Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generation og kvantitativ karakterisering af funktionelle og polariserede galde epitelcyster

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61404
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL
* These authors contributed equally

Summary

Tredimensionale (3D) cellulære systemer er relevante modeller til undersøgelse af organogenese. En hydrogel-baseret metode til galdecyster produktion og deres karakterisering er foreslået. Denne protokol optrævler barriererne i 3D karakterisering, med en enkel og pålidelig metode til at vurdere cyste dannelse effektivitet, størrelser, og at teste deres funktionalitet.

Abstract

Cholangiocytter, epitelceller, line up galdegangene i leveren, føre tilsyn med galdedannelse og modifikation. I de sidste tyve år, i forbindelse med leversygdomme, 3-dimensionelle (3D) modeller baseret på cholangiocytter er opstået såsom cyster, sfæroider, eller rør-lignende strukturer til at efterligne væv topologi for organogenese, sygdom modellering, og lægemiddelscreening undersøgelser. Disse strukturer er hovedsageligt opnået ved indlejring af cholangiocytter i en hydrogel. Hovedformålet var at studere selvorganisation ved at tage fat på epitelpolalitet, funktionelle og morfologiske egenskaber. Men meget få undersøgelser fokuserer på cyste dannelse effektivitet. Når dette er tilfældet, kvantificeres effektiviteten ofte ud fra billeder af et enkelt plan. Funktionelle analyser og strukturel analyse udføres uden at repræsentere den potentielle heterogenitet af cyste fordeling som følge af hydrogel polymerisering heterogeniteter og bivirkninger. Den kvantitative analyse kan derfor ikke anvendes til sammenligning fra en artikel til en anden, når den er udført. Desuden gør denne metode det ikke muligt at sammenligne 3D-vækstpotentialet for forskellige matricer og celletyper. Derudover er der ingen omtale af den eksperimentelle fejlfinding for immunstaining cyster. I denne artikel giver vi en pålidelig og universel metode til at vise, at den oprindelige cellefordeling er relateret til den heterogene vertikale fordeling af cystedannelse. Cholangiocyte celler indlejret i hydrogel følges med Z-stakke analyse langs hydrogel dybde i løbet af 10 dage. Med denne metode opnås en robust kinetik af cyste dannelse effektivitet og vækst. Vi præsenterer også metoder til at evaluere cyste polaritet og sekretoriske funktion. Endelig, yderligere tips til optimering immunstaining protokoller leveres for at begrænse cyste sammenbrud for billeddannelse. Denne tilgang kan anvendes på andre 3D-cellekulturundersøgelser, hvilket åbner mulighed for at sammenligne et system med et andet.

Introduction

I de sidste tre årtier har in vitro-forskningsområdet udviklet sig i retning af 3D-kultursystemer. Der er opstået en række protokoller for dyrkningsceller i 3D som sfæroider eller aggregater i tilstedeværelse eller fravær af et stillads/matrix, i et fald, i agitation, i mikrofluidiske anordninger eller flydende1. Brugen af 3D-kultur metoder har vist sine fordele i forhold til 2-dimensionelle (2D) kulturer, især for epitelceller, som blev vist sig at selv-organisere i 3D-strukturer, kaldet cyster eller acini. I dette tilfælde danner cellerne et monolag, der omkranser en lumen, hvor cellerne får deres fulde epitelfenotype med forbedrede fysiologiske specifikke funktioner2.

Talrige undersøgelser har bidraget til udviklingen af metoder til at danne disse epitelorganoider i naturlige matricer. Dette har gjort det muligt at opsummere in vivo celle-celle og celle-mikromiljø interaktioner, for at få etablering og stabiliteten af epitel fænotype3,4,5,6,7. For nylig, og især med det formål at udvikle transplanterbare organoider og dechifrere kravet om mikromiljø for orkestrering af epitelprogrammet, syntetiske hydrogels er blevet udviklet for at forbedre dannelsen af epitel acini8,9,10. Desværre, disse undersøgelser rapport om kvalitative data, eller nuværende beregningsmetoder ved hjælp af interne referencer såsom forholdet mellem cyster over ikke-cyster i et 2D-plan8,9,10. Dette udelukker enhver sammenligning mellem forskellige undersøgelser med hensyn til effektivitet, stabilitet, eller morfologiske og fysiologiske karakterisering af epitelorganoider.

Mikroindkapsling af epitelceller i perler ved hjælp af mikrofluidiske enheder har givet mulighed for mere realistiske kvantitative og komparative resultater. Ved hjælp af denne teknologi blev der dannet organoider fra forskellige celletyper, som var baseret på morfologien mellem forskellige 3D-cellestrukturer11,12. Men denne teknologi er ikke let at arbejde med og kræver brug af rene rum til at producere de mikrofluidiske enheder. Denne teknologi er blevet etableret for nogle få typer af hydrogels, men kræver teknisk tilpasning, der skal anvendes på andre hydrogels, begrænse dens alsidighed. Derfor er de fleste undersøgelser, der har til formål at udvikle epitelorganoider, afhængige af indlejring af epitelceller i en hydrogel bulk. I disse metoder overses den høje heterogenitet af gelstrukturering og cellefordeling inde i hele 3D-kulturen ofte. Derfor vedrører de fleste af analyserne enkelte 2D-billeder, som kun i meget høj tid repræsenterer fordelingen af de forskellige cellulære objekter i hele 3D-volumen.

Sygdomme, der påvirker galdegangene, såsom cholangiocarcinoma, galdeatresi, primær skleroserende cholangitis, blandt andre, er en væsentlig årsag til dødelighed og sygelighed. Bortset fra levertransplantation, der er ingen effektive behandlinger for disse betingelser13. Bestræbelser på at undersøge galdegang dannelse, sygdom årsager, og progression vil gøre det muligt at udvikle nye behandlingsformer14.

