Summary
هنا، وصفنا بروتوكول لدراسة كميا تجميع وهيكل الأجزاء الأولية محور عصبي (AIS) من الخلايا العصبية فرس النهر التي تفتقر إلى AIS تجميعها مسبقا بسبب عدم وجود عملاقة أنكيرين-G.
Abstract
الأجزاء الأولية المحورية العصبية (AIS) هي مواقع لبدء إمكانات العمل وقد تمت دراستها على نطاق واسع لهيكلها الجزيئي وتجميعها ولدونتها المعتمدة على النشاط. العملاقة ankyrin-G، المنظم الرئيسي لل AIS، يرتبط مباشرة مع غشاء تمتد الجهد الصوديوم مسور (VSVG) وقنوات البوتاسيوم (KCNQ2/3)، فضلا عن 186 kDa neurofascin، جزيء الالتصاق الخلية L1CAM. العملاقة ankyrin-G يربط أيضا إلى ويجند جزيئات AIS السيتوبلازمية بما في ذلك بيتا-4-سبيكترين, والبروتينات microtubule ملزمة, EB1/EB3 و Ndel1. العملاقة ankyrin-G كافية لانقاذ تشكيل AIS في الخلايا العصبية نقص ankyrin-G. Ankyrin-G يشمل أيضا أصغر 190 kDa isoform تقع في العمود الفقري dendritic بدلا من AIS, التي هي غير قادرة على استهداف AIS أو إنقاذ AIS في الخلايا العصبية أنكيرين-G-ناقصة. هنا، وصفنا بروتوكول باستخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة من ANK3-E22/23-flox الفئران، والتي، عندما transfected مع فقدان المعرض Cre-BFP من جميع isoform من الأنكيرين-G وإضعاف تشكيل AIS. الجمع بين تعديل بانكر غليا / الخلايا العصبية نظام الثقافة المشتركة، وضعنا طريقة لtransfect ankyrin-G الخلايا العصبية فارغة مع 480 kDa ankyrin-G-GFP البلازميد، وهو ما يكفي لإنقاذ تشكيل AIS. نحن نستخدم أيضا طريقة القياس الكمي، التي وضعتها سالزر وزملاؤه للتعامل مع الاختلاف في مسافة AIS من أجسام الخلايا العصبية التي تحدث في ثقافات الخلايا العصبية فرس النهر. يسمح هذا البروتوكول بإجراء دراسات كمية لتجميع دي نوفو والسلوك الديناميكي ل AIS.
Introduction
يقع الجزء الأولي من المحور عند المحور القريب في معظم الخلايا العصبية الفقارية. من الناحية الوظيفية ، AIS هو المكان الذي يتم فيه بدء إمكانات العمل بسبب الكثافة العالية لقنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد في هذه المنطقة. AIS من بعض الخلايا العصبية مثيرة وتستهدف أيضا من قبل interneurons المثبطة من خلال تشكيل نقاط الاشتباك العصبي GABAergic1,2,3. لذلك ، AIS هو موقع حاسم لدمج إشارات الخلايا وتعديل استثارة الخلايا العصبية. AIS هو عادة 20-60 ميكرومتر في الطول وتقع ضمن 20 ميكرومتر من جسم الخلية. طول وموقف AIS يختلف في الخلايا العصبية عبر مناطق الدماغ, وكذلك في مراحل النمو المختلفة من نفس الخلايا العصبية4,5. وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن تكوين وموقع AIS ديناميكية في الاستجابة لتغير نشاط الخلايا العصبية4و5و6و7.
