Summary
Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem de glóbulos brancos (WBC) através da quantificação dos padrões de metilação de DNA. Este protocolo apresenta um método de reação em cadeia de polimerase de gotícula multiplex (mdPCR) usando um dispositivo microfluido baseado em elastômero termoplástico (TPE) para geração de gotículas permitindo quantificação de alvo específica e multiplex específica da contagem diferencial WBC.
Abstract
Um fluxo de trabalho de gotícula multiplexada PCR (mdPCR) e um protocolo detalhado para determinar a contagem diferencial de células brancas baseadas em epigenética (WBC) são descritos, juntamente com um dispositivo de geração de gotículas microfluida (TPE) termoplástico. Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem WBC que é de importante valor prognóstico em diferentes doenças. Isso é conseguido através da quantificação dos padrões de metilação de DNA de regiões específicas ricas em CG no genoma (CpG loci). Neste artigo, o DNA tratado por bisulfita de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs) é encapsulado em gotículas com reagentes mdPCR, incluindo primers e sondas fluorescentes de hidrólise específicas para loci de CpG que se correlacionam com sub-populações WBC. A abordagem multiplex permite o interrogatório de muitos locis de CpG sem a necessidade de reações mdPCR separadas, permitindo uma determinação paramétrica mais precisa das subsépas WBC usando análise epigenética de locais de metilação. Essa quantificação precisa pode ser estendida a diferentes aplicações e destaca os benefícios para o diagnóstico clínico e prognóstico subsequente.
Introduction
A análise da composição dos glóbulos brancos (WBCs) está entre os exames laboratoriais mais solicitados em diagnósticos hematológicos. A contagem diferencial de leucócitos serve como um indicador para um espectro de doenças, incluindo infecção, inflamação, anemia e leucemia, e está sendo investigada como um biomarcador prognóstico precoce para várias outras condições também. O padrão-ouro na subtipagem WBC envolve a imunostenção e/ou citometria de fluxo, ambos que requerem anticorpos fluorescentes caros e propensos à instabilidade e são muitas vezes altamente dependentes da proficiência do operador na preparação da amostra. Além disso, este método é aplicável apenas a amostras de sangue fresco, de modo que as amostras não podem ser congeladas para embarque ou análise posterior.
Os marcadores epigenéticos surgiram recentemente como poderosas ferramentas analíticas para o estudo de variações fenotípicas. Posteriormente, as populações de leucócitos humanos têm mostrado ter padrões de metilação de DNA de linhagem celular que permitem a caracterização precisa dos subconjuntos WBC. A subtipagem baseada em marcadores epigenéticos fornece uma alternativa promissora que não depende de coleta de amostras de sangue fresco ou anticorpos caros e pode ser explorada como biomarcadora para o aparecimento da doença e suscetibilidade1,,2,3,,4,5.
Estudos em todo o genoma têm sido realizados para mapeamento extensivo de regiões ricas em CG específicas metiladas no genoma (ilhas CpG) em subtipos de leucócitos para identificar marcadores epigenéticos candidatos específicos para subtipos de leucócitos. Os protocolos PCR foram desenvolvidos por essa razão para regiões genéticas metiladas, por exemplo, CD3Z e FOXP3, correspondentes a CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ Células T Regulatórias (T-Regs), respectivamente. Wiencke et al. demonstraram a utilidade do PCR de gotícula duplex para subtipagem epigenética de Células T, produzindo resultados altamente correlacionados com a análise de classificação celular ativada de fluxo (FACS)6. Este método de análise genética quantitativa baseia-se na particionamento das moléculas de ácido nucleico modelo e reagentes PCR em milhares de gotículas discretas, volumosicamente definidas, sub-nanoliteras contendo zero, uma ou mais cópias de ácido nucleico alvo, utilizando emulsões de água em óleo habilitadas por microfluidos7,,8. A amplificação do PCR é realizada dentro de cada gotícula individual e a intensidade de fluorescência de ponto final de cada gotícula é medida, permitindo quantificação absoluta dos alvos presentes na amostra. O CDR gotícula foi estabelecido para ser mais preciso, preciso e tecnicamente mais simples do que o qPCR padrão, tornando-o um método mais favorável baseado em metilação de DNA para avaliação clínica de Células T. Embora uma metodologia de subtipagem rapidamente emergente, a análise epigenética multiplexada para sondar várias regiões de CpG metiladas simultaneamente está em falta. Isso é necessário para contagem diferencial de leucócito de rotina.
Aqui, um dispositivo microfluido de gotícula termoplástica (TPE) é apresentado e empregado para pcr de gotícula multiplex específica de metilação (mdPCR). A tecnologia tem sido usada para delinear subtipos específicos de leucócitos, CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ T-Regs, baseados em padrões de metilação de DNA de linhagem celular, ou seja, variação epigenética das regiões CD3Z e FOXP3 CpG, respectivamente. Um protocolo detalhado para extração de DNA, conversão de bissulfito e mdPCR é descrito em conjunto com um método de fabricação para um dispositivo de geração de gotículas TPE. Os resultados representativos do método são comparados aos da coloração da imunofluorescência, destacando a utilidade da abordagem proposta.