Biliær organotypiske modeller af cyster, sfæroider eller rørlignende strukturer ved hjælp af normale eller patientbaserede, differentierede eller progenitor-afledte cholangiocytcellelinjer er blevetudviklet 15,16,17,18,19,20. Forskellige undersøgelser har opsummeret cholangiocyt polaritet, udtryk for cholangiocyt markører, tilstedeværelse af cilier, cholangiocyt sekretorisk og reabsorptive evne, og lumen dannelse og obstruktion; som alle repræsenterer vigtige egenskaber ved cholangiocyt fænotype, morfologi, og funktion15,17,19. Andre har rapporteret om vedligeholdelse af patientbaserede galdeorganoider i lange perioder20. For nylig undersøgte vi den rolle, biokemiske og biofysiske signaler om galdecyster organogenese21. Det er vigtigt, at patogenesen af galdeatresi blev undersøgt i galde sfæroider og rør7,22. Endvidere, centrale elementer i primær skleroserende cholangitis såsom cholangiocyte senescence, sekretion af pro-inflammatoriske cytokiner, samt makrofag rekruttering blev med succes undersøgt ved hjælp af galde spheroids15,20. Men, reproducerbare in vitro 3D kvantitative modeller, der fysiologisk modulerer cholangiocyt fænotype, fysiologi, og mikromiljø, hvor disse spørgsmål kan løses, er stadig nødvendig. Desuden har kun få publikationer rapporteret cyste dannelse effektivitet21,23. Dette er et vigtigt punkt at etablere, især ved undersøgelse af organogenese, sygdom årsag, og korrelation af lægemiddelreaktioner med cholangiocyt funktion og polarisering. Desuden er det vanskeligt at sammenligne systemer med forskelle i stillads/matrix, der anvendes fra protokol til protokol. For at løse disse problemer foreslår vi en kvantitativ, pålidelig og universel metode til at generere galdecyster, der efterligner lumendannelse, kolangiocytpolarisering og cholangiocyt sekretorisk funktion. Vigtigere er det, at vi præsenterer en systematisk analyse udført langs Z-aksen på tværs af 3D-gelen ved vurdering over tid, cyste dannelse effektivitet, størrelse, levedygtighed, polarisering og funktionalitet. Desuden brugte vi en naturlig hydrogel og normale rotte cholangiocytter (NRC) s, som et eksempel for protokollen, men andre naturlige eller syntetiske hydrogels, samt epitelceller kunne anvendes til dannelsen af 3D cystisk strukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering af cyster

BEMÆRK: Denne protokol kan udføres med enhver form for hydrogel, hvis geleringen tillader indlejring af celler.

  1. Hydrogel belægning
    BEMÆRK: Korrekt hydrogel belægning af kammeret dias er et kritisk skridt for at undgå dannelsen af 2D-celle lag i bunden af brønden, der kan forstyrre efterfølgende cyste billeddannelse og forringe beregningen af cyste dannelse effektivitet.
    1. For at sikre, at gelopløsningen er homogen, skal hydrogelen tøs ved 4 °C natten over (O/N).
    2. Precool pipettespidser på is eller O/N ved -20 °C og en 8-brønd kammerslid ved -20 °C O/N.
    3. Placer hydrogel og 8-brønd kammer dias på en isspand fyldt med is.
    4. I et konisk rør på 15 ml konisk rør skal der forebrøs en opløsning, der indeholder 40% hydrogel (V/V) i koldt NRC komplet medium (se materialetabel),og røret anbringes på is.
    5. At belægge et kammer dias, ved hjælp af kolde pipette spidser, tilsæt 50 μL hydrogel løsning på midten af hver brønd, og spredt over hele overfladen ved hjælp af en pipette spids, mens du holder kammeret dias på is(Figur 1A).
      BEMÆRK: Spred hydrogelopløsningen så jævnt som muligt og undgår bobler.
    6. Hydrogelen polymeriseres ved kammerets rutsjebane i mindst 15 min. ved 37 °C, 5 % CO2.
  2. Forberedelse af celler
    1. Varm op NRC komplet medium, fosfat bufferet saltvand (PBS), og trypsin-ethylenediamin tetraetosesyre (trypsin-EDTA) i et vandbad forvarmet til 37 °C.
    2. Mens hydrogel polymeriserer, skal du sikre dig, at NRC'er dyrkes til 70% sammenløb i en T-25 cm2 kollagenbelagt kolbe21. Vask cellerne én gang med forvarmet 1x PBS.
    3. De nationale referencer skal kues med 5 ml forvarmet 1x PBS (for en T-25 cm2 kolbe) i 20 min. ved 37 °C, 5 % CO2.
      BEMÆRK: Dette trin, som forkorter inkubationstiden med trypsin-EDTA, er medvirkende til at bevare cellernes selvorganiserende egenskaber.
    4. Kassér PBS, tilsæt 1 ml trypsin-EDTA, og inkuber i 5-10 min ved 37 °C, 5% CO2.
    5. Neutralisere med 4 ml forvarmet komplet NRC medium. Opsaml og overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør, og drej ved 150 x g i 4 min.
    6. Kassér mediet og opslæm cellepellet i 5 ml forvarmet medium.
    7. Ved hjælp af en 40 μm celle si, filtrere celleopløsningen i en 50 ml konisk rør og tælle cellerne.
      BEMÆRK: At overføre cellerne gennem en si er et afgørende skridt for de kvantitative resultater, der skal reproduceres, dvs.
  3. Indlejring af celleaffjedring i hydrogelopløsning
    1. Der klargørs en opløsning på 1.600 μL 80 % hydrogel (V/V) i koldt komplet NRC-medium (rør 1) opbevares i is. 5 x 105 celler/ml fortyndes i 1.600 μL koldt komplet NRC-medium (rør 2) og opbevares i is.
      BEMÆRK: Dette trin skal udføres hurtigt for at undgå polymerisering af hydrogel, mens du blander den med celleaffjedringen og for at bevare cellernes levedygtighed.
    2. Til fremstilling af en cellesåningsopløsning på 2,5 x 105 celler/ml i 40% hydrogel (V/V) blandes rør 1 og rør 2. Der tilsættes 400 μL af celleopløsningen i hver brønd på det hydrogelbelagte kammerslid, så boblerne undgås (Figur 1B).
    3. Hold kammerets rutsjebane i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2, indtil mediet skifter.
    4. Efter 2 dage i kultur, fjerne 250 μL af mediet fra et hjørne af hver brønd, skal du passe på ikke pipette ud hydrogel. Derefter tilsættes langsomt 250 μL af kulturmediet. Skift mediet hver 2.
      BEMÆRK: Minimer kammerets bevægelse, især under cyststarten.

