Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

Este protocolo presenta un enfoque basado en qRT-PCR para determinar el número de copia genética de nucleoproteína (N) del virus de la rabia dentro de varias estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando transcripción in vitro.

Abstract

La rabia paralítica bovina (BPR) es una forma de encefalitis viral que tiene una importancia económica sustancial en toda América Latina, donde representa un riesgo zoonótico importante. Aquí, nuestro objetivo era utilizar un protocolo de laboratorio para determinar el número de copia relativa del genoma del virus de la rabia (RABV) en diferentes estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando la reacción cuantitativa en cadena de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR). qRT-PCR cuantifica el número específico de copias genéticas presentes en una muestra basada en la fluorescencia emitida después de la amplificación que es directamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico objetivo presente en la muestra. Este método es ventajoso debido a su corta duración, menor riesgo de contaminación y potencial para detectar ácidos nucleicos virales en diferentes muestras más fácilmente en comparación con otras técnicas. Los cerebros de seis animales rabiosos se dividieron en seis estructuras anatómicas, a saber, el cuerno, el cerebelo, la corteza, la medulla, los pons y el tálamo del Ammón. Todos los cerebros fueron identificados como positivos para los antígenos RABV basados en una prueba directa de inmunofluorescencia. También se evaluaron las mismas estructuras anatómicas del cerebro de cuatro bovinos negativos de RABV. El ARN se extrajo de cada estructura y se utilizó para qRT-PCR. Se realizó un ensayo para determinar el número de copias de genes RABV utilizando un gen de nucleoproteína transcrita in vitro. La curva estándar utilizada para cuantificar el ARN viral mostró una eficiencia del 100% y linealidad de 0,99. El análisis reveló que la corteza, la medulla y el tálamo eran las porciones ideales del SNC para su uso en la detección rabv, basándose en la observación de que estas estructuras poseían los niveles más altos de RABV. La especificidad de la prueba fue del 100%. Todas las muestras fueron positivas, no se detectaron falsos positivos. Este método se puede utilizar para detectar RABV en muestras que contienen bajos niveles de RABV durante el diagnóstico de BPR.

Introduction

La rabia puede ser confirmada ante mortem y post mortem por diversas técnicas que permiten la detección de ácidos nucleicos virales en el cerebro, la piel, la orina o la saliva1. La detección del gen de la nucleoproteína del virus de la rabia(N)se utiliza principalmente para el diagnóstico de rabia mediante pruebas moleculares. Este gen también se utiliza para el genotipado viral. La rabia se puede diagnosticar en animales utilizando cualquier porción del cerebro afectado; sin embargo, para excluir la posibilidad de rabia, tejido de al menos dos regiones en el cerebro debe ser probado2. Existen varios métodos de diagnóstico para la detección de la rabia en animales; sin embargo, la prueba directa de inmunofluorescencia sigue siendo la técnica de referencia estándar3. Otras pruebas incluyen pruebas biológicas que incorporan inoculación del ratón, infección en el cultivo de tejidos y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)4. Todas estas técnicas son recomendadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) para el diagnóstico de rabia en humanos y animales, respectivamente5.

Las técnicas de detección y amplificación de ácidos nucleicos han revolucionado el diagnóstico de la rabia en los últimos años6 y estas técnicas desempeñan un papel importante en el diagnóstico ante mortem de la rabia humana. Se han evaluado varias pruebas basadas en PCR para complementar las pruebas convencionales para diagnósticos de rabia ante mortem y post mortem 7,8,9,10. La mayoría de los ensayos apuntan al gen de la nucleoproteína viral de la rabia para la amplificación, que es la región más conservada en el genoma viral1,11. En los últimos 20 años, se han desarrollado varios ensayos moleculares para diagnosticar rabv, y algunos de estos ensayos se han utilizado para la caracterización del virus. La mayoría de los ensayos tienen como objetivo detectar genes conservados dentro del genoma viral, más comúnmente mediante el uso de ensayos convencionales o cuantitativos de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)12,13.