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Protocol
Todos os experimentos realizados neste estudo envolvendo amostras humanas foram aprovados pelo Conselho de Ética do NRC e foram feitos de acordo com as políticas do NRC que regem os sujeitos humanos que seguem as diretrizes de pesquisa aplicáveis e estão em conformidade com as leis em Québec, Canadá.
1. Preparação celular
- Descongele as células mononucleares de sangue periféricos congelados (PBMCs) imediatamente colocando o criovial em um banho de água a 37 °C por 5 min.
- Inverta o criovial duas vezes para resususpensar suavemente as células e usando uma pipeta de 1 mL transfira a suspensão da célula em um tubo cônico de 15 mL.
- Adicione 10 mL de meio de crescimento pré-aquecido (37 °C) complementado com 10% de soro bovino fetal (RPMI-1640 + 10% FBS) ao tubo de 15 mL contendo os PBMCs.
- Centrifugar a suspensão da célula em uma centrífuga de balde balançando à temperatura ambiente a uma velocidade de 330 x g por 10 minutos com aceleração rápida e o freio em alta.
- Uma vez que o giro acabou, decante cuidadosamente o supernante. Resuspend a pelota celular em 3 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7.2, contendo 2 mM ácido ethylenodiaminetetraacético (EDTA) tocando na lateral dos tubos.
- Misture as células invertendo o tubo com a tampa bem fechada.
- Prepare dois microtubos de 1,5 mL e usando uma alíquota de pipeta de 1,5 mL da suspensão celular em cada tubo, um dos quais é usado para posterior coloração de imunofluorescência e outro para a extração de DNA.
2. Protocolo de coloração e imagem de imunofluorescência
- Células resuspendas (a partir de 1,7) em 200 μL de tampão PBS contendo 0,1% de azida de sódio e 2% FBS e ajustar a concentração final da suspensão celular para um máximo de 2 x 107 células/mL.
- Divida a suspensão da célula por tubos de volume de 100 μL em dois microtubos separados de 1,5 mL.
- Adicione 20 μL de volume anti-Hu CD3/CD4 conjugado com isothiocianato fluoresceína (FITC) e Phycoerythrin (PE) a um tubo e anti-Hu CD4/CD25 conjugados com FITC e PE (ver Tabela de Materiais) ao segundo tubo, respectivamente.
- Adicione 1 gota de mancha azul fluorescente de célula viva (ver Tabela de Materiais) a cada tubo.
- Incubar à temperatura ambiente usando uma rotadora de tubos por 2 h. Proteja-se contra a luz.
- Centrifugar a suspensão da célula à temperatura ambiente a 330 x g por 10 minutos com aceleração rápida e o freio em alta.
- Decante o supernatante e resuspense cuidadosamente a pelota da célula tocando o tubo. Adicione 1 mL de PBS, pH 7.2 contendo 2 mM EDTA. Garantindo que a tampa esteja bem fechada, misture as células invertendo o tubo 2x.
- Repita as etapas 2.6 e 2.7 para três vezes.
- Células resuspend em 20 μL de PBS pH 7.2 contendo 2 mM EDTA.
- Pipeta 10 μL gota da suspensão celular em um slide de microscópio borossilicato e esperar por 2 minutos para as células sedimentarem lentamente até o fundo da gota.
- Coloque cuidadosamente um deslizamento de tampa de vidro em cima do slide do microscópio e coloque o slide no palco de um microscópio invertido.
- Registo imagens das células usando um objetivo de 10x e uma câmera EMCCD conectada ao microscópio para cada um dos fluoroforos para ambas as amostras de suspensão celular.
- Conte manualmente células rotuladas fluorescentes (consulte Informações Complementares para dados brutos).
- Leve a proporção de células rotuladas anti-Hu CD3 e anti-Hu CD4/CD25 para células manchadas de DAPI para obter as proporções de CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ T-Regs para leucócito total.
3. Extração de DNA e conversão de bisullfita
- Extração de DNA
NOTA: Extrair DNA de PBMCs preparados na seção 1 utilizando um kit de purificação de DNA magnético (ver Tabela de Materiais) seguindo procedimentos fornecidos pelo fabricante.- Em um tubo de 1,5 mL suspender células em 100 μL de PBS e adicionar 20 μL de Proteinase K e 400 μL de tampão lysis/binding. Misture por tubos para cima 10x, depois realize a incubação à temperatura ambiente por 5 minutos.
- Capture o complexo de contas de DNA colocando o tubo em um rack magnético por 1-2 min, depois remova cuidadosamente e descarte o supernasal.
- Remova o tubo contendo o complexo de contas de DNA do rack magnético e resuspenque as contas em 600 μL de Wash Buffer #1 para lavar qualquer ligação não específica.
- Coloque o tubo novamente no rack magnético e remova cuidadosamente e descarte o sobrenatário.
- Repita as etapas 3.1.3 e 3.1.4 com 600 μL de wash buffer #2.
- Deixe o tubo aberto para secar ao ar por 1 min.
- Remova o tubo do rack magnético e elute o DNA dispensando 100 μL de Tampão de Elução e pipetando o complexo dna/contas para cima e para baixo 20x.
- Coloque o tubo contendo o DNA elucido novamente no rack magnético e incubar por 1-2 min para separar as contas magnéticas do DNA elucido.
- Transfira a solução de DNA purificada elucida para um novo tubo limpo.
- Avalie a concentração da amostra de DNA purificada medindo a absorvância a 260 nm usando um espectrofotômetro.
- Conversão de bisullfita
NOTA: Realize a conversão de bisulfito no DNA purificado usando um kit de metilação (ver Tabela de Materiais) seguindo os procedimentos fornecidos pelo fabricante.- A 20 μL de amostra de DNA (200-500 ng) em um tubo PCR adicione 130 μL de Reagente de Conversão. Misture bem e gire brevemente.
- Transfira o tubo PCR para um cicloviário térmico e execute o protocolo de ciclismo da seguinte forma: 98 °C por 8 min; 54 °C por 60 min e a 4 °C.
- Adicione 600 μL do tampão de ligação a uma coluna de cromatografia de íons (IC) colocada em um tubo de coleta.
- Adicione a amostra de DNA à coluna IC contendo o tampão de ligação e misture invertendo o tubo várias vezes. Centrífuga para 30 s a toda velocidade. Descarte o fluxo coletado.
- À coluna agora adicione 100 μL de Wash Buffer. Realize a centrifugação conforme descrito na etapa 3.2.4 e descarte o fluxo.through.
- Adicione 200 μl de Tampão de Dessulfonação e realize a incubação à temperatura ambiente por 15-20 min. Centrifugar e descartar o fluxo-through como descrito em passos acima.
- Adicione 200 μL de Wash Buffer à coluna. Centrifugar a toda velocidade por 30 s e descartar o fluxo.
- Repita o passo 3.2.7.
- Transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mL e adicione 100 μL de água de grau PCR na membrana da coluna. Centrífuga a toda velocidade por 1 minuto para eluto o DNA.
- Avalie a concentração de amostra de DNA convertida por bisulfita medindo a absorvância a 260 nm usando um espectotômetro.
NOTA: Use um valor de 40 μg/mL para absorção a 260 nm = 1,0. - Armazene DNA a -20 °C para armazenamento a curto prazo ou a -70 °C para armazenamento a longo prazo.
4. Fabricação de dispositivos de geração de gotículas
NOTA: Um dispositivo microfluido usado para geração de gotículas (arquivo CAD fornecido no Material Complementar) foi fabricado em um ambiente de sala limpa (classe 1.000) em elastômero termoplástico (ver Tabela de Materiais) utilizando relevo quente gerado pelo protocolo aseguir.
- Fabricação de molde SU-8
- Prepare um molde SU-8 em um wafer de silício de 6" usando fotolitografia padrão conforme detalhado abaixo.
- Limpe um wafer de silício de 6" usando plasma de oxigênio a 500 W por 10 s.
- Spin-coat SU-8 resiste ao wafer de silício a 900 rpm por 40 s para alcançar uma espessura total de filme de 100 μm.
- Coloque o wafer em um prato quente e pré-asse por 15 min a 65 °C, seguido de 2h a 95 °C.
- Exponha à luz UV a 365 nm (Hg i-line) através de uma fotomak de transparência de alta definição usando uma dose de exposição de 1.000 mJ/cm2.
- Coloque o wafer em um prato quente e pós-asse por 15 min a 65 °C, seguido por 40 min a 95 °C.
- Desenvolver-se mergulhando no acetato de acetato de éter monometo-metil glitil (PGMEA) por 5 min.
- Enxágüe com PGMEA e isopropanol e seque com um fluxo de gás nitrogênio.
- Coloque o wafer em um prato quente e leve ao forno por 2h a 135 °C.
- Silanize o wafer no desiccator de vácuo contendo uma gota de agente silanizante (tricholoro perfluorooctil silane) colocado em um slide de microscópio de vidro adjacente por 2 h.
NOTA: Isso é feito para fazer com que as silanas formem uma monocamada na superfície do mestre SU-8. O silano de perfluorooctil tricholoro deve ser sempre manuseado no capô da fumaça e mantido longe das fontes de água.
- Réplica de polidimetilsiloxano (PDMS)
- Prepare os prepolímeros líquidos de PDMS (ver Tabela de Materiais) em uma proporção de 10:1 c/w de base elastômera para agente de cura em um copo de plástico.
- Coloque o copo em um misturador de vácuo centrífugo planetário para misturar e desgasar a mistura PDMS.
- Despeje a mistura de PDMS no molde colocado no suporte metálico personalizado que previne o vazamento de resina e cure a 65 °C por 2 h.
- Usando pinças, retire cuidadosamente o molde PDMS do mestre SU-8.
- Molde de epóxi
NOTA: Um molde epóxi foi fabricado a partir do mestre SU-8/silicon usando um processo de replicação intermediário com PDMS.- Prepare a resina epóxi (ver Tabela de Materiais) utilizando uma razão de 100/83 w/w de resina/endurecedor.
- Desgas a mistura sob pressão reduzida usando um forno de secagem a vácuo por 30 minutos.
- Despeje a resina sobre a réplica do PDMS e cure a 80 °C por 12 h.
- Retire o molde epóxi curado da réplica PDMS, coloque em uma placa quente e leve ao cozimento por 2h a 120 °C.
- Dispositivo TPE
- Extrude pelotas de TPE (ver Tabela de Materiais) a 165 °C em folhas de 2,0 mm de espessura e 7" de largura de vários metros de comprimento e armazená-las como um rolo para uso futuro.
- Corte a folha de TPE do rolo usando uma tesoura em um quadrado de 7".
- Coloque a folha de TPE entre o molde epóxi e um wafer de silício silanizado não padronizado (ver passo 4.1.10 para procedimento de silanização de wafer).
- Realize a relevo quente a uma temperatura de 125 °C, uma força aplicada de 10 kN, e uma pressão de 10-2 mbar por 10 minutos.
- Demold cuidadosamente à temperatura ambiente usando spray de metanol para separar o TPE em relevo do wafer de silício e o molde epóxi.
- Corte outra folha quadrada de 7" de TPE e coloque-a entre duas bolachas de silício silanizadas não padronizadas.
- Realize a relevo quente a uma temperatura de 140 °C, uma força aplicada de 10 kN, e uma pressão de 10-2 mbar por 10 minutos para formar uma superfície planar para fechar os canais e selar o dispositivo.
- Demold cuidadosamente à temperatura ambiente usando spray de metanol para separar o TPE em relevo dos dois wafers de silício.
- Corte cada uma das folhas de TPE em relevo para o tamanho do dispositivo usando uma lâmina médica.
- Faça os orifícios de acesso para os canais de entrada e saída no dispositivo estruturado usando uma agulha de perfuração de biópsia de 1 mm com um êmbolo.
- Inclua os canais colocando um dispositivo Planar TPE em contato direto com os canais à temperatura ambiente.
- Opcionalmente, coloque em forno a 70 °C por 2h para promover a ligação do dispositivo.
- Encaixe os orifícios de acesso com tubos fluidos descartáveis (I.D. 0,25 mm, O.D. 0,8 mm). Sele as juntas usando uma cola epóxi para garantir a manipulação à prova de vazamentos.
5. Geração de gotículas e PCR
NOTA: A tabela 1 descreve informações sobre os primers dianteiros e invertidos, juntamente com as sondas de hidrólise duplamente saciadas para os genes C-LESS, CD3Z e Foxp3, que são necessários para a amplificação multiplex de alvos genéticos desmetilados.
- Prepare a mistura mestra como descrito na Tabela 2.
- Descongele todos os componentes da mistura principal, exceto pela mistura de enzimas. Misture bem a mistura mestre, pipetando para cima e gire brevemente.
- Adicione o volume apropriado (1 μL) de DNA convertido por bisulfito (da seção 3.2) à mistura mestre em um tubo PCR. Misture a reação se escoando para cima e gire brevemente.
- Conecte tubos fluidos descartáveis (I.D. 0,25 mm, O.D. 1,6 mm) a duas seringas de vidro de precisão (volume de 250 μL) usando encaixes PEEK.
- Prefile uma seringa de vidro de precisão com 250 μL de óleo transportador contendo 5% fluoro-surfactante.
- Preencha outra seringa de vidro de precisão com 50 μL de óleo transportador antes de carregar 100 μL da mistura PCR para garantir a dispensação de todo o volume da amostra durante a emulsificação.
- Configure um dispositivo microfluido gotícula em um estágio de um microscópio de luz vertical equipado com uma câmera de alta velocidade para observar e gravar a formação de gotículas em tempo real.
- Coloque as seringas pré-enchadas na bomba de seringa programável e usando a união PEEK com encaixes (ver Tabela de Materiais),conecte a tubulação das seringas à tubulação dos respectivos canais de entrada do dispositivo microfluido gotícula.
- Coloque a tubulação da saída do gerador de gotículas dentro de um tubo PCR de 0,5 mL.
- Ajuste a taxa de fluxo da bomba de seringa para 2 μL/min e deixe que o tamanho da gotícula se estabilize antes de coletar a emulsão resultante.
- Colete a emulsão e transfira 75 μL para um tubo PCR de 0,2 mL para ciclismo térmico.
- Certifique-se de que o teor de óleo no tubo PCR corresponda de perto ao volume da fase dispersa, a fim de evitar a coalescência das gotículas durante o ciclismo térmico.
- Coloque o tubo PCR de 0,2 mL no cicloviário térmico e execute o protocolo de ciclismo da seguinte forma: pré-aquecimento a 95 °C por 5 min, depois 45 ciclos de desnaturação a 95 °C para 15 s e ressarcimento/extensão a 60 °C para 30 s.
- Use a emulsão restante para preencher um tubo capilar borossilicacate (profundidade de 100 μm) com um perfil retangular para imagens de gotículas e avaliar o diâmetro da gotícula.
- Coloque o tubo de borossilicato preenchido com a emulsão em um slide de microscópio. Use um microscópio invertido equipado com uma câmera EMCCD e objetivo de 10x para gravar imagens de campo brilhante das gotículas.
- Meça o diâmetro da gotícula usando um software de análise de imagem conforme detalhado abaixo.
- Defina a escala de distância conhecida em mícrons correspondentes ao número de pixels na imagem selecionando o botão 'Analisar' e, em seguida, 'Definir escala'.
- Converta a imagem em escala de cinza selecionando o botão 'Imagem' e, em seguida, 'Tipo'. Ajuste o brilho e o contraste, se necessário. Defina um limiar manual para delinear e preencher os círculos selecionando o botão 'Imagem' e, em seguida, 'Ajustar limiar'.
- Analise as partículas selecionando o botão 'Analisar partículas' e definindo a circularidade para 0,75 – 1.
- Obtenha a área resultante e o diâmetro das gotículas medidas que é exibida automaticamente no software.
- Calcular o diâmetro médio da gota e assumir uma gotícula esférica, estimar o volume de partição, que será usado para calcular a concentração de alvo absoluta.
- Certifique-se de que as gotículas são monodisperses analisando o coeficiente de variação (CV) que é tomado como a razão dos desvios-padrão para os valores médios (k = 1), para o diâmetro da gota (< 3%).
6. Análise de imagem e imagem de fluorescência
- Imagem de fluorescência
- Após a amplificação, transfira a emulsão pcr para tubo capilar borossilicato (50 μm de profundidade) com um perfil retangular, a fim de organizar gotículas em uma monocamada fechada para imagem.
- Fixar os capilares preenchidos em um slide de microscópio e selar ambos os lados usando um adesivo acrílico UV. Aplique uma fonte de luz UV no adesivo UV tomando cuidado para não iluminar a emulsão para evitar branquear a amostra.
- Carregue o slide de vidro em um microscópio invertido equipado com uma câmera EMCCD e um objetivo de 10x.
- Usando software de imagem de microscópio, selecione Adquirir | Ao vivo - Rápido para iniciar a aquisição da câmera em tempo real, observe a amostra e certifique-se de que a largura do capilar seja capturada.
- Coloque a lâmpada de campo brilhante para iluminação diascópica em 3,5 V.
- Coloque a lâmpada fluorescente LED de amplo espectro para iluminação episcópica com 20% de intensidade.
- Ajuste a configuração de captura para todos os comprimentos de onda (campo brilhante, FAM, HEX e Cy5) manualmente selecionando a Calibração | Comando de Configurações Ópticas no software de imagem. Para cada fluoróforo, o cubo correspondente do filtro de fluorescência precisa ser alternado manualmente. Um cubo de filtro para a imagem de campo brilhante deve ser usado para manter o mesmo caminho óptico.
- Ajuste o tempo de exposição manualmente antes da aquisição de imagem usando a Acquire | Comando de configurações de câmera para cada fluorfora como resumido na Tabela 3. Defina o modo de leitura EM ganhar 17 MHz em 16 bits com um multiplicador de ganho de 100 no menu 'Configuraçõesde captura ' do software.
- Na janela LUT do software, defina a escala LUTs de tal forma que o sinal de transmissão seja incorporado dentro do intervalo definido. Neste experimento, a escala foi fixada de 500 até 12.000 aproximadamente.
- Automatize a captura usando um programa de aquisição de vários pontos usando tanto a varredura XY quanto várias opções de comprimento de onda nessa ordem específica. Certifique-se de que o estágio se move para a posição inicial, capture todos os diferentes comprimentos de onda e, em seguida, prossiga para a próxima posição.
- Primeiro, configure a varredura XY personalizando o perfil de varredura XY no menu de varredura XY do software. Em 'Definição personalizada de vários pontos', escolha a caixa de definição de imagem grande e coloque-a em aproximadamente 40,0 x 1,0 mm (o comprimento do enchimento da emulsão). Use 1% de sobreposição.
- Habilite a opção 'Use a superfície de foco' e configure a curva de superfície de foco ajustando o plano de foco em diferentes pontos da amostra usando o botão de foco no microscópio.
- Em segundo lugar, configure a varredura de vários comprimentos de onda selecionando a guia de varredura. Adicione cada uma das configurações ópticas criadas na etapa 6.1.7 para cada comprimento de onda.
- Clique na opção de fechar o obturador ativo durante o movimento do estágio e durante a alteração do filtro para evitar branquear a amostra e executar a aquisição pressionando o botão 'Iniciar Corrida'. Exporte cada quadro de aquisição em arquivos de tiff e divida cada canal em um arquivo separado usando a opção de vários arquivos divididos e aplicando configurações LUTs salvas. Use o nome do ponto e a opção de nome do canal para diferenciar facilmente cada arquivo de imagem.
- Análise de imagem
- Classifique todas as imagens adquiridas por filtros brightfield e fluorescência para enviar para um software de análise de imagem de código aberto.
- Use o software de análise de imagens para criar um pipeline para identificar todas as gotículas usando imagens de campo brilhante e, em seguida, medir a intensidade das gotículas fluorescentes associadas.
- Para pipeline, carregue imagens de tiff de campo brilhante e fluorescência e adicione os módulos 'ColorToGray', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectIntensity' e 'ExportToSpreadsheet'. Use imagens de gotículas de campo brilhante para identificar objetos e use objetos como máscara para medir a intensidade de imagens fluorescentes.
- Execute o pipeline com imagens de tiff selecionadas para extrair intensidade média de fluorescência de imagens de gotículas de fluorescência. Conduza o experimento em triplicado, com cada conjunto consistindo de ~5.000 gotículas para análise.
- Aplique o algoritmo'definetherain' (http://definetherain.org.uk/) para identificar os clusters de gotículas positivos e negativos. Os pontos positivos devem estar dentro de 3 desvios padrão da média. Isso determina a intensidade limiar de gotículas positivas a serem usadas para a contagem.
- Use novamente o software de análise de imagem para implementar um novo pipeline onde o limiar de fluorescência para cada alvo genético seja definido como definido na etapa anterior.
- Carregue imagens brilhantes e fluorescentes para o pipeline. Adicione módulos 'ColorToGray', 'RescaleIntensity', 'Threshold', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectSizeShape',FilterObjects' e 'ExportToSpreadsheet'. Crie módulos exclusivos para imagens de campo brilhante e cada filtro de fluorescência para gotículas.
- Escala de intensidade de imagem de reescalada de 0 a 1 para cada grupo de imagem de fluorescência. Em seguida, defina o limiar para identificar e contar os objetos acima do limiar estabelecido. Se necessário, adicione o módulo 'ExpandOrShrinkObjects' para encolher objetos para facilitar a contagem e identificação de gotículas em brightfield.
- Apenas identifique objetos dentro do tamanho selecionado de 20-30 pixels e filtre os objetos contados apenas para reter esses objetos com um diâmetro específico (ou seja, gotículas na faixa de 75 μm de diâmetro) e uma excentricidade esférica redonda de 0,5 e abaixo.
- Exporte os resultados para uma tabela que liste a contagem total de gotículas a partir de imagens de campo brilhante, bem como contagem de gotículas de todos os canais de fluorescência utilizados; ou seja, Cy5 para gene C-LESS, HEX para gene CD3Z metilado e FAM para gene FOXP3 metilado (ver Informações Complementares para dados experimentais brutos obtidos para o ensaio mdPCR apresentado).
- Calcule a razão de gotículas negativas para cada alvo genético e aplique a distribuição poisson para obter as respectivas cópias por gotícula (CPD) usando a Equação 1:
onde x representa o número de gotículas contendo 0, 1, 2 ou mais moléculas, e λ representa o valor de CPD. - Calcule, a concentração de alvo absoluta tomando a razão do valor do CPD e o volume de gotícula obtido na etapa 5.20 com a Equação 2:
onde o valor (1-p) representa a fração de gotículas negativas. - Calcule a porcentagem de CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ T-Regs dividindo os respectivos valores de CPD dos genes CD3Z e FOXP3 metilados pelo valor C-LESS – ou célula total – (ver Informações Complementares para cálculos de CPD a partir de dados brutos).
- Compare esses valores por cento com os obtidos a partir de imagens de imunofluorescência usando anticorpos para contagem de CD3+ T-Cell e CD4+ CD25+ T-Reg.
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Representative Results
O dispositivo gerador de gotícula microfluida baseado em TPE foi fabricado usando o protocolo descrito, conforme mostrado na Figura 1. Uma máscara de transparência foi usada na fotolitografia para obter o mestre de silício (Si). A litografia suave foi realizada para obter uma réplica inversa do Mestre Si, que foi então usada para fabricar o molde epóxi. O precursor epóxi foi derramado no PDMS e curado para cruzar e endurecer. Este molde, representando a réplica exata do mestre Si foi mais resistente para a termoformação subsequente de termoplásticos usando relevo quente. Uma vez obtido o molde epóxi, o elastômero termoplástico foi gravado. Após a relevo, o TPE foi desmoldado, e os dispositivos foram cortados. Um substrato TPE plano foi usado para selar o dispositivo. Buracos foram perfurados na tampa superior, e os dois substratos foram ligados. Finalmente, a tubulação necessária para conexões world-to-chip foi inserida e o dispositivo estava pronto para uso. Imagens de amostra de molde mestre fabricado, material TPE e dispositivos em relevo são mostradas na Figura 2. O dispositivo montado com interconexões de tubulação foi operado com um par de bombas de seringa programáveis independentes para gerar emulsões para mdPCR. MdPCR específico para metilação foi realizado usando DNA tratado de bisulfato extraído de PBMCs congelados. Primers apropriados e sondas de hidrólise para genes CD3Z, FOXP3 e C-Less foram adicionados à mistura pcr para emulsificação. Após a geração de gotículas de tamanho apropriado (aproximadamente 72 μm de diâmetro), a emulsão foi submetida a um protocolo de ciclismo térmico. Finalmente, as gotículas foram introduzidas em um capilar de vidro com 1 mm de largura e 50 μm de altura para imagem. Isso resulta em uma distribuição monocamada de gotículas ideais para aquisição de imagens de fluorescência(Figura 3). As imagens foram gravadas para cada um dos quatro comprimentos de onda. Em seguida, foi realizada uma análise de imagem para identificar todas as gotículas(Figura 4)atendendo aos critérios limiares estabelecidos através do algoritmo 'definetherain'. A intensidade da fluorescência de todas as gotículas em seus respectivos fluoróforos é então traçada e o limiar de gotículas positivas e negativas foi estabelecido(Figura 5). Posteriormente, foram realizadas a identificação e contagem dessas gotículas, acima do limiar selecionado. Os valores de CPD foram então calculados e a porcentagem de CD3+ T-Cell e CD4+ 25+ T-Regs foi estabelecida com base em cópias metiladas CD3Z e FOXP3, respectivamente, no que diz respeito ao CPD das células totais, ou gene C-LESS(Figura 6). Os valores por cento foram então comparados aos obtidos através de imagens de imunofluorescência das populações T-Cell e T-Reg usando anticorpos apropriados.
| FOXP3 Para a frente | GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG | |
| Foxp3 Reverso | TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA | |
| CD3Z Para a frente | GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG | |
| Reverso CD3Z | CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA | |
| C-LESS Para a frente | TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA | |
| C-LESS Reverso | TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C | |
| Sonda FOXP3 | /56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/ | |
| Sonda CDZ3 | /56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/ | |
| Sonda C-Less | /56-CY5/CT CCC CCT CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/ | |
Tabela 1: Projeto da sonda primer e hidrólise.
| Reagente | Solução de Estoque | Volume de mixagem mestre | Concentração de Trabalho |
| Tris-HCl | 1 M | 2 μL | 20 mM |
| Kcl | 1 M | 10 μL | 100 mM |
| MgCl2 | 25 mM | 16 μL | 4 mM |
| C-LESS Primers | 10 μM | 10 μL | 1 μM cada |
| CD3Z Primers | 10 μM | 10 μL | 1 μM cada |
| FOXP3 Primers | 10 μM | 10 μL | 1 μM cada |
| Sonda C-LESS | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| Sonda CD3Z | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| Sonda FOXP3 | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| Polimerase de DNA HotStarTaq | 5 Unidades/μL | 8 μL | 0.4 Unidades/μL |
| Alvo de DNA tratado por bisulfita | Variável | Variável | Variável |
| Água sem nuclease | Variável | ||
| Total Volume | 100 μL |
Tabela 2: Mix mestre receita para mdPCR.
| Configuração óptica | Exposição | Lâmpada DIA | Luz florescente |
| Campo brilhante | 50 ms | Em | FORA |
| Fam | 300 ms | FORA | 20% |
| Hex | 300 ms | FORA | 20% |
| Cy5 | 400 ms | FORA | 20% |
Tabela 3: Configurações para configuração óptica e aquisição de imagens.
Figura 1: Prototipagem rápida do gerador de gotículas. Ilustração esquemática do processo utilizado para a fabricação de (A) molde mestre e (B) dispositivo de emulsificação microfluidic baseada em TPE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Componentes envolvidos no processo de fabricação. (A) Mestre do silício, (B) réplica PDMS, (C) molde epóxi, (D) material TPE extrudado em folhas e embalado em rolos, (E) em relevo TPE e(D) dispositivo montado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aquisição de imagem fluorescência de gotículas após o ciclismo térmico. (A) Imagem brightfield das gotículas em um capilar que permitiu a aquisição de imagens monocamadas. (B) Imagem do filtro Cy5 de alvos genéticos C-LESS representando a contagem total de células. (C) Imagem do filtro HEX do alvo do gene CD3Z metilado correlacionado à contagem de CÉLULAS CD3+ T. (D) Imagem do filtro FAM do alvo do gene FOXP3 metilado correlacionado à contagem CD4+ CD25+ T-Reg. A barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Tubulação usada para identificar gotículas que atendam à intensidade do limiar. As imagens foram organizadas pela primeira vez em filtros de fluorescência apropriados usando nomeação de arquivos. As imagens foram então convertidas em escala de cinza e intensidades relativas redimensionadas com base nas intensidades mínimas e máximas de fluorescência de gotículas. O limiar foi então selecionado de acordo com valores obtidos a partir do algoritmo 'definetherain' e os objetos – ou gotículas – atendendo aos critérios definidos foram identificados e quantificados. Finalmente, os objetos foram filtrados de acordo com excentricidade e tamanho para obter a contagem de gotículas refinadas de objetos esféricos que atendem ao tamanho de 75 μm de diâmetro. Os objetos quantificados e suas intensidades foram então exportados para um software de planilha para análise a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Parcelas de dispersão de intensidade para intensidade de fluorescência de gotículas após mdPCR. (A) Amplificação genética C-LESS com sonda de hidrólise Cy5 representando a contagem total de células como a região alvo foi desprovida de resíduos de citosina e, portanto, resistente ao tratamento de bisullfita. (B) Amplificação genética CD3Z metilada com sonda de hidrólise HEX, indicativa da população CD3+ T-Cell. (C) Amplificação genética FOXP3 metilada com sonda de hidrólise FAM, representando a população CD4+ CD25+ T-Reg. Todas as parcelas de dispersão foram submetidas ao algoritmo 'definetherain' para definir o limiar apropriado pelo qual os positivos estavam dentro de 3 desvios padrão da média de cluster positivo. Também foi estabelecida a quantidade de 'chuva' para que ela exceda 1% das gotículas definidas positivas. Cada conjunto de dados para análise consistia em ~5.000 gotículas e era executado em triplicado (ver Informações Complementares para dados brutos e análise). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Valores de CPD de todos os alvos genéticos e determinação da porcentagem de subconjunto de glóbulos brancos. (A) Os valores calculados de CPD com base na distribuição de Poisson da contagem positiva de gotículas como razão de gotículas totais. A entrada representa o CPD teórico esperado com base em 740 ng de DNA tratado de bisulfito, gotículas de 75 μm de diâmetro, assumindo 6,6 pg para 1 cópia genética. O CPD teórico de entrada foi de 0,25 e correlacionado com o CPD C-LESS representando a contagem total de células. (B) A razão de CPD para CD3Z e FOXP3 em relação a C-LESS foi então usada para obter a porcentagem de CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ T-Regs, respectivamente. Essas proporções como percentual do total de leucócitos foram então comparadas com os valores obtidos pela imagem de imunofluorescência. Como demonstrado, os valores da análise de mdPCR e imunofluorescência correlacionam-se sem diferença significativa, com erros de desvio padrão do MDPCR sendo muito menos pronunciados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Informações suplementares. Clique aqui para baixar esses arquivos.
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Discussion
O protocolo experimental apresentado e os métodos permitem o mdPCR interno usando um gerador de gotícula TPE fabricado, um cicloviário térmico e microscópio de fluorescência. O dispositivo fabricado usando tpe macio para ligação TPE oferece propriedades de superfície hidrofóbica que são uniformes em todas as paredes do canal, de tal forma que o dispositivo final não requer qualquer tratamento de superfície para uso subsequente como gerador de gotículas. Este material tem sido rotineiramente empregado em plataformas de ponto de cuidado que necessitam de compatibilidade com a fabricação de alto rendimento9,,10,,11,,12,13. Além disso, também é opticamente claro e exibe baixo fundo de fluorescência no espectro visível, que é um recurso atraente para a integração futura de um fluxo de trabalho amostra-resposta completo usando mdPCR. As receitas de reagente PCR também são fornecidas em formato homebrew para permitir a quantificação do gene multiplex fácil, mantendo também a estabilidade em todo o protocolo de ciclismo térmico. Como tal, uma das vantagens dos dispositivos e protocolos apresentados é a flexibilidade na personalização do design do dispositivo e dos reagentes utilizados para uma determinada aplicação, o que é difícil de alcançar com produtos comerciais e formulações proprietárias. Além disso, elimina a necessidade de instrumentação cara para realizar o experimento.
A seleção adequada de material termoplástico do gerador de gotícula microfluidic é um parâmetro crítico que pode contornar o tratamento superficial complicado para tornar o dispositivo hidrofóbico para uma formação eficiente de gotículas. Além disso, a seleção de um buffer mdPCR otimizado também é fundamental para manter a estabilidade da gotícula através do processo de ciclismo térmico – ao mesmo tempo em que não compromete a eficiência pcr e a funcionalidade da sonda de hidrólise. Outra modificação e otimização do buffer mdPCR é, portanto, encorajado a chegar a uma amplificação PCR altamente específica e sensível de alvos genéticos selecionados, juntamente com a detecção de teste baseada em fluorescência. Isso serve para aumentar a relação sinal-ruído, reduzindo as ocorrências de "chuva" e simplificando a análise experimental e identificação de populações positivas de gotículas. A solução de problemas do experimento depende da avaliação dos passos críticos da seleção de materiais termoplásticos à concentração de polimerase para adaptar a rampa de temperatura no programa de ciclismo térmico, a fim de garantir a estabilidade das gotículas.
A limitação atual do protocolo descrito é que ele ainda requer transferência manual de amostras do gerador de gotículas para o ciclor térmico e, finalmente, para um dispositivo de imagem de gotícula e instrumento, como um microscópio de fluorescência. Os esforços futuros, no entanto, são direcionados à miniaturização do mdPCR e à integração dessas etapas pelas quais a geração de gotículas, o PCR e a imagem podem ser realizados em uma única plataforma automatizada.
Os resultados obtidos na Figura 6 demonstram a versatilidade desta abordagem mdPCR para a realização de quantificação diferencial de glóbulos brancos. O método proposto é mais preciso e reprodutível do que a imagem de imunofluorescência, que muitas vezes é afetada pela manipulação do usuário, dando origem a erros de medição indesejados. Este também é o caso de técnicas de citometria de fluxo que também dependem de um método de detecção baseado em imunidade que é altamente dependente da viabilidade celular, bem como múltiplas etapas de protocolo propensas a erros do usuário. Métodos alternativos como PCR quantitativo em tempo real (qPCR) para a quantificação são frequentemente afetados negativamente por alvos genéticos de baixo número de cópia, uma desvantagem que é remediada através de mdPCR sem a necessidade de uma curva de calibração dedicada11. A abordagem mdPCR apresentada, portanto, apresenta uma abordagem molecular única para a contagem diferencial de glóbulos brancos que se baseia em perfis de metilação de alvos genéticos específicos. As curvas de calibração para alvos genéticos individuais também não são necessárias, uma vez que o mdPCR baseia-se em uma quantificação absoluta de sinais binários positivos positivos e negativos usando a distribuição de Poisson para cálculo de CPD.
A quantificação precisa de ilhas genéticas não metiladas, especialmente de genes de baixo número de cópias, como FOXP3, apresenta uma infinidade de oportunidades para o diagnóstico clínico. Isso é destacado pela capacidade de tal abordagem de identificar padrões conhecidos de metilação correlacionados ao início e progressão da doença. mdPCR, como uma abordagem molecular com quantificação absoluta pode ser empregada além de estudos de metilação e pode ser aplicada a amostras adequadamente preservadas, removendo assim a dependência de amostras clínicas frescas, e expandindo ainda mais suas aplicações. A automação futura e a miniaturização dessa técnica serão de grande valor para o diagnóstico clínico rápido e preciso e o prognóstico subsequente.
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Disclosures
Não há conflitos para declarar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B.
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
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- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
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- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
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- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
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