2. Cyste kvantificering

  1. Cyste billeddannelse
    BEMÆRK: Dette afsnit skal udføres hurtigt for ikke at kompromittere cellens levedygtighed, hvis mikroskopet ikke er udstyret med et varmekammer til at styre CO2 og temperatur. For at sikre en konsekvent kvantificering, der er repræsentativ for cystfordelingen i det fulde hydrogelvolumen, afbildes cyster via fasekontrastmikroskopi og seriel billedbehandling (Z-stakke) med foruddefinerede parametre på forskellige tidspunkter.
    1. Tag en Z-stack langs dybden af hydrogel for hvert tidspunkt punkt(Figur 1C, D). I dette eksempel tages Z-stakke på dag 1, 2, 4, 7 og 10.
      BEMÆRK: Kontroller, at den oprindelige cellefordeling er ensartet i hydrogelen for at sikre, at denne metode anvendes.
      1. Med et fasekontrastmikroskop, der er udstyret med en billedopkøbssoftware, skal du vælge den 10x objektive forstørrelse i det manuelle vindue til næsestykker (Figur 2B(1)).
      2. Tænd for den hvide lampe, og vælg indstillingen brightfield-billedbehandling.
      3. Tænd for kameraet ved at vælge knappen "Afspil" i undermenuen Bar. Fokuser på et felt af cyster og indstille eksponeringstiden (figur 2B(2)). Åbn vinduet Automatisk hentningsmappe for at få en automatisk lagring af billeder(Figur 2B(3)).
      4. Åbn vinduet i opsamlings-Z-serien, og definer med Z-skruen de øverste og nederste planer i Z-stacken (samme XY-koordinater, men forskellige Z-screenede). Juster Z-trinnet afhængigt af målsætningen, opløsningsniveauet, og tryk på knappen "Kør nu" for at starte anskaffelsen (Figur 2B(4)).
        BEMÆRK: I dette eksempel spredes cyster over en hydrogeltykkelse på 520 μm. 26 billeder anskaffes langs hydrogeldybden med et 20 μm Z-trins interval. Afhængigt af målet bør Z-trinnet justeres, så det ikke går glip af cyste, og for at sikre påvisning af enkelte celler og aggregater.
      5. Tag mindst 3 ikke-overlappende Z-stakke pr brønd.
        BEMÆRK: Denne prøveudtagning er nødvendig, når cyster som i dette eksempel er mere talrige i dybden af gelen end på kanterne på grund af heterogeniteter i hydrogel polymerisering.
      6. For at få et repræsentativt datasæt gentages trin 2.1.1.5. for 3 brønde i alt.
        BEMÆRK: Den heterogene fordeling af cyster afhænger af typen af hydrogel, dens polymerisering og cellelinjen. I betragtning af tre Z-stakke pr brønd og tre brønde pr eksperiment, er mindst 200 cyster afbildet over ni Z-stakke til at karakterisere cyste dannelse og cyste vækst på hvert tidspunkt.
  2. Billedbehandling
    BEMÆRK: I en hydrogel kan NRC'er findes som enkelte celler, cyster eller aggregater. Cyster er identificeret ved tilstedeværelsen af en rund og tynd kontrast celle shell omslutter en lumen, mens celle aggregater præsentere en uregelmæssig form og ikke har en lumen. Aggregater og enkelte celler har et tæt og kontrasterende udseende (Figur 3B(4)).
    1. Åbn Fiji-softwaren, åbn Z-stakken, og gå til menuen Fiji, og klik på Filer | Åbn (supplerende figur 1). Vælg den Z-stak, der skal analyseres. Hvis det er nødvendigt, skal du vælge indstillingen "Virtuelstak " og klikke på "Ja" for at åbne (Figur 3A(1)).
    2. Duplikere stakken via billede | Duplikeret. Klik på feltet "Dubletstak" og klik på "OK" (supplerende figur 2).
      BEMÆRK: I dette eksempel er Z-stacks i .nd2-filformat kodet i 16 bit.
    3. Opret en minimumintensitetsprojektion ud fra den dublerede stak. Gå til menuen Billede | Stakke | Z-projekt. Vælg Projektionstype "Min Intensity" og klik på "OK" (Figur 3A(2)) (supplerende figur 3).
    4. Træk baggrunden fra projektionen. Gå til menuen Proces | Træk baggrund . Skriv 500,0 pixel radius af rullende kugle, og klik på "lysbaggrund" for at gøre cyster mere kontrasterende end baggrunden (Figur 3A(3)) (supplerende figur 4).
      BEMÆRK: Den rullende kugleradius definerer størrelsen af det område, som baggrundsindtraktionen drives på. Denne parameter skal angives til størrelsen på det største objekt, der skal identificeres.
    5. Hvis der er behov for kontrastforbedring, skal du gå til menuen Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast | Auto | Anvend. Fiji optimerer automatisk lysstyrke og kontrast. I (Figur 3A(3)blev de nederste og øvre grå værdier sat til henholdsvis 49702 og 65452 (supplerende figur 5).
      BEMÆRK: Hvis projektionen ikke er kalibreret, skal du gå til menuen Analysér | Sæt skalaen, og skriv det tilsvarende kalibreringsforhold μm/pixel( supplerende figur 6).
  3. Cyste tælling og cyste størrelse målinger
    1. For at måle den omtrentlige cystediameter skal du vælge værktøjet Lige linje i Fiji-menuen og tegne en linje hen over diameteren af hver cyste på den endelige projektion (figur 3B(4)). Tilføj det nye interesseområde (ROI), der er oprettet for hver cyste, til roi-chefen: Tryk på genvejen "t" på tastaturet for hurtigere at tælle og åbne roi-chefen. Klik på" Vis alle" for at se de optalte cyster (supplerende figur 7)
    2. Kontroller, at der ikke er tilbage med cyste uden at tælle ved at overlejre de indstillede ROI'er fra projektionen på Z-stakken. Det gør du ved at klikke på vinduet Z-stack for at markere det. Klik på "Visalle " i ROI Manager, og flyt markøren langs Z-stakken for at kontrollere billedet pr. billede, alle cyster er talt (supplerende figur 8).
    3. Når nye cyster er talt op, og ROI'er er tilføjet på trin 2.3.1. skal du vælge ROI-sættet og gemme det via vinduet ROI Manager ved at klikke på Mere | Spar (supplerende figur 9).
    4. Vælg alle ROI'er i roi manager, og klik på "Mål" i ROI Manager for at få størrelsen på hver cyste. Dette vil åbne et nyt vindue af målinger med navnet " Resultater "nummereringhver cyste og dens anslåede størrelse. Gem derefter i .csv format ved at klikke på vinduet "Resultater" og via menuen: File | Gem som (supplerende figur 10).
      BEMÆRK: En makro kan oprettes til halvautomatiske processtakke, estimere antallet/størrelserne for cyster fra fremskrivningerne og gemme dataene til hurtigere optællingsprocedure. Det kan du gøre ved at vælge værktøjet "Optag" i søjlemenuen ved at klikke på Plugins | Makroer | Optag.
  4. Kvantificering af cystedannelseseffektivitet
    1. Tæl antallet af cyster på dag Y på Equation 1 en projektion (Y=1, 2, 4, 7 eller 10).
    2. For at beregne cystedannelseseffektiviteten for 1000 celler på dag Y divideres antallet af cyster, der tælles på det pågældende tidspunkt, med antallet af celler, der er seedet på dag 0 udledt af hydrogelvolumenet, og multipliceres med 1000 (Figur 3C, Figur 4).
      Equation 2

