Summary
Эпигенетические маркеры используются для подзарядки белых кровяных телец (WBC) через количественную оценку моделей метилирования ДНК. Этот протокол представляет собой мультиплекс капли полимеразной цепной реакции (mdPCR) метод с использованием термопластичного еластомера (TPE) на основе микрофлюидного устройства для производства капель позволяет точной и мультиплекс метилирования конкретных целевых количественно WBC дифференциальных кол-
Abstract
Описан мультиплексный рабочий процесс ПЦР (mdPCR) и подробный протокол для определения эпигенетических белых кровяных телец (WBC) дифференциального числа, наряду с термопластичным еластомером (TPE) микрофлюидным устройством генерации капель. Эпигенетические маркеры используются для субтипирования WBC, который имеет важное прогностический значение при различных заболеваниях. Это достигается за счет количественной оценки моделей метилирования ДНК конкретных богатых CG регионов в геноме (cpG локусов). В этой работе, бисульфит-обработанной ДНК из периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) инкапсулируется в каплях с mdPCR реагентов, включая грунтовки и гидролиз флуоресцентные зонды, характерные для cpG локусов, которые коррелируют с суб-популяций WBC. Мультиплексный подход позволяет проводить допрос многих локусов CpG без необходимости отдельных реакций mdPCR, что позволяет более точно определить параметрические поднаселения WBC с использованием эпигенетического анализа мест метилирования. Эта точная количественная оценка может быть распространена на различные приложения и подчеркивает преимущества для клинической диагностики и последующего прогноза.
Introduction
Анализ состава белых кровяных телец (WBCs) является одним из наиболее часто запрашиваемых лабораторных тестов в гематологической диагностике. Дифференциальное количество лейкоцитов служит индикатором для спектра заболеваний, включая инфекцию, воспаление, анемию и лейкемию, и находится под следствием в качестве раннего прогностический биомаркер для ряда других условий, а также. Золотой стандарт в субтипинге WBC включает в себя иммуностиметь и/или цитометрию потока, которые требуют дорогостоящих, подверженных нестабильности флуоресцентных антител и часто сильно зависят от квалификации оператора в подготовке образца. Кроме того, этот метод применим только к свежим образцам крови, так что образцы не могут быть заморожены для отгрузки или более поздний анализ.
Эпигенетические маркеры в последнее время стали мощными аналитическими инструментами для изучения фенотипических вариаций. Впоследствии было показано, что популяции лейкоцитов человека имеют модели метилирования ДНК клеточной линии, которые позволяют точно о характеристике подмножества WBC. Субтипирование на основе эпигенетических маркеров обеспечивает перспективную альтернативу, которая не зависит от сбора свежих образцов крови или дорогих антител и может быть использована в качестве биомаркера для начала заболеванияи восприимчивости 1,,2,,3,,4,,5.
Геномные исследования были проведены для обширного картирования метилированных конкретных богатых CG регионов в геноме (CpG островов) в подтипах лейкоцитов для выявления кандидатов эпигенетических маркеров, характерных для подтипов лейкоцитов. Протоколы ПЦР были разработаны по этой причине для метилированных областей генов, например, CD3 и FOXP3, соответствующихCD3 и T-Cells и CD4и CD25- Регуляторные Т-клетки (T-Regs), соответственно. Wiencke et al. продемонстрировали полезность дуплексной капли PCR для эпигенетического субтипирования Т-клеток, что дает результаты, которые сильно коррелируют с анализом активированной клетки потока (FACS)6. Этот метод количественного генетического анализа опирается на разделение молекул нуклеиновой кислоты шаблона и реагентов ПЦР на тысячи дискретных, объемно определенных, субнолитровых капель, содержащих ноль, одну или несколько копий целевой нуклеиновой кислоты, с использованием эмульсий воды в масле, включенныхмикрофлюиды 7,8. Усиление ПЦР выполняется в каждой отдельной капле, и измеряется интенсивность флуоресценции конечной точки каждой капли, что позволяет абсолютно количественно оценить целевые показатели, присутствующие в выборке. Droplet PCR был создан, чтобы быть более точным, точным и технически проще, чем стандартный qPCR, что делает его более благоприятным методом метилирования ДНК для клинической оценки Т-клеток. Несмотря на быстро возникающие методологии субтипирования, мультиплексный эпигенетический анализ для исследования различных метилированных регионов CpG одновременно отсутствует. Это необходимо для обычного дифференциального отсчета лейкоцитов.
В этом случае представлено и использовано термопластичное еластомерное (ТПЭ) капельное микрофлюидное устройство для метилирования-специфической мультиплексной капли ПЦР (mdPCR). Технология была использована для разграничения конкретных подтипов лейкоцитов,CD3 и Т-клеток и CD4, CD25и T-Regs, на основе клеточных моделей метилирования ДНК, т.е. эпигенетической вариации регионов CD3 и FOXP3 CpG, соответственно. Подробный протокол для извлечения ДНК, преобразования бисульфита и mdPCR описывается в согласовании с методом изготовления для устройства генерации капель TPE. Репрезентативные результаты метода сравниваются с результатами окрашивания иммунофлуоресценции, подчеркивая полезность предлагаемого подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, проведенные в этом исследовании с участием образцов человека, были одобрены Советом по этике СРН и проводились в соответствии с политикой СРН, регулируя человеческие предметы, которые следуют применимым руководящим принципам исследований и соответствуют законам Квебека, Канада.
