelder membraan type gels, maar wij geloven dat automatisering kan worden toegepast op transparante gels zoals PEG-afgeleide hydrogels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Verenigde Staten), die vriendelijk de NRC-cellijn verzorgde.
Dit werk kreeg de financiële steun van zowel het iLite RHU-programma (subsidie ANR-16-RHUS-0005) als de DHU Hepatinov.
Wij danken Isabelle Garcin en Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay voor hun steun op het beeldvorming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
References
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
- Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
- Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
- Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
- Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
- Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
- Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
- Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
- Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
- De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
- Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
- Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
- Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
- Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
- Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
- Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
- Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
- Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
- Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F.
- Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).