3. Cellernes levedygtighed

  1. Forbered en lageropløsning af fluoresceindiacet (FDA) ved 5 mg/ml ved opløsning af 5 mg FDA i 1 ml acetone og opbevares ved -20 °C.
  2. Der klargøres en lageropløsning af propidiumidodid (PI) i en koncentration på 2 mg/ml i deioniseret vand (dH2O) og opbevares ved 4 °C.
  3. Forbered NRC medium uden føtal kalv serum (FCS).
  4. Til fremstilling af FDA/PI-farvningsopløsningen tilsættes 4 μL FDA-lageropløsning (8 μg/ml endelig koncentration) og 25 μL PI-lageropløsning (20 μg/ml endelig koncentration) i 2,5 ml NRC-medium uden FCS.
  5. Fjern mediet fra kammerslide, tilsæt 250 μL farvningsopløsning i hver brønd og inkuber 4-5 min i mørke ved 37 °C, 5% CO2. Pipette farvningsopløsningen omhyggeligt ud og vask én gang med 250 μL 1x PBS.
  6. Tilsæt forsigtigt 250 μL komplet NRC-medium til hver brønd og tag billeder ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop med Texas rød og fluorescein isothiocyanate (FITC) filtre. Levende celler vil være grønne og døde celler vil være rød (Figur 5A).
    BEMÆRK: For at kvantificere levende/døde celler skal du tage Z-stakke over hydrogelvolumenet efter trin 2 og tilpasse billedbehandlingsmetoden for fluorescens.

4. Sekretion aktivitet

BEMÆRK: Sekretionen aktivitet gennem den apikale membran af cholangiocytter vurderes ved udskillelsen af fluorescein i lumen. Dens specificitet kan evalueres ved at gøre den samme test med Verapamil, en multi-resistent (MDR) transporter hæmmer24.

  1. For at klargøre en farvningsopløsning af Hoechst 33258 ved 5 μg/mL tilsættes 0,83 μL Hoechst-lageropløsning (15 mg/ml lagerkoncentration i dH2O) i 2,5 ml NRC-medium uden FCS.
  2. Der tilsættes 250 μL Hoechst-opløsning i hver brønd og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 15 min.
  3. Fjern Hoechst-opløsningen, og tilsæt 250 μL FDA-opløsning (8 μg/ml endelig koncentration) i hver brønd. Inkuber 4-5 min ved 37 °C, 5% CO2.
    BEMÆRK: Så snart celler er udsat for FDA farvning løsning, opfølgning af fluorescein sekretion kinetik kan være nyttigt at kalibrere den tid, der er nødvendig for cyster at udskille. For at gøre dette, tage billeder hver min i 1 time-lapse billeddannelse. I dette eksempel er den tid, der er nødvendig for at observere NRC udskille cyster i hydrogel omkring 15-20 min.
  4. Tag billeder ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop 5 minutter efter skylning med medium uden FCS. Brug 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og FITC filtre til at afsløre kerner mærkning og fluorescein ophobning i lumen (Figur 6A). At kvantificere antallet af udskiller cyster, tage Z-stakke som i trin 2 og tilpasse billedbehandling skridt til fluorescerende billeder.
    BEMÆRK: For Verapamil-testen indledes den foregående proces (trin 4.3. til 4.4.) med en inkubation med Verapamil i henhold til følgende betingelser:
  5. Der klargøres en lageropløsning på 10 mM Verapamil i dimethylsulfoxid (DMSO). For at forberede 10 μM arbejdsopløsning blandes 2,5 μL Verapamil-lageropløsning med 2,5 ml kulturmedium uden FCS.
  6. For at vurdere, at fluorescensen i lumen skyldes MDR-sekretion, skal du tage endnu et dias og tilsættes 250 μL Verapamil-arbejdsopløsning i hver brønd og inkuberes 20 min ved 37°C, 5% CO2
  7. Opløsningen fjernes, og der tilsættes 250 μL FDA-opløsning (8 μg/ml endelig koncentration) i hver brønd. Inkuber 4-5 min i mørke ved 37 °C, 5% CO2. Derefter vaskes med 250 μL 1x PBS, før billeddannelse(Figur 6B, C).