480 kDa ankyrin-G هو المنظم الرئيسي ل AIS. 480 kDa ankyrin-G هو بروتين محول مرتبط بالغشاء يرتبط مباشرة بقنوات الصوديوم المسورة بالجهد وكذلك بروتينات AIS الرئيسية الأخرى بما في ذلك beta4-spectrin و KCNQ2/3 القنوات التي تعدل نشاط قناة الصوديوم8و9و 186 kDa neurofascin ، وهو L1CAM يوجه نقاط الاشتباك العصبي GABAergic إلى AIS2،10. 480 kDa ankyrin-G أسهم المجالات الكنسي ankyrin وجدت في قصيرة 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK يكرر, المجال ملزمة spectrin, المجال التنظيمي), ولكن تتميز exon العملاقة التي توجد فقط في الفقاريات ويتم التعبير عنها على وجه التحديد في الخلايا العصبية (الشكل 1A)11,12. ال 480 kDa ankyrin-G مجال الخلايا العصبية محددة (NSD) مطلوب لتشكيل AIS12. و190 kDa ankyrin-G لا يعزز AIS التجمع أو الهدف AIS في الخلايا العصبية ankyrin-G-null12. ومع ذلك، 190 كدا ankyrin-G يتركز في AIS تحتوي على 480 kDa ankyrin-G12. هذه القدرة من 190 kDa ankyrin-G لاستهداف AIS تجميعها مسبقا من الخلايا العصبية البرية كان مصدرا للارتباك في الأدب وأبطأت تقدير الوظائف المتخصصة الحرجة من 480 kDa ankyrin-G في جمعية AIS. لذلك، فمن الأهمية بمكان لدراسة الجمعية AIS في الخلايا العصبية ankyrin-G-null التي تفتقر إلى AIS تجميعها مسبقا.
هنا، نقدم طريقة لدراسة تجميع وهيكل AIS باستخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة من ANK3-E22/23-flox الفئران التي تقضي على جميع isoforms من ankyrin-G13 (الشكل 1B). عن طريق تحويل الخلايا العصبية مع بناء Cre-BFP قبل أن يتم تجميع AIS، قمنا بتوليد الخلايا العصبية ankyrin-G-ناقص تفتقر تماما إلى AIS (الشكل 1B، الشكل 2). يتم إنقاذ تجميع AIS بالكامل بعد المشاركة في إعادة العدوى من 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid مع بلازميد Cre-BFP. يوفر هذا الأسلوب طريقة لدراسة تجميع AIS في بيئة AIS غير تجميعها مسبقا. كما قمنا بتعديل نظام الثقافة المشتركة بين الخلايا العصبية من غاري بانكر دون استخدام المضادات الحيوية ، المصممة سابقا للخلايا العصبية الجنينية في اليوم 18 ، لتطبيقها على الخلايا العصبية الماوس بعد الولادة وتكييفها طريقة كمية AIS لمتوسط قياسات AIS من الخلايا العصبية المتعددة لتطبيع الاختلاف من AIS14،15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم تكييف هذه الطريقة ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر من بعد الولادة 0-يوم ANK3-E22/23و / و الفئران من غاري بانكر في غليا / الخلايا العصبية نظام الثقافة المشتركة. لذلك، من المهم جدا تنفيذ جميع الخطوات بعد تشريح غطاء محرك السيارة باستخدام أدوات معقمة. يستغرق هذا البروتوكول شهرا. يتم عرض سير العمل في الشكل 3. يتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية الحيوانية لجامعة ديوك.
1. إعداد الأغطية وأطباق الطلاء العصبي
- قبل أسبوع واحد على الأقل من يوم الثقافة ، يغطي الحمل على رف الغطاء ونقعه في حمض النيتريك (70٪ W / W) بين عشية وضحاها (يمكن تمديده لأيام).
- غسل حمض النيتريك يعالج coverlips مع الماء المقطر على شاكر سرعة منخفضة في جرة زجاجية 2 مرات، 1 ساعة لكل منهما.
- احتضان الأغطية في KOH المشبعة الذائبة في الإيثانول 100٪ بين عشية وضحاها. أضف KOH إلى الإيثانول حتى لا يذوب.
- كرر خطوة الغسيل بالماء المقطر. شطف الأغطية مع الإيثانول 100٪ مرة واحدة لمدة 10 دقائق.
- نقل الأغطية من الرف إلى كوب زجاجي. تغطية الكأس مع رقائق الألومنيوم. خبز الأغطية في فرن 225 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتعقيم الأغطية. (Coverslips يمكن تخزينها في الكأس لأسابيع).