La PCR es una técnica diagnóstica altamente sensible que puede detectar el genoma de un patógeno dado dentro de los tejidos, incluso cuando estos tejidos están descompuestos. Utilizando enfoques basados en PCR, se pueden detectar cantidades mínimas de un agente infeccioso en una muestra clínica a través de la amplificación selectiva y repetitiva de una secuencia de nucleótidos de ADN14. qRT-PCR que incorpora sondas fluorescentes (por ejemplo, TaqMan) o tintes de unión al ADN (por ejemplo, SYBR Green) se ha utilizado en ensayos para diagnosticar RABV tanto ante- como post- mortem con alta sensibilidad; sin embargo, este enfoque requiere equipo especializado. Para superar esta limitación, se ha sugerido la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), basada en su bajo costo, simplicidad y características deseables para la detección de RABV. Este ensayo es particularmente importante, ya que puede utilizarse en los países en desarrollo15.

qRT-PCR se basa en la detección y cuantificación de una molécula, donde los aumentos de señal fluorescente son en proporción directa a la cantidad de producto PCR en una sola reacción. A medida que aumenta el número de copias del objetivo de ácido nucleico, también lo hace la fluorescencia. Los tintes intercalantes no específicos, como el tinte de unión al ADN verde SYBR o las sondas de oligonucleótido específicas de la secuencia que transportan un fluoróforo y un quencher, se utilizan comúnmente para proporcionar la lectura fluorescente en qRT-PCR. Este ensayo ofrece ventajas sobre rt-PCR convencionales que incluyen un tiempo de prueba más corto (2-4 h), menor riesgo de contaminación debido al sistema de tubo cerrado (falta de manipulación post-PCR de productos amplificados), y la capacidad de detectar diferentes objetivos simultáneamente16. qRT-PCR se puede utilizar para diagnosticar la rabia ante mortem a partir de saliva y otras muestras. Este ensayo también se puede utilizar como una prueba universal en tiempo real para la detección de diferentes especies de Lyssavirus o linajes de RABV15. En este enfoque rt-pcr combinado, se utilizan dos reacciones. El primero detecta diferentes linajes genéticos de RABV, y el segundo detecta la especie Lyssavirus. Ambos pasos implican ensayos qRT-PCR, donde el primero utiliza sondas de hibridación y el segundo utiliza tintes15. Debido al gran número de pruebas que han demostrado una detección molecular exitosa de RABV utilizando esta técnica, el actual Manual Terrestre de la OIE (2018) recomienda el uso de PCR para la detección molecular de RABV17.

México es un país con un considerable potencial ganadero. Los estados con mayor producción ganadera contienen regiones tropicales húmedas y regiones secas que están en riesgo de brotes de rabia debido a la presencia del murciélago vampiro Desmodus rotundus, el principal transmisor de la rabia. Por lo tanto, es esencial desarrollar más herramientas para la prevención y control de la rabia paralítica bovina (BPR) en México. Basándose en esto, el objetivo de este estudio era utilizar qRT-PCR cuantitativo para determinar el número de partículas virales en diferentes estructuras anatómicas de cerebros bovinos después de la muerte debido a la infección por rabia.

Seis cerebros obtenidos de bovinos positivos de RABV fueron donados por un laboratorio externo para su uso en el desarrollo del protocolo qRT-PCR descrito a continuación. Las muestras de estructura cerebral bovina fueron transportadas en cadena fría a la instalación BSL-2 del laboratorio CENID-MA del INIFAP y almacenadas a -80 °C hasta su uso. Los cerebros fueron obtenidos de animales de los estados de Campeche, Yucatán y Querétaro. Antes del recibo, varias estructuras fueron diseccionadas del cerebro. Estas estructuras incluían el cuerno del Ammón, cerebelo, corteza, medulla, pons y tálamo18,19. El material genético fue extraído como se describe a continuación. Se confirmó el diagnóstico de RABV utilizando anticuerpos fluorescentes directos (DFA)20. Como control positivo, se utilizaron cerebros de ratón que fueron inoculados con RABV21. Además, se utilizaron cuatro cerebros de ganado negativos de RABV (según lo determinado por DFA) como controles negativos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Este estudio fue aprobado y realizado de acuerdo con las recomendaciones para el uso de animales proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Muestras