5. Epitelpolæritetsvurdering ved immunfluorescens

  1. For at klargøre fikseringsopløsningen blandes 4% formaldehyd med 5% saccharose, i 1x PBS, pH 7.4 og inkuberes i et vandbad forvarmet ved 37 °C.
  2. For at fastgøre cellerne pipetters forsigtigt kulturmediet ud fra brønden uden at beskadige matrixen. Tilsæt langsomt 400 μL fastgørelsesopløsning på siden af brøndene. Inkuber i 20 min ved stuetemperatur (RT).
    BEMÆRK: Lad altid 25 μL af væsken over matrixen for at undgå beskadigelse.
  3. Fjern forsigtigt fastgørelsesopløsningen, og vask 3x med 400 μL 1x PBS ved (RT).
  4. Pipette ud PBS, tilsæt 400 μL permeabilisering løsning (0,5% Triton X-100 i 1x PBS) og inkubere 10 min på RT.
  5. Fjern forsigtigt permeabiliseringsopløsningen efterfulgt af 3 hurtige vasker med 400 μL 1x PBS og et langt vasketrin på 30 min ved RT.
    BEMÆRK: På dette trin kan slidsen opbevares ved 4 °C i 2 dage. I dette tilfælde forsegles diaset med en paraffinfilm for at forhindre fordampning og matrixtørring.
  6. PBS fjernes, der tilsættes 400 μL blokerende opløsning indeholdende 0,1% kvæg serumalbumin (BSA) og 10% gedeserum i 1x PBS og inkuberes i 60 min. ved RT.
    FORSIGTIG: Koncentrationer af BSA på over 0,1 % vil resultere i tilbagetrækning af lumen og yderligere cystekollaps (se afsnittet Repræsentative resultater) (Figur 7A).
  7. Der pipetskes blokeringsopløsningen, og der vaskes én gang med 400 μL PBS/0,05% Tween 20 og kasseres.
  8. Der tilsættes 150 μL antistofopløsning, f.eks.
    BEMÆRK: Denne fortynding af E-cadherin er den samme, der anvendes som i en standard 2D immunfluorescensprotokol.
  9. Prøven vaskes med 400 μL PBS/0,05% Tween 20, 3x hver gang inkuberes prøven i 10 minutter ved RT.
  10. Der tilsættes 150 μL af det sekundære antistof (gedanti-kaninen IgG Alexa Fluor Plus 647), fortyndet 1:500 i 1x PBS og inkuberes 60 min ved RT.
  11. 3x vaskes med 400 μL PBS/0,05 % Tween 20, hver gang prøven inkuberes i 10 min. ved RT.
  12. 3x vaskes med 400 μL 1x PBS, hver gang prøven inkuberes i 10 min. ved RT.
  13. Kassér PBS af den sidste vask og forberede kammeret dias til visualisering via konfokal mikroskopi efter en af de to muligheder nedenfor.
    1. Der tilsættes 400 μL 1x PBS og 50 μL DAPI pr. brønd. Prøverne kan undersøges gennem bunden af brønden uden behov for montering med en dæksling (Figur 7B).
    2. Der tilsættes 100 μL pr. brønd antifadereageaget indeholdende DAPI, og skubtørring O/N på RT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dannelse og karakterisering af cyster
3D-cellekultursystemer er et vigtigt redskab til at studere organogenese og sygdomsmodellering25. Desværre er de fleste af disse metoder kvalitative eller anvender intern kvantificering, der udføres på et enkelt plan, ved at sammenligne antallet af cyster versus ikke-cyster i variable og ofte uspecificerede mængder, hvilket forhindrer enhver sammenligning med hensyn tilcystedannelseeffektivitet mellemde forskellige undersøgelser 7,8,9,10,15,18,23. Den metode, der foreslås i denne protokol, ved at registrere det samlede antal cyster og deres respektive størrelser over forsøgets løbet af forsøgets løbeting, gør det muligt at analysere udviklingen i cystedannelse og -vækst (figur 4).

Baseret på fase kontrast billeder, på dag 0, 8 timer efter celle såning meste små celle aggregater findes indlejret i hydrogel. På dag 1 er små cyster med en median diameter på 42,95 (26,53, 50,47) (første tredje kvartil) μm og fusion af cyster spredt over hele hydrogelen mærkbar. Ved dag 4 er det almindeligt at observere aggregerede strukturer samt cyster med en median diameter på 75 (56,48, 97,97) μm. Ved dag 7 og 10 nåede mediancysterdiameteren op på 108,67 (75,31, 141,76) μm og 186,46 (113,98, 278,29) μm (Figur 4A-C). Interessant, cyste dannelse effektivitet stiger fra 70,03 ± 5,05 cyster/1000 celler på dag 1 til 99,83 ± 12,81 cyste/1000 celler på dag 4 forbliver konstant indtil dag 10 (figur 4B), hvilket tyder på, at cyster hovedsagelig danner fra celleaggregater, der er til stede på tidspunktet for indlejringen eller denne form i løbet af de næste 48 timer gennem cellemigration eller fusion af småcellesammengregres. Med hensyn til cyste størrelse evolution, mens den gennemsnitlige størrelse følger en langsom og regelmæssig hældning, størrelsesfordelingen stiger bredt langs kulturtiden, hvilket illustrerer, at de forskellige cyster ikke vokser med samme hastighed. Interessant, kan dette være knyttet til vores observation (ikke vist), at cyster ikke er jævnt fordelt i hydrogel, de største cyster liggende i midten af hydrogel volumen. Da stigningen i cystediameteren hovedsagelig afhænger af sekretionen (da celledelingsraten er begrænset i NRC-afledte cyster), kan det udledes, at denne aktivitet er meget afhængig af de hydrogelegenskaber, der ikke er homogene i cellekulturvolumenet.

