Summary
Epigenetiske markører brukes til underskriving av hvite blodlegemer (WBC) gjennom kvantifisering av DNA-metyleringsmønstre. Denne protokollen presenterer en multipleks dråpepolymerasekjedereaksjonsmetode (mdPCR) ved hjelp av en termoplastisk elastomer (TPE)-basert mikrofluidisk enhet for dråpegenerering, noe som gir presis og multipleks metyleringsspesifikk målkvantifisering av WBC differensialtellinger.
Abstract
En multipleksed dråpe PCR (mdPCR) arbeidsflyt og detaljert protokoll for å bestemme epigenetisk-baserte hvite blodlegemer (WBC) differensial teller er beskrevet, sammen med en termoplastisk elastomer (TPE) mikrofluidisk dråpe generasjon enhet. Epigenetiske markører brukes til WBC-underskriving som er av viktig prognostisk verdi i forskjellige sykdommer. Dette oppnås gjennom kvantifisering av DNA-metyleringsmønstre av spesifikke CG-rike regioner i genomet (CpG loci). I dette papiret er bisulfittbehandlet DNA fra perifere blodmononukleære celler (PBMCer) innkapslet i dråper med mdPCR-reagenser, inkludert primere og hydrolysefluoresestråler som er spesifikke for CpG loci som korrelerer med WBC-underpopulasjoner. Multiplekstilnærmingen muliggjør avhør av mange CpG loci uten behov for separate mdPCR-reaksjoner, noe som muliggjør mer nøyaktig parametrisk bestemmelse av WBC-underpopulasjoner ved hjelp av epigenetisk analyse av metyleringssteder. Denne presise kvantifiseringen kan utvides til ulike applikasjoner og fremhever fordelene for klinisk diagnose og påfølgende prognose.
Introduction
Analyse av sammensetning av hvite blodlegemer (WBCer) er blant de mest etterspurte laboratorietestene i hematologisk diagnostikk. Differensial leukocytt teller fungerer som en indikator for et spekter av sykdommer, inkludert infeksjon, betennelse, anemi, og leukemi, og er under etterforskning som en tidlig prognostisk biomarkør for flere andre forhold også. Gullstandard i WBC-underskriving innebærer immunstaining og/eller strømningscytometri som begge krever kostbare, ustabilitetsutsatte fluorescerende antistoffer og er ofte svært avhengige av operatørferdigheter i prøveforberedelse. Videre gjelder denne metoden kun for ferske blodprøver, slik at prøvene ikke kan fryses for forsendelse eller senere analyse.
Epigenetiske markører har nylig dukket opp som kraftige analytiske verktøy for studiet av fenotypiske variasjoner. Deretter har humane leukocytterpopulasjoner vist seg å ha cellelinje DNA-metyleringsmønstre som tillater nøyaktig karakterisering av WBC-undergrupper. Subtyping basert på epigenetiske markører gir et lovende alternativ som ikke er avhengig av fersk blodprøve samling eller dyre antistoffer og kan utnyttes som en biomarkør for sykdom utbruddet ogmottakelighet 1,2,3,4,5.
Genomomfattende studier er utført for omfattende kartlegging av metylertspesifikke CG-rike regioner i genomet (CpG-øyene) i leukocytterundertyper for å identifisere kandidatepigenetiske markører som er spesifikke for leukocytterundertyper. PCR-protokoller er utviklet på grunn av denne årsaken til metylert genregioner, for eksempel CD3Z og FOXP3, tilsvarende CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ Regulatoriske T-celler (T-Regs), henholdsvis. Wiencke et al. har demonstrert nytten av dupleksdråpe PCR for epigenetisk underskriving av T-celler, noe som gir resultater som er svært korrelerer med flytaktivert cellesortering (FACS) analyse6. Denne kvantitative genetiske analysemetoden er avhengig av å partisjonere malen nukleinsyremolekyler og PCR-reagenser i tusenvis av diskrete, volumetrisk definerte, sub-nanoliter størrelse dråper som inneholder null, en eller flere mål nukleinsyre kopier, ved hjelp av vann-i-olje emulsjoner aktivert av microflucs7,8. PCR-forsterkningen utføres innenfor hver enkelt dråpe, og endepunktets fluorescensintensitet for hver dråpe måles, slik at absolutt kvantifisering av mål som finnes i prøven. Dråpe-PCR er etablert for å være mer presis, nøyaktig og teknisk enklere enn standard qPCR, noe som gjør det til en gunstigere DNA-metyleringsbasert metode for klinisk evaluering av T-celler. Selv om en raskt fremvoksende underskrivingsmetodikk, mangler multipleksed epigenetisk analyse for å sondere for ulike metylerte CpG-regioner samtidig. Dette er nødvendig for rutinemessig leukocytt differensial teller.
Her presenteres en termoplastisk elastomer (TPE) dråpe mikrofluidisk enhet og brukes for metyleringsspesifikt multipleksdråpe PCR (mdPCR). Teknologien har blitt brukt til å avgrense spesifikke leukocytter undertyper, CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs, basert på celle-lineage DNA metylering mønstre, det vil si epigenetisk variasjon av CD3Z og FOXP3 CpG regioner, henholdsvis. En detaljert protokoll for DNA-ekstraksjon, bisulfittkonvertering og mdPCR er beskrevet sammen med en fabrikasjonsmetode for en TPE-dråpegenereringsenhet. Representative resultater av metoden sammenlignes med de av immunofluorescence farging fremhever nytten av den foreslåtte tilnærmingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene som ble utført i denne studien som involverte menneskelige prøver ble godkjent av NRCs etikkråd og ble gjort i henhold til NRCs retningslinjer for menneskelige som følger gjeldende forskningsretningslinjer og er i samsvar med lovene i Québec, Canada.
1. Celle forberedelse
- Tin de frosne mononukleære cellene i humant perifert blod (PBMCer) umiddelbart ved å plassere kryovialen i et vannbad ved 37 °C i 5 min.
- Inverter kryovial to ganger for å forsiktig gjenopplive cellene og ved hjelp av en 1 ml pipette overføre celle suspensjon til en 15 ml konisk rør.
- Tilsett 10 ml forvarmet (37 °C) vekstmedium supplert med 10 % fosterbovinserum (RPMI-1640 + 10 % FBS) til 15 ml-røret som inneholder PBMCene.
- Sentrifuger cellefjæringen i en svingende bøtte sentrifuge ved romtemperatur med en hastighet på 330 x g i 10 min med rask akselerasjon og bremsen på høy.
- Når spinnet er over, forsiktig dekantere supernatant. Resuspend cellepellet i 3 ml fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7.2, som inneholder 2 mM etylendiaminetetraacetic acid (EDTA) ved å trykke på siden av rørene.
- Bland cellene ved å snu røret med hetten tett lukket.
- Forbered to 1,5 ml mikrorør og bruk en pipette aliquot 1,5 ml cellefjæring i hvert rør, hvorav den ene brukes til påfølgende immunofluorescence farging og en for DNA ekstraksjon.
2. Immunofluorescence farging og bildebehandling protokoll
- Resuspend celler (fra 1,7) i 200 μL PBS buffer som inneholder 0,1% natriumazid og 2% FBS og justere den endelige konsentrasjonen av celle suspensjon til maksimalt 2 x 107 celler / ml.
- Del cellefjæringen ved å pipettere 100 μL volum i to separate 1,5 ml mikrorør.
- Tilsett 20 μL volum anti-Hu CD3/CD4 konjugert med Fluorescein isothiocyanat (FITC) og Phycoerythrin (PE) til ett rør og anti-Hu CD4/CD25 konjugert med FITC og PE (se Materialtabell) til andre rør, henholdsvis.
- Legg til 1 dråpe blå fluorescerende levende celleflekk (se Materialtabell)i hvert rør.
- Inkuber ved romtemperatur ved hjelp av en rørrotator i 2 timer. Beskytt mot lys.
- Sentrifuger cellefjæringen ved romtemperatur ved 330 x g i 10 min med rask akselerasjon og bremsen på høy.
- Dekanter den overnaturlige og forsiktig resuspend cellen pellet ved å trykke på røret. Tilsett 1 ml PBS, pH 7,2 som inneholder 2 mM EDTA. Sørg for at hetten er tett lukket, bland cellene ved å invertere røret 2x.
- Gjenta trinn 2.6 og 2.7 for tre ganger.
- Resuspend celler i 20 μL av PBS pH 7,2 som inneholder 2 mM EDTA.
- Pipette 10 μL dråpe cellefjæring på et borosilikatmikroskopsklie og vent i 2 min for celler å sakte sediment til bunnen av dråpen.
- Plasser forsiktig et glassdeksel på toppen av mikroskopsklien og plasser lysbildet på scenen til et omvendt mikroskop.
- Ta opp bilder av cellene ved hjelp av et 10x mål og et EMCCD-kamera koblet til mikroskopet for hver av fluoroforene for begge cellesuspensjonsprøvene.
- Telle fluorescerende merkede celler manuelt (se Tilleggsinformasjon for rådata).
- Ta forholdet mellom anti-Hu CD3 og anti-Hu CD4/CD25 merkede celler til DAPI-farget celler for å oppnå proporsjonene av CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs til total leukocytt.
3. DNA-ekstraksjon og bisulfittkonvertering
- DNA-ekstraksjon
MERK: Trekk ut DNA fra PBMCer utarbeidet i avsnitt 1 ved hjelp av et magnetisk DNA-rensesett (se Materialseksjon) følgende prosedyrer fra produsenten.- I et 1,5 ml rør suspenderer du celler i 100 μL PBS og tilsett 20 μL proteinase K og 400 μL lysis/bindingsbuffer. Bland ved å pipetter opp-ned 10x, og utfør deretter inkubasjon ved romtemperatur i 5 min.
- Fang DNA-perlekomplekset ved å plassere røret på et magnetisk stativ i 1-2 min, og fjern deretter forsiktig og kast det overnaturlige.
- Fjern røret som inneholder DNA-perlekomplekset fra magnetisk stativ og gjenoppuss perlene i 600 μL vaskebuffer #1 for å vaske bort eventuelle ikke-spesifikke bindinger.
- Plasser røret igjen på magnetstativet og fjern og kast overnaturet forsiktig.
- Gjenta trinn 3.1.3 og 3.1.4 med 600 μL vaskebuffer #2.
- La røret være åpent for å tørke i 1 min.
- Fjern røret fra magnetstativet og elute DNA ved å dispensere 100 μL Elution Buffer og pipettering av DNA / perle kompleks opp og ned 20x.
- Plasser røret som inneholder det rømte DNA-et igjen på magnetstativet og inkuber i 1-2 min for å skille de magnetiske perlene fra det rømte DNA-et.
- Overfør den eluted rensede DNA-løsningen til et nytt rent rør.
- Vurder konsentrasjonen av den rensede DNA-prøven ved å måle absorbansen ved 260 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
- Bisulfite konvertering
MERK: Utfør bisulfittkonverteringen på renset DNA ved hjelp av et metyleringssett (se Materialsekk) følgende prosedyrer fra produsenten.- Til 20 μL DNA-prøve (200-500 ng) i et PCR-rør tilsett 130 μL konverteringsreagens. Bland godt og spinn ned kort.
- Overfør PCR-røret til en termisk cycler og utfør sykkelprotokollen på følgende måte: 98 °C i 8 min; 54 °C i 60 min og hold ved 4 °C.
- Legg til 600 μL av bindingsbufferen i en ir-kromatografikolonne (IC) plassert i et oppsamlingsrør.
- Legg til DNA-prøven i IC-kolonnen som inneholder bindingsbufferen og bland ved å invertere røret flere ganger. Sentrifuge for 30 s i full fart. Kast den innsamlede gjennomstrømningen.
- Til kolonnen legger du nå til 100 μL vaskebuffer. Utfør sentrifugering som beskrevet i trinn 3.2.4 og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 200 μl av Desulfonation Buffer og utfør inkubasjon ved romtemperatur i 15-20 min. Sentrifuge og kast gjennomstrømningen som beskrevet i trinnene ovenfor.
- Tilsett 200 μL vaskebuffer i kolonnen. Sentrifuge i full hastighet i 30 s og kast gjennomstrømningen.
- Gjenta trinn 3.2.7.
- Overfør kolonnen til et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør og tilsett 100 μL PCR-graders vann på kolonnens membran. Sentrifuge i full hastighet i 1 min for å elute DNA.
- Vurder konsentrasjonen av bisulfittkonvertert DNA-prøve ved å måle absorbansen ved 260 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
MERK: Bruk en verdi på 40 μg/ml for absorbans ved 260 nm = 1,0. - Oppbevar DNA ved -20 °C for korttidslagring eller ved -70 °C for langtidslagring.
4. Dråpegenereringsenhetsfabrikasjon
MERK: En mikrofluidisk enhet som brukes til dråpegenerering (CAD-fil i tilleggsinformasjonen) ble fabrikkert i et rent rom (klasse 1000) miljø i termoplastisk elastomer (se Materialsetabell ) ved hjelp av varm preging generert av følgende protokoll.
- SU-8 mugg fabrikasjon
- Forbered en SU-8-form på en 6" silisiumwafer ved hjelp av standard fotolitografi som beskrevet nedenfor.
- Rengjør en 6" silisiumwafer ved hjelp av oksygenplasma ved 500 W i 10 s.
- Spin-coat SU-8 motstå på silisium wafer på 900 rpm for 40 s for å oppnå en total filmtykkelse på 100 μm.
- Plasser wafer på en kokeplate og forbak i 15 min ved 65 °C, etterfulgt av 2 t ved 95 °C.
- Utsett UV-lys ved 365 nm (Hg i-line) gjennom en HD-gjennomsiktighet fotomaske ved hjelp av en eksponeringsdose på 1000 mJ/cm2.
- Plasser wafer på en kokeplate og etter bake i 15 min ved 65 °C, etterfulgt av 40 min ved 95 °C.
- Utvikles ved nedsenking i propylenglykol monometyeteracetat (PGMEA) i 5 min.
- Skyll med PGMEA og isopropanol og tørk med en strøm av nitrogengass.
- Plasser wafer på en kokeplate og hard-bake i 2 t ved 135 °C.
- Silanize wafer i vakuum desiccator som inneholder en dråpe silaniseringsmiddel (tricholoro perfluorooctyl silane) plassert på en tilstøtende glass mikroskop lysbilde i 2 timer.
MERK: Dette gjøres for å få silanene til å danne et monolag på overflaten av SU-8-mesteren. Tricholoro perfluorooctyl silan bør alltid håndteres i røykhetten og holdes borte fra vannkilder.
- Polydimetylsiloxane (PDMS) replika
- Klargjør flytende prepolymerer av PDMS (se Materialse tabell) med et forhold på 10:1 m/w av elastomerbase til herdingsmiddel i en plastkopp.
- Plasser koppen i en planetarisk sentrifugalvakuummikser for å blande og degas PDMS-blandingen.
- Hell PDMS-blandingen på formen som er plassert i den tilpassede metallholderen som forhindrer harpikslekkasje og herd ved 65 °C i 2 timer.
- Bruk pinsett, forsiktig skrelle av PDMS mold fra SU-8 master.
- Epoksy mugg
MERK: En epoksyform ble fabrikkert fra SU-8/silisiummasteren ved hjelp av en mellomliggende replikeringsprosess med PDMS.- Klargjør epoksyharpiksen (se Materialsetabell ) med et forhold på 100/83 m/w-forhold mellom harpiks/herder.
- Degas blandingen under redusert trykk ved hjelp av en vakuumtørkende ovn i 30 min.
- Hell harpiksen over PDMS-replikaen og kur ved 80 °C i 12 timer.
- Fjern den herdede epoksyformen fra PDMS-replikaen, plasser på en kokeplate og hardbake i 2 timer ved 120 °C.
- TPE-enhet
- Ekstruder pellets av TPE (se Materialtabell)ved 165 °C i 2,0 mm tykke og 7" brede ark på flere meter i lengde og oppbevar dem som en rull for fremtidig bruk.
- Klipp TPE-arket fra rullen med saks i en 7 "firkant.
- Plasser TPE-arket mellom epoksyformen og en ikke-mønstret silanisert silisiumwafer (se trinn 4.1.10 for wafer silaniseringsprosedyre).
- Utfør varm preging ved en temperatur på 125 °C, en påført kraft på 10 kN og et trykk på 10–2 mbar i 10 min.
- Demold nøye ved romtemperatur ved hjelp av metanol spray for å skille preget TPE fra silisium wafer og epoxy mold.
- Klipp en annen 7 "firkantet ark med TPE og plassere den mellom to ikke-mønstrede silanisert silisium wafers.
- Utfør varm preging ved en temperatur på 140 °C, en påført kraft på 10 kN, og et trykk på 10–2 mbar i 10 min for å danne en planal overflate for å lukke kanalene og forsegle enheten.
- Demold nøye ved romtemperatur ved hjelp av metanol spray for å skille preget TPE fra de to silisium wafers.
- Klipp hvert av de pregede TPE-arkene til enhetsstørrelsen ved hjelp av et legeblad.
- Punch tilgangshullene for innløps- og utløpskanalene i den strukturerte enheten ved hjelp av en 1 mm biopsistanse nål med et stempel.
- Ved å plassere en planar TPE-enhet i direkte kontakt med kanalene ved romtemperatur.
- Eventuelt, plasser i en ovn ved 70 °C i 2 timer for å fremme enhetsbinding.
- Monter tilgangshullene med en engangs fluidrør (ID 0,25 mm, O.D. 0,8 mm). Forsegle leddene ved hjelp av et epoksylim for å sikre lekkasjesikker manipulasjon.
5. Dråpegenerering og PCR
MERK: Tabell 1 skisserer informasjon om fremre og omvendte primere sammen med de dobbeltsenchede hydrolyseprondene for C-LESS-, CD3Z- og Foxp3-gener, som kreves for multipleksforsterkning av demetylert genmål.
- Klargjør hovedblandingen som beskrevet i tabell 2.
- Tin alle komponentene i masterblandingen unntatt enzymblandingen. Bland hovedblandingen grundig ved å pipetting opp-ned og spinne ned kort.
- Tilsett riktig volum (1 μL) bisulfitt konvertert DNA (fra pkt. 3.2) for å mestre blandingen i et PCR-rør. Bland reaksjonen ved å pipetter opp-ned og spinne ned kort.
- Koble engangsvæskeslang (ID 0,25 mm, O.D. 1,6 mm) til to presisjonsglasssprøyter (250 μL volum) ved hjelp av PEEK-beslag.
- Forfyll en presisjonsglasssprøyte med 250 μL bæreolje som inneholder 5 % fluoroverflateaktivt middel.
- Forfyll en annen presisjonsglasssprøyte med 50 μL bæreolje før du laster 100 μL av PCR-blandingen for å sikre dispensering av hele prøvevolumet under emulgering.
- Sett opp en dråpemikrofluidisk enhet på et stadium av et oppreist lysmikroskop utstyrt med et høyhastighetskamera for å observere og registrere dråpedannelse i sanntid.
- Plasser de ferdigfylte sprøytene på den programmerbare sprøytepumpen og bruk PEEK-unionen med beslag (se Materialtabell),koble slangen på sprøytene til slangen til de respektive innløpskanalene på dråpemikrofluidisk enhet.
- Plasser slangen fra utløpet av dråpegeneratoren inne i et 0,5 ml PCR-rør.
- Juster strømningshastigheten til sprøytepumpen til 2 μL/min og la dråpestørrelsen stabiliseres før den resulterende emulsjonen hentes.
- Samle emulsjon og overføre 75 μL til en 0,2 ml PCR rør for termisk sykling.
- Sørg for at oljeinnholdet i PCR-røret samsvarer tett med volumet av den dispergerte fasen for å forhindre kokulering av dråpene under termisk sykling.
- Plasser 0,2 ml PCR-røret i termisk cycler og utfør sykkelprotokollen på følgende måte: forvarming ved 95 °C i 5 min, deretter 45 sykluser med denmetning ved 95 °C i 15 s og glødende/forlengelse ved 60 °C i 30 s.
- Bruk den gjenværende emulsjonen til å fylle et borosilikatkapillærrør (100 μm dybde) med en rektangulær profil for å bildedråper og vurdere dråpediameteren.
- Plasser borosilikatrøret fylt med emulsjonen på et mikroskopsklie. Bruk et omvendt mikroskop utstyrt med et EMCCD-kamera og 10x mål for å ta opp lyse feltbilder av dråpene.
- Mål dråpediameteren ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare som beskrevet nedenfor.
- Angi omfanget av kjent avstand i mikron som tilsvarer antall piksler i bildet ved å velge'Analyser'-knappen og deretter 'Angi skala'.
- Konverter bildet til gråtoner ved å velge'Bilde'-knappenog deretter 'Type'. Juster lysstyrke og kontrast om nødvendig. Angi en manuell terskel for å avgrense og fylle sirklene ved å velge'Bilde'-knappenog deretter 'Juster terskel'.
- Analyser partiklene ved å velge knappen 'Analyser partikler' og sett sirkulariteten til 0,75 – 1.
- Få det resulterende området og diameteren på de målte dråpene som automatisk vises i programvaren.
- Beregne gjennomsnittlig dråpediameter og anta en sfærisk dråpe, anslå partisjonsvolumet, som vil bli brukt til å beregne absolutt målkonsentrasjon.
- Kontroller at dråpene er monodisperse ved å analysere variasjonskoeffisienten (CV) som tas som forholdet mellom standardavvikene til gjennomsnittsverdiene (k = 1), for dråpediameteren (< 3%).
6. Fluorescensavbildning og bildeanalyse
- Fluorescensavbildning
- Etter forsterkning, overfør PCR-emulsjonen til borosilikatkapillærrør (50 μm dybde) med en rektangulær profil for å ordne dråper til et tettpakket monolag for bildebehandling.
- Fest de fylte kapillærene på et mikroskopsklie og forsegle begge sider ved hjelp av et UV-akryllim. Påfør en UV-lyskilde på UV-klebemidlet som er forsiktig så du ikke lyser opp emulsjonen for å unngå bleking av prøven.
- Legg glasssklien på et invertert mikroskop utstyrt med et EMCCD-kamera og et 10x mål.
- Bruk av mikroskopbildeprogramvare, velg Hent | Live - Rask å starte sanntid kamera oppkjøp, observere prøven, og sikre at bredden på kapillæren er fanget.
- Still inn den lyse feltlampen for diaascopisk belysning ved 3,5 V.
- Still inn den bredspektrede LED-lysrøren for episkopisk belysning med 20 % intensitet.
- Juster opptaksinnstillingen for alle bølgelengder (Bright field, FAM, HEX og Cy5) manuelt ved å velge kalibreringen | Kommandoen Optiske konfigurasjoner i bildebehandlingsprogramvaren. For hver fluorofor må den tilsvarende fluorescensfilterkuben byttes manuelt. En filterkube for den lyse feltavbildningen må brukes til å holde samme optiske bane.
- Justere eksponeringstiden manuelt før bildeanskaffelse ved hjelp av Acquire | Kommandoen Kamerainnstillinger for hver fluorofor som oppsummert i tabell 3. Sett avlesningsmodus EM få 17 MHz på 16-bit med en gevinst multiplikator på 100 i 'Capture Settings' menyen i programvaren.
- I LUT-vinduet i programvaren angir du LUTs-skalaen slik at overføringssignalet er omfattet innenfor det angitte området. I dette eksperimentet ble skalaen satt fra 500 til 12.000 omtrent.
- Automatiser opptaket ved hjelp av et flerpunktsanskaffelsesprogram ved hjelp av både XY-skanning og flere bølgelengdealternativer i den bestemte rekkefølgen. Kontroller at scenen beveger seg til startposisjonen, fange opp alle de forskjellige bølgelengdene, og fortsett deretter til neste posisjon.
- Først konfigurerer du XY-skanningen ved å tilpasse XY-skanneprofilen i XY-skannemenyen i programvaren. I 'Custom Multipoint Definition', velg den store bildedefinisjonsboksen og sett den til 40,0 x 1,0 mm omtrent (lengden på emulsjonsfyllingen). Bruk 1% overlapping.
- Aktiver alternativet'Bruk Fokusoverflate'og sett opp fokusoverflatekurven ved å justere fokusplanet på forskjellige punkter på prøven ved hjelp av fokusknappen på mikroskopet.
- For det andre konfigurerer du skanningen med flere bølgelengder ved å velge skannefanen. Legg til hver av de optiske konfigurasjonene som ble opprettet i trinn 6.1.7 for hver bølgelengde.
- Klikk alternativet for å lukke aktiv lukker under scenebevegelse og under filterendring for å unngå bleking av prøven og kjøre oppkjøpet ved å trykke på 'Start Kjør' -knappen. Eksporter hver anskaffelsesramme til TIFF-filer og del hver kanal i en atskilt fil ved hjelp av delt flere filer alternativ og ved å bruke lagrede LUTs-innstillinger. Bruk alternativet punktnavn og kanalnavn for enkelt å skille mellom hver bildefil.
- Bildeanalyse
- Sorter alle kjøpte bilder etter brightfield- og fluorescensfiltre for å laste opp til en åpen kildekode-bildeanalyseprogramvare.
- Bruk bildeanalyseprogramvare til å opprette en rørledning for å identifisere alle dråper ved hjelp av brightfield-bilder, og mål deretter intensiteten til tilknyttede fluorescerende dråper.
- For å pipeline, laste opp brightfield og fluorescens tiff bilder deretter legge moduler 'ColorToGray', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectIntensity', og 'ExportToSpreadsheet'. Bruk brightfield-dråpebilder til å identifisere objekter, og bruk deretter objekter som maske for å måle intensiteten av fluorescerende bilder.
- Kjør rørledning med utvalgte tiff-bilder for å trekke ut gjennomsnittlig fluorescensintensitet av fluorescensdråpebilder. Utfør eksperimentet i triplikat, med hvert sett bestående av ~ 5000 dråper for analyse.
- Brukalgoritmen definetherain(http://definetherain.org.uk/) til å identifisere de positive og negative dråpeklyngene. Det positive bør være innenfor 3 standardavvik av gjennomsnittet. Dette bestemmer terskelintensiteten til positive dråper som skal brukes til telling.
- Bruk bildeanalyseprogramvaren til å implementere en ny rørledning igjen der fluorescensterskelen for hvert genmål er angitt som definert i forrige trinn.
- Last opp brightfield og fluorescerende bilder til pipeline. Legg til moduler 'ColorToGray', 'RescaleIntensity', 'Terskel', 'IdentifiPrimaryObjects', 'MeasureObjectSizeShape', 'FilterObjects', og 'ExportToSpreadsheet'. Lag unike moduler for brightfield-bilder og hvert fluorescensfilter for dråper.
- Skaler bildeintensitetsskalaen på ny fra 0 til 1 for hver fluorescensbildegruppe. Angi deretter terskelen for å identifisere og telle objektene over den etablerte terskelen. Legg eventuelt til' ExpandOrShrinkObjects'modul for å krympe objekter for å lette telling og identifisering av dråper i brightfield.
- Identifiser bare objekter innenfor valgt størrelse på 20-30 piksler og filtrer de talte objektene for å bare beholde disse objektene med en bestemt diameter (det vil si dråper i 75 μm diameterområdet) og en rund sfærisk eksentrisitet på 0,5 og under.
- Eksporter resultatene til en tabell som viser det totale dråpeantallet fra brightfield-bilder, samt dråpetellinger av alle fluorescenskanalene som brukes. nemlig Cy5 for C-LESS-genet, HEX for metylert CD3Z-gen og FAM for metylert FOXP3-gen (se Tilleggsinformasjon for rå eksperimentelle data innhentet for den presenterte mdPCR-analysen).
- Beregn forholdet mellom negative dråper for hvert genmål og bruk Poisson-distribusjon for å få de respektive kopiene per dråpe (CPD) ved hjelp av Formel 1:
der x representerer antall dråper som inneholder 0, 1, 2 eller flere molekyler, og λ representerer CPD-verdien. - Beregn, den absolutte målkonsentrasjonen ved å ta forholdet mellom CPD-verdien og dråpevolumet oppnådd i trinn 5.20 med Formel 2:
der verdien (1-p) representerer brøkdelen av negative dråper. - Beregn prosentandelen av CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs ved å dele de respektive CPD-verdiene for metylert CD3Z og FOXP3 gener med C-LESS - eller total celle - CPD-verdi (se Supplerende informasjon for CPD-beregninger fra rådata).
- Sammenlign disse prosentverdiene med de som er hentet fra immunofluorescence imaging ved hjelp av antistoffer for CD3+ T-Cell og CD4+ CD25+ T-Reg telling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den TPE-baserte mikrofluidiske dråpegeneratorenheten ble fabrikkert ved hjelp av den beskrevne protokollen som vist i figur 1. En gjennomsiktig maske ble brukt i fotolitografi for å oppnå silisium (Si) master. Myk litografi ble utført for å få en omvendt PDMS kopi av Si-mesteren som deretter ble brukt til å fremstille epoksyformen. Epoxy forløper ble strømmet på PDMS og kurert for å krysslinke og herde. Denne formen, som representerer den nøyaktige kopien av Si-mesteren, var mer motstandsdyktig for påfølgende termoforming av termoplast ved hjelp av varm preging. Når epoksyformen var oppnådd, ble termoplastisk elastomer preget. Etter pregingen ble TPE demolded, og enheter ble kuttet. Et flatt TPE-substrat ble brukt til å forsegle enheten. Hullene ble slått i toppdekselet, og de to substrater ble limt. Til slutt ble de nødvendige slangene for verden-til-chip-tilkoblinger satt inn og enheten var klar til bruk. Eksempelbilder av fabrikkert masterform, TPE-materiale og pregede enheter er vist i figur 2. Montert enhet med rørsammenkoblinger ble operert med et par uavhengige programmerbare sprøytepumper for å generere emulsjoner for mdPCR. Metyleringsspesifikt mdPCR ble utført ved hjelp av bisulfittbehandlet DNA ekstrahert fra frosne PBMCer. Passende primere og hydrolysesonder for CD3Z, FOXP3 og C-Less gener ble lagt til PCR-blandingen for emulgering. Etter dråpegenerering av passende størrelse (ca. 72 μm diameter), ble emulsjonen utsatt for en termisk sykkelprotokoll. Til slutt ble dråpene introdusert i en glasskapillær med 1 mm bredde og 50 μm høyde for bildebehandling. Dette resulterer i en monolayer distribusjon av dråper ideell for fluorescens bilde oppkjøp (Figur 3). Bilder ble tatt opp for hver av de fire bølgelengdene. En bildeanalyse ble deretter utført for å identifisere alle dråper (figur 4) som oppfyller terskelkriteriene som er fastsatt gjennom 'definetherain' algoritme. Fluorescensintensiteten til alle dråper i deres respektive fluorofor plottes deretter og terskelen for positive og negative dråper ble etablert (figur 5). Deretter ble identifisering og telling av disse dråpene utført som var over den valgte terskelen. CPD-verdiene ble deretter beregnet og prosentandelen av CD3+ T-Cellog CD4 + 25+ T-Regs ble etablert basert på metylert CD3Z og FOXP3 kopier, henholdsvis med hensyn til CPD av totale celler, eller C-LESS genet (figur 6). Prosentverdiene ble deretter sammenlignet med de som ble oppnådd gjennom immunofluorescence imaging av T-Cell og T-Reg populasjoner ved hjelp av passende antistoffer.