1. Подготовка клеток
- Оттепель замороженных человеческих периферических кровяных моноядерных клеток (PBMCs) немедленно, поместив криовиальный в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
- Переверните криовиальный дважды, чтобы аккуратно повторно использовать клетки и с помощью 1 мл пипетки передачи клеточной подвески в 15 мл конической трубки.
- Добавьте 10 мл предварительно разогретой (37 градусов по Цельсию) среды роста, дополненной 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (RPMI-1640 и 10% FBS) к трубке 15 мл, содержащей PBMCs.
- Центрифуга клеточной подвески в размахивая центрифуг ведро при комнатной температуре со скоростью 330 х г в течение 10 мин с быстрым ускорением и тормоза на высоком.
- После того, как спина закончилась, тщательно decant супернатант. Повторное использование клеточных гранул в 3 мл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) рН 7,2, содержащего 2 мМ этилендиаминтетраацевой кислоты (ЭДТА), нажав на сторону труб.
- Смешайте клетки, инвертирование трубки с крышкой плотно закрыты.
- Подготовь два микротрубки объемом 1,5 мл и используя пипетку aliquot 1,5 мл клеточной суспензии в каждой трубке, одна из которых используется для последующего окрашивания иммунофлюоресценции и одна для извлечения ДНК.
2. Протокол окрашивания и визуализации иммунофлюоресценции
- Повторное потребление клеток (от 1,7) в 200 МКЛ буфера PBS, содержащего 0,1% азида натрия и 2% FBS и настроить окончательную концентрацию клеточной суспензии максимум до 2 х 107 клеток / мл.
- Разделите подвеску ячейки, затмив объемом 100 МКЛ на две отдельные микротрубки объемом 1,5 мл.
- Добавьте 20 мкл объема анти-Ху CD3/CD4, спряченного с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) и фикоэритроном (PE) в одну трубку и анти-Hu CD4/CD25, спряченные с FITC и PE (см. Таблицуматериалов ) во вторую трубку, соответственно.
- Добавьте 1 каплю синего флуоресцентного пятна живой клетки (см. Таблицу материалов)к каждой трубке.
- Инкубировать при комнатной температуре с помощью трубчатого ротатора в течение 2 ч. Защитите от света.
- Центрифуга клеточной подвески при комнатной температуре 330 х г в течение 10 мин с быстрым ускорением и торможением на высоком уровне.
- Декант supernatant и тщательно повторно использовать ячейки гранулы, нажав на трубку. Добавьте 1 мл PBS, рН 7.2, содержащий 2 мМ EDTA. Обеспечение того, чтобы крышка плотно закрыта, смешать клетки, инвертирование трубки 2x.
- Повторите шаги 2.6 и 2.7 в течение трех раз.
- Повторное распределение клеток в 20 МКЛ рН PBS 7.2, содержащего 2 мМ EDTA.
- Pipette 10 йл капли клеточной подвески на борозиликат микроскоп слайд и ждать 2 мин для клеток медленно осадка на дно капли.
- Аккуратно поместите стеклянную крышку скольжения на верхней части слайда микроскопа и поместите слайд на сцене перевернутого микроскопа.
- Запись изображений клеток с помощью 10x цели и камеры EMCCD подключен к микроскопу для каждого из фторфоров для обоих образцов подвески клеток.
- Ручное подсчет флуоресцентно помеченных ячеек (см. Дополнительную информацию для необработанных данных).
- Возьмите соотношение анти-Ху CD3 и анти-Ху CD4/CD25 помечены-клетки DAPI-окрашенных клеток, чтобы получить пропорцииCD3 и Т-клеток и CD4- CD25и T-Regs в общей сложности лейкоцитов.
3. Извлечение ДНК и преобразование бисульфита
- Извлечение ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлекайте ДНК из ПХМГ, подготовленных в разделе 1, используя комплект для очистки магнитной ДНК(см. таблицу материалов) после процедур, предоставленных производителем.- В трубке 1,5 мл приостанавливаются клетки в 100 МКЛ PBS и добавляют 20 МКЛ протеиназы K и 400 МКЛ буфера лиза/связывания. Смешайте с помощью пипетки вверх-вниз 10x, а затем выполнить инкубацию при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Захват ДНК-бисер комплекс, поместив трубку на магнитной стойке в течение 1-2 мин, а затем тщательно удалить и отказаться от супернатанта.
- Удалите трубку, содержащую ДНК-бисерный комплекс, из магнитной стойки и повторно снимите бисер в 600 МКЛ от Wash Buffer #1 чтобы смыть любой неспецифический переплет.
- Поместите трубку снова на магнитной стойке и тщательно удалить и отказаться от супернатанта.
- Повторите шаги 3.1.3 и 3.1.4 с 600 йл #2.
- Оставьте трубку открытой для высыхания воздуха в течение 1 мин.
- Удалите трубку из магнитной стойки и elute ДНК путем дозирования 100 йл Elution Buffer и трубопроводов ДНК / бисера комплекса вверх и вниз 20x.
- Поместите трубку, содержащую eluted ДНК снова на магнитной стойке и инкубировать в течение 1-2 минут, чтобы отделить магнитные бусы от элайта ДНК.
- Перенесите элевируется очищенный раствор ДНК в новую чистую трубку.
- Оцените концентрацию очищенного образца ДНК, измерив абсорбанс в 260 нм с помощью спектрофотометра.
- Преобразование бисульфита
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните преобразование бисульфита на очищенной ДНК с помощью метилирования комплект (см. Таблицу материалов) следующие процедуры, предоставляемые производителем.- К 20 йл образца ДНК (200-500 нг) в ПЦР-трубке добавляют 130 МКЛ конверсионного реагента. Хорошо перемешать и спина вниз кратко.
- Перенесите трубку ПЦР на теплотрассу и выполните протокол езды на велосипеде следующим образом: 98 градусов по Цельсию в течение 8 минут; 54 КК в течение 60 мин и удерживайте при 4 градусов по Цельсию.
- Добавьте 600 МКЛ буфера Связывания в столбец ионные хроматографии (IC), помещенный в трубку для сбора.
- Добавьте образец ДНК в столбец IC, содержащий связывающий буфер, и перемешайте трубку несколько раз. Центрифуга на 30 с на полной скорости. Откажитесь от собранного потока.
- К столбецу теперь добавить 100 йл от Wash Buffer. Выполните центрифугирование, описанное в шаге 3.2.4, и отбросьте протеку.
- Добавьте 200 мкл буфера десульфонации и выполните инкубацию при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Центрифуга и отказаться от потока через, как описано в шагах выше.
- Добавьте в столбец 200 йл буфера для мытья. Центрифуга на полной скорости в течение 30 с и отказаться от потока через.
- Повторите шаг 3.2.7.
- Перенесите колонку в новую трубку для сбора 1,5 мл и добавьте 100 МКЛ воды ПЦР-класса на мембрану колонны. Центрифуга на полной скорости в течение 1 мин, чтобы утаить ДНК.
- Оцените концентрацию бисульфит-преобразованного образца ДНК путем измерения абсорбтности на 260 нм с помощью спектрофотометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте значение 40 мкг/мл для поглощения при 260 нм и 1,0. - Храните ДНК при -20 градусов по Цельсию для кратковременного хранения или при -70 градусов по Цельсию для длительного хранения.
4. Изготовление устройств поколения капель
ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидное устройство, используемое для генерации капель (cad файл, представленный в дополнительной информации) был изготовлен в чистой комнате (класс 1000) окружающей среды в термопластичном еластомер (см. Таблица материалов) с использованием горячего тиснирования порожденных следующим протоколом.
- Изготовление плесени СУ-8
- Подготовь форму СУ-8 на 6-"силиконовой пластине, используя стандартную фотолитографию, как описано ниже.
- Очистите 6-процентную кремниевую пластину с использованием кислородной плазмы при 500 Вт на 10 с.
- Spin-coat SU-8 сопротивляется кремниевой пластине при 900 об/мин при 40 с для достижения общей толщины пленки 100 мкм.
- Поместите на горячую тарелку и предварительно выпекайте в течение 15 мин при температуре 65 градусов по Цельсию, а затем 2 ч при температуре 95 градусов по Цельсию.
- Подвергать воздействию УФ-излучения на 365 нм (Hg i-line) через фотомаск прозрачности высокой четкости с использованием дозы воздействия 1000 мДж/см2.
- Поместите на горячую тарелку и пост-выпекать в течение 15 мин при температуре 65 градусов по Цельсию, а затем 40 мин при температуре 95 градусов по Цельсию.
- Развивайте, погружаясь в пропиленгликоль монометил эфир ацетат (PGMEA) в течение 5 мин.
- Промыть PGMEA и изопропанолом и высушить потоком азотного газа.
- Поместите на горячую тарелку и жесткого выпекать в течение 2 ч при температуре 135 градусов по Цельсию.
- Силанизируйте в вакуумном децикаторе, содержащем каплю силанизирующего агента (трихолоро перфтороктиль силан), помещенного на соседнюю стеклянную микроскопическую горку на 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для того, чтобы силаны образуют монослой на поверхности мастера СУ-8. Трихолоро perfluorooctyl силан всегда должны быть обработаны в дым капот и держаться подальше от источников воды.
- Полидиметилсилоксан (PDMS) реплики
- Подготовка жидких преполимеров PDMS (см. Таблицу материалов)при соотношении 10:1 ж/в базы еластомера для лечения агента в пластиковом стаканчике.
- Поместите чашку в планетарный центробежный вакуумный смеситель для смешивания и дегазации смеси PDMS.
- Налейте смесь PDMS на форму, помещенную в пользовательский держатель металла, который предотвращает утечку смолы и вылечить при 65 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
- Используя пинцет, аккуратно снимите форму PDMS с мастера СУ-8.
- Эпикси плесень
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпоксидная плесень была изготовлена из СУ-8/силиконового мастера с использованием промежуточного процесса репликации с PDMS.- Подготовка эпоксидной смолы (см. Таблица материалов) с использованием 100/83 ж / в соотношении смолы / затвердевания.
- Дега смесь под пониженным давлением с помощью вакуумной сушильной печи в течение 30 мин.
- Налейте смолы на реплики PDMS и вылечить при 80 градусов по Цельсию в течение 12 ч.
- Удалите вылеченную эпоксидную плесень из реплики PDMS, поместите на горячую тарелку и жесткого выпекать в течение 2 ч при температуре 120 градусов по Цельсию.