Vi bekræftede derefter levedygtigheden af celler efter indlejring dem i hydrogel (dag 0) og cyster på dag 10 ved hjælp af FDA / PI levende farvning (Figur 5A). FDA er en ikke-fluorescerende molekyle, der kun levende celler, gennem en enzymatisk reaktion, er i stand til at konvertere til den grønne fluorescerende forbindelse fluorescein26. PI er et ikke-permeantmolekyle til levende celler, der intercalater i DNA'et hos nekrotiske celler27. Interessant, døde celler, der repræsenterer mindre end 3% af hele cellerne i kulturen volumen på dag 10, er for det meste findes uden for cyster, som isolerede celler eller en del af små aggregater. Men vi har bemærket, at snavs fra nekrotiske celler ophobes i nogle store cyster på dag 10 (Figur 5B). Derfor, for vedligeholdelse af cystiske kulturer, passerer af cyster anbefales før 10 dage i disse betingelser.

Funktionel vurdering
Under fysiologiske forhold, den vigtigste funktion af cholangiocytter er at ændre kanalgaldet via absorptive og sekretoriske mekanismer, som MDR kanal er en central aktør28. For at vurdere funktionaliteten af cyster, vi inkuberede dag 10 cyster med FDA / Hoechst og observeret dannelse af fluorescein og dens sekretion fra basal i apical luminal rum (Figur 6A, B). Således bekræfter, at NRC'er i cyster bevarer deres sekretoriske funktioner. Desuden blev udskillelsen af fluorescein hæmmet af forbehandling af cyster med MDR-hæmmer verapamil (Figur 6C), der viste, at akkumulering af fluorescens FDA i lumen skyldtes udskillelsen gennem MDR-transportøren og ikke ved at lække fra det intercellulære rum.

Vurdering af cystepolæritet
For at etablere polarisering af NRC cyster, gennemførte vi en række optimeringstrin i immunfluorescensprotokollen. En af de vigtigste hindrer i undersøgelsen af epitelcelle polaritet i cyster er den hyppige sammenbrud af organoid arkitektur under immunfluorescens proces, på grund af lækage af væsken i lumen. For at omgå dette problem, hvert trin i immunfluorescens protokollen er blevet evalueret ved at teste, hvordan forskellige betingelser kan påvirke vedligeholdelsen af cyste struktur. Vi fandt, at modulerende fastsættelse (formaldehyd (2-4%) + saccharose (5-10%)) eller permeabilization betingelser (0,1-1% af både Triton X-100 og saccharose) ikke havde meget indflydelse på cyste arkitektur. Disse intervaller kan bruges til kraftigt at fastsætte og forsigtigt permeabilize cholangiocytter (Figur 7A). Vi bemærkede imidlertid, at holde BSA på 0,1% eller mindre under mætning er et vigtigt skridt i at opretholde cyste integritet, som højere koncentrationer resultere i cyste tilbagetrækning og lumen sammenbrud (Figur 7A).