  1. Utilice diferentes áreas del cerebro diseccionadas de 6 cerebros bovinos diferentes positivo para el análisis RT-PCR.

2. Anticuerpos fluorescentes directos (ADF) para confirmar la rabia

NOTA: La detección del antígeno antirrábico por DFA es un método cualitativo para determinar la presencia de la nucleoproteína de la rabia utilizando anticuerpos etiquetados con fluoresceína. La prueba se realizó utilizando el protocolo proporcionado por Dean et al. (1966)20, como se describe a continuación.

  1. Haga dos impresiones de cada tejido diseccionado de diferentes estructuras cerebrales en un deslizamiento estéril de aproximadamente 15 mm de diámetro. Utilice un aplicador de madera para untar una porción de aproximadamente 3 mm3 del tejido en el tobogán estéril. Para crear el frotis, presione suavemente el aplicador de madera contra el tobogán manualmente.
  2. Corrija las diapositivas de frotis de muestra sumergiendo las diapositivas en acetona 100% durante 1 h a -20 °C. Después de la incubación, seque los toboganes en un paño seco a 21 °C durante 30 min.
  3. Añadir 50 μL del anticuerpo antinúcleoproteína etiquetado con fluoresceína a cada frotis cerebral a una dilución de 1:10 dispensando a través de una jeringa.
  4. Incubar los toboganes con el conjugado en una cámara húmeda a 37 °C durante 1 h.
  5. Después de la incubación, lave los toboganes dos veces con agua y con PBS para eliminar el exceso de conjugar. Deje que las diapositivas se sequen a 21 °C. Borre cuidadosamente para eliminar el exceso de líquido y luego seque brevemente al aire antes del montaje.
  6. Agregue una gota de 50% de glicerina de fosfato para cubrir la superficie de la sección, y luego cubra con un coverlip. Observe las secciones bajo un microscopio de epifluorescencia a una ampliación de 40x.
    1. Procesar y observar los controles positivos y negativos (control positivo: cerebros de ratón inoculados con RABV; controles negativos: cerebros bovinos negativos rabv) de la misma manera que las muestras.

3. Generar un control positivo para RT-PCR

  1. Obtenga células BHK-21 del banco de germoplasma. Utilice celdas hasta el pasaje70 para replicar la cepa RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) usando el pasaje 2.
  2. Mantener y propagar células BHK-21 en botellas que contengan un medio esencial mínimo (MEM) complementado con un 10% de suero de becerro fetal (FCS) a 37 °C en presencia de CO2 (5%) y en condiciones húmedas. Cultivar las células en frascos de cultivo de 25 cm2 hasta que alcancen el 80% de confluencia y luego la subcultura.
  3. Retire el medio de cultivo de las células y lave el frasco con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Inocular la cultura con 105 TCID/mL de cepa RABV ERA. Incubar el inoculum viral durante 2 h bajo agitación constante a 37 °C en presencia de CO2 (5%) y en condiciones húmedas.
  4. Retire el medio de infección y agregue mem suplementado con 5% (bovino fetal sérico) SFB. Incubar durante 72 h a 37 °C en presencia de CO2 (5%) en condiciones húmedas.
  5. Cosecha RABV 3 días después de la inoculación cuando las células exhiben efectos citopáticos. Congele las células infectadas y luego descongelarlas a 4 °C para lilas. Recoge el medio de la botella y luego coloca las células en un tubo centrífuga para una centrifugación a 1.050 x g durante 10 min a 4 °C.
  6. Almacene los sobrenadantes de RABV a -80 °C y prepare alícuotas de trabajo para almacenarlos a -70 °C.
  7. Intracerebrally inocula el virus obtenido en el paso anterior en ratones CD1 hembra de 21 días de edad. Utilice una jeringa de 1 ml para inocular 50 μL de soluciones que contengan 106 MICLD50 (dosis letal de cultivo infeccioso del ratón 50 %) dosis en ratones22.

4. Extracción de ARN

NOTA: El ARN total se extrajo directamente de cerebros bovinos utilizando un método de extracción orgánica de acuerdo con el siguiente protocolo.

  1. Utilice 100 mg de tejido cerebral de cada estructura anatómica para extraer ARN total utilizando un reactivo disponible comercialmente que contiene isoticianato de guanidium.
  2. Homogeneizar manualmente un total de 100 mg de tejido de cada estructura en 1 ml del reactivo de isotiocyanato de guanidium mediante vórtice utilizando un homogeneizador Dounce con un pequeño pestle dentro del microtubo durante 15 s a máxima velocidad.
  3. Incubar las muestras en hielo durante 5 min, y luego añadir 200 μL de cloroformo. Mezcle las muestras vigorosamente durante 15 s, incubar en hielo durante 2 a 3 minutos y luego centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  4. Transfiera la fase acuosa a un tubo limpio y agregue 500 μL de alcohol isopropílico. Incubar las muestras durante 15 min a 21 °C.
  5. Centrífuga las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante acuoso por pipeteo. El ARN aislado estará presente como pellet en el tubo.
  6. A continuación, lave el pellet de ARN con 1 ml de etanol al 75% por pipeteo y centrífuga a 7500 x g durante 5 minutos a 4 °C.
  7. Decantar el sobrenadante y secar al aire el pellet de ARN a temperatura ambiente (21 °C). A continuación, diluya el pellet en 50 μL de agua libre de nucleasa.
  8. Determine la concentración y la calidad del ARN a 260 nm utilizando un espectrofotómetro. Almacene el ARN a -80 °C hasta su uso.
  9. Retire el ADN de las muestras de ARN por digestión con DNase I. Añadir 2 U de DNase I por 1 μg de ARN extraído en el paso anterior. A continuación, agregue 5 μL de búfer de reacción de 10x y luego incuba a 37 °C durante 30 min. Inactivar la DNase I añadiendo 1 μL de EDTA a la mezcla seguida de incubación durante 10 min a 65 °C.

5. síntesis de cDNA y PCR

  1. Sintetizar cDNA de primera fila usando oligo dT y transcriptasa inversa. Por cada 1 μg de ARN, agregue 1 μL de oligo DT (500 μg/mL), 1 μL de mezcla dNTP de 10 mM y agua destilada sin nucleasa a un volumen final de 12 μL. Incubar la mezcla a 65 °C durante 5 min.
  2. Enfríe la mezcla de reacción a 4 °C. Centrífuga el tubo durante 30 s a 1.050 x g,y luego agregue 4 μL de amortiguador de reacción, 2 μL 0,1 M TDT y 1 μL de inhibidor de la ribonucleasa (40 U/μL).
  3. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 min, y luego añadir 1 μL de transcriptasa inversa (200 U). A continuación, incubar la mezcla de reacción durante 50 min a 37 °C, y luego inactivar la reacción a 70 °C durante 15 min.
  4. Almacene el cDNA a -20 °C antes de su uso.
    NOTA: Para verificar la calidad del cDNA sintetizado, realice la amplificación de un fragmento de 761 bp del gen RABV N antes de realizar la síntesis in vitro. Utilice el protocolo descrito por Loza-Rubio et al.11 como se describe en el paso 5.5 a continuación.
  5. Realice PCR utilizando taq DNA polymerasa en las siguientes condiciones. Realice la reacción configurada de la siguiente manera: 10x tampón Taq que contiene 20 mM MgCl2,0,2 mM dNTPs, 1 U Taq polimerasa, 10 μM de cada imprimación (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ y SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL de cDNA, y agua ultrapura a un volumen final de 50 μL.
  6. Realice la amplificación en un termociclo utilizando las siguientes condiciones de ciclismo: 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de 95 ° C para 30 s, 60 ° C para 30 s, y 72 ° C durante 1 min; un ciclo de 72 °C durante 7 min.
  7. Evaluar la presencia de los productos PCR de 761 bp utilizando un gel de agarose del 1%.

6. Transcripción in vitro

NOTA: La transcripción in vitro genera ARNM de un gen objetivo. Utilice un par de imprimación que amplíe el gen COMPLETO RABV N y uno que se utilice como control positivo para el ensayo qRT-PCR. Estas imprimaciones están diseñadas para amplificar el gen RABV N completo y para añadir un promotor que reconozca la polimerasa T7 (TAATACGACTCACTATAG).

  1. Para amplificar todo el gen N RABV, utilice las imprimaciones Trans-Nrab forward (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) y reversa (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) y un kit de PCR de alta fidelidad.
    1. Para cada reacción, prepare una mezcla maestra de PCR añadiendo a un búfer de reacción de tubo PCR limpio 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2,10 mM dNTPs, 10 μM de cada imprimación, 0,5 U de polimerasa de alta fidelidad, 1,5 μL de cDNA (preparado en el paso 5) y agua ultrapura a un volumen final de 50 μL.
    2. Utilice un termociclo establecido en las siguientes condiciones de amplificación: 94 °C durante 1 min; 4 ciclos de 94 °C durante 1 min, 40 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min; 35 ciclos de 94 °C durante 1 min, 60 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min; extensión final de 72 °C durante 2 min.
  2. Para utilizar el producto PCR como plantilla para la síntesis in vitro y eliminar componentes de la reacción enzimática del paso 6.1.2, purifique el producto PCR utilizando un kit concentrador basado en columnas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y, a continuación, cuantifique utilizando un espectrofotómetro.
  3. Para la síntesis de ARN, utilice un kit de transcripción in vitro con la siguiente mezcla de reacción: 5 μL T7 Transcripción 5x buffer, 1.9 μL de cada nucleótido de trifosfato, 10 μg de ADN purificado rabv N DNA VP2, y 2.5 μL de la mezcla enzimática. A continuación, incubar la mezcla a 37 °C durante 4 h. A continuación, añadir 1 μL de 1 U/μg RNase-Free DNase a la mezcla de reacción e incubar durante 15 min a 37 °C para eliminar la contaminación del ADN.
  4. Purifique el ARN transcrito in vitro y concentre el arne y luego concéntrelo usando fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (25:24:1).
  5. Resuspend el pellet de ARN purificado en 70 μL de Tampón TE, y luego almacenar a -80 °C hasta su uso.
  6. Repita el protocolo PCR desde el paso 6.1 hasta obtener aproximadamente 5 μg de producto PCR. Después de la purificación y concentración, el ARNM del gen N transcrito in vitro estará presente a una concentración de 4.711 μg/μL.
  7. Confirme que el ARNm transcrito in vitro corresponde al gen N siguiendo el paso 5 de este protocolo y utilícelo como un control positivo para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR).

7. Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR)

  1. Para qRT-PCR, utilice una transcripción de ARNm in vitro que codifica el gen N completo como un control positivo junto con un kit comercial qRT-PCR de un solo paso utilizando sondas de hibridación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice la sonda y las imprimaciones descritas por Carneiro et al. (2010)23 para detectar una región conservada del gen RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, y BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
  2. Utilice las siguientes condiciones de ciclismo térmico: 1 ciclo de 50 °C durante 10 min y 95 °C durante 2 min; 40 ciclos de 95 °C para 15 s y 50 °C durante 30 s.

8. Curva de calibración o curva estándar

  1. Realice diluciones en serie del ARNm transcrito in vitro canalizando en serie 1 μg/μL de ARNm en tubos hasta que se obtengan seis diluciones de decuple. Prepare tubos a un volumen de 100 μL en triplicato para su uso en la creación de la curva estándar. Realice qRT-PCR como se describe en el paso 7.
  2. Realice qRT-PCR en un termociclo con un rotor procesando las diversas muestras cerebrales simultáneamente con las reacciones en ejecución para crear la curva estándar y utilizar controles positivos, controles negativos y sobrenautas aislados del cultivo celular.
  3. Para evaluar el límite de detección, eficacia de la prueba y sensibilidad de la prueba, utilice una curva estándar en triplicado en las mismas condiciones.

9. qRT-PCR de muestras biológicas

  1. Para la detección del gen RABV N, utilice el ARN a partir de muestras de campo, controles positivos, controles negativos y sobrenatantes de cultivo celular para realizar qRT-PCR utilizando el kit de PCR descrito en el paso 7.
  2. Para determinar el número de copias del genoma rabv presentes en las muestras cerebrales bovinas, obtenga datos de Tc de la curva estándar y muestras biológicas y de las interpoladas desde la ecuación de la curva de calibración.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Los resultados de DFA mostraron positividad del 100%, 100%, 83,3%, 66% y positividad del 50% para RABV en la corteza, tálamo, medulla, pons y cuerno, respectivamente. Estos resultados confirmaron los resultados anteriores, y al menos tres de las estructuras diseccionadas de cada cerebro fueron positivas para RABV. En la Figura 1se muestra una tinción DAF positiva representativa.

La Figura 2 muestra la amplificación de un fragmento del gen RABV N (paso 5.5) con las imprimaciones primero reportadas por Loza-Rubio et al.11. Esto mostró que el material obtenido para ser utilizado en la amplificación era de buena calidad.

El tamaño del fragmento amplificado por PCR se muestra en la Figura 3. La ecuación de la curva estándar muestra la relación entre la cantidad de contenido genético rabv en una muestra y el tamaño del fragmento amplificado por PCR. La cantidad de contenido genético RABV (in ng) se dedujo mediante la interpolación de los valores Ct en la curva de calibración utilizando la ecuación presentada en la Figura 4. Utilizando esta ecuación, se encontró que el límite de detección de 1 x10 5 μg/μL de ARN viral correspondía a 36 copias del genoma de RABV. Estos resultados demuestran que el ensayo es sensible y se puede utilizar para detectar el virus en muestras que contienen un bajo número de copias del gen RABV N. La eficiencia del ensayo se calculó utilizando la pendiente de la curva estándar, que era -3.28. Las muestras utilizadas para qRT-PCR mostraron amplificación del gen RABV N.

Para determinar el número de copias virales presentes, los valores ct de cada muestra se interpolaron utilizando la ecuación de curva de calibración. El resultado obtenido (en nanogramos) se sustituyó a la fórmula descrita a continuación a partir de la siguiente referencia24:

Número de copias gen RABV N = (muestra ng * 6.022 x 1023) / (104 bp (longitud del producto PCR) * 1 x 109 * 650).

Comparativamente, los resultados de los ensayos qRT-PCR fueron consistentes con los obtenidos utilizando DFA. Según los resultados obtenidos en la prueba qRT-PCR en los casos C y D(Tabla 1),el tálamo es la estructura que posee el mayor número de copias del gen RABV N. Esto sugiere que la infección temprana de neuronas hipotalámicas y talámicas es importante en el desarrollo de la enfermedad, dado que estas neuronas controlan las funciones vegetativas de un animal. Los números de copia del gen RABV N que se detectaron en cada estructura de cada muestra se muestran en el Cuadro 1. La sensibilidad y especificidad de la prueba qRT-PCR fueron 100%, ya que todas las muestras fueron positivas. Este resultado es consistente con los diagnósticos iniciales de las muestras.