| FOXP3 Fremover | GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG | |
| FOXP3 Omvendt | TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA | |
| CD3Z fremover | GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG | |
| CD3Z omvendt | CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA | |
| C-LESS fremover | TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA | |
| C-LESS revers | TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C | |
| FOXP3-sonde | /56-VANLIGE SPØRSMÅL/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/ | |
| CDZ3-sonde | /56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/ | |
| C-mindre sonde | /56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/ | |
Tabell 1: Primer og hydrolyse sonde design.
| Reagent | Lagerløsning | Master Mix Volum | Konsentrasjon i arbeid |
| Tris-HCl | 1 M (andre personer) | 2 μL | 20 mM |
| KCl (andre | 1 M (andre personer) | 10 μL | 100 mM |
| MgCl2 Leilighet | 25 mM | 16 μL | 4 mM (andre personer) |
| C-MINDRE Primere | 10 μM | 10 μL | 1 μM hver |
| CD3Z Primere | 10 μM | 10 μL | 1 μM hver |
| FOXP3 Primere | 10 μM | 10 μL | 1 μM hver |
| C-LESS-sonde | 10 μM | 5 μL | 500 000 000 000 000 |
| CD3Z-sonde | 10 μM | 5 μL | 500 000 000 000 000 |
| FOXP3-sonde | 10 μM | 5 μL | 500 000 000 000 000 |
| HotStarTaq DNA Polymerase | 5 enheter /μL | 8 μL | 0,4 Enheter/μL |
| Bisulfittbehandlet DNA-mål | Variabel | Variabel | Variabel |
| Kjernefritt vann | Variabel | ||
| Totalt volum | 100 μL |
Tabell 2: Master mix oppskrift på mdPCR.
| Optisk konfigurasjon | Eksponering | DIA-lampe | Blomstrende lys |
| Lyst felt | 50 ms | På | Av |
| Fam | 300 ms | Av | 20% |
| Hex | 300 ms | Av | 20% |
| Slekten Cy5 | 400 ms | Av | 20% |
Tabell 3: Innstillinger for optisk konfigurasjon og bildeanskaffelse.
Figur 1: Rask prototyping av dråpegeneratoren. Skjematisk illustrasjon av prosessen som brukes til fabrikasjon av (A) master mold og (B) TPE-basert mikrofluidisk emulgering enhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Komponenter som er involvert i fabrikasjonsprosessen. (A)Silisium master, (B) PDMS kopi, (C) epoxy mold,(D) TPE materiale ekstrudert i ark og pakket i ruller, (E) preget TPE og (D) montert enhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescens bildeoppkjøp av dråper etter termisk sykling. (A)Brightfield bilde av dråpene i en kapillær som tillot monolayer bilde oppkjøp. (B) Cy5 filterbilde av C-LESS genmål som representerer totalt antall celler. (C)HEX filterbilde av metylert CD3Z genmål korrelert til CD3+ T-Celle antall. (D) FAM filter bilde av metylert FOXP3 genmål korrelert til CD4+ CD25+ T-Reg antall. Vektstangen er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Pipeline som brukes til å identifisere dråper som oppfyller terskelintensiteten. Bilder ble først organisert i passende fluorescensfiltre ved hjelp av filnavn. Bildene ble deretter konvertert til gråtoner og relative intensiteter rekalert basert på minimum og maksimal dråpe fluorescens intensiteter. Terskelen ble deretter valgt i henhold til verdier hentet fra 'definetherain'-algoritmen, og objektene – eller dråpene – som oppfyller de definerte kriteriene, ble identifisert og kvantifisert. Til slutt ble objektene filtrert i henhold til eksentrisitet og størrelse for å oppnå det raffinerte dråpeantallet av sfæriske objekter som oppfyller 75 μm diameterstørrelse. De kvantifiserte objektene og intensitetene deres ble deretter eksportert til en regnearkprogramvare for nedstrøms analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Intensitetsspødplott for fluorescensintensitet av dråper etter mdPCR. (A) C-LESS genforsterkning med Cy5 hydrolysesonde som representerer det totale celletallet da målområdet var blottet for cytosinrester og derfor motstandsdyktig mot bisulfittbehandling. (B) Metylert CD3Z genforsterkning med HEX hydrolysesonde, som indikerer CD3+ T-cellepopulasjon. (C) Metylert FOXP3 genforsterkning med FAM hydrolyse sonde, som representerer CD4+ CD25+ T-Reg befolkningen. Alle scatter-plottene ble utsatt for "definetherain" algoritme for å sette riktig terskel der de positive var innenfor 3 standardavvik av det positive klyngen. Mengden "regn" ble også etablert slik at den overstiger 1% av de positive definerte dråpene. Hvert datasett for analyse besto av ~5000 dråper og ble kjørt i triplikate (se Tilleggsinformasjon for rådata og analyse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: CPD-verdier for alle genmål og bestemmelse av undergruppe av hvite blodlegemer. (A)De beregnede CPD-verdiene basert på Poisson-fordelingen av det positive dråpet antallet som et forhold mellom totale dråper. Innspillene representerer den teoretiske CPD forventet basert på 740 ng bisulfitt behandlet DNA, 75 μm diameter dråper, forutsatt 6,6 pg for 1 genkopi. Den teoretiske inndata-CPD var 0,25 og korrelert med C-LESS CPD som representerer det totale celleantallet. (B)Forholdet mellom CPD for CD3Z og FOXP3 med hensyn til C-LESS ble deretter brukt til å få prosentandelen av CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs, henholdsvis. Disse forholdene som prosent av totale leukocytter ble deretter sammenlignet med verdier oppnådd ved immunofluorescence imaging. Som vist, korrelerer verdiene fra mdPCR og immunofluorescence analyse uten signifikant forskjell, med standardavviksfeil fra mdPCR som mye mindre uttalt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsinformasjon. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte eksperimentelle protokollen og metodene tillater internt mdPCR ved hjelp av en fabrikkert TPE-dråpegenerator, en termisk cycler og fluorescensmikroskop. Den fabrikkerte enheten ved hjelp av myk TPE til TPE-binding gir hydrofobe overflateegenskaper som er ensartede på tvers av alle kanalvegger, slik at den endelige enheten ikke krever overflatebehandling for etterfølgende bruk som dråpegenerator. Dette materialet har vært rutinemessig ansatt i point-of-care plattformer som krever kompatibilitet med høy gjennomstrømningproduksjon 9,,10,11,12,13. I tillegg er det også optisk klart og viser lav fluorescens bakgrunn i det synlige spekteret som er en attraktiv funksjon for fremtidig integrering av en komplett prøve-til-svar arbeidsflyt ved hjelp av mdPCR. PCR reagens oppskrifter er også gitt i et homebrew format for å tillate facile multiplex gen kvantifisering, samtidig som stabiliteten i hele den termiske sykling protokollen. Som sådan er en av fordelene med de presenterte enhetene og protokollene fleksibiliteten i å tilpasse enhetens design og reagenser som brukes til et bestemt program, noe som er vanskelig å oppnå med kommersielle produkter og proprietære formuleringer. Videre fjerner det nødvendigheten av dyre instrumentering for å utføre eksperimentet.
Passende termoplastisk materialvalg av mikrofluidisk dråpegenerator er en kritisk parameter som kan omgå tungvint overflatebehandling for å gjøre enheten hydrofob for effektiv dråpedannelse. I tillegg er valg av en optimalisert MDPCR-buffer også avgjørende for å opprettholde dråpestabiliteten gjennom den termiske sykkelprosessen – samtidig som det ikke går på bekostning av PCR-effektiviteten og hydrolysesondefunksjonaliteten. Ytterligere modifisering og optimalisering av mdPCR-bufferen oppfordres derfor til å komme frem til svært spesifikk og sensitiv PCR-forsterkning av utvalgte genmål, kombinert med fluorescensbasert sondedeteksjon. Dette tjener til å øke signal-til-støy-forholdene, redusere forekomstene av "regn" og forenkle eksperimentell analyse og identifisering av positive dråpepopulasjoner. Feilsøking av forsøket avhenger av å vurdere de kritiske trinnene fra valg av termoplastisk materiale til polymerasekonsentrasjon for å tilpasse temperaturrampen i det termiske sykkelprogrammet for å sikre dråpestabilitet.
Den nåværende begrensningen av den beskrevne protokollen er at den fortsatt nødvendiggjør manuell prøveoverføring fra dråpegeneratoren til den termiske cycleren og til slutt til en dråpebildeenhet og instrument som et fluorescensmikroskop. Fremtidig innsats er imidlertid rettet mot miniatyrisering av MDPCR og integrering av disse trinnene der dråpegenerering, PCR og bildebehandling kan utføres på en enkelt automatisert plattform.
De oppnådde resultatene i figur 6 viser allsidigheten til denne mdPCR-tilnærmingen for å utføre differensial hvitcellekvantifisering. Den foreslåtte metoden er mer presis og reproduserbar enn immunofluorescence imaging, som ofte påvirkes av brukermanipulering, noe som gir opphav til uønskede målefeil. Dette er også tilfelle for flytcytometri teknikker som også er avhengige av en immunbasert metode for deteksjon som er svært avhengig av celle levedyktighet, samt flere protokolltrinn utsatt for brukerfeil. Alternative metoder som sanntids kvantitative PCR (qPCR) for kvantifiseringen påvirkes ofte negativt av lave genmål for kopinummer, en ulempe som løses gjennom MDPCR uten behov for en dedikert kalibreringskurve11. Den presenterte mdPCR-tilnærmingen presenterer derfor en unik molekylær tilnærming til hvite blodcelleforskjeller som er basert på metyleringsprofiler av spesifikke genmål. Kalibreringskurver for individuelle genmål er heller ikke nødvendig siden MDPCR er basert på en absolutt kvantifisering av binære positive og negative signaler ved hjelp av Poisson-distribusjon for CPD-beregning.
Den nøyaktige kvantifiseringen av ikke-metylererte genøyer, spesielt av gener med lavt antall kopier som FOXP3, gir en rekke muligheter for klinisk diagnose. Dette fremheves av kapasiteten til en slik tilnærming for å identifisere kjente metyleringsmønstre som er korrelert med sykdomsutbrudd og progresjon. mdPCR, som en molekylær tilnærming med absolutt kvantifisering kan brukes utover metyleringsstudier og kan brukes på hensiktsmessig bevarte prøver, derfor fjerne avhengigheten av friske kliniske prøver, og ytterligere utvide sine applikasjoner. Fremtidig automatisering og miniatyrisering av denne teknikken vil være av stor verdi for rask og nøyaktig klinisk diagnose og påfølgende prognose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konflikter å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner økonomisk støtte fra National Research Council of Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B.
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