- وضع coverlips في طبق بيتري ومن ثم تطبيق 3-4 نقاط الشمع على coverslip لتكون بمثابة القدمين. استخدام ماصة باستور لتراجع في الشمع المسلوق في زجاجة. ثم المس الغطاء بسرعة لإنشاء نقطة. طبق بيتري 60 ملم يمكن أن تعقد 4 coverlips. طبق بيتري 10 ملم يمكن أن تعقد ~ 10 coverlips.
- قبل يومين من يوم الثقافة، يغطي معطفا (الجانب مع نقاط الشمع) مع مرشح معقم 1 ملغم/ مل بولي-L-ليسين في 0.1 M حمض البوريك (درجة الحموضة 8.5) لمدة لا تقل عن 6 ساعات وشطف بالماء 2 مرات، 1 ساعة في كل مرة. لا تزال الأغطية في نفس طبق بيتري.
- إضافة الطلاء المتوسط (MEM تستكمل مع الجلوكوز 0.6٪ (wt/vol) و 10٪ (فول / فول) مصل الحصان) إلى لوحات ببطء دون coverlips المزعجة. وضع لوحات في الحاضنة حتى يوم الثقافة لزرع الخلايا العصبية.
2. إعداد أطباق التغذية بالخلايا غليا (2 أسابيع قبل يوم الثقافة)
- تشريح القشرة من الدماغ الفئران بعد الولادة 1 يوم من العمر وقشر قبالة السحايا.
- فرم الأنسجة القشرة ناعما قدر الإمكان مع مقص نظيفة في طبق بيتري نظيفة في مقعد نظيف.
- نقل الأنسجة المفرومة إلى 12 مل من HBSS وإضافة 1.5 مل من 2.5٪ تريبسين و 1٪ (wt/vol) DNase. احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، سوينغ كل 5 دقائق. هضم الأنسجة جيدا تصبح لزجة وتشكل كتلة كبيرة. تريتورات 10-15 مرات مع ماصة 10 مل لكسر الأنسجة والحصول على أفضل الهضم.
- تريتورات الأنسجة هضمها جيدا 10-15 مرات مع ماصة 5 مل حتى تختفي معظم القطع والمتوسطة يتحول إلى غائم. تمر عبر مصفاة الخلية لإزالة القطع المتبقية وإضافة 15 مل من المتوسط غليا (الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) تكملها الجلوكوز (0.6٪ wt/vol)، 10٪ (فول / فول) مصل الحصان وبينسلين-ستريبتوميسين (1x) لوقف الهضم.
- طرد الخلايا في 120 × ز لمدة 5 دقائق ونسيخ supernatant. Resuspend بيليه الخلية مع المتوسطة جليا الطازجة والبذور في أطباق زراعة الخلية (حوالي 105 خلايا / سم2).
- استبدال المتوسطة مع المتوسطة جليا الطازجة في اليوم التالي لإزالة الخلايا غير المرتبطة.
- إطعام أطباق غليا كل 3-4 أيام مع المتوسطة جليا الطازجة. صفعة قارورة 5-10 مرات مع اليد لطرد الخلايا المرفقة فضفاضة قبل تغيير المتوسطة.
- بعد 10 أيام من الثقافة ، يجب أن تكون خلايا غليا التقاء تقريبا. فصل خلايا غليا مع 0.25٪ تريبسين-EDTA والبذور حوالي 105 خلايا في طبق جديد ثقافة الخلية 60 ملم. ويمكن تجميد الخلايا المتبقية لاستخدامها في المستقبل.
- 3 أيام قبل يوم الثقافة, تغيير المتوسطة غليا إلى الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة (Neurobasal-A المتوسطة مع 1x GlutaMAX-I و 1x B27 الملحق).
3. ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
- تشريح 6-8 فرس النهر من الجراء بعد الولادة 1 يوم من العمر ANK3-E22/23الفئران و / و مع HBSS المتوسطة في طبق بيتري في غرفة المعتدلة. فرم فرس النهر مع مقص تشريح إلى قطع أصغر. نقل فرس النهر من طبق بيتري إلى أنبوب 15 مل.
- غسل فرس النهر 2x مع 5 مل من HBSS في الأنبوب. ترك فرس النهر في 4.5 مل من 1x HBSS بعد الغسيل.
- إضافة 0.5 مل من 2.5٪ تريبسين إلى 4.5 مل من HBSS واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. عكس الأنبوب كل 5 دقائق. وينبغي أن تصبح فرس النهر هضمها جيدا لزجة وتشكيل مجموعة. إذا لزم الأمر، قم بتمديد عملية الهضم لمدة 5 دقائق إضافية.
- اغسل فرس النهر مع HBSS 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. لا تستخدم فراغ لإزالة HBSS. فمن السهل جدا لإزالة فرس النهر.
- إضافة 2 مل من HBSS بعد غسل وماصة فرس النهر صعودا وهبوطا مع ماصة باستور 15 مرات.
- تريتورات الأنسجة مع ماصة باستور مصقول النار (يتم تضييق قطر الفتح إلى النصف) 10 مرات. لا تتجاوز 10 مرات حتى لو كان لا يزال هناك قطع المتبقية. الإفراط في العمل يقتل الخلايا العصبية.
- بقية الأنبوب لمدة 5 دقائق حتى جميع القطع تعيين إلى أسفل. استخدم بلطف طرف ماصة 1 مل لنقل النافورة التي تحتوي على الخلايا العصبية المفككة إلى أطباق الطلاء (طبق10 5 خلايا /60 مم). إضافته مباشرة إلى وسيط الطلاء قبل المحتضنة ويهز لوحة بلطف.
- كرر الخطوة 3.6-3.7 مع القطع المتبقية حتى اختفت معظم القطع.
- بعد 2-4 ساعات من البذر، تحقق من أطباق الطلاء بالمجهر الخفيف. غالبية الخلايا العصبية يجب أن تعلق على غطاء. الخلايا المرفقة مستديرة ومشرقة. الوجه coverslips باستخدام ملقط تلميح غرامة إلى الأطباق المغذية للخلية غليا مع المتوسطة ثقافة الخلايا العصبية مسبقا مع الجانب النقاط الشمع التي تواجه إلى أسفل.
- يمكن أن تنمو الخلايا العصبية في الأطباق المغذية للخلايا جليا لمدة تصل إلى 1 شهر. تغذية الخلايا العصبية كل 7 أيام مع 1 مل من الخلايا العصبية الطازجة الثقافة المتوسطة.
- الخطوة الاختيارية: بعد أسبوع واحد من البذر، أضف السيتوسينوزيد السيتوسين (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر للحد من الانتشار الدبقية.
4. تعطيل AIS بالضربة القاضية من Ankyrin-G في مرحلة مبكرة من تطور الخلايا العصبية
- على 3 div (يوم في المختبر)،الوجه coverslips مع الجانب النقاط الشمع التي تواجه ما يصل الى طبق تغذية الخلية جليا مع المتوسطة ثقافة الخلايا العصبية مشروطة.
- مزيج 0.25 ميكروغرام من الحمض النووي كر-BFP مع 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي أنكيرين-G-GFP (WT/mutant) في أنبوب 1.7 مل إلى transfect 4 coverslips (~ 2:1 نسبة رقم نسخة الحمض النووي). أضف 100 ميكرولتر من الوسط الثقافي (على سبيل المثال، Opti-MEM)، واخلطها واستريح على رف. إذا تم تحويل Cre-BFP فقط ، يتم استخدام العمود الفقري ل GFP plasmid لمطابقة الكمية الإجمالية للحمض النووي.
- مزيج 3 ميكرولتر من كاشف العدوى (على سبيل المثال، Lipofectamine 2000) (~ 3 مرات من الحمض النووي) مع 100 ميكرولتر متوسطة الثقافة في أنبوب جديد 1.7 مل. حضانة لمدة 5 دقائق في RT.
- مزيج 100 ميكرولتر من محلول الحمض النووي من الخطوة 4.2 مع 100 ميكرولتر من كاشف العدوى من الخطوة 4.3. بقية لمدة 5-10 دقائق على رف.
- أضف 50 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي من الخطوة 4.4 مباشرة فوق كل غطاء عن طريق إدخال الطرف أسفل الوسط مباشرة دون لمس الأغطية. ماصة ببطء لتجنب انتشار مزيج الحمض النووي.
- أحضر الطبق ببطء إلى الحاضنة واحتضنه لمدة 30-45 دقيقة.
- الوجه coverlips العودة إلى المنزل طبق التغذية glia مع الجانب نقاط الشمع التي تواجه أسفل ووضع لوحة العودة إلى الحاضنة.
5. تحديد كمي للجزء الأولي من المحور
- إصلاح الخلايا العصبية على 7-10 div وصمة عار مع علامة AIS بعد بروتوكول الكيمياء المناعية القياسية للبروتين مثيرة للاهتمام.
- جمع الصور الفلورية مع المجهر المطلوب.
- خذ أقسام سلسلة Z لجمع إشارة AIS بأكملها. احتفظ بنفس العمق Z لجميع الصور.
- ضبط كثافة الليزر للوصول إلى أفضل نطاق ديناميكي كثافة بكسل.
- تأكد من التقاط جميع صور AIS على إعداد المجهر نفسه.
- تحقق دائما من إشارة Cre-BFP.
- تحديد كمية AIS
- صورة مفتوحة مع فيجي (https://fiji.sc).
- إنشاء أقصى عرض للصور من سلسلة Z.
- طرح إشارة الخلفية coverslip فارغة من الصورة.
- رسم خط على طول AIS. يجب أن يغطي عرض الخط AIS بالكامل. بدء تشغيل الخط قبل رفع إشارة AIS فوق الخلفية وإيقاف بعد أن يسقط إلى الخلفية.
- قياس متوسط كثافة بكسل وحدها الخط والتصدير إلى جدول البيانات (هناك حاجة إلى ~ 10-15 AISs).
- توليد منحنى كثافة متوسط AIS باستخدام السيناريو MATLAB مقتبس منبيرغر وآخرون.
- لكل تجربة، وتشمل كري فقط وكري بالإضافة إلى wildtype 480 kDa ankyrin-G الخلايا العصبية المصابة كضوابط سلبية وإيجابية للتأكد من أن خروج المغلوب من AIS هو الكفاءة والإنقاذ ناجحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وينبغي أن تشمل مجموعة كاملة من التجربة Cre-BFP transfection فقط كتحكم سلبي، Cre-BFP بالإضافة إلى 480 kDa ankyrin-G المشارك transfection كتحكم إيجابي وحالة غير مصابة كتحكم تقني. في التحكم فقط في Cre-BFP ، تفتقر الخلايا العصبية المصابة إلى تراكم علامات AIS ، بما في ذلك ankyrin-G (ankG) وبيتا4-سبيكترين (β4) و neurofascin (Nf) وقنوات الصوديوم المسورة الجهد (VSVG) (الشكل 4A)16. في المقابل، كري و 480 kDa ankyrin-G الخلايا العصبية المشتركة المصابة قد جمعت تماما AIS كشفت عن وجود علامات AIS (الشكل 4B). من المهم التأكد من جودة الثقافة من خلال المقارنة مع الأطباق غير المصابة. الخلايا العصبية غير الصحية تميل إلى إظهار بنية AIS غير طبيعية، مثل توقف أو خارج الرحم AIS (الشكل 4C).
ثم أظهرنا مثالا لتقييم كيفية ankyrin-G الإنسان اضطراب النمائي العصبي طفرة (ankG-K2864N) يؤثر على التجمع AIS (الشكل 5). 3 div ANK3-E22/23 تم تحويل الخلايا العصبيةf/f مع Cre-BFP والنمط البري 480 kDa ankyrin-G (ankG-WT) أو 480 kDa ankyrin-G baring طفرة بشرية (ankG-K2864). تم إصلاح الخلايا العصبية في div7 وملطخة ل ankyrin-G. تم جمع الصور من 10-15 الخلايا العصبية المصابة و10-15 الخلايا العصبية السيطرة على نفس coverslips ومعالجتها مع الإسقاط كثافة قصوى. ثم نرسم خطا عند AIS كما هو موضح و نقيس متوسط الكثافة عبر الخط. بعد متوسط كثافة AIS ، نقوم برسم كثافة AIS من سوما إلى المحور البعيدة. أظهر البروتين المخصب AIS عادة زيادة سريعة في الإشارة من المحور القريب وانخفاض بطيء في الإشارة إلى المحور البعيدة. AIS التي جمعتها ankyrin-G مع متحولة الإنسان أظهرت زيادة وانخفاض إشارة. ولكن عندما تتماشى مع AIS غير المصابة، منحنى متحولة أوسع، وذروة المنحنى هو أقل مما يشير إلى تغيير هيكل AIS. نوع البرية ankyrin-G تجميع AIS محاذاة بشكل وثيق مع واحد غير المصابة.
الشكل 1: التحرير الجينومي ل ANK3-E22/23-flox. (أ) التمثيل التخطيطي لنطاقات البروتين ل 3 أشكال متساوية من أنكيرين -G. يشير خط الاندفاعة إلى موقع المنطقتين المشفرتين exon 22 و23 في المجال الكنسي. (ب) يشير المثلث إلى موقع مواقع LoxP في فئران ANK3-E22/23-flox. في الحاضر من إعادةcombinase كري، يتم حذف exon 22 و 23 ويسبب فقدان التعبير عن جميع isoforms 3 من ankyrin-G. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: فقدان AIS في ANK3-E22/23-flox الخلايا العصبية في الحاضر من إعادة دمج كري. رسم بياني يظهر الإطار الزمني للتعبير ankyrin-G والتجمع AIS في الخلايا العصبية نوع البرية مقابل في ANK3-E22/23f/f الخلايا العصبية مع العدوى الكر في 3 div. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: سير العمل في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إنقاذ كامل من AIS بواسطة 480kDa AnkG في ANK3-E22/23-flox الخلايا العصبية المصابة مع كري. 3 الخلايا العصبية DIV من ANK3-E22/23 تم تحويل الفئرانf/f مع Cre-BFP (A) أو مع Cre-BFP ونوع البرية 480 kDa ankyrin-G-GFP (B). تم إصلاح الخلايا العصبية في 7 div وملطخة ل Ankyrin-G (ankG) ، β4-spectrin (β4) ، neurofascin (Nf) وقنوات الصوديوم المسورة الجهد (VSVG). يشير رأس السهم الأبيض إلى AIS لخلية عصبية مصابة. شريط المقياس هو 20 ميكرومتر. تم اقتباس هذا الرقم من يانغ وآخرون16. (ج) تم عرض اثنين من الخلايا العصبية غير صحية المصابة مع tdTM و 480 kDa ankyrin-G-GFP. تشكيل المجاميع (دائرة في الأبيض والموسع) هو علامة على الخلايا العصبية غير صحية. أعلى: 480 kDa ankyrin-G يظهر في المنطقة غير AIS (وأشار من قبل رؤساء الأسهم البيضاء. أسفل: شكلت الخلايا العصبية 3 AIS وتراكم خارج الرحم من أنكيرين-G على سوما. شريط المقياس هو 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقدير حجم التغير الهيكلي في معهد الدراسات الإسماعيلية. تم تحويل الخلايا العصبية div3 من ANK3-E22/23f/f الفئران المصابة مع Cre-BFP ونوع البرية 480 kDa ankyrin-G أو 480 kDa ankyrin-G-K2864N. في 7 div، تم إصلاح الخلايا العصبية وملطخة ل ankyrin-G. تظهر الصور التمثيلية إشارة ankyrin-G في AIS. يشير الخط الأخضر والخط الأصفر إلى مكان رسم خط قياس كثافة AIS. خط اندفاعة بيضاء حلقت جسم الخلية من الخلايا العصبية المصابة. شريط المقياس هو 20 ميكرومتر. يتم رسم متوسط كثافة AIS لكلا الشرطين مسافة وحيدة ومحاذاتها مع الخلايا غير المصابة (n = 10). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تنظيم جمعية AIS من قبل 480 kDa ankyrin-G. ومع ذلك، أنكيرين-G لديه isoforms أقصر التي يمكن أن تستهدف AIS من الخلايا العصبية البرية، والتي قد تؤدي إلى صعوبة في تفسير تحليلات هيكل وظيفة التجمع AIS. هنا نقدم طريقة باستخدام الخلايا العصبية من ANK3-E22/23-flox الفئران التي تسمح لدراسة الجمعية دي نوفو من AIS. عن طريق التحويل مع Cre-BFP في 3 div ، نقضي على جميع الأشكال الذاتية من ankyrin-G. يمكننا أيضا المشاركة في العدوى 480 kDa ankyrin-G لإنقاذ تشكيل AIS. وهذا يسمح بدراسة تكوين AIS في نظام نظيف. من خلال اعتماد المزيد من نظام الثقافة المصرفي الذي يحسن الجدوى دون مضاعفات الإفراط في نمو الخلايا الدبقية ، يمكننا الوصول إلى كفاءة عالية في العدوى ، والتي توفر لنا ما يكفي من الخلايا العصبية للقياس الكمي لأبعاد AIS.
هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. الخطوة الحرجة الأولى هي النظر في أفضل نافذة زمنية للقيام transfection ، والتي تحتاج إلى أن تكون في وقت مبكر بما فيه الكفاية لمنع تجميع AIS ومتأخرة بما فيه الكفاية للوصول إلى أعلى كفاءة في العدوى. حاولنا 0 div نقل العدوى الكهربائية، والتي أعطت حوالي 10٪ كفاءة العدوى مع Cre-BFP فقط، ولكن لم نكن قادرين على تحويل 480 kDa Ankyrin-G في 0 div. ونحن نشك في أنه يرجع إلى حجم كبير من البلازميد (حوالي 20 كيلوبايت). الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة الأولية لديها نافذة ضيقة لtransfection، وهو ما بين 3-5 أيام. تراكم ankyrin-G في AIS يبدأ من 3 div. عندما كنا transfect Cre-BFP في 3 div، لم ينظر إلى تشكيل AIS في الخلايا العصبية المصابة(الشكل 4A). يمكننا الحصول على 10-20 الخلايا العصبية المصابة مع 480 kDa ankyrin-G من واحد 18 ملم coverslip. أيضا ، لتجربة الإنقاذ عبر العدوى المشتركة ، يجب إنشاء جميع الحمض النووي تحت نفس المروج ويجب مطابقة نسبة Cre-BFP و 480 kDa ankyrin-G-GFP. في هذه التجربة، استخدمنا الدجاج بيتا أكتين المروج.
خطوة أخرى حاسمة هي تعديل ثقافة المصرفي. تم تطوير ثقافة المصرفي لزراعة الخلايا العصبية الفئران الجنينية. لدعم أفضل للخلية العصبية فرس النهر الماوس أكثر حساسية بعد الولادة, ونحن تشمل خطوة من تقطيع فرس النهر إلى قطع أصغر لتحسين كفاءة المحاولة. إضافة علاج KOH بعد علاج حمض النيتريك مزيد من خفض سمية من الأغطية الزجاجية، والتي تساعد الخلايا العصبية نعلق وتنمو بشكل أفضل.
التحدي المتبقي هو كيفية التحكم في مستوى التعبير من ankyrin-G. ساعدت شاشة الجرعة على تحديد الكمية المثلى من البلازميد المستخدم في العدوى. للمضي قدما، فمن الأفضل استخدام المروج الخلايا العصبية محددة للسيطرة على مستوى التعبير. ولم يقيس تحليل البيانات الحالي موقف معهد الدراسات الإسماعيلية. وينبغي إدراج هذه الوظيفة في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور غاري بانكر على اقتراحه بشأن بروتوكول ثقافة الخلايا العصبية. ويدعم هذا العمل معهد هوارد هيوز الطبي، وهو منحة من المعاهد القومية للصحة، وهبت جورج بارث جيلر الأستاذية (V.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