Figure 1
Figura 1: Tejidos cerebrales bovinos que muestran tinción positiva según la prueba directa de inmunofluorescencia que detecta la proteína N del virus de la rabia en los tejidos infectados. Se observa una coloración verde manzana al manchar, donde el anticuerpo se une al antígeno de la rabia. Escala: 50 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Gel de agarose del 1,5% que muestra los productos de amplificación. Amplificación de un fragmento de 761 bp del gen RABV N para demostrar la presencia y calidad del cDNA que se utilizará en la transcripción in vitro. El carril 1 contiene un marcador de peso molecular, línea 2: amplificación del control positivo; carril 3: control negativo (muestra no infectada); línea 4: amplificación de cDNA utilizada para la transcripción in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Gel de agarose del 1,5% que muestra los productos de amplificación. La amplificación del gen N completo se muestra en el carril 2. El carril 1 contiene un marcador de peso molecular, y el carril 3 contiene el control de amplificación negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Curva estándar del qRT-PCR utilizando ARN genético N transcrito in vitro para cuantificar el número de copias del gen RABV N. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cerebro de identificación estructura DAF Copias numés (x109)
un Cuerno de Ammón + 0.261
cerebelo + 0.0663
córtex + 0.02
médula + 0.146
pons + 30.7
tálamo + 108
B Cuerno de Ammón - 0.0251
cerebelo + 4.64
córtex + 12.4
médula + 0.175
pons \u2012 0.0721
tálamo + 121
C Cuerno de Ammón \u2012 0.168
cerebelo + 0.0239
córtex + 21.5
médula + 17.2
pons + 1.32
tálamo + 102
D Cuerno de Ammón + 11.8
cerebelo + 0.0239
córtex + 8.72
médula + 1.25
pons \u2012 0.0165
tálamo + 33.4
E Cuerno de Ammón + 4.15
cerebelo + 6.78
córtex + 1.53
médula + 1.41
pons + 0.025
tálamo + 95
F Cuerno de Ammón + 0.0221
cerebelo \u2012 0.00023
córtex + 4.95
médula \u2012 0.000556
pons + 1.02
tálamo + 89

Cuadro 1: Determinación del número de copias del gen RABV N dentro de cada estructura cerebral. Los resultados se obtuvieron de seis estructuras anatómicas de cerebros bovinos positivos de RABV diagnosticados con DFA. Las palabras resaltadas en negrita indican las estructuras con más copias. Los resultados se expresaron como número de copias del gen N por miligramo de tejido.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Estudios anteriores han demostrado que DFA sólo puede detectar RABV dentro de los siete días posteriores a la lectura de la muestra a temperatura ambiente (21 °C)14. Por el contrario, este trabajo demostró que la sensibilidad de RT-PCR comienza a disminuir después de que las muestras han estado expuestas a la temperatura ambiente durante 12 días. Por lo tanto, el genoma rabv puede ser detectado por qRT-PCR en muestras expuestas a temperatura ambiente durante un tiempo de hasta 23 días. Esto demuestra que la sensibilidad de qRT-PCR es relativamente mayor para muestras más altamente descompuestas. Sin embargo, sigue siendo necesario desarrollar métodos más sencillos que no comprometan la especificidad25. La investigación actual demostró un ensayo molecular que posee una sensibilidad más alta que el DFA, basado en la observación de que fue capaz de detectar el genoma viral independientemente de la estructura cerebral específica.

Las ventajas de la técnica RT-PCR para el uso en la detección de agentes infecciosos se han destacado en varios estudios científicos. Sin embargo, esta técnica puede exhibir algunas desventajas, como el costo de ejecución, ya que requiere equipos especializados. Se requiere personal capacitado para manejar ensayos de biología molecular. Además, cabe mencionar que como una técnica altamente sensible, algunos de los pasos son críticos para obtener los mejores resultados. Uno de ellos es el manejo adecuado de muestras para la extracción de ARN. Este paso es crucial, ya que el ARN se degrada fácilmente y, por lo tanto, los resultados podrían verse afectados. Considere la posibilidad de mantener la muestra en condiciones frías (aproximadamente 4 °C) durante el proceso. Además, considere que se llevan a cabo varias rondas de aplicación de PCR como se menciona en el paso 6.1 para generar la transcripción in vitro. Esto se debe a que una gran cantidad de material genético es necesaria para que la reacción produzca cantidades sustanciales (más de miligramos) de ADN. Otro aspecto crucial de este ensayo es el requisito de purificación del material genético en las columnas, ya que el ADN también puede perderse durante este paso.

qRT-PCR es conocido por ser tan específico como la prueba DFA, que es la prueba estándar aprobada por la OMS y la OIE. Sin embargo, se ha demostrado que los ensayos moleculares que emplean RT-qPCR tienen una mayor sensibilidad y permiten así el análisis de muestras con un mayor grado de descomposición para facilitar la detección de un número relativamente pequeño de copias del genoma viral. También es mucho más rápido, reduce el riesgo de contaminación, y se puede utilizar ante-mortem26,27.

Bingham y van Der Merwe (2002)28 llevaron a cabo un estudio utilizando DFA para determinar qué estructuras cerebrales poseían concentraciones más altas del gen RABV N. Se evaluaron un total de 252 estructuras cerebrales de varias especies. El tálamo, pons y medulla eran las estructuras cerebrales más relevantes, ya que eran positivas en todas las muestras cerebrales evaluadas. Estos resultados coinciden con los resultados presentados aquí, que fueron consistentes con los resultados de DFA en las siguientes estructuras: corteza y tálamo, 100%; medulla, 83,3%; pons, 66%; y cuerno, 50%. En contraste, estudios anteriores no reportaron falsos negativos. En este trabajo, algunos resultados negativos se detectaron en estructuras cerebrales completas que previamente habían sido diagnosticadas como positivas. Esto puede deberse a que la parte de la muestra utilizada para la prueba no contenía partículas virales identificadas por el anticuerpo o el ensayo molecular más sensible. Otra posible explicación es que las muestras no se transportaron o almacenaron correctamente antes de la recepción en el laboratorio.

El ensayo qRT-PCR realizado en este estudio podría detectar tan solo 36,3 copias del gen RABV N por miligramo de tejido. Las estructuras cerebrales más adecuadas para qRT-PCR incluían la corteza y el tálamo. Esto se basa en las observaciones de que se detectaron concentraciones más altas del gen RABV N en estas estructuras y que también se encontró que eran positivas utilizando la prueba de referencia rabv. La prueba fue capaz de detectar concentraciones muy bajas (0.00023 x 109 copias) del virus en varias muestras. Además de cuantificar las partículas virales en la muestra, la prueba parece proporcionar una buena herramienta alternativa de diagnóstico e investigación para la detección de RABV.

Con los resultados obtenidos utilizando el protocolo de detección del genoma viral del virus de la rabia presentado aquí, se prevé que esta técnica se pueda aplicar para el diagnóstico molecular del virus en diferentes tipos de muestras, ya que es capaz de detectar cantidades mínimas del genoma viral. Su mayor ventaja sobre otros métodos como el DFA es que es más sensible y se puede utilizar ante mortem,como han sugerido otros autores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Forestales y Ganaderas (INIFAP). Agradecemos a Jerzayn Fraustro Esquivel su colaboración en el desarrollo del video asociado a este documento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

Tags

Inmunología e infección Problema 171 virus rabia paralítica bovina qRT-PCR diagnóstico zoonosis cerebro
Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D.,… More

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter