Summary
Burada, dev bir ankyrin-G'nin yokluğu nedeniyle önceden monte edilmiş AIS'den yoksun hipokampal nöronların akson başlangıç segmentlerinin (AIS) montajını ve yapısını nicel olarak incelemek için bir protokol tanımladık.
Abstract
Nöronal akson başlangıç segmentleri (AIS) eylem potansiyellerinin başlangıç alanlarıdır ve moleküler yapıları, montajları ve aktiviteye bağımlı plastisiteleri için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. AIS'nin ana organizatörü dev ankyrin-G, membran yayılan voltaj kapılı sodyum (VSVG) ve potasyum kanalları (KCNQ2/3) ve L1CAM hücre yapışma molekülü olan 186 kDa nörofassin ile doğrudan ilişkilidir. Dev ankyrin-G ayrıca beta-4-spectrin ve mikrotübül bağlayıcı proteinler, EB1/EB3 ve Ndel1 dahil olmak üzere sitoplazmik AIS moleküllerine bağlanır ve işe alınır. Dev ankyrin-G, ankyrin-G eksik nöronlarda AIS oluşumunu kurtarmak için yeterlidir. Ankyrin-G ayrıca AIS yerine dendritik dikenlerde bulunan ve AIS'yi hedef alama veya ais'yi ankyrin-G eksikliği olan nöronlarda kurtaramayan daha küçük bir 190 kDa izoform içerir. Burada, Cre-BFP ile enfekte olduğunda tüm ankyrin-G izoformunun kaybını sergileyen ve AIS oluşumunu bozan ANK3-E22/23-flox farelerden kültürlü hipokampal nöronları kullanan bir protokol tanımladık. Modifiye banker glia/nöron ortak kültür sistemini birleştirerek, AIS oluşumunu kurtarmak için yeterli olan 480 kDa ankyrin-G-GFP plazmid ile ankyrin-G null nöronları transfect etmek için bir yöntem geliştirdik. Ayrıca, Hipokampal nöron kültürlerinde meydana gelen nöronal hücre cisimlerinden AIS uzaklığındaki varyasyonla başa çıkmak için Salzer ve meslektaşlarımız tarafından geliştirilen bir niceleme yöntemi de kullanmaktadır. Bu protokol, de novo montajının nicel çalışmalarına ve AIS'nin dinamik davranışına izin verir.
Introduction
Akson başlangıç segmenti çoğu omurgalı nöronda proksimal aksonda bulunur. İşlevsel olarak, AIS, bu bölgedeki voltaj kapılı sodyum kanallarının yüksek yoğunluğu nedeniyle eylem potansiyellerinin başlatıldığı yerdir. Bazı uyarıcı nöronların AIS'si de GABAergic sinapsları1,2,3oluşturarak inhibitör internöronlar tarafından hedeflenir. Bu nedenle, AIS hücre sinyallerini entegre etmek ve nöronların heyecanlanabilirliğini modüle etmek için kritik bir sitedir. AIS normalde 20-60 μm uzunluğundadır ve hücre gövdesinin 20 μm içinde bulunur. AIS'nin uzunluğu ve konumu beyin bölgelerindeki nöronlarda ve aynı nöronun farklı gelişim aşamalarında değişir4,5. Birikmiş kanıtlar, AIS'nin bileşiminin ve konumunun nöronal aktivitenin değişimine yanıt vermede dinamik olduğunu öne sürdü4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G, AIS'nin ana organizatörüdür. 480 kDa ankyrin-G, voltaj kapılı sodyum kanallarına ve beta4-spectrin dahil olmak üzere diğer büyük AIS proteinlerine doğrudan bağlanan membran ilişkili bir adaptör proteinidir, Sodyum kanal aktivitesi 8,9ve186kDa nörofascin modüle eden KCNQ2/3 kanalları, GABAergic sinapsları AIS 2,10'ayönlendiren bir L1CAM . 480 kDa ankyrin-G, kısa 190 kDa ankyrin-G izoformunda bulunan kanonik ankyrin etki alanlarını paylaşır (ANK tekrarları, spectrin bağlama etki alanı, düzenleyici alan adı), ancak sadece omurgalılarda bulunan ve özellikle nöronlarda ifade edilen dev bir ekson ile ayırt edilir (Şekil 1A)11,12. AIS oluşumu için 480 kDa ankyrin-G nöron spesifik etki alanı (NSD) gereklidir12. 190 kDa ankyrin-G, AIS montajını desteklemez veya ankyrin-G-null nöronlarda AIS'i hedeflemez12. Bununla birlikte, 190 kDa ankyrin-G, 480 kDa ankyrin-G12içeren AIS'de yoğunlaşmıştır. 190 kDa ankyrin-G'nin wildtype nöronların önceden monte edilmiş AIS'lerini hedefleme yeteneği literatürde bir karışıklık kaynağı olmuştur ve AIS montajındaki 480 kDa ankyrin-G'nin kritik özel işlevlerinin takdirini yavaşlatmıştır. Bu nedenle, önceden monte edilmiş bir AIS'den yoksun ankyrin-G-null nöronlarda AIS derlemesinin incelenmesi kritik öneme sahiptir.
Burada, ankyrin-G13'ün tüm izoformlarını ortadan kaldıran ANK3-E22/23-flox farelerden kültürlü hipokampal nöronlar kullanarak AIS'nin montajını ve yapısını incelemek için bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1B). AIS toplanmadan önce nöronları Cre-BFP yapısı ile transfekte ederek, tamamen AIS'den yoksun ankyrin-G eksikliği olan nöronlar ürettik (Şekil 1B, Şekil 2). AIS montajı, 480 kDa ankyrin-GFP plazmidinin Cre-BFP plazmid ile birlikte transfeksiyonu sonrasında tamamen kurtarılır. Bu yöntem, önceden monte edilmemiş bir AIS ortamında AIS derlemesini incelemek için bir yol sağlar. Ayrıca, daha önce embriyonik gün 18 nöronları için tasarlanmış antibiyotik kullanmadan Gary Banker'den glia-nöron ortak kültür sistemini, doğum sonrası fare nöronlarına uygulama için değiştirdik ve AIS14,15varyasyonunu normalleştirmek için birden fazla nörondan ortalama AIS ölçümlerine bir AIS nicelasyon yöntemi uyarladık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Doğum sonrası 0 günlük ANK3-E22/23f/f farelerden hipokampal nöronların bu kültür yöntemi Gary Banker'ın glia/nöron ortak kültür sisteminden uyarlanmıştır. Bu nedenle, sterilize edilmiş aletler kullanarak temiz bir başlıkta diseksiyondan sonra tüm adımların gerçekleştirilmesi önemlidir. Bu protokol 1 aya kadar sürer. İş akışı Şekil 3'te görüntülenir. Protokol Duke Üniversitesi'nin hayvan kurallarına uyuyor.
1. Kapak ve nöronal kaplama yemeklerinin hazırlanması
- Kültür gününden en az bir hafta önce, kapak kapaklarını kapak rafı üzerine yükleyin ve gece boyunca nitrik aside (% 70 W / W) batırın (günlerce uzatılabilir).
- Nitrik asitle işlenmiş kapak örtülerini damıtılmış suyla, her biri 1 saat olmak üzere 2 kez bir cam kavanozda düşük hızlı bir çalkalayıcıda yıkayın.
- Doymuş KOH'daki inkübatif kapaklar bir gecede% 100 etanolde çözülür. Koh'u artık çözünene kadar etanol içine ekleyin.
- Yıkama adımını damıtılmış suyla tekrarlayın. Kapak örtülerini 10 dakika boyunca bir kez% 100 etanol ile durulayın.
- Kapakları raftan cam bir behere aktarın. Beheri alüminyum folyo ile örtün. Kapakları sterilize etmek için gece boyunca 225 °C fırında coverlips pişirin. (Kapaklar haftalarca beherde saklanabilir).
- Kapakları bir Petri kabına yerleştirin ve ardından ayak görevi görmek için kapak kılıfı üzerine 3-4 balmumu noktası uygulayın. Cam şişede haşlanmış balmumuna daldırmak için pasteur pipet kullanın. Ardından bir nokta oluşturmak için kapak kılıfı'na hızlı bir şekilde dokunun. 60 mm Petri kabı 4 kapak kılıfı tutabilir. 10 mm Petri kabı ~ 10 kapak kılıfı tutabilir.
- Kültür gününden 2 gün önce, 0,1 M borik asitte (pH 8,5) 1 mg/mL poli-L lizini sterilize edilmiş filtreli palto örtüleri (balmumu noktaları ile yan) en az 6 saat boyunca ve her seferinde 2 kez, 1 saat su ile durulayın. Kapaklar aynı Petri kabında kalır.
- Kaplama ortamını (MEM glikoz ile desteklenmiş MEM% 0.6 (wt / vol) ve% 10 (vol / vol) at serumu) rahatsız edici kapaklar olmadan yavaşça plakalara ekleyin. Nöronları tohumlamak için kültür gününe kadar inkübatöre plaka koyun.
2. Glia hücre besleyici yemeklerinin hazırlanması (kültür gününden 2 hafta önce)
- Korteksi doğum sonrası 1 günlük fare beyninden parçalara ayrıştırın ve menenjitleri soyun.
- Korteks dokusunu temiz bir bankta temiz bir Petri kabında temiz bir makasla mümkün olduğunca ince doğrayın.
- Doğranmış dokuyu 12 mL HBSS'ye aktarın ve %2,5 tripsin ve %1 (wt/vol) DNase'nin 1,5 mL'sini ekleyin. 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatır, her 5 dakikada bir sallan. İyi sindirilmiş doku yapışkan hale gelir ve büyük bir küme oluşturur. Dokuyu parçalamak ve daha iyi sindirim elde etmek için 10 mL pipetle 10-15 kez tritüre edin.
- İyi sindirilmiş dokuyu 5 mL pipetle 10-15 kez tritüre edin, ta ki çoğu parça kaybolana ve ortası bulanıklaşana kadar. Kalan parçaları çıkarmak için bir hücre süzgecinden geçirin ve sindirimi durdurmak için glikoz (%0,6 wt/vol), %10 (vol/vol) at serumu ve Penisilin-Streptomisin (1x) ile desteklenmiş 15 mL glia ortamı (Minimum esansiyel ortam (MEM) ekleyin.
- Hücreleri 120 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. Hücre peletini taze glia ortamı ve hücre kültürü yemeklerinde tohumla yeniden depola (yaklaşık 105 hücre /cm2).
- Eklenmemiş hücreleri çıkarmak için ertesi gün ortamı taze glia ortamıyla değiştirin.
- Glia yemeklerini her 3-4 günde bir taze glia ortamı ile besleyin. Ortamı değiştirmeden önce gevşek bağlı hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi bir el ile 5-10 kez tokatlayın.
- 10 günlük kültürden sonra, glia hücreleri neredeyse bir araya gelmeli. Glia hücrelerini% 0.25 tripsin-EDTA ile ayır ve yeni bir 60 mm hücre kültürü çanağı içinde yaklaşık 105 hücre tohumlayın. Kalan hücreler ileride kullanılmak üzere dondurulabilir.
- Kültür gününden 3 gün önce, glia ortamını nöronal kültür ortamına değiştirin (1x GlutaMAX-I ve 1x B27 takviyesi ile Neurobasal-A Medium).
3. Kültür hipokampal nöronlar
NOT: Tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- 6-8 hipokampiyi ANK3-E22/23f farelerden doğum sonrası 1 günlük yavrulardan oda ılıman bir Petri kabında HBSS ortamı ile parçalara ayırt edin. Hipokampiyi diseksiyon makasıyla daha küçük parçalara bölün. Hipokampiyi Petri kabından 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Hipokampi 2x'i tüpte 5 mL HBSS ile yıkayın. Hipokampiyi yıkadıktan sonra 4,5 mL 1x HBSS'de bırakın.
- 4,5 mL HBSS'ye %2,5 trypsin 0,5 mL ekleyin ve 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü her 5 dakikada bir ters çevirin. İyi sindirilmiş hipokampi yapışkan hale gelmeli ve bir küme oluşturmalıdır. Gerekirse, sindirimi 5 dakika daha uzatın.
- Hipokampiyi HBSS ile 3 kez 5'er dakika yıkayın. HBSS'yi çıkarmak için vakum kullanmayın. Hipokampiyi çıkarmak çok kolaydır.
- Yıkadıktan sonra 2 mL HBSS ekleyin ve hipokampiyi 15 kez Pasteur pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Dokuyu ateş cilalı bir Pasteur pipetle (açık çapı yarı yarıya daralır) 10 kez üçe bölün. Hala kalan parçalar olsa bile 10 kezden fazla gitmeyin. Aşırı kulak misafiri nöronları öldürür.
- Tüm parçalar tabana ayarlanana kadar tüpü 5 dakika dinlendirin. Ayrışmış nöronları içeren süpernatantı kaplama yemeklerine (10 5 hücre/60 mm çanak) aktarmak için hafifçe1 mL pipet ucu kullanın. Doğrudan önceden inkübe edilmiş kaplama ortamına ekleyin ve plakayı hafifçe sallayın.
- Parçaların çoğu kaybolana kadar kalan parçalarla 3.6-3.7 adımını yineleyin.
- Tohumlamadan 2-4 saat sonra, kaplama yemeklerini hafif bir mikroskopla kontrol edin. Nöronların çoğu kapak kılıflarına bağlı olmalıydı. Bağlı hücreler yuvarlak ve parlaktır. Balmumu noktaları tarafı aşağı bakacak şekilde ön koşulsuz nöronal kültür ortamına sahip glia hücre besleyici yemeklerine ince bir uçlu önseçimler kullanarak kapakları çevirin.
- Nöronlar glia hücre besleyici yemeklerinde 1 aya kadar büyüyebilir. Nöronları 7 günde bir 1 mL taze nöron kültürü ortamı ile besleyin.
- İsteğe bağlı adım: Tohumlamadan 1 hafta sonra, glial çoğalmasını önlemek için 5 μM'lik son konsantrasyona sitozin arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) ekleyin.
4. Nöron gelişiminin erken aşamasında Ankyrin-G'nin Nakavtı ile AIS'nin Bozulması
- 3 div (gün in vitro),bir glia hücre besleyici kabına bakan balmumu noktaları tarafı ile kapakları koşullandırılmış nöronal kültür ortamı ile çevirin.
- 4 kapaklıyı (~ 2:1 DNA kopya numarası oranı) transfect etmek için 1,7 mL tüpte 0,25 μg Cre-BFP DNA'sını 0,5 μg ankyrin-G-GFP (WT/mutant) DNA ile karıştırın. 100 μL kültür ortamı ekleyin (örneğin, Opti-MEM), karıştırın ve bir rafa dinlendirin. Sadece Cre-BFP transktrise, GFP plazmid omurgası toplam DNA miktarıyla eşleşmek için kullanılır.
- Yeni bir 1,7 mL tüpte 3 μL transfeksiyon reaktifini (örneğin Lipofectamine 2000) (~ 3 kez DNA) 100 μL kültür ortamı ile karıştırın. RT'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
- 4.2. adımdan 100 μL DNA çözeltisi ile 4.3. Bir rafta 5-10 dakika dinlendirin.
