Summary
이 프로토콜은 체외 전사를 사용하여 다양한 소 뇌 해부학 구조 내에서 광견병 바이러스 뉴클레오프로틴(N) 유전자 복사 수를 결정하기 위한 qRT-PCR 기반 접근법을 제시한다.
Abstract
소 마비 광견병 (BPR)은 라틴 아메리카 전역에 걸쳐 상당한 경제적 중요성의 바이러스 성 뇌염의 한 형태이며, 주요 동물 노 면 위험을 제기 합니다. 여기서, 우리의 목적은 정량적 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 이용하여 상이한 소 뇌 해부학 구조에서 광견병 바이러스(RABV) 게놈의 상대적 카피 수를 결정하는 실험실 프로토콜을 활용하는 것이었다. qRT-PCR은 시료에 존재하는 표적 핵산의 양에 직접적으로 비례하는 증폭 후 방출되는 형광에 기초하여 샘플에 존재하는 유전자 사본의 특정 수를 정량화한다. 이 방법은 짧은 기간, 오염 의 위험을 감소, 다른 기술에 비해 다른 샘플에서 바이러스 성 핵산을 검출 할 수있는 잠재력으로 인해 유리하다. 여섯 마리의 동물들의 뇌는 암몬의 뿔, 소뇌, 피질, 수질, 폰, 시상 등 여섯 가지 해부학적 구조로 나뉘었다. 모든 뇌는 직접적인 면역 형광 시험에 근거를 둔 RABV 항원에 대한 양성으로 확인되었습니다. 4개의 RABV 음성 소의 두뇌에서 동일 해부학 구조물도 평가되었습니다. RNA는 각 구조에서 추출되어 qRT-PCR에 사용되었습니다. 시험관 내 전사 뉴클레오단백질 유전자를 이용하여 RABV 유전자의 카피 수를 결정하기 위해 분석이 수행되었다. 바이러스 RNA를 정량화하는 데 사용되는 표준 곡선은 100% 및 0.99의 선형성을 나타냈다. 분석 결과, 피질, 수질 및 시상은 이러한 구조가 RABV의 최고 수준을 소유했다는 관측에 기초하여 RABV 검출에 사용하기에 이상적인 CNS 부분이었다는 것을 밝혔다. 시험 특이성은 100%였습니다. 모든 샘플은 긍정적이었고 거짓 긍정이 발견되지 않았습니다. 이 방법은 BPR의 진단 도중 RABV의 낮은 수준을 포함하는 견본에서 RABV를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
광견병은 뇌, 피부, 소변 또는 타액1에서바이러스 성 핵산의 검출을 가능하게 하는 다양한 기술에 의해 선행 및 사후 평가를 확인할 수 있다. 광견병 바이러스 뉴클레오단백질(N) 유전자의 검출은 주로 분자 시험에 의한 광견병 진단에 사용된다. 이 유전자는 또한 바이러스성 유전자 를 위해 이용됩니다. 광견병은 영향을받는 뇌의 어떤 부분을 사용하여 동물에서 진단 할 수 있습니다; 그러나 광견병의 가능성을 배제하려면 뇌의 적어도 두 부위에서 조직을 테스트해야합니다2. 동물에서 광견병 검출을 위한 몇몇 진단 방법은 존재합니다; 그러나, 직접적인 면역형광시험은 표준 기준기술3로남아 있다. 그밖 시험은 마우스 접종을 통합하는 생물학 시험을, 조직 배양에 있는 감염 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)4를포함합니다. 이러한 모든 기술은 인간과 동물의 광견병 진단을 위해 세계 보건 기구 (WHO)와 세계 동물 건강기구 (OIE)에 의해 각각 5권장됩니다.
핵산 검출 및 증폭 기술은 최근6년 동안 광견병의 진단에 혁명을 일으켰으며 이러한 기술은 인간 광견병의 절제 진단에 중요한 역할을 합니다. 몇몇 PCR 기지를 둔 시험은 앤테모템 및 사후 광견병에 대한 종래의 시험을 보완하기 위하여 평가되었습니다7,8,9,10. 대부분의 분석은 바이러스 게놈1,11에서가장 높은 보존 영역인 증폭을위한 바이러스 성 뉴클레오단백질 유전자를 표적으로 한다. 지난 20 년 동안, 다양한 분자 적 술RABV를 진단하기 위해 개발되었으며, 이러한 소의 일부는 바이러스 특성화에 사용되었습니다. 대부분의 예심은 바이러스 게놈 내의 보존된 유전자를 검출하는 것을 목표로, 가장 일반적으로 종래 또는 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)분석12,13을사용하여.
PCR은 조직 내의 주어진 병원체의 게놈을 검출할 수 있는 매우 민감한 진단 기술입니다, 이 조직이 분해되는 경우에. PCR 기반 접근법을 사용하여, DNA 뉴클레오티드서열(14)의선택적이고 반복적인 증폭을 통해 임상 샘플에서 최소한의 수량을 검출할 수 있다. 형광 프로브(예를 들어, TaqMan) 또는 DNA 결합 염료(예를 들어, SYBR Green)를 통합하는 qRT-PCR은 RABV를 모두 진단하는시험에서 사용되어 왔으며, 포스트- 높은 민감도를 가진 모템; 그러나 이러한 접근 방식에는 특수 장비가 필요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 역전사 루프-중재이체형 증폭(RT-LAMP)은 RABV 검출을 위한 저비용, 단순성 및 바람직한 특성에 기초하여 제안되었다. 이 분석은 개발도상국15에서사용할 수 있기 때문에 특히 중요합니다.
qRT-PCR은 형광 신호 증가가 단일 반응에서 PCR 제품의 양에 직접 비례하는 분자의 검출 및 정량화를 기반으로 합니다. 핵산 표적의 사본 수가 증가함에 따라 형광도 증가합니다. SYBR 그린 DNA 결합 염료 또는 형광과 담소를 운반하는 서열 별 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 비특이적 상호 작용 염료는 일반적으로 qRT-PCR에서 형광 판독을 제공하는 데 사용된다. 이 분석은 더 짧은 시험 시간 (2-4 시간), 폐쇄 튜브 시스템 (증폭 된 제품의 후 PCR 조작부족)으로 인한 오염 위험 감소, 동시에 다른 표적을 감지 할 수있는 능력을 포함하는 기존의 RT-PCR에 비해 이점을 제공한다16. qRT-PCR은 타액 및 기타 샘플에서 광견병 앤테모템을 진단하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 또한 RABV15의다른 리사바이러스 종 또는 혈통의 검출을 위한 보편적인 실시간 시험으로 사용될 수 있다. 이 콤보 RT-PCR 접근 방식에서는 두 가지 반응이 사용됩니다. 첫 번째는 RABV의 다른 유전 보종을 검출하고, 두 번째는 Lyssavirus 종을 검출합니다. 두 단계 모두 qRT-PCR assays를 포함하며, 첫 번째 는 혼성화 프로브를 사용하고 두 번째 단계는 염료15를사용합니다. 이 기술을 사용하여 RABV의 성공적인 분자 검출을 입증한 많은 수의 테스트로 인해 현재 OIE 지상매뉴얼(2018)은 RABV17의분자 검출을 위해 PCR을 사용하는 것이 좋습니다.
멕시코는 상당한 가축 잠재력을 가진 나라입니다. 가축 생산량이 가장 높은 주에는 광견병의 주요 송신기인 뱀파이어 박쥐 데스모두스 로툰더스의 존재로 인해 광견병 발병 위험이 있는 습한 열대 지역과 건조한 지역이 모두 포함되어 있습니다. 따라서 멕시코의 소 마비 광견병 (BPR)을 예방하고 제어하기위한 더 많은 도구를 개발하는 것이 필수적입니다. 이를 바탕으로, 이 연구의 목적은 광견병 감염으로 인한 사망 후 소 뇌의 다른 해부학 적 구조에서 바이러스 성 입자의 수를 결정하기 위해 정량적 qRT-PCR을 사용하는 것이었습니다.
RABV 양성 소에서 얻은 6개의 두뇌는 아래에 기술된 qRT-PCR 프로토콜의 개발에 사용하기 위해 외부 실험실에 의해 기증되었습니다. 소 뇌 구조 샘플은 INIFAP CENID-MA 실험실 BSL-2 시설로 이송된 콜드 체인을 사용전까지 -80°C에 저장하였다. 뇌는 캄페체, 유카탄, 케레타로 주에서 동물로부터 얻어졌다. 영수증 전에, 다양한 구조는 뇌에서 해부되었다. 이러한 구조에는 암몬의 뿔, 소뇌, 피질, 수질, 폰, 시상18,19가포함되었다. 유전 물질은 아래에 설명된 바와 같이 추출되었다. RABV 진단은 직접 형광 항체(DFA)(20)를사용하여 확인되었다. 긍정적 인 대조군으로, RABV21로 접종 된 마우스 뇌가 사용되었습니다. 또한, 4 개의 RABV 음성 가축 두뇌 (DFA에 의해 결정) 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다.