Cholangiocyte funktioner er afhængige af deres rette apico-basolateral polaritet29. For at kontrollere, at NRC cyster selv samles i hydrogel som polariserede strukturer, bekræftede vi den apikale og basolaterale lokalisering af F-actin og E-cadherin, henholdsvis. E-cadherin udtryk i vores cyster indikerer også, at NRCs opretholde deres epitel fænotype i hydrogel (Figur 7B) i løbet af mindst 10 dage.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel arbejdsgang for cystedannelse og karakterisering. (A) Hydrogel belægning af kammeret dias. (B) Celle indlejring i hydrogel. c) Mikroskopi af cystedannelse. D) En 10-dages opfølgende vurdering af cyste vækst, levedygtighed, funktionalitet, og polarisering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Metode til anskaffelse af billede. a) Arbejdsgang for Z-stack erhvervelse udført langs hydrogel dybde fra dag 1 til 10: Z-stack erhvervelse (1) billedbehandling af Z-stack (2) generation af en minimum intensitet projektion og cyste kvantificering (3). (B) Image erhvervelse software screenshots viser udvælgelsen af målet (1), justering af parametre (2),automatisk lagring af billeder (3), og Z-stack kalibrering (4). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Metode til kvantificering af cystestørrelse og cystedannelseseffektivitet. (A)Billedbehandling layout skildrer: Z-stakke til at analysere (1), dens mindste intensitet Z-projektion (2), den endelige Z-projektion efter baggrund subtraktion (3), der anvendes til cyste optælling og cyste størrelse skøn. (B) Cyste identifikation på projektionen (A3) med en zoom af projektionen (4) for at vise identifikation af cyster featured af en mørk celle shell omslutter en lysere lumen, som er kendetegnet ved blå linjer afbildet for diameter måling vs aggregater med en mørk og uregelmæssig udseende pegede med røde pile. C) Formlen til beregning af cystedannelseeffektivitet for 1.000 celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Cyste dannelse effektivitet og cyste størrelse fordeling i hydrogel. (A) Time-lapse viser repræsentative fase kontrast billeder på dag 0, 1, 2, 4, 7 og 10 af 3D-kulturer. b) Afbilde graf med kinetik af middelcysterdannelseseffektivitet ± SEM (n=3). (C)Box og whisker plot viser cyste størrelse fordeling over den tid af kultur. Sorte bjælker repræsenterer den første kvartil, medianen og den tredje kvartil; linjer repræsenterer bredden af fordelingen. sorte prikker repræsenterer minimum og maksimum for fordelingen, n=3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: NRC-cysters levedygtighed i hydrogelen. (A) Repræsentant fluorescerende levende billeder af kulturer på dag 0 og på dag 10, farves med FDA (green = live) og PI (red = død). Bemærk, at den røde fluorescens hovedsagelig var forbundet med enkelte celler. (B) Repræsentativt fluorescerende levende billede af en nekrotisk cyste på dag 10, hvor de døde celler (med rødt) blev set akkumulere i lumen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Funktionaliteten af NRC-cyster i hydrogelen. (A)Repræsentant fluorescerende levende billeder af en 10-dages cyste, hvor cellens lag blev afsløret ved kerner mærkning med Hoechst (blå) og lumen af udskilles FDA (grøn). (B)Repræsentativ fase kontrast / fluorescerende levende billeder efter en sekretion test med FDA, som blev vist akkumuleret i lumen. (C)Efter redegørelsen til Verapamil, en MDR-hæmmer, repræsentativ fase kontrast / fluorescerende levende billeder af cyster, der viser, at FDA blev bevaret i cellens lag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Immunofluorescens af NRC-cyster i hydrogelen. (A) Optimering af immunofluorescensprotokollen med lyse feltbilleder, der viser repræsentative cysteformer på hvert trin i protokollen. Fra venstre mod højre: (Living cyste) en levende cyste i komplet medium før fiksering, (Fiksering) en cyste efter fiksering, (Permeabilization) en anden cyste efter permeabilisering, (Mætning) encysteefter mætning trin og ( Mærkning ) en cyste på immunmærkning trin. (B) (1-2): Konfokale billeder af en sektion gennem en cyste, der viser den apikale overflademarkør F-actin (rød-orange), basolateral markør E-cadherin (grøn) og de kerner, der er plettet med DAPI (blå). (3): 3D rekonstituering af et sæt cyster med følgende mærkning: rød-orange for F-actin og grøn for E-cadherin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Åbning af en stak. Skærmbillede fanger af softwaren, der viser proceduren for at åbne en Z-stack. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 2: Stakduplikering. Skærmbillede fanger af den software, der viser processen med at duplikere en Z-stack. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 3: Fremskringning af en minimumsintensitetsfremskrivning. Skærmbillede fanger af softwaren, der illustrerer proceduren for at skabe en minimumintensitetsprojektion fra den duplikerede Z-stack. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 4: Fjernelse af baggrund. Skærmbillede fanger af softwaren portrættere metoden til at fjerne baggrunden fra Z-stack projektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 5: Kontrastforbedring. Skærmbillede fanger af softwaren, der skitserer trinene for at forbedre kontrasten i Z-stack projektionen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 6: Billedkalibrering. Skærmbillede fanger af softwaren delineating processen til at kalibrere Z-stack og Z-stack projektion i mikron. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 7: Cystetælling. Skærmbillede fanger af softwaren skildrer proceduren for at tælle cyster på Z-stack projektion med lige linje værktøj. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 8: Kontrol af cyster. Screenshot fanger af softwaren skitserer metoden til at sammenligne antallet af cyster tælles på Z-stack projektion og Z-stack. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 9: Spare på investeringsafkastet. Skærmbillede af den software, der viser, hvordan du gemmer investeringsafkastet, der er defineret af optællingerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 10: Cysterstørrelse og talmålinger. Skærmbillede fanger af softwaren beskriver, hvordan man måler og gemme cyste størrelse og cyste nummer fra Z-stack projektion og Z-stack. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at studere organogenese og vedligeholdelse af 3D cellulære strukturer, forskellige væv er blevet modelleret, ved hjælp af forskellige cellulære oprindelse, men også forskellige typer af ekstra-cellulærematricer,herunder syntetiske hydrogels8,9,10,21. Men på grund af manglende 3D kvantitativ analyse, der giver mulighed for sammenligninger mellem metoder i form af organoider dannelse eller funktionalitet7,8,9,10,15,18, yderligere standardisering for hydrogel eller narkotika screening forbliver uden for rækkevidde.

For at afhjælpe disse mangler foreslår vi en hydrogelbaseret, reproducerbar og standardiseret protokol til at generere epitelcelleafledte cyster. Her eksemplificerede vi det med dannelsen af galdecyster i en basal lamina afledt hydrogel, fra en refereret cholangiocyt cellelinje. For at låse op for begrænsningen af 3D-kvantificering beregnes cystedannelseseffektiviteten i forhold til det samlede antal celler, der er seedet i hydrogel, og cystevækstkinetik måles over en konstant hydrogelvolumen.

Vi leverer en række systematiske skridt til at generere og karakterisere cyster, at tillade relevante cyste kvantitativ analyse. Med henblik herpå er der gjort en særlig indsats for at skabe en ensartet fordeling af celleaggregerede på tidspunktet for hydrogeloplejring og omgå hydrogelens heterogenitet, hvilket påvirker dannelsen af cyster ved at fastsætte betingelserne for at have en repræsentativ prøve til cysttælling.

Eksperimentel reproducerbarhed behandles gennem kritiske trin såsom filtrering celle suspensioner for at begrænse celle aggregat størrelse og pre-belægning af kammerdias før celle-hydrogel ud for at undgå 2D-lag dannelse, når celler kommer i kontakt overfladen af kulturbeholderen. Konsekvent kvantificering er løst at tage billeder langs Hydrogelens Z-akse med et konstant sæt parametre på tværs af forskellige prøver og eksperimenter.

Cyste dannelse effektivitet og cyste vækst kinetik er anslået fra det samlede antal celler seedet i hydrogel. Derfor foreslås en fleksibel algoritme til billedbehandling for at segmentere billeder til cystetælling og cystestørrelsesmålinger. Det nye ved den foreslåede metode er, at optællingen og målingerne foretages på Z-stack-projektioner. Efter fjernelse af den specifikke baggrund, er antallet af billeder til at analysere begrænset, giver mulighed for en betydelig gevinst på tid og begrænse harddiskens mætning. Immunfluorescens er et vigtigt redskab til at analysere 3D-kulturer på det strukturelle niveau, især polarisering, nøglen i korrekt epitelcellefunktion4. Således påtog vi os opgaven med omhyggeligt at optimere fiksering, permeabilization, og blokere trin af immunfluorescens del af vores protokol; fejlfinding BSA koncentration for at forhindre cyste tilbagetrækning og yderligere lumen sammenbrud.

Alt i alt åbner den foreslåede metode vejen til at generere en enkel, reproducerbar og kostbar protokol, 3D-cellulære kulturer og undersøge kvalitative og kvantitative parametre. Desuden giver denne metode mulighed for sammenligninger mellem forskellige typer af matricer: ved hjælp af den samme metode med poly (ethylenglycol) (PEG)-afledte hydrogels kunne vi påvise, at lumen dannelse og vækst er kritisk afhængige af hydrogel stivhed og klæbeevne, henholdsvis21. Denne protokol gælder også for sammenligning af dannelse og funktion af sfæroider afledt af forskellige celler, som kunne deltage i standardiseringen af vævsspecifikke epitelspheroidmodeller. Men en begrænsning er, at optimering af kultur betingelser såsom kultur medier, indledende celle såning, og den tid, der er nødvendig for cyste dannelse kan være nødvendig for andre celletyper. I galdegang feltet, dette arbejde kan bidrage til at besvare spørgsmål vedrørende galdegang organogenese, samt molekylære veje af sygdom, og test af lægemidler. Denne protokol vil også finde sin grænse, når de anvendes til høj gennemløb analyse, da nogle trin som cyste optælling og billedbehandling ikke er automatiseret endnu, selvom vi foreslår makroer til halvautomatisere billeddannelse proces, der kunne videreudvikles til automatisering. Begrænsningen for automatisk behandling i dette tilfælde er billedbaggrunden. Dette skyldes heterogen struktur af naturlige komplekse hydrogels sådanne kælder membran type geler, men vi mener, at automatisering kan anvendes på gennemsigtige geler såsom PEG-afledte hydrogels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, USA), der venligt forudsat NRC celle linje.

Dette arbejde fik økonomisk støtte fra både iLite RHU-programmet (tilskud ANR-16-RHUS-0005) og DHU Hepatinov.

Vi takker Isabelle Garcin og Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay for deres støtte til billedbehandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000020
100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000046
1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000062
1X PBS Thermo Fisher Scientific 14190-094
200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma-Aldrich T5516 NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL
Acetic acid VWR 20104-298 0.02N final
Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707439
Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707404
Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707430
Antibiotic Antimicotic Solution (100X) Sigma-Aldrich A5955 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Bovine pituitary extract Thermo Fisher Scientific 13028-014 NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153 1:1000 dilution
Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) Thermo Fisher Scientific 11905-031 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Collagen high concentration, rat tail Thermo Fisher Scientific 354249 50 µg/mL final concentration
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 21331-020 NRC complete medium final concentration = 1X
E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal Thermo Fisher Scientific PA5-32178 1:400 dilution
Eclipse TE300 inverted microscope Nikon imaging
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508 NRC complete medium final concentration = 0.32 mM
Fetal calf serum Thermo Fisher Scientific 10270-106 NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution
Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) Sigma-Aldrich F6057
Formaldehyde 16% (W/V) Thermo Fisher Scientific 28906 4% (W/V)
Goat serum Thermo Fisher Scientific 16210-064 1:10 dilution
Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) Hamamatsu imaging
Hoechst 33258 Sigma-Aldrich B1155 5 µg/mL final concentration
IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 Thermo Fisher Scientific A32733 1:500 dilution
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n Open source image processing software
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) Thermo Fisher Scientific 51300-044 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-024 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 356231 4:10 dilution
NIS Elements software version 4.50.00 Nikon image acquisition and display
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-035 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) Nikon
Prolong Gold Antifade Reagent Thermo Fisher Scientific P36931
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 20 µg/mL final concentration
Rhodamine Phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 16.2 nM final concentration
Sir-Actin / Verapamil kit Spirochrome SC001 10 µM final concentration
Soybean trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific 17075-029 NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL
Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22363547
Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811D
Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 11926955
Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 7200886
Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 553913
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 5:100 dilution
Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) Thermo Fisher Scientific 353108
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 5:1000 dilution
Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red Thermo Fisher Scientific 25300-054 1X
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 5:10000 dilution
Vitamin (100X) Thermo Fisher Scientific 11120-037 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi Clinisciences 80826

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  2. Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
  3. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  4. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
  5. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
  6. Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
  7. Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
  8. Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
  9. Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
  10. Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
  11. Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
  12. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
  13. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  14. Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
  15. Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
  16. De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
  17. Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
  18. Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
  19. Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
  20. Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
  21. Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
  22. Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
  23. Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
  24. Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
  25. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  26. Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
  27. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
  28. Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
  29. Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).

Tags

Bioengineering cholangiocytter selvorganisering lumen celle polaritet cyster organogenese galdegange
Generation og kvantitativ karakterisering af funktionelle og polariserede galde epitelcyster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bouzhir, L., Gontran, E., Loarca,… More

Bouzhir, L., Gontran, E., Loarca, L., Collado-Hilly, M., Dupuis-Williams, P. Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts. J. Vis. Exp. (159), e61404, doi:10.3791/61404 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter