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Bioengineering

Generierung und quantitative Charakterisierung funktioneller und polarisierter Gallenepithelzysten

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61404
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL
* These authors contributed equally

Summary

Dreidimensionale (3D) zelluläre Systeme sind relevante Modelle zur Untersuchung der Organogenese. Eine hydrogelbasierte Methode für die Produktion von Gallenzysten und deren Charakterisierung wird vorgeschlagen. Dieses Protokoll entschlüsselt die Barrieren der 3D-Charakterisierung, mit einer einfachen und zuverlässigen Methode, um die Effizienz der Zystenbildung und ihre Funktionalität zu bewerten.

Abstract

Cholangiozyten, die Epithelzellen, die die Gallengänge in der Leber aneinanderreihen, bewachen die Gallenbildung und -modifikation. In den letzten zwanzig Jahren sind im Zusammenhang mit Lebererkrankungen dreidimensionale (3D) Modelle entstanden, die auf Cholangiozyten basieren, wie Zysten, Sphäroide oder röhrenartige Strukturen, um Gewebetopologie für Organogenese, Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening-Studien nachzuahmen. Diese Strukturen wurden hauptsächlich durch Einbettung von Cholangiozyten in ein Hydrogel gewonnen. Der Hauptzweck bestand darin, die Selbstorganisation zu untersuchen, indem epitheliale Polarität, funktionelle und morphologische Eigenschaften angegangen wurden. Jedoch, nur sehr wenige Studien konzentrieren sich auf Zystenbildung Effizienz. Wenn dies der Fall ist, wird die Effizienz oft anhand von Bildern einer einzelnen Ebene quantifiziert. Funktionelle Assays und Strukturanalysen werden durchgeführt, ohne die potenzielle Heterogenität der Zystenverteilung darzustellen, die sich aus Hydrogelpolymerisationsheterogenitäten und Nebenwirkungen ergibt. Daher kann die quantitative Analyse, wenn sie durchgeführt wird, nicht für den Vergleich von einem Artikel zum anderen verwendet werden. Darüber hinaus erlaubt diese Methode keine Vergleiche des 3D-Wachstumspotenzials verschiedener Matrizen und Zelltypen. Darüber hinaus wird die experimentelle Fehlerbehebung für immunstainierende Zysten nicht erwähnt. In diesem Artikel bieten wir eine zuverlässige und universelle Methode, um zu zeigen, dass die anfängliche Zellverteilung mit der heterogenen vertikalen Verteilung der Zystenbildung zusammenhängt. Cholangiozytenzellen, die in Hydrogel eingebettet sind, werden mit Z-Stacks-Analysen entlang der Hydrogeltiefe im Laufe von 10 Tagen verfolgt. Mit dieser Methode wird eine robuste Kinetik der Zystenbildung Effizienz und Wachstum erhalten. Wir präsentieren auch Methoden zur Bewertung der Zystenpolarität und der Sekretorialfunktion. Schließlich werden zusätzliche Tipps zur Optimierung von Immunstaining-Protokollen zur Verfügung gestellt, um den Zystenkollaps für die Bildgebung zu begrenzen. Dieser Ansatz kann auf andere 3D-Zellkulturstudien angewendet werden, wodurch die Möglichkeiten eröffnet werden, ein System mit einem anderen zu vergleichen.

Introduction

In den letzten drei Jahrzehnten hat sich der Bereich der In-vitro-Forschung zu 3D-Kultursystemen entwickelt. Eine Reihe von Protokollen sind für die Kultivierung von Zellen in 3D als Sphäroide oder Aggregate in Gegenwart oder Abwesenheit eines Gerüstes/Matrix, in einem Tropfen, in Deragitation, in mikrofluidischen Geräten oder schwimmend1entstanden. Die Verwendung von 3D-Kulturmethoden hat sich gegenüber 2-dimensionalen (2D) Kulturen bewährt, insbesondere bei Epithelzellen, die sich nachweislich in 3D-Strukturen, zysten oder acini, selbst organisieren. In diesem Fall bilden die Zellen eine Monoschicht, die ein Lumen umgibt, wo Zellen ihren vollen epitheliaalen Phänotyp mit verbesserten physiologischen spezifischen Funktionen erwerben2.

Zahlreiche Studien haben zur Entwicklung von Methoden zur Bildung dieser epitheliale Organoide in natürlichen Matrizen beigetragen. Dies hat es ermöglicht, in vivo Zell-Zell- und Zell-Mikroumgebung-Wechselwirkungen zu rekapitulieren, um die Etablierung und Stabilität des epithelialen Phänotyps3,4,5,6,7zu erhalten. Kürzlich, insbesondere mit dem Ziel, transplantierbare Organoide zu entwickeln und die Anforderung der Mikroumgebung für die Orchestrierung des Epithelprogramms zu entschlüsseln, wurden synthetische Hydrogele entwickelt, um die Bildung von epithelialen Acini8,9,10zu verbessern. Leider berichten diese Studien über qualitative Daten oder präsentieren Berechnungsmethoden mit internen Referenzen wie das Verhältnis von Zysten zu Nichtzysten in einer 2D-Ebene8,9,10. Dies schließt einen Vergleich zwischen verschiedenen Studien in Bezug auf Effizienz, Stabilität oder morphologische und physiologische Charakterisierung der Epithelorganoide aus.

Die Mikroverkapselung von Epithelzellen in Perlen mit mikrofluidischen Geräten hat realistischere quantitative und vergleichende Ergebnisse ermöglicht. Mit dieser Technologie wurden Organoide aus verschiedenen Zelltypen gebildet und anhand der Morphologie zwischen verschiedenen 3D-Zellstrukturen11,12unterschieden. Diese Technologie ist jedoch nicht einfach zu bedienen und erfordert die Verwendung von Reinräumen, um die mikrofluidischen Geräte herzustellen. Diese Technologie wurde für einige Arten von Hydrogelen etabliert, erfordert aber technische Anpassungen, um auf andere Hydrogele angewendet zu werden, was ihre Vielseitigkeit einschränkt. Daher basieren die meisten Studien, die epitheliale Organoide entwickeln sollen, auf der Einbettung von Epithelzellen in eine Hydrogelmasse. Bei diesen Methoden wird die hohe Heterogenität der Gelstrukturierung und Zellverteilung innerhalb der gesamten 3D-Kultur oft vernachlässigt. Daher beziehen sich die meisten Analysen auf einzelne 2D-Bilder, die nur sehr grob die Verteilung der verschiedenen zellulären Objekte im gesamten 3D-Volumen darstellen.

Krankheiten, die Gallengänge beeinflussen, wie Cholangiokarzinom, Gallenatresie, primäre sklerosierende Cholangitis, unter anderem, sind eine der Hauptursachen für Sterblichkeit und Morbidität. Mit Ausnahme der Lebertransplantation gibt es keine wirksamen Behandlungen für diese Bedingungen13. Bemühungen zur Untersuchung der Gallengangbildung, der Krankheitsursachen und des Fortschreitens werden die Entwicklung neuartiger Therapien ermöglichen14.

Biliäre organotypische Modelle von Zysten, Sphäroiden oder röhrenähnlichen Strukturen mit normalen oder patientenabgeleiteten, differenzierten oder von Vorläufern abgeleiteten Cholangiozytenzelllinien wurden15,16,17,18,19,20entwickelt. Verschiedene Studien haben cholangiozyte Polarität, Expression von Cholangiozytenmarkern, Vorhandensein von Zilien, Cholangiocyte sekretot und reabsortive Fähigkeit, und Lumenbildung und Obstruktion rekapituliert; alle stellen wichtige Merkmale des Cholangiocyten-Phänotyps, der Morphologie und der Funktion15,17,19dar. Andere haben berichtet, dass die Aufrechterhaltung von patientenabgeleiteten Gallenorganoiden über einen längeren Zeitraum20berichtet hat. Kürzlich haben wir die Rolle biochemischer und biophysikalischer Hinweise auf gallenzysische Organogeneseuntersucht 21. Wichtig ist, dass die Pathogenese der Gallenatresie in Gallensphäriden und Röhren untersucht wurde7,22. Darüber hinaus wurden Schlüsselmerkmale der primären sklerosierenden Cholangitis wie Cholangiozytenszenz, Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen sowie Makrophagenrekrutierung erfolgreich mit Gallensphäriden15,20untersucht. Reproduzierbare in vitro 3D-quantitative Modelle, die physiologisch modulierencholangioyten Phänotyp, Physiologie und Mikroumgebung, in denen diese Fragen behandelt werden können, sind jedoch noch erforderlich. Darüber hinaus haben nur wenige Veröffentlichungen zystenbildung Effizienzberichtet 21,23. Dies ist ein wichtiger Punkt, um festzustellen, vor allem bei der Untersuchung der Organogenese, Krankheitsursache, und Korrelation der Arzneimittelreaktionen mit Cholangigiocyte Funktion und Polarisation. Darüber hinaus ist es schwierig, mit Unterschieden in Gerüst/Matrix, die von Protokoll zu Protokoll verwendet werden, zwischen Systemen zu vergleichen. Um diese Probleme zu lösen, schlagen wir eine quantitative, zuverlässige und universelle Methode vor, um Gallenzysten zu erzeugen, die Lumenbildung, Cholangiozytenpolarisation und Cholangiozytensekretoriennachlungimitat imitieren. Wichtig ist, dass wir eine systematische Analyse entlang der Z-Achse über das 3D-Gel hinweg präsentieren, wenn wir die Effizienz der Zystenbildung, Größe, Lebensfähigkeit, Polarisation und Funktionalität im Zeitverlauf bewerten. Darüber hinaus verwendeten wir ein natürliches Hydrogel und normale Rattencholangiocyten (NRC)s, als Beispiel für das Protokoll, aber andere natürliche oder synthetische Hydrogele, sowie Epithelzellen könnten für die Bildung von 3D-zystischen Strukturen verwendet werden.

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Protocol

1. Erzeugung von Zysten

HINWEIS: Dieses Protokoll kann mit jeder Art von Hydrogel durchgeführt werden, wenn die Gegebung das Einbetten von Zellen zulässt.

  1. Hydrogelbeschichtung
    HINWEIS: Die richtige Hydrogelbeschichtung des Kammerschlittens ist ein kritischer Schritt, um die Bildung von 2D-Zellschichten auf der Unterseite des Brunnens zu vermeiden, die die nachfolgende Zystenbildgebung stören und die Berechnung der Zystenbildungseffizienz beeinträchtigen könnten.
    1. Um die Homogenität der Gellösung zu gewährleisten, das Hydrogel über Nacht (O/N) bei 4 °C auftauen.
    2. Vorcoolpipettenspitzen auf Eis oder O/N bei -20 °C und ein 8-Well-Kammerschlitten bei -20 °C O/N.
    3. Legen Sie das Hydrogel und die 8-Well-Kammerrutsche auf einen eisbedeckten Eiskübel.
    4. In einem 15 ml konischen Rohr eine Lösung mit 40% Hydrogel (V/V) in kaltem NRC-Gesamtmedium (siehe Materialtabelle)vorbereiten und die Röhre auf Eis legen.
    5. Um eine Kammerrutsche mit kalten Pipettenspitzen zu beschichten, fügen Sie 50 L Hydrogellösung in der Mitte jedes Brunnens hinzu und verteilen sie über die gesamte Oberfläche mit einer Pipettenspitze, während Sie die Kammerrutsche auf Eis halten (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Verteilen Sie die Hydrogellösung so gleichmäßig wie möglich, um Blasen zu vermeiden.
    6. Um das Hydrogel zu polymerisieren, inkubieren Sie den Kammerschlitten mindestens 15 min bei 37 °C, 5%CO2.
  2. Zellvorbereitung
    1. Erwärmen Sie NRC-Komplettmedium, phosphatgepufferte Salzsäure (PBS) und Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Trypsin-EDTA) in einem auf 37 °C vorgeheizten Wasserbad.
    2. Während das Hydrogel polymerisiert, stellen Sie sicher, dass NRCs in einem T-25cm2 Kollagenkolben21auf 70% Konfluenz angebaut werden. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgeheiztem 1x PBS.
    3. Inkubieren Sie die NRCs mit 5 ml vorgeheiztem 1x PBS (für einen T-25 cm2 Kolben) für 20 min bei 37 °C, 5%CO2.
      HINWEIS: Dieser Schritt, der die Inkubationszeit mit trypsin-EDTA verkürzt, ist entscheidend, um die selbstorganisierenden Eigenschaften von Zellen beizubehalten.
    4. Entsorgen Sie die PBS, fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA hinzu und brüten Sie 5-10 min bei 37 °C, 5%CO2.
    5. Neutralisieren Sie mit 4 ml vorgewärmten kompletten NRC Medium. Sammeln und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und drehen Sie bei 150 x g für 4 min.
    6. Entsorgen Sie das Medium und setzen Sie das Zellpellet in 5 ml vorgeheiztem Medium wieder auf.
    7. Filtern Sie die Zelllösung mit einem 40 mL-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr und zählen die Zellen.
      ANMERKUNG: Das Übergeben der Zellen durch ein Sieb ist ein entscheidender Schritt, damit die quantitativen Ergebnisse reproduzierbar sind, d. h. dass fast ähnliche Größe von Zellaggregaten eingebettet werden soll.
  3. Einbettung der Zellsuspension in Hydrogellösung
    1. Bereiten Sie eine Lösung von 1.600 l 80% Hydrogel (V/V) in kaltem komplettem NRC-Medium (Rohr 1); im Eis zu halten. 5 x 105 Zellen/ml in 1.600 l kaltem NRC-Medium (Tube 2) verdünnen und im Eis halten.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss schnell durchgeführt werden, um eine Polymerisation des Hydrogels beim Mischen mit der Zellsuspension zu vermeiden und die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.
    2. Zur Herstellung einer Zellsaatlösung von 2,5 x 105 Zellen/ml in 40% Hydrogel (V/V), Mischen Vonrohr 1 und Tube 2. Fügen Sie 400 l der Zelllösung in jede Bohrung des hydrogelbeschichteten Kammerschlittens ein, um Blasen zu vermeiden (Abbildung 1B).
    3. Halten Sie die Kammerrutsche in einem Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2, bis sich die Medien ändern.
    4. Nach 2 Tagen in der Kultur, entfernen Sie 250 l des Mediums aus einer Ecke jedes Brunnens, achten Sie darauf, das Hydrogel nicht auszurohren. Fügen Sie dann langsam 250 l des Kulturmediums hinzu. Ändern Sie das Medium alle 2 Tage.
      HINWEIS: Minimieren Sie die Bewegung der Kammerrutsche, insbesondere während der Zysteninitiation.

2. Zysenquantifizierung

  1. Zystenbildgebung
    HINWEIS: Dieser Abschnitt sollte schnell durchgeführt werden, um die Zelllebensfähigkeit nicht zu beeinträchtigen, wenn das Mikroskop nicht mit einer Heizkammer zur Kontrolle von CO2 und Temperatur ausgestattet ist. Um eine konsistente Quantifizierung zu gewährleisten, die für die Zystenverteilung im gesamten Hydrogelvolumen repräsentativ ist, werden Zysten mittels Phasenkontrastmikroskopie und serieller Bildgebung (Z-Stacks) mit vordefinierten Parametern über verschiedene Zeitpunkte abgebildet.
    1. Nehmen Sie einen Z-Stack entlang der Tiefe des Hydrogels für jeden Zeitpunkt (Abbildung 1C, D). In diesem Beispiel werden Z-Stacks an den Tagen 1, 2, 4, 7 und 10 genommen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie, ob die anfängliche Zellverteilung im Hydrogel einheitlich ist, um die Anwendbarkeit dieser Methode zu gewährleisten.
      1. Mit einem Phasenkontrastmikroskop, das mit einer Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist, wählen Sie die 10-fache Objektivvergrößerung im manuellen Nasenstück-Pad-Fenster aus (Abbildung 2B(1)).
      2. Schalten Sie die weiße Lampe ein, und wählen Sie die Hellfeld-Bildgebungsoption aus.
      3. Schalten Sie die Kamera ein, indem Sie die Schaltfläche"Wiedergabe" im Untermenü der Leiste auswählen. Konzentrieren Sie sich auf ein Zystenfeld und legen Sie die Belichtungszeit fest (Abbildung 2B(2)). Öffnen Sie das Fenster Auto Capture Folder für ein automatisches Speichern von Bildern ( Abbildung2B(3)).
      4. Öffnen Sie das Fenster der Erfassungs-Z-Serie und definieren Sie mit der Z-Schraube die obere und untere Ebene des Z-Stacks (gleiche XY-Koordinaten, aber unterschiedlich Z geschirmt). Passen Sie den Z-Schritt abhängig vom Objektiv, der Auflösungsstufe an und drücken Sie die Taste"Jetzt ausführen", um die Erfassung zu starten (Abbildung 2B(4)).
        HINWEIS: In diesem Beispiel werden Zysten über eine Hydrogeldicke von 520 m verteilt. 26 Bilder werden entlang der Hydrogeltiefe mit einem Z-Schritt-Intervall von 20 m aufgenommen. Je nach Ziel sollte der Z-Schritt so eingestellt werden, dass keine Zyste verpasst wird und der Nachweis einzelner Zellen und Aggregate sichergestellt wird.
      5. Nehmen Sie mindestens 3 nicht überlappende Z-Stacks pro Brunnen.
        HINWEIS: Diese Probenahme ist notwendig, wenn, wie in diesem Beispiel, Zysten in der Tiefe des Gels zahlreicher sind als an den Rändern aufgrund von Heterogenitäten in der Hydrogelpolymerisation.
      6. Um ein repräsentatives Dataset zu haben, wiederholen Sie Schritt 2.1.1.5. für insgesamt 3 Brunnen.
        HINWEIS: Die heterogene Verteilung der Zysten hängt von der Art des Hydrogels, seiner Polymerisation und der Zelllinie ab. Unter Berücksichtigung von drei Z-Stacks pro Brunnen und drei Brunnen pro Experiment werden mindestens 200 Zysten über neun Z-Stacks abgebildet, um die Zystenbildung und das Zystenwachstum zu jedem Zeitpunkt zu charakterisieren.
  2. Bildverarbeitung
    HINWEIS: In einem Hydrogel können NRCs als einzelne Zellen, Zysten oder Aggregate gefunden werden. Zysten werden durch das Vorhandensein einer runden und dünnen kontrastierten Zellhülle identifiziert, die ein Lumen umschließt, während Zellaggregate eine unregelmäßige Form darstellen und kein Lumen haben. Aggregate und einzelne Zellen haben ein dichtes und kontrastiertes Erscheinungsbild (Abbildung 3B(4)).
    1. Öffnen Sie die Fidschi-Software, öffnen Sie den Z-Stack und gehen Sie zum Fidschi-Menü und klicken Sie auf Datei | Öffnen (Ergänzende Abbildung 1). Wählen Sie den zu analysierenden Z-Stack aus. Wählen Sie bei Bedarf die Option"Virtueller Stapel" und klicken Sie zum Öffnen auf "Ja" (Abbildung 3A(1)).
    2. Duplizieren Sie den Stapel über Image | Duplikat. Klicken Sie auf das Feld "Duplicate Stack" und klicken Sie auf "OK" (Ergänzende Abbildung 2).
      HINWEIS: In diesem Beispiel sind Z-Stacks im .nd2-Dateiformat in 16 Bit codiert.
    3. Erstellen Sie eine minimale Intensitätsprojektion aus dem duplizierten Stapel. Gehen Sie zum Bildmenü | Stapel | Z-Projekt. Wählen Sie Projektionstyp "Min Intensität" und klicken Sie auf "OK" (Abbildung 3A(2)) (Ergänzende Abbildung 3).
    4. Subtrahieren Sie den Hintergrund von der Projektion. Gehen Sie zum Menü Prozess | Hintergrund subtrahieren. Geben Sie 500,0 Pixel rollenden Kugelradius ein und klicken Sie auf"Lichthintergrund", um Zysten kontrastreicher als der Hintergrund zu rendern (Abbildung 3A(3)) (Ergänzende Abbildung 4).
      HINWEIS: Der Rollenkugelradius definiert die Größe des Bereichs, auf dem die Hintergrundsubtraktion betrieben wird. Dieser Parameter muss auf die Größe des größten zu identifizierenden Objekts festgelegt werden.
    5. Wenn eine Kontrastverbesserung erforderlich ist, gehen Sie zum Menü Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast | Auto | Bewerben Sie sich. Fidschi wird automatisch Helligkeit und Kontrast optimieren. In (Abbildung 3A(3)) wurden die unteren und oberen Grauwerte auf 49702 bzw. 65452 (Ergänzende Abbildung 5) gesetzt.
      ANMERKUNG: Wenn die Projektion nicht kalibriert ist, gehen Sie zum Menü Analysieren | Setzen Sie die Skala und geben Sie das entsprechende Kalibrierverhältnis von m/Pixel ein (Zusatzabbildung 6).
  3. Zystenzählung und Zystengrößenmessungen
    1. Um den ungefähren Zystendurchmesser zu messen, wählen Sie das Straight-Line-Werkzeug im Fidschi-Menü aus und zeichnen Sie eine Linie über den Durchmesser jeder Zyste auf der endigen Projektion (Abbildung 3B(4)). Fügen Sie dem ROI-Manager die neue Region von Interesse (ROI) hinzu, die für jede Zyste erstellt wurde: Drücken Sie die "t"-Verknüpfung" auf der Tastatur, um schneller zu zählen und den ROI-Manager zu öffnen. Klicken Sie auf "Alle anzeigen ", um die gezählten Zysten zu sehen (Ergänzende Abbildung 7)
    2. Stellen Sie fest, dass keine Zyste ohne Zählung übrig geblieben ist, indem Sie die eingestellten ROIs aus der Projektion auf dem Z-Stack überlagern. Klicken Sie dazu auf das Z-Stack-Fenster, um es auszuwählen. Klicken Sie im ROI-Manager auf"Alle anzeigen" und bewegen Sie den Cursor entlang des Z-Stacks, um dieses Bild pro Bild zu überprüfen, alle Zysten wurden gezählt (Ergänzende Abbildung 8).
    3. Sobald neue Zysten gezählt und ROIs in Schritt 2.3.1 hinzugefügt wurden, wählen Sie den ROI-Satz aus und speichern Sie ihn über das FENSTER ROI Manager, indem Sie auf Mehr | Speichern (Zusatzabbildung 9).
    4. Wählen Sie alle ROIs im ROI Manager aus und klicken Sie im ROI Manager auf "Messen", um die Größe jeder Zyste zu erhalten. Dadurch wird ein neues Zeitfenster mit dem Namen "Ergebnisse" geöffnet, das jede Zyste und ihre geschätzte Größe nummeriert. Speichern Sie dann im .csv Format, indem Sie auf das Fenster"Ergebnisse"und über das Menü: Datei | Save As (Zusatzabbildung 10).
      HINWEIS: Ein Makro kann erstellt werden, um halbautomatisch Stapel zu verarbeiten, die Anzahl/Größen der Zysten aus den Projektionen zu schätzen und die Daten für eine schnellere Zählung zu speichern. Wählen Sie dazu im Balkenmenü das Tool "Record" aus, indem Sie auf Plugins | Makros | Datensatz.
  4. Quantifizierung der Effizienz der Zystenbildung
    1. Zählen Sie die Anzahl der Zysten an Tag Y Equation 1 auf einer Projektion (Y=1, 2, 4, 7 oder 10).
    2. Um die Zystenbildungseffizienz für 1000 Zellen am Tag Y zu berechnen, dividieren Sie die Anzahl der zu diesem Zeitpunkt gezählten Zysten durch die Anzahl der Zellen, die am Tag 0 aus dem Hydrogelvolumen abgeleitet wurden, und multiplizieren Sie mit 1000 (Abbildung 3C, Abbildung 4).
      Equation 2

3. Zelllebensfähigkeit

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von Fluorescein-Diacetat (FDA) bei 5 mg/ml vor, indem Sie 5 mg FDA in 1 ml Aceton auflösen und bei -20 °C lagern.
  2. Bereiten Sie eine Lagerlösung mit Propidiumjodid (PI) in einer Konzentration von 2 mg/ml in entionisiertem Wasser (dH2O) vor und lagern Sie sie bei 4 °C.
  3. Vorbereiten NRC medium ohne fetales Wadenserum (FCS).
  4. Zur Vorbereitung der FDA/PI-Färbelösung fügen Sie 4 l FDA-Stammlösung (8 g/ml Endkonzentration) und 25 l PI-Lagerlösung (20 g/ml Endkonzentration) in 2,5 ml NRC-Medium ohne FCS ein.
  5. Entfernen Sie das Medium aus dem Kammerschlitten, fügen Sie 250 L Färbung Lösung in jeden Brunnen und inkubieren 4-5 min im Dunkeln bei 37 °C, 5%CO2. Die Färbelösung sorgfältig austeilen und einmal mit 250 l 1x PBS waschen.
  6. Fügen Sie vorsichtig 250 L komplettes NRC-Medium zu jedem Brunnen hinzu und fotografieren Sie mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit Texas-Rot- und Fluorescein-Isothiocyanat-Filtern (FITC). Lebende Zellen werden grün und abgestorbene Zellen rot sein (Abbildung 5A).
    HINWEIS: Um lebende/tote Zellen zu quantifizieren, nehmen Sie Z-Stacks über das Hydrogelvolumen nach Schritt 2 und passen Sie die Bildverarbeitungsmethode für die Fluoreszenz an.

4. Sekretionsaktivität

HINWEIS: Die Sekretionsaktivität durch die apikale Membran der Cholangiozyten wird durch die Sekretion von Fluorescein im Lumen beurteilt. Seine Spezifität kann durch den gleichen Test mit Verapamil, einem multiresistenten (MDR) Transporterhemmer(24)bewertet werden.

  1. Um eine Färbelösung von Hoechst 33258 bei 5 g/ml vorzubereiten, fügen Sie 0,83 l Hoechst-Stammlösung (15 mg/ml Lagerkonzentration in dH2O) in 2,5 ml NRC-Medium ohne FCS hinzu.
  2. Fügen Sie in jedem Brunnen 250 L der Hoechst-Lösung hinzu und brüten Sie bei 37 °C, 5%CO2 für 15 min.
  3. Entfernen Sie die Hoechst-Lösung, und fügen Sie in jedem Brunnen 250 l FDA-Lösung (8 g/ml Endkonzentration) hinzu. 4-5 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
    HINWEIS: Sobald Zellen der FDA-Färbelösung ausgesetzt sind, könnte die Nachverfolgung der Fluorescein-Sekretionskinetik nützlich sein, um die Zeit zu kalibrieren, die für das Absepernieren von Zysten benötigt wird. Nehmen Sie dazu jede min für 1 h per Zeitraffer-Bildgebung Bilder auf. In diesem Beispiel beträgt die Zeit, die benötigt wird, um NRC-Sekretionszysten im Hydrogel zu beobachten, etwa 15-20 min.
  4. Nehmen Sie Bilder mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop 5 min nach dem Spülen mit Medium ohne FCS auf. Verwenden Sie 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und FITC-Filter, um Kerne Kennzeichnung und Fluorescein-Akkumulation im Lumen zu offenbaren (Abbildung 6A). Um die Anzahl der sezernierenden Zysten zu quantifizieren, nehmen Sie Z-Stacks wie in Schritt 2 und passen Sie die Bildverarbeitungsschritte an fluoreszierende Bilder an.
    HINWEIS: Für den Verapamil-Test vor dem vorherigen Prozess (Schritte 4.3. bis 4.4.) durch eine Inkubation mit Verapamil, gemäß den folgenden Bedingungen:
  5. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Verapamil in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Um eine Arbeitslösung mit 10 m zu erstellen, mischen Sie 2,5 l Verapamil-Lagerlösung mit einem 2,5 ml-Kulturmedium ohne FCS.
  6. Um zu beurteilen, dass die Fluoreszenz im Lumen aus der MDR-Sekretion resultiert, nehmen Sie einen weiteren Schlitten und fügen Sie 250 L Verapamil Arbeitslösung in jedem Brunnen hinzu und brüten 20 min bei 37° C, 5%CO2
  7. Entfernen Sie die Lösung und fügen Sie jedem Bohrgut 250 l FDA-Lösung (8 g/ml Endkonzentration) hinzu. 4-5 min im Dunkeln bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Dann waschen Sie mit 250 l 1x PBS, bevor Sie bildgebungsbilden (Abbildung 6B, C).

5. Epitheliale Polaritätsbewertung durch Immunfluoreszenz

  1. Zur Herstellung der Befestigungslösung 4% Formaldehyd mit 5% Saccharose in 1x PBS, pH 7,4 mischen und in einem bei 37 °C vorgeheizten Wasserbad inkubieren.
  2. Um die Zellen zu fixieren, pipette das Kulturmedium vorsichtig aus dem Brunnen heraus, ohne die Matrix zu beschädigen. Fügen Sie langsam 400 l der Befestigungslösung an der Seite der Brunnen hinzu. Inkubieren Sie für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
    HINWEIS: Lassen Sie immer 25 l der Flüssigkeit über der Matrix, um schäden zu verhindern.
  3. Entfernen Sie die Befestigungslösung vorsichtig und waschen Sie 3x mit 400 l 1x PBS bei (RT).
  4. Pipetten Sie die PBS heraus, fügen Sie 400 L Permeabilisationslösung (0,5% Triton X-100 in 1x PBS) und inkubieren 10 min bei RT.
  5. Entfernen Sie vorsichtig die Permeabilisationslösung, gefolgt von 3 Schnellwäschen mit 400 l 1x PBS und einem langen Waschschritt von 30 min bei RT.
    HINWEIS: In diesem Schritt kann der Schlitten bei 4 °C für 2 Tage gelagert werden. Versiegeln Sie in diesem Fall das Dia mit einem Paraffinfilm, um Verdunstung und Matrixtrocknung zu verhindern.
  6. Entfernen Sie die PBS, fügen Sie 400 L der blockierenden Lösung, die 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und 10% Ziegenserum in 1x PBS enthält, und brüten für 60 min bei RT.
    VORSICHT: Konzentrationen von BSA über 0,1% führen zu Lumenrückzug und weiterem Zystenkollaps (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse) (Abbildung 7A).
  7. Die Sperrlösung auspfeifen und einmal mit 400 l PBS/0,05% Tween 20 waschen und entsorgen.
  8. Fügen Sie 150 l der Antikörperlösung hinzu, z. B. E-Cadherin-Antikörper verdünnt 1:400 und Phalloidin 568 (16,2 nM Endkonzentration) in 1x PBS und inkubieren sie 90 min bei RT.
    HINWEIS: Diese Verdünnung von E-Cadherin ist die gleiche, die wie in einem Standard-2D-Immunfluoreszenzprotokoll verwendet wird.
  9. Waschen Sie die Probe mit 400 l PBS/0,05% Tween 20, 3x; jedes Mal, wenn die Probe für 10 min bei RT inkubiert wird.
  10. Fügen Sie 150 l des sekundären Antikörpers (Ziegenanti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus 647), verdünnt 1:500 in 1x PBS und inkubieren 60 min bei RT.
  11. Waschen Sie 3x mit 400 l PBS/0,05% Tween 20, jedes Mal inkubieren die Probe für 10 min bei RT.
  12. Waschen Sie 3x mit 400 l 1x PBS, wobei die Probe jedes Mal 10 min bei RT inkubiert wird.
  13. Entsorgen Sie die PBS der letzten Wäsche und bereiten Sie die Kammerrutsche nach einer der beiden folgenden Optionen zur Visualisierung mittels konfokaler Mikroskopie vor.
    1. Fügen Sie 400 l 1x PBS und 50 l DAPI pro Brunnen hinzu. Die Proben können durch den Boden des Brunnens untersucht werden, ohne dass eine Montage mit einem Deckschein erforderlich ist (Abbildung 7B).
    2. Fügen Sie 100 l pro Bohrung antifade Reagenz enthaltenDAPI und lassen Sie die Folie trocknen O/ N bei RT.

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Representative Results

Bildung und Charakterisierung von Zysten
3D-Zellkultursysteme sind ein wichtiges Werkzeug, um Organogenese und Krankheitsmodellierung zu studieren25. Leider sind die meisten dieser Methoden qualitativ oder verwenden interne Quantifizierung auf einer einzigen Ebene durch den Vergleich der Anzahl der Zysten im Vergleich zu Nicht-Zysten, in variablen und oft nicht spezifizierten Volumen, verhindert jeden Vergleich in Bezug auf Zystenbildung Effizienz zwischen den verschiedenen Studien7,8,9,10,15,18,23. Die in diesem Protokoll vorgeschlagene Methode, indem die gesamte Anzahl der Zysten und ihre jeweilige Größe während des Versuchs aufgezeichnet wird, ermöglicht die Analyse der Evolution der Zystenbildung und des Wachstums (Abbildung 4).

Basierend auf Phasenkontrastbildern werden am Tag 0, 8 Stunden nach der Zellaussaat meist kleine Zellaggregate gefunden, die in das Hydrogel eingebettet sind. Am ersten Tag sind kleine Zysten mit einem mittleren Durchmesser von 42,95 (26,53, 50,47) (erstes, drittes Quartil) und die Im gesamten Hydrogel verstreute Zystenzysten auffallen. Am Tag 4 ist es üblich, Aggregatstrukturen sowie Zysten mit einem Mediandurchmesser von 75 (56,48, 97,97) zu beobachten. An den Tagen 7 und 10 erreichte der mediane Zystendurchmesser 108,67 (75,31, 141,76) und 186,46 (113,98, 278,29) bzw. m (Abbildung 4A-C). Interessanterweise erhöht sich die Zystenbildungseffizienz von 70,03 ± 5,05 Zysten/1000 Zellen am Tag 1 auf 99,83 ± 12,81 Zysten/1000 Zellen am Tag 4, die bis zum Tag 10 konstant bleiben (Abbildung 4B), was darauf hindeutet, dass Sich Zysten im Wesentlichen aus Zellaggregaten bilden, die zum Zeitpunkt der Einbettung vorhanden sind oder sich während der nächsten 48h durch Zellmigration oder die Fusion von zelligen Aggregaten bilden. In Bezug auf die Zystengröße Evolution, während die mittlere Größe folgt einer langsamen und regelmäßigen Neigung, die Größenverteilung steigt weit entlang der Kulturzeit, was zeigt, dass die verschiedenen Zysten nicht mit der gleichen Geschwindigkeit wachsen. Interessanterweise kann dies mit unserer Beobachtung (nicht gezeigt) in Verbindung gebracht werden, dass Zysten nicht gleichmäßig im Hydrogel verteilt sind, den größten Zysten, die in der Mitte des Hydrogelvolumens liegen. Da die Zunahme des Zystendurchmessers hauptsächlich von der Sekretionsaktivität abhängt (da die Zellteilungsrate in NRC-abgeleiteten Zysten begrenzt ist), lässt sich daraus schließen, dass diese Aktivität in hohem Maße von den Hydrogeleigenschaften abhängt, die im Zellkulturvolumen nicht homogen sind.

Wir bestätigten dann die Lebensfähigkeit von Zellen nach der Einbettung in das Hydrogel (Tag 0) und Zysten am Tag 10 mit FDA/PI Live-Färbung (Abbildung 5A). FDA ist ein nicht fluoreszierendes Molekül, das nur lebende Zellen durch eine enzymatische Reaktion in die grüne fluoreszierende Verbindung Fluorescein26umwandeln können. PI ist ein nicht-permeant Molekül für lebende Zellen, die in der DNA von nekrotischen Zellen intercalatiert27. Interessanterweise finden sich abgestorbene Zellen, die weniger als 3% der gesamten Zellen im Kulturvolumen an Tag 10 darstellen, meist außerhalb der Zysten, als isolierte Zellen oder als Teil kleiner Aggregate. Wir bemerkten jedoch, dass sich Trümmer aus nekrotischen Zellen an Tag 10 in einigen großen Zysten ansammeln (Abbildung 5B). Daher, für die Aufrechterhaltung der zystischen Kulturen, Passaging von Zysten wird vor 10 Tagen unter diesen Bedingungen empfohlen.

Funktionelle Bewertung
Unter physiologischen Bedingungen besteht die Hauptfunktion von Cholangiocyten darin, die kanalikuläre Galle über absorptive und sekretore Mechanismen zu modifizieren, von denen der MDR-Kanal ein Schlüsselspieler ist28. Um die Funktionalität von Zysten zu beurteilen, inkubierten wir Tag 10 Zysten mit FDA/Hoechst und beobachteten die Bildung von Fluorescein und seiner Sekretion vom Basal in den apikalen Luminalraum (Abbildung 6A,B). Somit bestätigt die Bestätigung, dass NRCs in Zysten ihre sekretorialen Funktionen behalten. Darüber hinaus wurde die Sekretion von Fluorescein durch Vorbehandlung von Zysten mit dem MDR-Hemmer Verapamil (Abbildung 6C) gehemmt, was zeigte, dass die Ansammlung der Fluoreszenz FDA in das Lumen auf die Sekretion durch MDR-Transporter und nicht durch Leckaustreten aus dem interzellulären Raum zurückzuführen war.

Bewertung der Zystenpolarität
Um die Polarisation der NRC-Zysten zu etablieren, haben wir eine Reihe von Optimierungsschritten im Immunfluoreszenzprotokoll durchgeführt. Ein Haupthindernis bei der Untersuchung der Epithelzellpolarität in den Zysten ist der häufige Zusammenbruch der Organoidarchitektur während des Immunfluoreszenzprozesses aufgrund des Auslaufens der im Lumen enthaltenen Flüssigkeit. Um dieses Problem zu umgehen, wurde jeder Schritt des Immunfluoreszenzprotokolls durch Tests ausgewertet, wie verschiedene Bedingungen die Aufrechterhaltung der Zystenstruktur beeinflussen könnten. Wir fanden heraus, dass die Modulation der Fixierung (Formaldehyd (2-4%) + Saccharose (5-10%)) oder Permeabilisationsbedingungen (0,1-1% der beiden Triton X-100 und Saccharose) keinen großen Einfluss auf die Zystenarchitektur hatte. Diese Bereiche können verwendet werden, um die Cholangiocyten stark zu fixieren und sanft zu durchsondiegen (Abbildung 7A). Wir beobachteten jedoch, dass die Beibehaltung von BSA bei 0,1% oder weniger während der Sättigung ein wichtiger Schritt bei der Aufrechterhaltung der Zystenintegrität ist, da höhere Konzentrationen zu Zystenrückzug und Lumenkollaps führen (Abbildung 7A).

Cholangiocyte Funktionen sind abhängig von ihrer richtigen apico-basolateralen Polarität29. Um zu überprüfen, ob sich die NRC-Zysten in Hydrogel als polarisierte Strukturen selbst zusammensetzen, bestätigten wir die apikale und basolaterale Lokalisierung von F-Actin bzw. E-Cadherin. Die E-Cadherin-Expression in unseren Zysten zeigt auch, dass NRCs ihren epitheliale Phänotyp in Hydrogel (Abbildung 7B) mindestens 10 Tage lang beibehalten.

Figure 1
Abbildung 1: Experimenteller Arbeitsablauf der Zystenbildung und Charakterisierung. (A) Hydrogelbeschichtung der Kammerrutsche. (B) Zelleinbettung in das Hydrogel. (C) Mikroskopie der Zystenbildung. (D) Eine 10-tägige Follow-up-Bewertung des Zystenwachstums, der Lebensfähigkeit, der Funktionalität und der Polarisation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Bildaufnahmemethode. (A) Workflow der Z-Stack-Erfassung, die entlang der Hydrogeltiefe vom Tag 1 bis 10 durchgeführt wurde: Z-Stack-Erfassung (1) Bildverarbeitung der Z-Stack (2) Erzeugung einer minimalen Intensitätsprojektion und Zystenquantifizierung (3). (B) Bildaufnahme-Software-Screenshots, die die Auswahl des Objektivs (1), die Einstellung der Parameter (2), das automatische Speichern von Bildern (3) und die Z-Stack-Kalibrierung (4) zeigen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Methode zur Quantifizierung der Zystengröße und der Effizienz der Zystenbildung. (A) Bildverarbeitungslayout, das darstellt: Z-Stacks zu analysieren (1), seine minimale Intensität Z-Projektion (2), die endgültige Z-Projektion nach Hintergrundsubtraktion (3) für Zystenzählung und Zystengrößenschätzung verwendet. (B) Zystenidentifikation auf der Projektion (A3) mit einem Zoom der Projektion (4), um die Identifizierung von Zysten zu zeigen, die von einer dunklen Zellhülle gekennzeichnet sind, die ein helleres Lumen umschließt, die sich durch blaue Linien unterscheiden, die für die Durchmessermessung dargestellt werden, vs. Aggregate mit einem dunklen und unregelmäßigen Aussehen, das von roten Pfeilen hervorgehoben wird. (C) Die Formel für die Berechnung der Zystenbildungseffizienz für 1.000 Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Effizienz der Zystenbildung und Zystengrößenverteilung im Hydrogel. (A) Zeitraffer mit repräsentativen Phasenkontrastbildern an den Tagen 0, 1, 2, 4, 7 und 10 der 3D-Kulturen. (B) Diagramm mit der Kinetik der mittleren Zystenbildungseffizienz ± SEM (n=3). (C) Box und Schnurrbart-Plot, der die Zystengrößenverteilung über die Zeit der Kultur zeigt. Schwarze Balken stellen das erste Quartil, den Median und das dritte Quartil dar. Zeilen stellen die Breite der Verteilung dar; schwarze Punkte stellen das Minimum und das Maximum der Verteilung dar, n=3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Lebensfähigkeit von NRC-Zysten im Hydrogel. (A) Repräsentative fluoreszierende Live-Bilder von Kulturen an Tag 0 und am Tag 10, gefärbt mit FDA (grün=live) und PI (rot=tot). Beachten Sie, dass die rote Fluoreszenz hauptsächlich einzelnen Zellen zugeordnet war. (B) Repräsentatives fluoreszierendes Lebendbild einer nekrotischen Zyste an Tag 10, wo sich die abgestorbenen Zellen (rot) im Lumen ansammeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Funktionalität von NRC-Zysten im Hydrogel. (A) Repräsentative fluoreszierende Live-Bilder einer 10-Tage-Zyste, bei denen die Zellschicht durch Kernkennzeichnung mit Hoechst (blau) und dem Lumen durch die sezernierte FDA (grün) aufgedeckt wurde. (B) Repräsentative Phasenkontrast-/Fluoreszenz-Livebilder nach einem Sekretionstest mit FDA, der im Lumen angesammelt gezeigt wurde. (C) Nach der Exposition gegenüber Verapamil, einem MDR-Hemmer, repräsentative Phasenkontrast-/fluoreszierende Live-Bilder von Zysten, die zeigen, dass die FDA in der Zellschicht zurückgehalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Immunfluoreszenz von NRC-Zysten im Hydrogel. (A) Optimierung des Immunfluoreszenzprotokolls mit hellen Feldbildern, die repräsentative Zystenformen bei jedem Schritt des Protokolls zeigen. Von links nach rechts: (Lebende Zyste) eine lebende Zyste in vollständigem Medium vor der Fixierung, (Fixierung) eine Zyste nach Fixierung, (Permeabilisierung) eine weitere Zyste nach Permeabilisierung, (Sättigung) eine Zyste nach dem Sättigungsschritt und (Etikettierung) eine Zyste am Immunetikettierungsschritt. (B) (1-2): Konfokale Bilder eines Abschnitts durch eine Zyste, die den apikalen Oberflächenmarker F-Actin (rot-orange), den basolateralen Marker E-cadherin (grün) und die mit DAPI (blau) gebeizten Kerne zeigt. (3): 3D-Rekonstitution einer Reihe von Zysten mit folgenden Kennzeichnungen: rot-orange für F-Actin und grün für E-Cadherin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Öffnen eines Stapels. Screenshot-Aufnahmen der Software, die das Verfahren zum Öffnen eines Z-Stacks darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 2: Stapelduplizierung. Screenshot-Aufnahmen der Software, die den Prozess zum Duplizieren eines Z-Stacks anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 3: Erzeugung einer Minimalintensitätsprojektion. Screenshot-Aufnahmen der Software, die das Verfahren veranschaulicht, um eine minimale Intensitätsprojektion aus dem duplizierten Z-Stack zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 4: Hintergrundentfernung. Screenshot-Aufnahmen der Software, die die Methode zum Entfernen des Hintergrunds aus der Z-Stack-Projektion darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 5: Kontrastverbesserung. Screenshot-Aufnahmen der Software, die die Schritte zur Verbesserung des Kontrasts der Z-Stack-Projektion umreißt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 6: Bildkalibrierung. Screenshot-Aufnahmen der Software, die den Prozess abgibt, um den Z-Stack und die Z-Stack-Projektion in Mikrometern zu kalibrieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 7: Zystenzählung. Screenshot-Aufnahmen der Software, die das Verfahren zur Zählung von Zysten auf der Z-Stack-Projektion mit dem geradlinigen Werkzeug darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 8: Zystenzählung. Screenshot-Aufnahmen der Software, die die Methode zum Vergleich der Anzahl der Zysten auf der Z-Stack-Projektion und dem Z-Stack skizziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 9: ROI-Einsparung. Screenshot-Aufnahmen der Software zeigen, wie sie den ROI-Satz speichern, der durch die Zählungen definiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 10: Zystengröße und Zahlenmessungen. Screenshot-Aufnahmen der Software, die detailliert beschreiben, wie zyste Größe und Zystenzahl aus der Z-Stack-Projektion und dem Z-Stack zu messen und zu speichern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Um die Organogenese und die Erhaltung von 3D-Zellstrukturen zu untersuchen, wurden verschiedene Gewebe modelliert, mit unterschiedlichen zellulären Ursprüngen, aber auch verschiedenen Arten von extrazellulären Matrizen einschließlich synthetischer Hydrogele8,9,10,21. Aufgrund des Fehlens einer quantitativen 3D-Analyse, die Vergleiche zwischen Methoden in Bezug auf Organoidbildung oder Funktionalität ermöglicht7,8,9,10,15,18, bleibt eine weitere Standardisierung für Hydrogel oder Arzneimittelscreening außer Reichweite.

Um diese Mängel zu beheben, schlagen wir ein hydrogelbasiertes, reproduzierbares und standardisiertes Protokoll zur Erzeugung von epitheliaalzellabgeleiteten Zysten vor. Hier haben wir es mit der Bildung von Gallenzysten in einem basalen Lamina abgeleiteten Hydrogel aus einer referenzierten Cholangioyten-Zelllinie exemplarisch dargestellt. Um die Begrenzung der 3D-Quantifizierung freizusetzen, wird die Effizienz der Zystenbildung relativ zur Gesamtzahl der Zellen berechnet, die in das Hydrogel eingesät werden, und die Zystenwachstumskinetik wird über ein konstantes Hydrogelvolumen gemessen.

Wir bieten eine Reihe von systematischen Schritten, um Zysten zu erzeugen und zu charakterisieren, um relevante quantitative Zystenanalysen zu ermöglichen. Zu diesem Zweck wurden besondere Anstrengungen unternommen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellaggregate zum Zeitpunkt der Hydrogeleinbettung zu erzeugen und die Heterogenität der Hydrogelstruktur zu umgehen, die sich auf die Zystenbildung auswirkt, indem die Bedingungen für eine repräsentative Probe für die Zystenzählung gesetzt werden.

Die experimentelle Reproduzierbarkeit wird durch kritische Schritte wie das Filtern von Zellsuspensionen zur Begrenzung der Zellaggregatgröße und die Vorbeschichtung der Kammergleiter vor der Zellhydrogel-Zugabe angegangen, um die Bildung von 2D-Schichten zu vermeiden, wenn Zellen die Oberfläche des Kulturgefäßes kontaktieren. Die konsistente Quantifizierung wird gelöst, indem Bilder entlang der Z-Achse des Hydrogels mit einem konstanten Satz von Parametern über verschiedene Proben und Experimente hinweg gemacht werden.

Die Effizienz der Zystenbildung und die Zystenwachstumskinetik werden anhand der Gesamtzahl der zellen geschätzt, die in das Hydrogel eingesät werden. Daher wird ein anpassungsfähiger Algorithmus für die Bildverarbeitung vorgeschlagen, um Bilder für Dieszähl- und Zystengrößenmessungen zu segmentieren. Die Neuheit der vorgeschlagenen Methode ist, dass die Zählung und Messungen auf Z-Stack-Projektionen durchgeführt werden. Nach dem Entfernen des spezifischen Hintergrunds ist die Anzahl der zu analysierenden Bilder begrenzt, was einen erheblichen Zeitgewinn und eine Einschränkung der Festplattensättigung ermöglicht. Immunfluoreszenz ist ein wichtiges Werkzeug zur Analyse von 3D-Kulturen auf struktureller Ebene, insbesondere Polarisation, Schlüssel in der richtigen Epithelzellfunktion4. So haben wir uns die Aufgabe gestellt, die Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung von Schritten des Immunfluoreszenzteils unseres Protokolls sorgfältig zu optimieren; Fehlerbehebung der BSA-Konzentration, um zystenrückzug und weiteren Lumenkollaps zu verhindern.

Insgesamt eröffnet die vorgeschlagene Methode den Weg, um ein einfaches, reproduzierbares und kostspielig-wirksames Protokoll, 3D-Zellkulturen, zu erzeugen und qualitative und quantitative Parameter zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren Vergleiche zwischen verschiedenen Matrizentypen: Mit dem gleichen Verfahren mit Poly(Ethylenglykol) (PEG)-abgeleiteten Hydrogelen konnten wir nachweisen, dass Lumenbildung und -wachstum entscheidend von der Hydrogelsteifigkeit und Klebstoffität abhängig sind, bzw.21. Dieses Protokoll eignet sich auch für den Vergleich der Bildung und Funktion von Sphäroiden, die aus verschiedenen Zellen stammen, die an der Standardisierung gewebespezifischer epitheliale Sphäroidmodelle teilnehmen könnten. Eine Einschränkung ist jedoch, dass die Optimierung von Kulturbedingungen wie Kulturmedien, anfänglichezellaussierung und die für die Zystenbildung benötigte Zeit für andere Zelltypen erforderlich sein könnte. Im Gallengang könnte diese Arbeit dazu beitragen, Fragen zur Gallengangsorganogenese sowie molekulare Krankheitswege und Arzneimitteltests zu beantworten. Dieses Protokoll wird auch seine Grenze finden, wenn es auf die Analyse mit hohem Durchsatz angewendet wird, da einige Schritte wie Zystenzählung und Bildverarbeitung noch nicht automatisiert sind, obwohl wir Makros zur halbautomatischen Automatisierung des Bildgebungsprozesses vorschlagen, die für die Automatisierung weiterentwickelt werden könnten. Die Einschränkung der automatischen Verarbeitung in diesem Fall ist der Bildhintergrund. Dies ist auf die heterogene Struktur natürlicher komplexer Hydrogele wie Kellermembrangele zurückzuführen, aber wir glauben, dass die Automatisierung auf transparente Gele wie PEG-abgeleitete Hydrogele angewendet werden könnte.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Vereinigte Staaten), der freundlicherweise die NRC-Zelllinie zur Verfügung gestellt hat.

Diese Arbeit wurde sowohl vom iLite RHU-Programm (Grant ANR-16-RHUS-0005) als auch von der DHU Hepatinov finanziell unterstützt.

Wir danken Isabelle Garcin und Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay für ihre Unterstützung bei der Bildgebung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000020
100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000046
1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000062
1X PBS Thermo Fisher Scientific 14190-094
200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma-Aldrich T5516 NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL
Acetic acid VWR 20104-298 0.02N final
Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707439
Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707404
Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707430
Antibiotic Antimicotic Solution (100X) Sigma-Aldrich A5955 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Bovine pituitary extract Thermo Fisher Scientific 13028-014 NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153 1:1000 dilution
Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) Thermo Fisher Scientific 11905-031 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Collagen high concentration, rat tail Thermo Fisher Scientific 354249 50 µg/mL final concentration
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 21331-020 NRC complete medium final concentration = 1X
E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal Thermo Fisher Scientific PA5-32178 1:400 dilution
Eclipse TE300 inverted microscope Nikon imaging
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508 NRC complete medium final concentration = 0.32 mM
Fetal calf serum Thermo Fisher Scientific 10270-106 NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution
Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) Sigma-Aldrich F6057
Formaldehyde 16% (W/V) Thermo Fisher Scientific 28906 4% (W/V)
Goat serum Thermo Fisher Scientific 16210-064 1:10 dilution
Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) Hamamatsu imaging
Hoechst 33258 Sigma-Aldrich B1155 5 µg/mL final concentration
IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 Thermo Fisher Scientific A32733 1:500 dilution
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n Open source image processing software
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) Thermo Fisher Scientific 51300-044 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-024 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 356231 4:10 dilution
NIS Elements software version 4.50.00 Nikon image acquisition and display
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-035 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) Nikon
Prolong Gold Antifade Reagent Thermo Fisher Scientific P36931
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 20 µg/mL final concentration
Rhodamine Phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 16.2 nM final concentration
Sir-Actin / Verapamil kit Spirochrome SC001 10 µM final concentration
Soybean trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific 17075-029 NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL
Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22363547
Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811D
Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 11926955
Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 7200886
Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 553913
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 5:100 dilution
Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) Thermo Fisher Scientific 353108
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 5:1000 dilution
Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red Thermo Fisher Scientific 25300-054 1X
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 5:10000 dilution
Vitamin (100X) Thermo Fisher Scientific 11120-037 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi Clinisciences 80826

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Generierung und quantitative Charakterisierung funktioneller und polarisierter Gallenepithelzysten
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Bouzhir, L., Gontran, E., Loarca, L., Collado-Hilly, M., Dupuis-Williams, P. Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts. J. Vis. Exp. (159), e61404, doi:10.3791/61404 (2020).

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