- Устройство TPE
- Экструд гранулы TPE (см. Таблица материалов) при 165 градусов по Цельсию в 2,0 мм толщиной и 7 "широкие листы несколько метров в длину и хранить их в качестве рулона для использования в будущем.
- Вырезать лист TPE из рулона с помощью ножниц в 7 "квадрат.
- Поместите лист TPE между эпоксидной плесенью и не узорчатой силанизированной кремниевой пластиной (см. шаг 4.1.10 для процедуры вафельной силанизации).
- Выполняем горячее тиснение при температуре 125 градусов по Цельсию, прикладную силу 10 кН и давление 10-2 мбар в течение 10 мин.
- Demold тщательно при комнатной температуре с помощью метанола спрей отделить тиснением TPE от кремниевой пластины и эпоксидной плесени.
- Вырезать еще 7 "квадратный лист TPE и поместить его между двумя не-узорчатых силанизированных кремниевых пластин.
- Выполните горячее тиснение при температуре 140 градусов по Цельсию, прикладную силу 10 кН и давление 10-2 мбар в течение 10 минут, чтобы сформировать планарную поверхность для закрытия каналов и уплотнения устройства.
- Demold тщательно при комнатной температуре с помощью метанола спрей отделить тиснением TPE от двух кремниевых пластин.
- Вырезать каждый из тиснением TPE листов до размера устройства с помощью врача лезвие.
- Удар отверстия доступа для входных и розетки каналов в структурированное устройство с помощью 1 мм биопсии удар иглы с поршень.
- Завехайте каналы, поместив планарное устройство TPE в прямой контакт с каналами при комнатной температуре.
- По желанию, поместите в духовку при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 2 ч для содействия склеиванию устройства.
- Подходит для доступа отверстия с одноразовыми жидкостными трубками (I.D. 0.25 мм, O.D. 0.8 мм). Печать суставов с помощью эпоксидного клея для обеспечения утечки доказательство манипуляции.
5. Поколение капель и ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 излагается информация о форвардных и обратных грунтовок вместе с двойной утоленной гидролиз зондов для C-LESS, CD3 и Foxp3 генов, которые необходимы для мультиплексного усиления деметилированных целей гена.
- Подготовьте мастер-микс, описанный в таблице 2.
- Оттепель все компоненты мастер смеси, за исключением ферментной смеси. Смешайте мастер смесь тщательно по трубопроводу вверх вниз и спина вниз кратко.
- Добавьте соответствующий объем (1 л) бисульфита преобразованной ДНК (из раздела 3.2) для мастер-микса в трубке ПЦР. Смешайте реакцию, трубя вверх-вниз и спина вниз кратко.
- Подключите одноразовые жидкостные трубки (I.D. 0,25 мм, O.D. 1,6 мм) к двум точным стеклянным шприцам (объем 250 мкл) с помощью фитингов PEEK.
- Предварительно заполнюйте один точный стеклянный шприц с 250 МЛ несущего масла, содержащего 5% фтор-сурфактанта.
- Предварительно заполнюйте еще один высокоточный стеклянный шприц с 50 мл масла перевозчика перед загрузкой 100 МКЛ смеси ПЦР для обеспечения распределения всего объема образца во время эмульсификации.
- Настройка капельного микрофлюидного устройства на сцене вертикального светового микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой для наблюдения и записи образования капель в режиме реального времени.
- Поместите предварительно заполненные шприцы на программируемый шприц-насос и Table of Materialsс помощью peek союза с фитингами (см. Таблицу материалов), подключите трубки шприцев к трубе соответствующих входных каналов микрофлюидного устройства капли.
- Поместите трубки из розетки генератора капель внутри трубки ПЦР 0,5 мл.
- Отрегулируйте скорость потока шприц-насоса до 2 мкл/мин и позвольте размеру капли стабилизироваться перед сбором полученной эмульсии.
- Соберите эмульсию и перенесите 75 мкл в трубку ПЦР 0,2 мл для теплового езды на велосипеде.
- Убедитесь, что содержание масла в ПЦР-трубке близко соответствует объему рассеянной фазы, чтобы предотвратить слияние капель во время теплового цикла.
- Поместите трубку ПЦР 0,2 мл в тепловой циклер и выполните протокол езды на велосипеде следующим образом: разогрев при 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, затем 45 циклов денатурации при 95 градусов по Цельсию на 15 с и аннеалирование/расширение при 60 градусов по Цельсию на 30 с.
- Используйте оставшуюся эмульсию, чтобы заполнить боросиликатную капиллярную трубку (100 мкм глубиной) прямоугольным профилем, чтобы издать капли и оценить диаметр капли.
- Поместите боросиликатную трубку, наполненную эмульсией, на слайд микроскопа. Используйте перевернутый микроскоп, оснащенный камерой EMCCD и 10x цель для записи ярких полевых изображений капель.
- Измерьте диаметр капли с помощью программного обеспечения для анализа изображений, как описано ниже.
- Установите шкалу известного расстояния в микронах, соответствующую количеству пикселей на изображении,выбравкнопку «Анализ», а затем«Установить шкалу».
- Преобразуем изображение в серый масштаб, выбравкнопку «Изображение»,а затем«Тип». При необходимости отрегулируйте яркость и контрастность. Установите ручной порог, чтобы разграничить и заполнить круги, выбравкнопку 'Изображение', а затем 'Отрегулируйте порог'.
- Проанализируйте частицы, выбравкнопку «Анализчастиц» и установив круговорот до 0,75 – 1.
- Получить полученную площадь и диаметр измеренных капель, которые автоматически отображаются в программном обеспечении.
- Вычислите средний диаметр капли и предполагая сферическую каплю, оцените объем перегородки, который будет использоваться для расчета абсолютной целевой концентрации.
- Убедитесь, что капли являются монодисперсами, анализируя коэффициент изменения (CV), который считается соотношением стандартных отклонений к средним значениям(k No 1), для диаметра капли (lt; 3%).
6. Флуоресценция изображений и анализа изображений
- Флуоресценция изображения
- После усиления перенесите эмульсию ПЦР в борозиликатную капиллярную трубку (глубина 50 мкм) с прямоугольным профилем, чтобы упорядочить капли в плотно упакованный монослой для визуализации.
- Зафиксните заполненные капилляры на слайде микроскопа и запечатайте обе стороны с помощью УФ-акрилового клея. Нанесите источник УФ-излучения на уф-клей, чтобы не освещать эмульсию, чтобы избежать отбеливания образца.
- Загрузите стеклянную горку на перевернутый микроскоп, оснащенный камерой EMCCD и 10-й целью.
- Используя программное обеспечение для визуализации микроскопа, выберите Acquire Live - Быстро, чтобы начать в режиме реального времени приобретение камеры, наблюдать за образцом, и убедитесь, что ширина капилляра захвачен.
- Установите яркую полю лампу для диаскопикового освещения на 3,5 В.
- Установите светодиодную люминесцентную лампу широкого спектра действия для эпископического освещения на 20% интенсивности.
- Отрегулируйте настройку захвата для всех длин волн (Яркое поле, FAM, HEX и Cy5) вручную, выбрав Калибровку Оптические конфигурации команды в программном обеспечении изображений. Для каждого флюорофора необходимо вручную переключить соответствующий куб фильтра флуоресценции. Куб фильтра для изображения яркого поля должен использоваться для времени того же оптического пути.
- Отрегулируйте время экспозиции вручную перед приобретением изображения с помощью Acquire Команда настроек камеры для каждого флюорофора, как обобщено в таблице 3. Установите режим считывания EM получить 17 МГц на 16-битный с увеличением множитель 100 в 'Захват Настройки' меню программного обеспечения.
- В окне LUT программного обеспечения установите шкалу LUTs так, чтобы сигнал передачи был охвачен в пределах установленного диапазона. В этом эксперименте шкала была установлена от 500 до 12000 примерно.
- Автоматизация захвата с помощью многоапунктной программы приобретения с помощью сканирования XY и нескольких вариантов длины волны в этом конкретном порядке. Убедитесь, что этап перемещается в исходное положение, захватить все различные длины волн, а затем перейти к следующему положению.
- Во-первых, настройка XY-сканирования путем настройки профиля сканирования XY в меню сканирования XY программного обеспечения. В'Custom Multipoint Definition',выберите большую коробку определения изображения и установите ее на 40,0 х 1,0 мм приблизительно (длина эмульсии заполнения). Используйте перекрытие 1%.
- Включите опцию'Use Focus Surface'и навейте кривую поверхности фокусировки, регулируя плоскость фокусировки в разных точках образца с помощью ручки фокусировки на микроскопе.
- Во-вторых, настройка сканирования нескольких длин волн путем выбора вкладки сканирования. Добавьте каждую из оптических конфигураций, созданных в шаге 6.1.7 для каждой длины волны.
- Нажмите на опцию, чтобы закрыть активный затвор во время движения этапа и во время изменения фильтра, чтобы избежать отбеливания образца и запустить приобретение, нажавкнопку 'Start Run'. Экспорт каждого кадра приобретения в файлы tiff и разделить каждый канал на разделенный файл, используя раздельный вариант нескольких файлов и применяя сохраненные настройки LUTs. Используйте опцию имени точки и имени канала, чтобы легко дифференцировать каждый файл изображения.
- Анализ изображений
- Сортировать все приобретенные изображения с помощью ярких полевых и флуоресцентных фильтров для загрузки в программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом.
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений для создания конвейера для идентификации всех капель с помощью изображений яркого поля, а затем измерить интенсивность связанных флуоресцентных капель.
- Чтобы конвейер, загрузить яркие поля и флуоресценции tiff изображения затем добавить модули 'ColorToGray', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectIntensity', и 'ExportToSpreadsheet'. Используйте изображения капли яркого поля для идентификации объектов, а затем используйте объекты в качестве маски для измерения интенсивности флуоресцентных изображений.
- Запустите конвейер с выбранными изображениями tiff для извлечения средней интенсивности флуоресценции изображений капель флуоресценции. Проведите эксперимент в триплете, каждый набор состоит из 5000 капель для анализа.
- Применитеалгоритм 'definetherain'(http://definetherain.org.uk/) для определения положительных и отрицательных кластеров капель. Положительные стороны должны быть в пределах 3 стандартных отклонений от среднего. Это определяет пороговую интенсивность положительных капель, которые будут использоваться для подсчета.
- Снова используйте программное обеспечение для анализа изображений для реализации нового конвейера, где порог флуоресценции для каждой цели гена устанавливается, как это определено на предыдущем этапе.
- Загрузите яркие и флуоресцентные изображения в конвейер. Добавьте модули 'ColorToGray','RescaleIntensity','Порог','ОпределитеПримариОбъекты','MeasureObjectSizeShape','FilterObjects', и 'ExportToSpreadsheet'. Создавайте уникальные модули для ярких изображений и каждый флуоресцентный фильтр для капель.
- Шкала интенсивности изображения от 0 до 1 для каждой группы изображений флуоресценции. Затем установите порог для определения и подсчета объектов выше установленного порога. При необходимости добавьтемодуль ExpandOrShrinkObjectsдля сжатия объектов для облегчения подсчета и идентификации капель в ярком поле.
- Определите только объекты в пределах выбранного размера 20-30 пикселей и отфильтруйтесь подсчитанные объекты только для удержания этих объектов с определенным диаметром (т.е. капель в диапазоне диаметром 75 мкм) и круглой сферической эксцентричностью 0,5 и ниже.
- Экспорт результатов в таблицу, которая перечисляет общее количество капель из изображений яркого поля, а также количество капель всех используемых каналов флуоресценции; а именно Cy5 для гена C-LESS, HEX для метилированного гена CD3 и FAM для метилированного гена FOXP3 (см. Дополнительную информацию для необработанных экспериментальных данных, полученных для представленного анализа mdPCR).
- Рассчитайте соотношение отрицательных капель для каждой цели гена и примените распределение Пуассона для получения соответствующих копий на каплю (CPD) с помощью Equation 1:
где x представляет количество капель, содержащих 0, 1, 2 или более молекул, и представляет значение CPD. - Рассчитайте абсолютную целевую концентрацию, взяв соотношение значения CPD и объем капли, полученный в шаге 5.20 с уравнением 2:
где значение (1-p) представляет собой долю отрицательных капель. - Рассчитайте процентCD3 - T-Cells и CD4- CD25- T-Regs, разделив соответствующие значения CPD метилированных генов CD3 и FOXP3 на C-LESS - или общую ячейку - значение CPD (см. Дополнительную информацию для расчетов CPD из необработанных данных).
- Сравните эти процентные значения с значениями, полученными в результате иммунофлуоресценции изображений с использованием антител дляCD3 и T-Cell иCD4 , CD25+ и T-Reg подсчета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Устройство генератора микрофлюидных капель на основе TPE было изготовлено с использованием описанного протокола, как показано на рисунке 1. Маска прозрачности была использована в фотолитографии для получения кремния (Si) мастер. Мягкая литография была выполнена для получения обратной реплики PDMS мастера Si, который затем был использован для изготовления эпоксидной плесени. Прекурсор Epoxy был налил на PDMS и вылечить для перекрестного и затвердевания. Эта плесень, представляющая точную копию мастера Si, была более упругой для последующего термоформирования термопластика с помощью горячего тиснирования. После того, как эпоксидная плесень была получена, термопластичный еластомер был тиснением. После тиснением, TPE был понижен, и устройства были сокращены. Для уплотнения устройства использовался плоский субстрат TPE. Отверстия были пробита в верхней крышке, и два субстрата были связаны. Наконец, были вставлены необходимые трубки для соединения между миром и чипом, и устройство было готово к использованию. Образцы изображений изготовленной формы мастера, материала TPE и тиснением устройств показаны на рисунке 2. Собранное устройство с трубчатыми соединениями эксплуатировалось с парой независимых программируемых шприц-насосов для генерации эмульсий для mdPCR. Метилирование конкретных mdPCR была выполнена с использованием бисульфита обработанной ДНК, извлеченной из замороженных ПХМТ. Соответствующие грунтовки и гидролизные зонды для CD3, FOXP3 и C-Less генов были добавлены в смесь ПЦР для эмульсификации. После генерации капель соответствующего размера (примерно 72 мкм в диаметре) эмульсия была подвергнута тепловому протоколу езды на велосипеде. Наконец, капли были введены в стеклянный капилляр шириной 1 мм и высотой 50 мкм для визуализации. Это приводит к монослойное распределение капель идеально подходит для флуоресценции изображения приобретения (Рисунок 3). Изображения были записаны для каждой из четырех длин волн. Затем был проведен анализ изображений для выявления всех капель(рисунок 4), которые соответствует пороговымкритериям, установленным с помощью алгоритма "definetherain". Затем устанавливается интенсивность флуоресценции всех капель в соответствующих флюорофорах и установлен порог положительных иотрицательных капель (рисунок 5). Впоследствии была проведена идентификация и подсчет этих капель, которые были выше выбранного порога. Затем были рассчитаны значения CPD, и процент CD3- T-Cell иCD4 - 25 T-Regsбыл установлен на основе метилированных копий CD3 и FOXP3, соответственно, по отношению к CPD общих клеток, или гену C-LESS(рисунок 6). Процентные значения затем сравнивались с значениями, полученными с помощью иммунофлуоресценции Т-клеток и Т-рег населения с использованием соответствующих антител.
| FOXP3 Вперед | GGG TTT TGT TGT ТАТ АГТ TTT TG | |
| FOXP3 Обратный | TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA | |
| CD3 " Вперед | GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG | |
| CD3' Обратный | CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA | |
| C-LESS Вперед | TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA | |
| C-LESS Обратный | TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C | |
| Зонд FOXP3 | /56-FAM/CA ACA CAT C/ЗЕН/C AAC CAC CAT /3IABkF/ | |
| Зонд CD-3 | /56-HEX/CC AAC CAC C/ЗЕН/A CTA CCT CAA /3IABkF/ | |
| C-Less зонд | /56-CY5/CT CCC CCT C/ДЗЕН/Т AAC TCT AT/3IABKF/ | |
Таблица 1: Конструкция зонда Primer и гидролиза.
| Реагента | Фондовое решение | Мастер Микс Том | Рабочая концентрация |
| Трис-HCl | 1 М | 2 МЛ | 20 мМ |
| Kcl | 1 М | 10 йл | 100 мМ |
| MgCl2 | 25 мМ | 16 йл | 4 мМ |
| C-LESS Праймеры | 10 МКМ | 10 йл | По 1 МКМ каждый |
| Праймеры CD3 | 10 МКМ | 10 йл | По 1 МКМ каждый |
| FOXP3 Праймеры | 10 МКМ | 10 йл | По 1 МКМ каждый |
| Зонд C-LESS | 10 МКМ | 5 мкл | 500 нм |
| Cd3 зонд | 10 МКМ | 5 мкл | 500 нм |
| Зонд FOXP3 | 10 МКМ | 5 мкл | 500 нм |
| HotStarTaq ДНК полимераза | 5 единиц/КЛ | 8 йл | 0,4 единицы/КЛ |
| Бисульфит-обработанная цель ДНК | Переменной | Переменной | Переменной |
| Вода без нуклеазы | Переменной | ||
| Общий объем | 100 мкл |
Таблица 2: Мастер рецепт смеси для mdPCR.
| Оптическая конфигурация | Воздействия | Лампа DIA | Флуоресцентный свет |
| Яркое поле | 50 мс | На | ВЫКЛЮЧЕНО |
| Fam | 300 мс | ВЫКЛЮЧЕНО | 20% |
| Шестигранный | 300 мс | ВЫКЛЮЧЕНО | 20% |
| Cy5 | 400 мс | ВЫКЛЮЧЕНО | 20% |
Таблица 3: Настройки для оптической конфигурации и получения изображений.
Рисунок 1: Быстрое прототипирование генератора капель. Схематическая иллюстрация процесса, используемого для изготовления ( A )мастерформы и ( B )TPEоснове микрофлюидной эмульсификации устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Компоненты, участвующие в процессе изготовления. (A) Силиконовый мастер, (B) PDMS реплики, ( C ) эпоксиднойплесени,( D ) TPE материал экструдирован в листы и упакованы вCрулонах,( E ) тиснением TPE и (D) собранное устройство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Флуоресценция изображения приобретения капель после тепловой езды на велосипеде. (A) Brightfield изображение капель в капилляре, что позволило монослойное изображение приобретения. (B) Cy5 фильтр изображение C-LESS цели гена, представляющие общее количество клеток. (C) HEX фильтр изображение метилированного CD3 "ген цели коррелирует с CD3и T-Cell кол. (D) FAM фильтр изображение метилированного FOXP3 ген цели коррелирует сCD4 и CD25+ T-Reg кол. Шкала бар составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Трубопровод, используемый для определения капель, которые соответствуют пороговой интенсивности. Изображения были впервые организованы в соответствующие фильтры флуоресценции с использованием имен файлов. Изображения затем были преобразованы в серый масштаб и относительная итензиция rescaled на основе минимальной и максимальной интенсивности флуоресценции капель. Порог был затем выбран в соответствии с значениями, полученными из алгоритма "definetherain", и объекты - или капли - в соответствии с определенными критериями были определены и количественно. Наконец, объекты были отфильтрованы в соответствии с эксцентриситетом и размером, чтобы получить уточненное количество капель сферических объектов, встречая размер диаметром 75 мкм. Количественные объекты и их интенсивности затем экспортировались в программное обеспечение электронной таблицы для анализа ниже по течению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Интенсивность рассеяния участков для флуоресценции интенсивности капель после mdPCR. (A) Усиление гена C-LESS с помощью гидролизного зонда Cy5, представляющего общее количество клеток, поскольку целевая область была лишена остатков цитозина и, следовательно, устойчива к лечению бисульфитом. (B) Метилированное усиление гена CD3 с помощью гидролизного зонда HEX, что свидетельствует опопуляции CD3 и Т-клеток. (C) Метилированное усиление гена FOXP3 с помощью зонда гидролиза FAM, представляющего популяциюCD4 и CD25.+ Все участки рассеяния были подвергнуты алгоритму "definetherain", чтобы установить соответствующий порог, при котором срабатывания находились в пределах 3 стандартных отклонений от среднего положительного кластера. Количество «дождя» также было установлено таким образом, что оно превышает 1% от положительных определенных капель. Каждый набор данных для анализа состоял из 5000 капель и запускался в триплете (см. Дополнительную информацию для необработанных данных и анализа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: CPD значения всех целей гена и определение белых кровяных клеток подмножество процент. (A)Рассчитанные значения CPD на основе распределения Пуассона положительного количества капель как соотношения общего количества капель. Вход представляет собой теоретический CPD ожидается на основе 740 нг бисульфита лечение ДНК, 75 мкм диаметр капель, предполагая, 6,6 пг для 1 копия гена. Теоретический ввод CPD составил 0,25 и коррелировал с C-LESS CPD, представляющим общее количество ячеев. (B) Соотношение CPD для CD3 и FOXP3 по отношению к C-LESS затем был использован для получения процентаCD3 и T-Cells и CD4и CD25+ и T-Regs, соответственно. Эти соотношения в процентах от общего числа лейкоцитов затем сравнивались со значениями, полученными с помощью иммунофлуоресценции изображений. Как было продемонстрировано, значения анализа mdPCR и иммунофторесценции коррелируют без существенной разницы, при этом стандартные ошибки отклонения от mdPCR гораздо менее выражены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная информация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный экспериментальный протокол и методы позволяют в доме mdPCR с помощью изготовленного генератора капель TPE, тепловой циклер, и флуоресцентный микроскоп. Изготовленное устройство с использованием мягкого TPE для связи TPE обеспечивает гидрофобные свойства поверхности, которые являются однородными во всех стенках канала, так что окончательное устройство не требует какой-либо обработки поверхности для последующего использования в качестве генератора капель. Этот материал регулярно используется в точках ухода платформ, которые требуют совместимости с высокой пропускнойспособностью производства 9,,10,11,12,13. Кроме того, он также оптически ясок и демонстрирует низкий фон флуоресценции в видимом спектре, что является привлекательной особенностью для будущей интеграции полного рабочего процесса от образца к ответу с использованием mdPCR. Рецепты реагентов ПЦР также предоставляются в формате доморощенного, чтобы обеспечить поверхностную количественную количественную количественное оценку генов мультиплекса, сохраняя при этом стабильность на протяжении всего теплового велосипедного протокола. Одним из преимуществ представленных устройств и протоколов является гибкость в настройке конструкции устройства и реагентов, используемых для конкретного приложения, чего трудно достичь с помощью коммерческих продуктов и фирменных формулировок. Кроме того, он устраняет необходимость дорогостоящих приборов для выполнения эксперимента.
Соответствующий термопластичный выбор материала генератора микрофлюидных капель является критическим параметром, который может обойти громоздкую обработку поверхности, чтобы сделать устройство гидрофобным для эффективного образования капель. Кроме того, выбор оптимизированного буфера mdPCR также имеет решающее значение для поддержания стабильности капель в процессе теплового цикла – при этом не ставя под угрозу эффективность ПЦР и функциональность зонда гидролиза. Поэтому дальнейшая модификация и оптимизация буфера mdPCR поощряется к достижению весьма специфического и чувствительного усиления ПЦР выбранных целей генов в сочетании с обнаружением зондов на основе флуоресценции. Это служит для увеличения соотношения сигнала к шуму, сокращения случаев "дождя" и упрощения экспериментального анализа и идентификации популяций положительных капель. Устранение неполадок в эксперименте зависит от оценки критических шагов от выбора термопластичного материала до концентрации полимеразы до адаптации температурного пандуса в тепловой велосипедной программе для обеспечения стабильности капель.
Нынешнее ограничение описанного протокола заключается в том, что он по-прежнему требует ручной передачи образца от генератора капель к теплотрассе и, наконец, к устройству и прибору для визуализации капель, таким как флуоресцентный микроскоп. Однако будущие усилия направлены на миниатюризацию mdPCR и интеграцию этих шагов, в соответствии с которой генерация капель, ПЦР и визуализация могут выполняться на одной автоматизированной платформе.
Полученные результаты на рисунке 6 демонстрируют универсальность этого подхода mdPCR для выполнения дифференциальной количественной оценки белых кровяных телец. Предлагаемый метод является более точным и воспроизводимым, чем иммунофлуоресценция изображения, которые часто страдают от манипуляций пользователей, что приводит к нежелательным ошибкам измерения. Это также имеет место для методов цитометрии потока, которые также полагаются на иммунный метод обнаружения, который в значительной степени зависит от жизнеспособности клеток, а также несколько этапов протокола, подверженных ошибке пользователя. Альтернативные методы, такие как количественный ПЦР в реальном времени (qPCR) для количественной оценки, часто отрицательно влияют на низкие цели гена числа копий, недостаток, который исправляется с помощью mdPCR без необходимости выделенной кривойкалибровки 11. Таким образом, представленный подход mdPCR представляет собой уникальный молекулярный подход к дифференциальным показателям белых кровяных клеток, основанный на профилях метилирования конкретных целей генов. Кривые калибровки для отдельных целей генов также не являются необходимыми, так как mdPCR основан на абсолютной количественной оценке бинарных положительных и отрицательных сигналов с использованием распределения Пуассона для расчета CPD.
Точная количественная оценка не метилированных островов генов, особенно генов с низким числом копий, таких как FOXP3, открывает множество возможностей для клинической диагностики. Об этом свидетельствует способность такого подхода выявлять известные модели метилирования, коррелированные с началом и прогрессированием заболевания. mdPCR, как молекулярный подход с абсолютной количественной оценкой может быть использован за пределами метилирования исследований и может быть применен к надлежащим сохраненным образцам, таким образом, устранение зависимости от свежих клинических образцов, и дальнейшее расширение его применения. Будущая автоматизация и миниатюризация этого метода будет иметь большое значение для быстрой и точной клинической диагностики и последующего прогноза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликтов, которые будут объявлять, нет.
Acknowledgments
Авторы признают финансовую поддержку со стороны Национального исследовательского совета Канады.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