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Protocol
이 연구는 센트로 나시오날 드 Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 제공하는 동물의 사용에 대한 권고에 따라 엄격하게 승인되고 수행되었습니다.
1. 샘플
- RT-PCR 분석을 위해 6가지 광견병 양성 소 뇌에서 해부된 뇌의 다양한 영역을 사용하십시오.
2. 광견병을 확인하기 위한 직접 형광 항체(DFA)
참고: DFA에 의한 광견병 항원의 검출은 형광염 표지 항체를 사용하여 광견병 뉴클레오단백질의 존재를 결정하는 질적 방법입니다. 시험은 아래설명과 같이 Dean et al. (1966)20에서제공하는 프로토콜을 사용하여 수행되었다.
- 직경 약 15mm의 멸균 슬라이드에서 다른 뇌 구조에서 해부된 각 조직에서 두 가지 인상을 남기십시오. 나무 어플리케이터를 사용하여 조직의 약3mm 3 부분을 멸균 슬라이드에 얼룩지게 합니다. 얼룩을 만들려면 나무 어플리케이터를 슬라이드에 수동으로 누릅니다.
- -20°C에서 1시간 동안 슬라이드를 100% 아세톤으로 잠급하여 샘플 얼룩 슬라이드를 수정합니다. 인큐베이션 후, 30 분 동안 21 °C에서 마른 천에 슬라이드를 건조.
- 주사기를 통해 분배하여 1:10 희석시 각 뇌 얼룩에 형광 표지 된 핵단백질 항체의 50 μL을 추가합니다.
- 1h에 대해 37°C의 습한 챔버에서 컨쥬게이트로 슬라이드를 배양한다.
- 인큐베이션 후, 슬라이드를 물과 PBS로 두 번 세척하여 과도한 컨쥬게이트를 제거합니다. 슬라이드가 21°C에서 건조되도록 합니다. 조심스럽게 여분의 액체를 제거하고 장착하기 전에 잠시 공기 건조를 제거하기 위해 얼룩.
- 50% 인산염 글리세린을 첨가하여 단면의 표면을 덮은 다음 커버슬립으로 덮습니다. 40배율에서 피불화 현미경의 밑에 단면을 관찰하십시오.
- 공정 및 관찰 긍정적 인 및 부정적인 컨트롤 (긍정적 인 제어 : RABV로 접종 마우스 뇌; 부정적인 제어: RABV 음성 소 뇌) 샘플과 같은 방식으로.
3. RT-PCR에 대한 긍정적 인 제어 생성
- 세균은행으로부터 BHK-21 세포를 구한다. 70번째 통로까지 세포를 사용하여 2항을 사용하여 RABV 에블린-로키니키-아벨세스(ERA) 균주를 복제한다.
- CO2(5%)가 있는 경우 최소 필수 배지(MEM)를 함유한 병에 BHK-21 세포를 유지 및 전파하여 37°C에서 10%의 태아 종아리 혈청(FCS)으로 보충됨 습한 조건에서. 25cm2 배양소에서 세포를 성장하여 80%의 합류와 하위 배양에 도달할 때까지 플라스크를 성장시다.
- 세포에서 배양 배지를 제거하고 인산염 완충식염(PBS)으로 병을 씻는다. RABV 균주 ERA의 105 TCID /mL로 문화를 접종하십시오. CO2(5%)의 존재시 37°C에서 일정한 흔들림으로 2h의 바이러스 접종을 배양합니다. 습한 조건에서.
- 감염 배지를 제거하고 5 %(혈청 태아 소) SFB로 보충 MEM을 추가합니다. CO2(5%)의 존재시 37°C에서 72h의 인큐베이션 습한 조건에서.
- 세포가 세포 병증 효과를 나타낼 때 접종 후 3 일 RABV를 수확하십시오. 감염된 세포를 동결한 다음 세포를 lyse하기 위해 4°C에서 해동합니다. 병에서 배지를 수집한 다음 세포를 원심분리튜브에 넣고 4°C에서 10분 동안 1,050xg에서 원심분리를 합니다.
- -80°C에서 RABV의 수퍼네티츠를 저장하고 -70°C에서 보관할 수 있는 작업 알리쿼트작업을 준비한다.
- 21일 된 암컷 CD1 마우스로 이전 단계에서 얻은 바이러스를 무도증으로 접종하였다. 1mL 주사기를 사용하여 106 MICLD 50 (마우스 전염성 배양 치명적인 용량 50%)을 포함하는50 μL의 용액을 접종하십시오. 마우스로 용량22.
4. RNA 추출
참고: 총 RNA는 다음 프로토콜에 따라 유기 추출 방법을 사용하여 소 뇌에서 직접 추출하였다.
- 각 해부학 구조에서 뇌 조직의 100 mg을 사용하여 guanidium isothiocyanate를 포함하는 시판되는 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하십시오.
- 15s의 마이크로튜브 내부에 작은 유봉을 가진 Dounce 균질화제를 사용하여 분피하여 분비성 이소티오카네이트 시약의 1mL에서 각 구조로부터 총 100 mg의 조직을 수동으로 균질화한다.
- 얼음에 샘플을 5분 동안 배양한 다음 200 μL의 클로로폼을 추가합니다. 샘플을 15초 동안 격렬하게 섞고, 얼음에서 2~3분 동안 배양한 다음 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g로 배양합니다.
- 수성 상위를 깨끗한 튜브로 옮기고 500 μL의 이소프로필 알코올을 추가합니다. 21°C에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
- 4°C에서 10분 동안 12,000 x g의 샘플을 원심분리합니다. 피펫팅으로 수성 상체를 흡인합니다. 격리된 RNA는 관내 펠릿으로서 존재할 것이다.
- 다음으로, RNA 펠릿을 파이펫팅하여 75% 에탄올의 1mL로 세척하고, 원심분리기는 7500 x g에서 4°C에서 5분 동안 세척한다.
- 상온(21°C)에서 RNA 펠릿을 극류 및 공기 건조시켰다. 다음으로, 펠릿을 50μL의 핵염수로 희석한다.
- 분광광계를 사용하여 260 nm에서 RNA 농도 및 품질을 결정합니다. RNA를 -80°C에서 사용할 때까지 저장합니다.
- DNase I로 소화하여 RNA 샘플에서 DNA를 제거합니다. 이전 단계에서 추출된 RNA의 1 μg당 DNase I의 U 2 U를 추가합니다. 다음으로, 10x 반응 버퍼의 5 μL을 추가한 다음 30분 동안 37°C에서 배양합니다. 혼합물에 EDTA1 μL을 첨가한 후 65°C에서 10분 동안 배양하여 DNase I를 비활성화합니다.
5. cDNA 합성 및 PCR
- 올리고 dT및 역전사를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성합니다. RNA 의 1 μg에 대해, 올리고 DT (500 μg/mL), 10mM dNTP 믹스의 1 μL, 12 μL의 최종 부피에 뉴클레아제 없는 증류수를 1 μL를 추가합니다. 혼합물을 65°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 반응 혼합물을 4°C로 식힙니다. 1,050 x g에서30 s의 튜브를 원심 분리한 다음 반응 버퍼 4μL, 2 μL 0.1 M DTT 및 리보누벨리스 억제제 1 μL(40 U/μL)을 추가합니다.
- 반응 혼합물을 37°C에서 2분 동안 배양한 다음 역전사(200 U)의 1μL을 추가합니다. 다음으로, 반응 혼합물을 37°C에서 50분 동안 배양한 다음 70°C에서 15분 동안 반응을 비활성화합니다.
- 사용하기 전에 -20 °C에 cDNA를 저장합니다.
참고: 합성된 cDNA의 품질을 확인하기 위해, 체외에서 합성을 수행하기 전에 RABV N 유전자의 761 bp 단편의 증폭을 수행한다. 아래 5.5 단계에서 설명된 바와 같이 Loza-Rubio외. 11에 의해 기술된 프로토콜을 사용하십시오. - 다음 조건하에서 Taq DNA 폴리머라아제를 사용하여 PCR을 수행합니다. 다음과 같이 설정된 반응 수행: 20mM MgCl2,0.2 mM dNTP를 함유한 10x Taq 버퍼, 1 U Taq 폴리머라제, 각 프라이머의 10 μM (SuEli +: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ 및 SuEli-: 5′ caggctcraacattcttcttta 3′), 2.5 cDNA의 μL, 그리고 50 μL의 최종 부피에 초순수 수.