- Kapağın ucuna dokunmadan ortamın hemen altına yerleştirerek her kapak kapağının tam üstüne 4,4 adımdan 50 μL DNA karışımı ekleyin. DNA karışımının yayılmasını önlemek için pipet yavaşça.
- Yemeği yavaşça inkübatöre geri getirin ve 30-45 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kapakları, balmumu noktaları tarafı aşağı bakacak şekilde ev glia besleyici kabına geri çevirin ve plakayı inkübatöre geri koyun.
5. Akson başlangıç segmentinin nicelleştirilmesi
- Nöronları 7-10 div'e sabitleyin ve ilginç protein için standart immünostokimya protokolünü izleyerek AIS işaretleyici ile lekeleyin.
- İstediğiniz mikroskopi ile floresan resimleri toplayın.
- Tüm AIS'nin sinyalini toplamak için Z serisi bölümler alın. Tüm resimler için aynı Z derinliğini koruyun.
- En iyi piksel yoğunluğu dinamik aralığına ulaşmak için lazer yoğunluğunu ayarlayın.
- Tüm AIS resimlerinin aynı mikroskop kurulumunda çekildiğinden emin olun.
- Her zaman Cre-BFP'nin sinyalini kontrol edin.
- AIS nicelemesi
- Fiji (https://fiji.sc) ile resmi açın.
- Z serisi görüntülerin maksimum projeksiyonu oluşturun.
- Görüntüden boş kapak altlık arka plan sinyalini çıkarın.
- AIS boyunca bir çizgi çizin. Hattın genişliği AIS'i tamamen kapsamalıdır. AIS sinyali arka planın üzerine çıkmadan önce satırı başlatın ve arka plana düştükten sonra durun.
- Ortalama piksel yoğunluğunu tek başına çizgi olarak ölçün ve bir elektronik tabloya dışa aktarın (~10-15 AIS gereklidir).
- Berger ve ark.15'ten uyarlanan MATLAB komut dosyasını kullanarak AIS'nin ortalama yoğunluk eğrisini oluşturun.
- Her deney için, AIS'nin nakavtının verimlilik ve kurtarmanın başarılı olduğundan emin olmak için negatif ve pozitif kontroller olarak yalnızca Cre ve Cre artı wildtype 480 kDa ankyrin-G transfected nöronları ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tam bir deney seti, negatif kontrol olarak cre-BFP sadece transfection, pozitif kontrol olarak Cre-BFP artı 480 kDa ankyrin-G ko-transfection ve teknik kontrol olarak transktaklı olmayan bir durumu içermelidir. Cre-BFP'de sadece kontrol, transfected nöronlar ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), nörofassin (Nf) ve voltaj kapılı sodyum kanalları (VSVG) dahil olmak üzere AIS belirteçlerinin birikmesinden yoksundur (Şekil 4A)16. Buna karşılık, Cre ve 480 kDa ankyrin-G ko-transfected nöronlar, AIS belirteçlerinin bugünüyle ortaya çıkan AIS'yi tamamen bir araya getirmişlerdir (Şekil 4B). Transfected olmayan yemekler ile karşılaştırarak kültürün kalitesini teyit etmek önemlidir. Sağlıksız nöronlar, durdurulmuş veya ektopik AIS (Şekil 4C)gibi anormal AIS yapısı gösterme eğilimindedir.
Daha sonra bir ankyrin-G insan nörogelişimsel bozukluk mutasyonunun (ankG-K2864N) AIS montajını nasıl etkilediğini değerlendirmenin bir örneğini gösterdik (Şekil 5). 3 div ANK3-E22/23f/f nöronları Cre-BFP ve wildtype 480 kDa ankyrin-G (ankG-WT) veya 480 kDa ankyrin-G baring insan mutasyonu (ankG-K2864) ile transk enfeksiyon kaptı. Nöronlar div7'de sabitlendi ve ankyrin-G için lekelendi. Görüntüler aynı kapaklarda 10-15 transkromanyak nörondan ve 10-15 kontrol nörondan toplanarak maksimum yoğunluk projeksiyonu ile işlendi. Daha sonra gösterildiği gibi AIS'de bir çizgi çizeriz ve çizgi boyunca ortalama yoğunluğu ölçeriz. AIS yoğunluğunu ortalama aldıktan sonra, AIS yoğunluğunu somadan distal aksona kadar çiziyoruz. AIS zenginleştirilmiş protein normalde proksimal aksondan gelen sinyalde hızlı bir artış ve distal aksona sinyalin yavaş bir şekilde azaldığını gösterdi. Ankyrin-G tarafından insan mutant ile birleştirilen AIS, sinyalde bir artış ve azalma gösterdi. Ancak transfected olmayan AIS ile hizalandığında, mutant eğri daha geniştir ve eğrinin zirvesi daha düşüktür ve AIS'nin yapı değişikliğini önerir. Vahşi tip ankyrin-G, AIS'i transfected olmayanla yakından hizalanmış olarak bir araya getirmiş.
Şekil 1: ANK3-E22/23-flox'un genomik düzenlemesi. (A) 3 ankyrin-G izoformu için protein etki alanlarının şematik gösterimi. Standart etki alanındaki exon 22 ve 23 kodlanmış bölgelerin konumu çizgi çizgisi tarafından işaret edilir. (B) LoxP sitelerinin ANK3-E22/23-flox farelerdeki konumu üçgen ile gösterilir. Cre rekombinazının günümüzde, ekson 22 ve 23 silinir ve 3 ankyrin-G izoformunun da ekspresyonunun kaybına neden olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cre rekombinazında ANK3-E22/23-flox nöronlarında AIS kaybı. Bir diyagram, ankyrin-G ekspresyonunun ve AIS tertibatının vahşi tip nöronlarda ank3-E22/23f/f nöronlarına karşı 3 div'de Cre transfection ile zaman dilimini gösterir.
Şekil 3: İletişim kuralı iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Cre ile transfected ANK3 -E22/23-flox nöronlarda AIS'nin 480kDa AnkGtarafından tam olarak kurtarılması. ANK3-E22/23f/f farelerinin 3 div nöronları Cre-BFP (A) veya Cre-BFP ve vahşi tip 480 kDa ankyrin-G-GFP (B)ile trans enfekte edildi. Nöronlar 7 div'de sabitlendi ve ankyrin-G (ankG), β4-spektrin (β4), nörofassin (Nf) ve voltaj kapılı sodyum kanalları (VSVG) için lekelendi. Beyaz ok kafası transfected nöronun AIS'sine işaret eder. Ölçek çubuğu 20 μm'dir. Bu rakam Yang veark. (C) TdTM ve 480 kDa ankyrin-G-GFP ile trans enfekte iki sağlıksız nöron gösterildi. Agregaların oluşumu (beyaz ve genişlemiş) sağlıksız nöronların bir işaretidir. Üst: 480 kDa ankyrin-G, AIS olmayan bölgede (beyaz ok başlıklarıyla işaret edilen) ortaya çıkıyor. Alt: Nöron soma üzerinde 3 AIS ve ektopik ankyrin-G birikimi oluşturdu. Ölçek çubuğu 20 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: AIS yapısal değişiminin nicelemesi. ANK3-E22/23f/f farelerinin div3 nöronları Cre-BFP ve vahşi tip 480 kDa ankyrin-G veya 480 kDa ankyrin-G-K2864N ile trans enfekte edildi. 7 div'de nöronlar sabitlendi ve ankyrin-G için lekelendi. Temsili görüntüler AIS'deki ankyrin-G sinyalini gösteriyor. Yeşil çizgi ve sarı çizgi, AIS yoğunluk ölçümü için çizginin nereye çizdiğini gösterir. Beyaz çizgi çizgisi transfected nöronun hücre gövdesini daire içine aldı. Ölçek çubuğu 20 μm'dir. Her iki durum için ortalama AIS yoğunluğu tek başına çizilir ve transfected olmayan hücrelerle hizalanır (n=10). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AIS montajı 480 kDa ankyrin-G tarafından düzenleniyor. Bununla birlikte, ankyrin-G, wildtype nöronların AIS'sine hedefleyebilen daha kısa izoformlara sahiptir ve bu da AIS montajının yapı-fonksiyon analizlerinin yorumlanmasında zorluk çekebilir. Burada, AIS'nin de novo montajının incelenmesine izin veren ANK3-E22/23-flox farelerden nöronları kullanarak bir yöntem sunuyoruz. Cre-BFP ile 3 div'de transfecting yaparak, ankyrin-G'nin tüm endojen izoformlarını ortadan kaldırırız. Ayrıca AIS oluşumunu kurtarmak için 480 kDa ankyrin-G'yi birlikte transfect edebiliriz. Bu, temiz bir sistemde AIS oluşumunun incelenmesini sağlar. Glial hücre aşırı büyümesinin komplikasyonları olmadan canlılığı artıran Banker kültür sistemini daha da benimseyerek, AIS boyutlarının nicel ölçümü için yeterli nöron sağlayan yüksek bir transeksiyon verimliliğine ulaşabiliriz.
Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk kritik adım, AIS'nin montajını önlemek için yeterince erken ve en yüksek transfeksiyon verimliliğine ulaşmak için yeterince geç olması gereken transfeksiyon yapmak için en iyi zaman penceresini düşünmektir. Sadece Cre-BFP ile yaklaşık% 10 transfeksiyon verimliliği veren 0 div elektroporasyon transfeksiyonunu denedik, ancak 0 div'de 480 kDa Ankyrin-G'yi asla transfect edemedik. Plazmid'in büyük boyutundan (yaklaşık 20 kb) kaynaklandığından şüpheleniyoruz. Birincil kültürlü hipokampal nöronlar, 3-5 gün arasında olan transfeksiyon için dar bir pencereye sahiptir. AIS'de ankyrin-G birikimi 3 div'den başlar. Cre-BFP'yi 3 div'de transfect ettiğimizde transkro enfekte nöronlarda AIS oluşumu görülmedi(Şekil 4A). 18 mm'lik bir kapakçıktan 480 kDa ankyrin-G ile 10-20 nöron transkte olabilir. Ayrıca, ko-transfection kurtarma deneyi için, tüm DNA aynı promotör altında oluşturulmalı ve Cre-BFP ve 480 kDa ankyrin-G-GFP oranı eşleştirilmelidir. Bu deneyde tavuk beta-actin promotörü kullandık.
Bir diğer kritik adım da Banker kültüründe yapılan değişikliktir. Banker kültürü embriyonik sıçan nöronlarını kült etmek için geliştirilmiştir. Daha hassas fare postnatal hipokampal nöronunu daha iyi desteklemek için, tripizasyon verimliliğini artırmak için hipokampiyi daha küçük parçalara ayırma adımını dahil ediyoruz. Nitrik asit tedavisinden sonra KOH tedavisi eklemek, nöronların daha iyi bağlanmasına ve büyümesine yardımcı olan cam kapaklardan toksisiteyi daha da azalttı.
Kalan bir zorluk, ankyrin-G'nin ifade seviyesinin nasıl kontrol edilir. Dozajlı bir ekran, transfection için kullanılan en uygun plazmid miktarını belirlemeye yardımcı oldu. İleride, ifade seviyesini kontrol etmek için nörona özgü bir promotör kullanmak daha iyidir. Mevcut veri analizi AIS'nin konumunu ölçmedi. Bu işlev gelecekte dahil edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Nöronal kültür protokolü önerisi için Dr. Gary Banker'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü, NIH'den bir hibe ve George Barth Geller tarafından profesörlük (V.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G.
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