- 다음 사이클링 조건을 사용하여 열순환기에서 증폭을 수행하십시오: 3분 동안 95°C; 30초동안 95°C, 30초동안 60°C, 72°C의 35사이클을 1분 동안; 7 분 동안 72 °C의 1 사이클.
- 1% 아가로즈 젤을 사용하여 761 bp PCR 제품의 존재를 평가합니다.
6. 시험관 내 전사
참고: 시험관 내 전사는 표적 유전자의 mRNA를 생성합니다. 완전한 RABV N 유전자와 qRT-PCR 분석기의 양성 제어로 사용되는 프라이머 쌍을 사용하십시오. 이 프라이머는 완전한 RABV N 유전자를 증폭시키고 T7 폴리머라제(TAATACGACTCACTATAG)를 인식하는 프로모터를 추가하도록 설계되었습니다.
- 전체 N 유전자 RABV를 증폭하려면 프라이머 트랜스-Nrab 포워드(5개 가트가트크액트cgaatgtt3)와 역(5개 카라타좀트가가트가가트)과 고충실도 PCR 키트를 사용하십시오.
- 각 반응에 대해, 깨끗한 PCR 튜브 반응 버퍼 10배, 2mM DMSO, 25m MgCl2,10mM dNTPs, 각 프라이머의 10 μM, 고충실도 폴리머라제 0.5U, cDNA 1.5 μL(단계 5)에 첨가하여 PCR 마스터 믹스를 준비하고, 5L의 최종 부피를 위한 초퓨어 워터를 준비한다.
- 증폭을 위해 다음 조건으로 설정된 열순환기를 사용하십시오: 1분 동안 94°C; 1분 동안 94°C의 4사이클, 1분 동안 40°C, 2분 동안 72°C; 1분 동안 94°C의 35사이클, 1분 동안 60°C, 2분 동안 72°C; 2 분 동안 72 °C의 최종 연장.
- PCR 제품을 시험관 내 합성을 위한 템플릿으로 사용하고 6.1.2 단계에서 효소 반응의 구성 요소를 제거하기 위해 제조업체의 지시에 따라 열 기반 농축기 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화한 다음 분광계를 사용하여 정량화한다.
- RNA 합성의 경우, 다음 반응 혼합물을 사용한 체외 전사 키트를 사용하십시오: 5 μL T7 전사 5배 버퍼, 각 삼중산염 뉴클레오티드의 1.9 μL, 정제된 RABV N DNA VP2 DNA 10μg, 효소 혼합물의 2.5 μL. 다음으로, 혼합물을 37°C에서 4시간 동안 배양한다. 이어서, 반응 혼합물에 U/μg RNase-free DNase 1의 1 μL을 추가하고 DNA 오염을 제거하기 위해 37°C에서 15분 동안 배양한다.
- 시험관 내 전사 RNA를 정화한 다음 페놀: 클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1)을 사용하여 농축한다.
- 정제 된 RNA 펠릿을 TE 버퍼70 μL로 다시 중단한 다음 사용할 때까지 -80 °C에 저장하십시오.
- PCR 제품의 약 5 μg가 얻어지을 때까지 6.1 단계에서 PCR 프로토콜을 반복하십시오. 정제 및 농도 후, 생체 외 전사 N 유전자 mRNA는 4.711 μg/μL의 농도로 존재할 것이다.
- 시험관 내 전사 mRNA가 이 프로토콜의 다음 단계 5에 따른 N 유전자에 대응하고 이를 실시간 역전사 중합체 연쇄 반응(qRT-PCR)에 대한 양성 대조군으로 사용하는지 확인한다.
7. 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)
- qRT-PCR의 경우 제조업체의 지침에 따라 하이브리드화 프로브를 사용하여 상용 1단계 qRT-PCR 키트와 함께 완전한 N 유전자를 양성 대조군으로 인코딩하는 시험관내 mRNA 전사체를 사용한다. 카네이로 외에서 설명한 프로브와 프라이머를 사용한다. (2010)23 RABV 유전자 N의 보존 지역을 감지하기 위해 (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactggggaatg 3′, 그리고 BRDesrot-Probe: 5′-FAM-아카그락-카타그-카그
- 다음 열 순환 조건을 사용하십시오 : 10 분 동안 50 °C의 1 사이클과 2 분 동안 95 °C; 15s용 95°C의 40사이클, 30대 50°C.
8. 교정 곡선 또는 표준 곡선
- 6개의 디큐클 희석이 얻어질 때까지 mRNA의 1 μg/μL을 튜브로 직렬로 배관하여 생체외 전사 된 mRNA의 직렬 희석을 수행하십시오. 표준 곡선을 만드는 데 사용할 수 있는 트리플리케이트로 100 μL 볼륨으로 튜브를 준비합니다. 7단계에서 설명한 대로 qRT-PCR을 수행합니다.
- 표준 곡선을 생성하고 세포 배양으로부터 분리된 양수 제어, 음수 제어 및 슈퍼나탈제를 사용하기 위한 실행 반응과 동시에 다양한 뇌 샘플을 처리하여 로터로 써모사이클러에서 qRT-PCR을 수행합니다.
- 시험의 검출, 테스트 효능 및 감도의 한계를 평가하려면 동일한 조건에서 트리플리케이트에 표준 곡선을 사용합니다.
9. 생물학적 샘플의 qRT-PCR
- RABV 유전자 N의 검출을 위해, 필드 샘플, 양성 제어, 음의 대조군 및 세포 배양 초중제로부터 RNA를 사용하여 7단계에서 설명된 PCR 키트를 사용하여 qRT-PCR을 수행한다.
- 소 뇌 샘플에 존재하는 RABV 게놈의 사본 수를 확인하려면 표준 곡선 및 생물학적 샘플및 교정 곡선 방정식에서 보간된 Ct 데이터를 가져옵니다.
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Representative Results
DFA 결과는 각각 피질, 시상, 수질, 폰 및 경적에서 RABV에 대해 100 %, 100 %, 83.3 %, 66 %, 50 %의 긍정성을 보였다. 이러한 결과는 이전 결과를 확인, 각 뇌에서 해부 구조의 적어도 세 RABV에 대 한 긍정적인. 대표적인 양성 DAF 염색은 도 1에표시됩니다.
도 2는 로자-루비오 외11에의해 보고된 프라이머를 처음 보고한 프라이머와 함께 RABV N 유전자(Step 5.5)의 단편의 증폭을 나타낸다. 이는 증폭에 사용되는 물질이 양호한 것으로 나타났다.
PCR 증폭 된 조각의 크기는 도 3에표시됩니다. 표준 곡선의 방정식은 샘플에서 RABV 유전 함량의 양과 PCR 증폭 단편의 크기 사이의 관계를 보여줍니다. RABV 유전 함량의 양(ng)은 도 4에제시된 방정식을 사용하여 교정 곡선에서 Ct 값의 보간에 의해 추론되었다. 이 방정식을 사용하여, 바이러스 RNA의 1 x 105 μg/μL의 검출 한계는 RABV 게놈의 36사본에 대응하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 분석이 민감하고 RABV N 유전자의 낮은 수를 포함하는 샘플에서 바이러스를 검출하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 분석의 효율은 -3.28인 표준 곡선의 경사를 사용하여 계산되었다. qRT-PCR에 사용되는 샘플은 RABV N 유전자의 증폭을 보였다.
존재하는 바이러스 복사 수를 결정하기 위해 각 샘플의 Ct 값은 교정 곡선 방정식을 사용하여 보간되었습니다. (나노그램)에서 얻은 결과는 다음 심판으로부터 아래에 설명된 수식으로대체하였다.
사본 의 수 RABV N 유전자 = (ng 샘플 * 6.022 x 1023)/ (104 bp (PCR 제품의 길이) * 1 x 109 * 650).
비교적 qRT-PCR 어약의 결과는 DFA를 사용하여 얻은 것과 일치하였다. QRT-PCR 시험에서 얻은 결과에 따르면 C 및D(표1)에서, 시상은 RABV N 유전자의 가장 많은 수의 사본을 소유하는 구조이다. 이것은 시상 하 부 및 thalamic 뉴런의 초기 감염이 질병의 개발에 중요 하다는 것을 건의, 이러한 뉴런 동물의 식물 기능을 제어 주어진. 각 샘플의 각 구조에서 검출된 RABV N 유전자의 카피 번호는 표 1에도시된다. qRT-PCR 테스트의 민감도 및 특이성은 모두 100%였으며 모든 샘플은 양수였습니다. 이 결과는 견본의 초기 진단과 일치합니다.
그림 1: 감염된 조직에서 광견병 바이러스 단백질 N을 검출하는 직접적인 면역 형광 시험에 따라 양성 염색을 보여주는 소 뇌 조직. 사과 녹색 착색은 항체가 광견병 항원에게 결합하는 염색시 관찰됩니다. 규모 표시줄: 50 μm이 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 증폭 제품을 나타내는 아가로즈 젤 1.5% RABV N 유전자의 761 bp 단편의 증폭은 체외 전사에 사용되는 cDNA의 존재 와 품질을 입증한다. 레인 1에는 분자량 마커, 라인 2: 양성 조절증폭이 포함되어 있습니다. 차선 3: 음수 제어(감염되지 않은 샘플); 줄 4: 시험관 내 전사에 사용되는 cDNA의 증폭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 증폭 제품을 나타내는 아가로즈 젤 1.5% 완전한 N 유전자의 증폭은 레인 2에서 도시된다. 레인 1은 분자량 마커를 포함하고, 레인 3은 음수 증폭 제어를 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 시험관 내를 이용한 qRT-PCR의 표준 곡선은 RABV N 유전자의 사본 수를 정량화하기 위해 N 유전자 mRNA를 전사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| ID 뇌 | 구조 | DAF | 번호 사본(x109) |
| A | 암몬의 뿔 | + | 0.261 |
| 소뇌 | + | 0.0663 | |
| 외피 | + | 0.02 | |
| 메둘라 | + | 0.146 | |
| 폰스 | + | 30.7 | |
| 시상 | + | 108 | |
| B | 암몬의 뿔 | - | 0.0251 |
| 소뇌 | + | 4.64 | |
| 외피 | + | 12.4 | |
| 메둘라 | + | 0.175 | |
| 폰스 | \u2012 | 0.0721 | |
| 시상 | + | 121 | |
| C | 암몬의 뿔 | \u2012 | 0.168 |
| 소뇌 | + | 0.0239 | |
| 외피 | + | 21.5 | |
| 메둘라 | + | 17.2 | |
| 폰스 | + | 1.32 | |
| 시상 | + | 102 | |
| D | 암몬의 뿔 | + | 11.8 |
| 소뇌 | + | 0.0239 | |
| 외피 | + | 8.72 | |
| 메둘라 | + | 1.25 | |
| 폰스 | \u2012 | 0.0165 | |
| 시상 | + | 33.4 | |
| E | 암몬의 뿔 | + | 4.15 |
| 소뇌 | + | 6.78 | |
| 외피 | + | 1.53 | |
| 메둘라 | + | 1.41 | |
| 폰스 | + | 0.025 | |
| 시상 | + | 95 | |
| F | 암몬의 뿔 | + | 0.0221 |
| 소뇌 | \u2012 | 0.00023 | |
| 외피 | + | 4.95 | |
| 메둘라 | \u2012 | 0.000556 | |
| 폰스 | + | 1.02 | |
| 시상 | + | 89 |
표 1: 각 뇌 구조 내에서 RABV N 유전자의 사본 수의 결정. 결과는 DFA를 사용하여 진단된 RABV 양성 소 두뇌의 6개의 해부학 적인 구조물에서 얻어졌습니다. 굵게 강조 표시된 단어는 가장 많은 복사본을 가진 구조를 나타냅니다. 결과는 조직의 밀리그램 당 N 유전자의 사본의 수로 표현되었다.
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Discussion
이전 연구는 DFA가 실온 (21 °C)14에서저장되는 샘플의 7 일 이내에 RABV를 감지 할 수 있음을 보여 주었다. 대조적으로, 이 연구는 견본이 12 일 동안 실온에 드러낸 후에 RT-PCR의 감도가 감소하기 시작한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 RABV 게놈은 최대 23일 동안 실온에 노출된 샘플에서 qRT-PCR에 의해 검출될 수 있다. 이는 qRT-PCR의 감도가 더 높게 분해된 시료에 대해 상대적으로 높다는 것을 보여줍니다. 그러나특이성(25)을손상시키지 않는 간단한 방법을 개발할 필요가 있다. 본 연구는 특정 뇌 구조에 관계없이 바이러스 게놈을 검출할 수 있었다는 관측에 기초하여 DFA보다 더 높은 감도를 지닌 분자 분석체를 시연했다.
전염성 에이전트 검출에 있는 사용을 위한 RT-PCR 기술의 이점은 몇몇 과학적인 연구 결과에서 강조되었습니다. 그러나 이 기술은 특수 장비가 필요하기 때문에 실행 비용과 같은 몇 가지 단점을 나타낼 수 있습니다. 훈련된 직원은 분자 생물학 의약을 취급하기 위하여 요구됩니다. 또한 매우 민감한 기술로 최상의 결과를 얻기 위해 일부 단계가 중요하다는 점을 언급해야 합니다. 이들 중 하나는 RNA 추출을 위한 시료의 적절한 처리입니다. RNA가 쉽게 저하되고 결과가 영향을 받을 수 있기 때문에 이 단계는 매우 중요합니다. 공정 중에 냉기 조건(약 4°C)에서 샘플을 유지하는 것이 좋습니다. 또한, 시험관내에서 성적증명서를 생성하기 위해 6.1단계에서 언급된 바와 같이 여러 발의 PCR 애플리케이션이 수행된다는 점을 고려한다. 이는 상당한(밀리그램 이상) 양의 DNA를 산출하기 위해 반응에 많은 양의 유전 물질이 필요하기 때문이다. 이 분석의 또 다른 중요한 측면은 DNA가 또한 이 단계 도중 분실될 수 있기 때문에, 열에 있는 유전 물질의 정화를 위한 요구 사항입니다.
qRT-PCR은 WHO와 OIE에서 승인한 표준 테스트인 DFA 테스트와 같은 특정한 것으로 알려져 있습니다. 그러나, RT-qPCR을 사용하는 분자 분석은 바이러스 게놈의 상대적으로 적은 수의 사본을 검출하기 위해 분해의 높은 정도를 갖는 시료의 분석을 허용하는 더 높은 감도를 갖는 것으로 나타났다. 또한 훨씬 빠르며 오염 위험을 줄이며 앤티 모템26,27을사용할 수 있습니다.
빙엄과 반 데르 메르웨 (2002)28 은 RABV N 유전자의 높은 농도를 소유 하는 뇌 구조를 결정 하기 위해 DFA를 사용 하 여 연구를 실시. 여러 종에서 총 252 개의 뇌 구조를 평가하였다. 시상, 폰, 메둘라는 모든 평가된 뇌 샘플에서 양성반응을 보였던 가장 관련성이 있는 뇌 구조였습니다. 이러한 결과는 여기에 제시 된 결과에 동의, 이는 다음과 같은 구조에서 DFA 결과와 일치했다: 피질과 시상, 100%; 수질라, 83.3%; 폰, 66%; 및 뿔, 50 %. 대조적으로, 이전 연구는 아무 거짓 부정을 보고하지 않았습니다. 이 작품에서, 일부 부정적인 결과 이전에 긍정적으로 진단 했다 완전 한 뇌 구조에서 발견 되었다. 이는 시험에 사용되는 시료의 일부가 항체 또는 보다 민감한 분자 분석체에 의해 확인된 바이러스 입자를 포함하지 않았기 때문일 수 있다. 또 다른 가능한 설명은 샘플이 실험실에서 수신하기 전에 제대로 운반되거나 저장되지 않았다는 것입니다.
이 연구에서 수행 된 qRT-PCR 분석은 조직의 밀리그램 당 RABV N 유전자의 36.3 사본만큼 검출 할 수 있습니다. qRT-PCR에 가장 적합한 뇌 구조에는 피질과 시상이 포함되었습니다. 이것은 RABV N 유전자의 더 높은 농도가 이 구조물에서 검출되었다는 관측에 근거하고 그(것)들은 또한 RABV 참조 시험을 사용하여 양성인 것으로 나타났습니다. 이 시험은 다양한 샘플에서 바이러스의 매우 낮은 농도(0.00023 x 109부)를 검출할 수 있었다. 샘플에서 바이러스 입자를 정량화하는 것 외에도, 이 시험은 RABV 검출을 위한 좋은 대체 진단 및 연구 도구를 제공하는 것으로 보인다.
여기에 제시된 광견병 바이러스 바이러스 바이러스 게놈 검출 프로토콜을 사용하여 얻은 결과로, 이 기술은 바이러스 게놈의 최소량을 검출할 수 있기 때문에, 견본의 다른 모형에 있는 바이러스의 분자 진단을 위해 적용될 수 있다는 것을 예상됩니다. DFA와 같은 다른 방법에 비해 가장 큰 장점은 다른 저자가 제안한 것처럼 더 민감하고 앤티 모템을사용할 수 있다는 것입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 농업, 임업 및 가축 연구 (INIFAP)에 의해 지원되었다. 이 문서와 관련된 비디오 개발에 대한 그의 협력에 대한 Jerzayn Fraustro Esquivel에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
References
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