Summary
Ce protocole présente une approche basée sur qRT-PCR pour déterminer le numéro de copie de gène de nucléoprotéine de virus de rage (N) dans diverses structures anatomiques de cerveau bovin utilisant la transcription in vitro.
Abstract
La rage paralytique bovine (BPR) est une forme d’encéphalite virale d’une importance économique importante dans toute l’Amérique latine, où elle présente un risque zoonotique majeur. Ici, notre objectif était d’utiliser un protocole de laboratoire pour déterminer le nombre relatif de copies du génome du virus de la rage (RABV) dans différentes structures anatomiques du cerveau bovin à l’aide de la réaction quantitative en temps réel de la chaîne de polymérase de transcription inverse (qRT-PCR). qRT-PCR quantifie le nombre spécifique de copies génétiques présentes dans un échantillon à partir de la fluorescence émise après amplification qui est directement proportionnelle à la quantité d’acide nucléique cible présent dans l’échantillon. Cette méthode est avantageuse en raison de sa courte durée, de son risque réduit de contamination et du potentiel de détection plus facile des acides nucléiques viraux dans différents échantillons par rapport à d’autres techniques. Le cerveau de six animaux enragés a été divisé en six structures anatomiques, à savoir la corne d’Ammon, le cervelet, le cortex, la médulle, les pons et le thalamus. Tous les cerveaux ont été identifiés comme positifs pour des antigènes rabv basés sur un essai direct d’immunofluorescence. Les mêmes structures anatomiques du cerveau de quatre bovins négatifs au RABV ont également été évaluées. L’ARN a été extrait de chaque structure et utilisé pour qRT-PCR. Un essai a été effectué pour déterminer les numéros de copie des gènes RABV à l’aide d’un gène nucléoprotéine transcrit in vitro. La courbe standard utilisée pour quantifier l’ARN viral présentait une efficacité de 100 % et une linéarité de 0,99%. L’analyse a indiqué que le cortex, la médulle, et le thalamus étaient les portions idéales de CNS pour l’usage dans la détection de RABV, basé sur l’observation que ces structures ont possédé les niveaux les plus élevés de RABV. La spécificité du test était à 100%. Tous les échantillons étaient positifs, aucun faux positif n’a été détecté. Cette méthode peut être utilisée pour détecter rabv dans les échantillons qui contiennent de faibles niveaux de RABV lors du diagnostic de BPR.
Introduction
La rage peut être confirmée ante mortem et post mortem par diverses techniques qui permettent la détection d’acides nucléiques viraux dans le cerveau, la peau, l’urine ou la salive1. La détection du gène de nucléoprotéine de virus de rage(N)est principalement employée pour le diagnostic de rage par des essais moléculaires. Ce gène est également utilisé pour le génotypage viral. La rage peut être diagnostiquée chez les animaux en utilisant n’importe quelle partie du cerveau affecté; toutefois, pour exclure la possibilité de la rage, les tissus d’au moins deux régions du cerveau doivent être testés2. Plusieurs méthodes diagnostiques existent pour la détection de la rage chez les animaux; cependant, le test d’immunofluorescence directe reste la technique de référence standard3. D’autres essais incluent des essais biologiques qui incorporent l’inoculation de souris, l’infection dans la culture de tissu, et la réaction en chaîne de polymése (PCR)4. Toutes ces techniques sont recommandées par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE) pour le diagnostic de la rage chez l’homme et l’animal,respectivement 5.
Les techniques de détection et d’amplification de l’acide nucléique ont révolutionné le diagnostic de larage au cours des dernières années 6 et ces techniques jouent un rôle important dans le diagnostic ante mortem de la rage humaine. Plusieurs tests basés sur pcr ont été évalués pour compléter les tests conventionnels pour les diagnostics anti mortem et post mortem de rage 7,8,9,10. La plupart des analyses ciblent le gène viral de nucléoprotéine de rage pour l’amplification qui est la région la plus fortement conservée dans le génome viral1,11. Au cours des 20 dernières années, divers tests moléculaires ont été développés pour diagnostiquer rabv, et certains de ces tests ont été utilisés pour la caractérisation du virus. La plupart des essais ont pour but de détecter les gènes conservés dans le génome viral, le plus souvent en utilisant des analyses conventionnelles ou quantitatives en temps réel de la chaîne de polymése (qRT-PCR)12,13.
Pcr est une technique de diagnostic très sensible qui peut détecter le génome d’un agent pathogène donné dans les tissus, même lorsque ces tissus sont décomposés. À l’aide d’approches basées sur la PCR, des quantités minimales d’un agent infectieux peuvent être détectées dans un échantillon clinique par l’amplification sélective et répétitive d’une séquence de nucléotidesd’ADN 14. qRT-PCR qui incorpore des sondes fluorescentes (p. ex., TaqMan) ou des colorants liant l’ADN (p. ex., SYBR Green) a été utilisé dans des essais pour diagnostiquer rabv ante- et post- mortem avec une sensibilité élevée; toutefois, une telle approche nécessite un équipement spécialisé. Pour surmonter cette limitation, l’amplification isothermale à médie en boucle de transcription inverse (RT-LAMP) a été suggérée, basée sur son faible coût, sa simplicité et ses caractéristiques souhaitables pour la détection du RABV. Cet essai est particulièrement important car il peut être utilisé dans les pays en développement15.
qRT-PCR est basé sur la détection et la quantification d’une molécule, où les augmentations de signal fluorescent sont en proportion directe de la quantité de produit PCR en une seule réaction. À mesure que le nombre de copies de la cible de l’acide nucléique augmente, la fluorescence augmente également. Les colorants intercalaires non spécifiques tels que le colorant liant l’ADN SYBR Green ou les sondes oligonucléotides spécifiques à la séquence transportant un fluorophore et un quencher sont couramment utilisés pour fournir la lecture fluorescente dans qRT-PCR. Cet essai offre des avantages par rapport au RT-PCR conventionnel qui incluent un temps d’essai plus court (2-4 h), un risque réduit de contamination dû au système de tube fermé (absence de manipulation post-PCR des produits amplifiés), et la capacité de détecter différentes cibles simultanément16. qRT-PCR peut être utilisé pour diagnostiquer l’anti mortem de la rage à partir de salive et d’autres échantillons. Cet essai peut également être utilisé comme un test universel en temps réel pour la détection de différentes espèces de Lyssavirus ou lignées de RABV15. Dans cette approche RT-PCR combo, deux réactions sont utilisées. Le premier détecte différents linages génétiques du RABV, et le second détecte les espèces de Lyssavirus. Les deux étapes impliquent des analyses qRT-PCR, où la première utilise des sondes d’hybridation et la seconde utilise des dyes15. En raison du grand nombre de tests qui ont démontré la détection moléculaire réussie du RABV à l’aide de cette technique, l’actuel Manuel terrestre de l’OIE (2018) recommande l’utilisation du PCR pour la détection moléculaire du RABV17.
Le Mexique est un pays avec un potentiel d’élevage considérable. Les États où la production animale est la plus élevée contiennent à la fois des régions tropicales humides et des régions sèches à risque d’épidémies de rage en raison de la présence de la chauve-souris vampire Desmodus rotundus, principal émetteur de la rage. Il est donc essentiel de développer davantage d’outils de prévention et de lutte contre la rage paralytique bovine (BPR) au Mexique. Sur cette base, l’objectif de cette étude était d’utiliser qRT-PCR quantitative pour déterminer le nombre de particules virales dans différentes structures anatomiques du cerveau bovin après la mort due à l’infection par la rage.
Six cerveaux obtenus à partir de bovins positifs au RABV ont été donnés par un laboratoire externe pour l’utilisation dans le développement du protocole qRT-PCR décrit ci-dessous. Les échantillons de structure cérébrale bovine ont été transportés à la chaîne froide au laboratoire BSL-2 du laboratoire DE LNE-MA de l’INIFAP et stockés à -80 °C jusqu’à utilisation. Des cerveaux ont été obtenus des animaux des États de Campeche, Yucatán, et Querétaro. Avant la réception, diverses structures ont été disséquées du cerveau. Ces structures comprenaient la corne de l’Ammon, le cervelet, le cortex, la médulle, les pons et le thalamus18,19. Le matériel génétique a été extrait tel que décrit ci-dessous. Le diagnostic rabv a été confirmé utilisant les anticorps fluorescents directs (DFA)20. Comme un contrôle positif, cerveaux de souris qui ont été inoculés avec RABV21 ont été utilisés. En outre, quatre cerveaux de bovins négatifs au RABV (déterminés par le DFA) ont été utilisés comme témoins négatifs.
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Protocol
Cette étude a été approuvée et menée dans le strict respect des recommandations relatives à l’utilisation des animaux fournies par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).
1. Échantillons
- Utilisez différentes zones du cerveau disséquées à partir de 6 cerveaux bovins positifs à la rage pour l’analyse RT-PCR.
2. Anticorps fluorescents directs (AD) pour confirmer la rage
REMARQUE : La détection de l’antigène antirabique par DFA est une méthode qualitative pour déterminer la présence de la nucléoprotéine de la rage à l’aide d’anticorps étiquetés fluorescéine. Le test a été effectué à l’aide du protocole fourni par Dean et coll. (1966)20, tel que décrit ci-dessous.
- Faites deux impressions de chaque tissu disséqué à partir de différentes structures cérébrales sur une lame stérile d’environ 15 mm de diamètre. Utilisez un applicateur en bois pour enduiser une partied’environ 3 mm 3 du tissu sur la glissière stérile. Pour créer le frottis, appuyez doucement sur l’applicateur en bois contre la diapositive manuellement.
- Fixez les glissières de frottis de l’échantillon en submersant les diapositives dans 100% d’acétone pendant 1 h à -20 °C. Après l’incubation, sécher les glissières sur un chiffon sec à 21 °C pendant 30 min.
- Ajouter 50 μL de l’anticorps antinucléoprotéine étiqueté fluorés à chaque frottis cérébral à une dilution de 1:10 en distribuant à travers une seringue.
- Incuber les glissières avec le conjugué dans une chambre humide à 37 °C pendant 1 h.
- Après l’incubation, laver les glissières deux fois avec de l’eau et avec du PBS pour éliminer l’excès de conjugué. Laisser sécher les glissières à 21 °C. Éponger soigneusement pour enlever l’excès de liquide, puis sécher brièvement à l’air avant le montage.
- Ajouter une goutte de 50% de glycérine phosphatée pour couvrir la surface de la section, puis couvrir d’un coverslip. Observez les sections au microscope épifluorescence à 40x grossissement.
- Traiter et observer les contrôles positifs et négatifs (contrôle positif : cerveaux de souris inoculés avec RABV; contrôles négatifs : cerveaux bovins négatifs rabv) de la même manière que les échantillons.
3. Générer un contrôle positif pour RT-PCR
- Obtenir les cellules BHK-21 de la banque de germplasme. Utilisez des cellules jusqu’au 70e passagepour reproduire la souche RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) à l’aide du passage 2.
- Maintenir et propager les cellules BHK-21 dans des bouteilles contenant un minimum de milieu essentiel (MEM) complété par 10% de sérum fœtal de veau (FCS) à 37 °C en présence de CO2 (5 %) et dans des conditions humides. Faire pousser les cellules dans des flacons de culturede 25 cm 2 jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence, puis de sous-culture.
- Retirer le milieu de culture des cellules et laver la bouteille avec du salin tamponné au phosphate (PBS). Inoculer la culture avec 105 TCID/mL de souche RABV ERA. Incuber l’inoculum viral pendant 2 h sous secousse constante à 37 °C en présence de CO2 (5 %) et dans des conditions humides.
- Retirer le milieu d’infection et ajouter mem complété avec 5% (sérum fœtal bovin) SFB. Incuber pendant 72 h à 37 °C en présence de CO2 (5 %) dans des conditions humides.
- Récolte RABV 3 jours après l’inoculation lorsque les cellules présentent des effets cytopathiques. Congeler les cellules infectées, puis les décongeler à 4 °C pour lyser les cellules. Recueillir le milieu de la bouteille, puis placer les cellules dans un tube de centrifugeuse pour centrifugation à 1050 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Conservez les supernatants de RABV à -80 °C et préparez des aliquots de travail pour le stockage à -70 °C.
- Inoculer inocule intracerébrally le virus obtenu dans l’étape précédente dans les souris femelles cd1 de 21 jours. Utilisez une seringue de 1 mL pour inoculer 50 μL de solutions contenant 106 MICLD50 (dose mortelle de culture infectieuse de souris 50 %) doses chez la souris22.
4. Extraction d’ARN
REMARQUE : L’ARN total a été extrait directement des cerveaux bovins à l’aide d’une méthode d’extraction organique selon le protocole suivant.
- Utilisez 100 mg de tissu cérébral de chaque structure anatomique pour extraire l’ARN total à l’aide d’un réaccélément disponible dans le commerce contenant de l’isothiocyanate de guanidium.
- Homogénéiser manuellement un total de 100 mg de tissu de chaque structure dans 1 mL du réagent d’isothiocyanate de guanidium par vortexing à l’aide d’un homogénéisateur Dounce avec un petit pilon à l’intérieur du microtube pendant 15 s à vitesse maximale.
- Incuber les échantillons sur la glace pendant 5 min, puis ajouter 200 μL de chloroforme. Mélanger vigoureusement les échantillons pendant 15 s, incuber sur la glace pendant 2 à 3 minutes, puis centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Transférer la phase aqueuse dans un tube propre et ajouter 500 μL d’alcool isopropylique. Incuber les échantillons pendant 15 min à 21 °C.
- Centrifugeuse les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le supernatant aqueux par pipetting. L’ARN isolé sera présent comme granulé dans le tube.
- Ensuite, lavez la pastille d’ARN avec 1 mL d’éthanol à 75 % par pipetting, et centrifugeuse à 7500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Décanter le supernatant et sécher à l’air le granulé d’ARN à température ambiante (21 °C). Ensuite, diluer la pastille dans 50 μL d’eau sans nucléase.
- Déterminer la concentration et la qualité de l’ARN à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Conserver l’ARN à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Retirer l’ADN des échantillons d’ARN par digestion avec DNase I. Ajouter 2 U de DNase I par 1 μg d’ARN extrait dans l’étape précédente. Ensuite, ajouter 5 μL de tampon de réaction 10x, puis incuber à 37 °C pendant 30 min. Inactivez le DNase I en ajoutant 1 μL d’EDTA au mélange suivi de l’incubation pendant 10 min à 65 °C.
5. synthèse cDNA et PCR
- Synthétiser le cDNA du premier brin à l’aide d’oligo dT et de transcriptase inverse. Pour chaque 1 μg d’ARN, ajouter 1 μL d’oligo DT (500 μg/mL), 1 μL de mélange dNTP de 10 mM et de l’eau distillée sans nucléase à un volume final de 12 μL. Incuber le mélange à 65 °C pendant 5 min.
- Réfrigérer le mélange de réaction à 4 °C. Centrifugeuse du tube pendant 30 s à 1 050 x g,puis ajouter 4 μL de tampon de réaction, 2 μL 0,1 M DTT et 1 μL d’inhibiteur de la ribonucléase (40 U/μL).
- Incuber le mélange de réaction à 37 °C pendant 2 min, puis ajouter 1 μL de transcriptase inverse (200 U). Ensuite, incuber le mélange de réaction pendant 50 min à 37 °C, puis inactiver la réaction à 70 °C pendant 15 min.
- Conserver l’ADN à -20 °C avant utilisation.
REMARQUE : Pour vérifier la qualité de l’ADN synthétisé, effectuez l’amplification d’un fragment de 761 bp du gène RABV N avant d’effectuer la synthèse in vitro. Utilisez le protocole décrit par Loza-Rubio et coll.11 tel que décrit à l’étape 5.5 ci-dessous. - Effectuez la PCR à l’aide de polymésase d’ADN Taq dans les conditions suivantes. Effectuez la réaction configurée comme suit : tampon Taq 10x contenant 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 U Taq polymélase, 10 μM de chaque amorce (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ et SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL de cDNA, et l’eau ultrapure à un volume final de 50 μL.
- Effectuer l’amplification dans un thermocycleur en utilisant les conditions de vélo suivantes: 95 ° C pendant 3 min; 35 cycles de 95 ° C pour 30 s, 60 °C pour 30 s, et 72 °C pendant 1 min; un cycle de 72 °C pendant 7 min.
- Évaluer la présence des produits PCR de 761 pb à l’aide d’un gel d’agarose de 1 %.
6. Transcription in vitro
REMARQUE : La transcription in vitro génère l’ARNm d’un gène cible. Utilisez une paire d’amorce qui amplifie le gène RABV N complet et qui est utilisé comme un contrôle positif pour l’analyse qRT-PCR. Ces amorces sont conçues pour amplifier le gène RABV N complet et pour ajouter un promoteur qui reconnaît la polymése T7 (TAATACGACTCACTATAG).
- Pour amplifier l’ensemble du gène N RABV, utilisez les amorces Trans-Nrab vers l’avant (5'gatgagtcactcgaatatgtctt 3') et l’inverse (5'caataatacgactcactatagggatggatgcacaagatt 3') et un kit PCR haute fidélité.
- Pour chaque réaction, préparez un mix maître PCR en ajoutant à un tampon de réaction de tube PCR propre 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP, 10 μM de chaque amorce, 0,5 U de polymélas haute fidélité, 1,5 μL de cDNA (préparé à l’étape 5), et de l’eau ultrapure à un volume final de 50 μL.
- Utilisez un thermocycleur réglé dans les conditions suivantes pour l’amplification : 94 °C pendant 1 min; 4 cycles de 94 °C pendant 1 min, 40 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 2 min; 35 cycles de 94 °C pendant 1 min, 60 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 2 min; extension finale de 72 °C pendant 2 min.
- Pour utiliser le produit PCR comme modèle pour la synthèse in vitro et pour supprimer les composants de la réaction enzymatique de l’étape 6.1.2, purifiez le produit PCR à l’aide d’un kit concentrateur à colonne selon les instructions du fabricant, puis quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Pour la synthèse de l’ARN, utilisez une trousse de transcription in vitro avec le mélange de réaction suivant : 5 μL T7 Transcription 5x tampon, 1,9 μL de chaque nucléotide triphosphate, 10 μg d’ADN RABV N VP2 purifié et 2,5 μL de l’enzyme du mélange. Ensuite, incuber le mélange à 37 °C pendant 4 h. Ajouter ensuite 1 μL de 1 U/μg de DNase sans RNase au mélange de réaction et incuber pendant 15 min à 37 °C pour éliminer la contamination par l’ADN.
- Purifier l’ARN transcrit in vitro, puis le concentrer à l’aide de phénol: chloroforme: alcool isoamyle (25:24:1).
- Resuspendez la pastille d’ARN purifiée en tampon 70 μL de TE, puis stockez à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Répétez le protocole PCR de l’étape 6.1 jusqu’à ce qu’environ 5 μg de produit PCR soient obtenus. Après purification et concentration, l’ARNm transcrit in vitro du gène N sera présent à une concentration de 4,711 μg/μL.
- Confirmer que l’ARNm transcrit in vitro correspond au gène N suivant l’étape 5 de ce protocole et l’utiliser comme un contrôle positif pour la réaction en chaîne de polymésexe de transcription inverse en temps réel (qRT-PCR).
7. Réaction en chaîne de polymése de transcription inverse en temps réel (qRT-PCR)
- Pour qRT-PCR, utilisez une transcription in vitro de l’ARNm codant le gène N complet comme un contrôle positif avec un kit commercial qRT-PCR en une étape à l’aide de sondes d’hybridation selon les instructions du fabricant. Utilisez la sonde et les amorces décrites par Carneiro et coll. (2010)23 pour détecter une région conservée du gène RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, et BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
- Utilisez les conditions de cycle thermique suivantes : 1 cycle de 50 °C pendant 10 min et 95 °C pendant 2 min; 40 cycles de 95 °C pour 15 s et 50 °C pour 30 s.
8. Courbe d’étalonnage ou courbe standard
- Effectuer des dilutions périodiques de l’ARNm transcrit in vitro en pipetant périodiquement 1 μg/μL d’ARNm dans des tubes jusqu’à ce que six dilutions decuple soient obtenues. Préparez des tubes à un volume de 100 μL en triplicate pour une utilisation dans la création de la courbe standard. Effectuez qRT-PCR tel que décrit à l’étape 7.
- Effectuez qRT-PCR dans un thermocycler avec un rotor en traitant les différents échantillons de cerveau simultanément avec les réactions courantes pour créer la courbe standard et en utilisant des contrôles positifs, des contrôles négatifs et des supernatants isolés de la culture cellulaire.
- Pour évaluer la limite de détection, d’efficacité des tests et de sensibilité du test, utilisez une courbe standard en triplicate dans les mêmes conditions.
9. qRT-PCR d’échantillons biologiques
- Pour la détection du gène RABV N, utilisez l’ARN à partir d’échantillons sur le terrain, de contrôles positifs, de contrôles négatifs et de supernatants de culture cellulaire pour effectuer qRT-PCR à l’aide du kit PCR décrit à l’étape 7.
- Pour déterminer le nombre de copies du génome rabv présentes dans les échantillons de cerveau bovin, obtenir des données Ct à partir de la courbe standard et des échantillons biologiques et de ceux interpolés à partir de l’équation de la courbe d’étalonnage.
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Representative Results
Les résultats de DFA ont montré 100%, 100%, 83.3%, 66%, et 50% positivité pour RABV dans le cortex, thalamus, medulla, pons, et corne, respectivement. Ces résultats ont confirmé les résultats précédents, et au moins trois des structures disséquées de chaque cerveau étaient positives pour RABV. Une coloration positive représentative du DAF est indiquée dans la figure 1.
La figure 2 montre l’amplification d’un fragment du gène RABV N (étape 5.5) avec les amorces les premières rapportées par Loza-Rubio et coll.11. Ceci a prouvé que le matériel obtenu pour être employé dans l’amplification était de bonne qualité.
La taille du fragment amplifié par pcr est indiquée à la figure 3. L’équation de la courbe standard montre la relation entre la quantité de contenu génétique RABV dans un échantillon et la taille du fragment amplifié par pcr. La quantité de contenu génétique RABV (en ng) a été déduite par interpolation des valeurs Ct dans la courbe d’étalonnage à l’aide de l’équation présentée à la figure 4. À l’aide de cette équation, la limite de détection de 1 x10 5 μg/μL d’ARN viral correspondait à 36 copies du génome du RABV. Ces résultats démontrent que l’analyse est sensible et peut être utilisée pour détecter le virus dans des échantillons qui contiennent un faible nombre de copies rabv n gène. L’efficacité de l’essai a été calculée à l’aide de la pente de la courbe standard, qui était de -3,28. Les échantillons utilisés pour qRT-PCR ont montré l’amplification du gène RABV N.
Pour déterminer le nombre de copies virales présentes, les valeurs Ct pour chaque échantillon ont été interpolées à l’aide de l’équation de la courbe d’étalonnage. Le résultat obtenu (en nanogrammes) a été substitué à la formule décrite ci-dessous à partir de l’arbitresuivant 24:
Nombre d’exemplaires GÈNE RABV N = (échantillon ng * 6.022 x 1023) / (104 bp (longueur du produit PCR) * 1 x 109 * 650).
Comparativement, les résultats des analyses qRT-PCR étaient compatibles avec ceux obtenus à l’aide de DFA. Selon les résultats obtenus lors du test qRT-PCR dans les cas C et D (tableau 1), le thalamus est la structure qui possède le plus grand nombre de copies du gène RABV N. Ceci suggère que l’infection tôt des neurones hypothalamic et thalamic soit importante dans le développement de la maladie, étant donné que ces neurones contrôlent les fonctions végétatives d’un animal. Les numéros de copie du gène RABV N qui ont été détectés dans chaque structure de chaque échantillon sont indiqués dans le tableau 1. La sensibilité et la spécificité du test qRT-PCR étaient toutes deux de 100 %, car tous les échantillons étaient positifs. Ce résultat est compatible avec les diagnostics initiaux des échantillons.
Figure 1 : Tissus cérébraux bovins montrant une coloration positive selon le test d’immunofluorescence directe qui détecte la protéine N du virus de la rage dans les tissus infectés. Une coloration vert pomme est observée lors de la coloration, où l’anticorps se lie à l’antigène antirabiques. Barre d’échelle: 50 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Gel d’agarose de 1,5 % montrant les produits d’amplification. Amplification d’un fragment de 761 bp du gène RABV N pour démontrer la présence et la qualité de l’ADND à utiliser dans la transcription in vitro. Lane 1 contient un marqueur de poids moléculaire, ligne 2 : amplification du contrôle positif; voie 3 : contrôle négatif (échantillon non infecté); ligne 4 : amplification de l’ADND utilisée pour la transcription in vitro. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Gel d’agarose de 1,5 % montrant les produits d’amplification. L’amplification du gène N complet est indiquée dans la voie 2. Lane 1 contient un marqueur de poids moléculaire, et la voie 3 contient le contrôle négatif de l’amplification. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Courbe standard du QRT-PCR à l’aide de l’ARNm transcrit in vitro du gène N pour quantifier le nombre de copies du gène RABV N. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Cerveau d’identification | structure | DAF (DAF) | Nombre d’exemplaires (x109) |
| un | Corne d’Ammon | + | 0.261 |
| cervelet | + | 0.0663 | |
| cortex | + | 0.02 | |
| moelle | + | 0.146 | |
| Pons | + | 30.7 | |
| thalamus | + | 108 | |
| B | Corne d’Ammon | - | 0.0251 |
| cervelet | + | 4.64 | |
| cortex | + | 12.4 | |
| moelle | + | 0.175 | |
| Pons | \u2012 | 0.0721 | |
| thalamus | + | 121 | |
| C | Corne d’Ammon | \u2012 | 0.168 |
| cervelet | + | 0.0239 | |
| cortex | + | 21.5 | |
| moelle | + | 17.2 | |
| Pons | + | 1.32 | |
| thalamus | + | 102 | |
| D | Corne d’Ammon | + | 11.8 |
| cervelet | + | 0.0239 | |
| cortex | + | 8.72 | |
| moelle | + | 1.25 | |
| Pons | \u2012 | 0.0165 | |
| thalamus | + | 33.4 | |
| e | Corne d’Ammon | + | 4.15 |
| cervelet | + | 6.78 | |
| cortex | + | 1.53 | |
| moelle | + | 1.41 | |
| Pons | + | 0.025 | |
| thalamus | + | 95 | |
| F | Corne d’Ammon | + | 0.0221 |
| cervelet | \u2012 | 0.00023 | |
| cortex | + | 4.95 | |
| moelle | \u2012 | 0.000556 | |
| Pons | + | 1.02 | |
| thalamus | + | 89 |
Tableau 1 : Détermination du nombre de copies du gène RABV N dans chaque structure cérébrale. Les résultats ont été obtenus à partir de six structures anatomiques de cerveaux bovins rabv-positifs diagnostiqués utilisant DFA. Les mots mis en évidence en gras indiquent les structures avec le plus de copies. Les résultats ont été exprimés en tant que nombre de copies du gène N par milligramme de tissu.
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Discussion
Des études antérieures ont montré que le DFA ne peut détecter rabv que dans les sept jours suivant le stock de l’échantillon à température ambiante (21 °C)14. En revanche, ces travaux ont démontré que la sensibilité de RT-PCR commence à diminuer après que les échantillons ont été exposés à la température ambiante pendant 12 jours. Par conséquent, le génome rabv peut être détecté par qRT-PCR dans les échantillons exposés à la température ambiante pendant un jusqu’à 23 jours. Cela démontre que la sensibilité du QRT-PCR est relativement plus élevée pour les échantillons plus décomposés. Toutefois, il reste nécessaire de développer des méthodes plus simples qui ne compromettent pas la spécificité25. La présente recherche a démontré un test moléculaire qui possède une sensibilité plus élevée que le DFA, basé sur l’observation qu’il était capable de détecter le génome viral indépendamment de la structure spécifique du cerveau.
Les avantages de la technique RT-PCR pour l’utilisation dans la détection des agents infectieux ont été mis en évidence dans plusieurs études scientifiques. Toutefois, cette technique peut présenter certains inconvénients, tels que le coût d’exécution, car elle nécessite un équipement spécialisé. Du personnel qualifié est nécessaire pour s’occuper des analyses de biologie moléculaire. En outre, il convient de mentionner qu’en tant que technique hautement sensible, certaines des étapes sont essentielles pour obtenir les meilleurs résultats. L’un d’eux est la manipulation appropriée des échantillons pour l’extraction de l’ARN. Cette étape est cruciale, car l’ARN est facilement dégradé, et les résultats pourraient, par conséquent, être affectés. Envisagez de maintenir l’échantillon dans des conditions froides (environ 4 °C) pendant le processus. En outre, considérez que plusieurs séries de demande de PCR sont effectuées comme mentionné à l’étape 6.1 pour générer la transcription in vitro. C’est parce qu’une grande quantité de matériel génétique est nécessaire pour que la réaction donne des quantités substantielles (plus de milligrammes) d’ADN. Un autre aspect crucial de cet essai est l’exigence de purification du matériel génétique dans les colonnes, car l’ADN peut également être perdu au cours de cette étape.
qRT-PCR est connu pour être aussi spécifique que le test DFA, qui est le test standard approuvé par l’OMS et l’OIE. Cependant, il a été démontré que les analyses moléculaires utilisant rt-qPCR ont une sensibilité plus élevée et permettent ainsi l’analyse d’échantillons avec un degré plus élevé de décomposition pour faciliter la détection d’un nombre relativement faible de copies du génome viral. Il est également beaucoup plus rapide, réduit le risque de contamination, et peut être utilisé ante mortem26,27.
Bingham et van Der Merwe (2002)28 ont mené une étude utilisant le DFA pour déterminer quelles structures cérébrales possédaient des concentrations plus élevées du gène RABV N. Au total, 252 structures cérébrales de plusieurs espèces ont été évaluées. Le thalamus, les pons et la médulle étaient les structures cérébrales les plus pertinentes, car elles étaient positives dans tous les échantillons de cerveau évalués. Ces résultats concordent avec les résultats présentés ici, qui étaient compatibles avec les résultats de DFA dans les structures suivantes : cortex et thalamus, 100%; medulla, 83,3 %; pons, 66%; et corne, 50%. En revanche, les études précédentes n’ont rapporté aucun faux négatif. Dans ce travail, quelques résultats négatifs ont été détectés dans les structures complètes de cerveau qui avaient précédemment été diagnostiquées comme positives. C’est peut-être parce que la partie de l’échantillon utilisée pour le test ne contenait pas de particules virales identifiées par l’anticorps ou l’analyse moléculaire plus sensible. Une autre explication possible est que les échantillons n’ont pas été correctement transportés ou entreposés avant la réception au laboratoire.
L’analyse qRT-PCR menée dans cette étude pourrait détecter aussi peu que 36,3 copies du gène RABV N par milligramme de tissu. Les structures cérébrales les plus appropriées pour qRT-PCR comprenaient le cortex et le thalamus. Ceci est basé sur les observations selon laquelle des concentrations plus élevées du gène RABV N ont été détectées dans ces structures et qu’elles se sont également révélés positives à l’aide du test de référence RABV. Le test a été en mesure de détecter de très faibles concentrations (0,00023 x 109 copies) du virus dans divers échantillons. En plus de quantifier les particules virales de l’échantillon, le test semble fournir un bon outil alternatif de diagnostic et de recherche pour la détection du RABV.
Avec les résultats obtenus à l’aide du protocole de détection du génome viral du virus de la rage présenté ici, il est prévu que cette technique peut être appliquée pour le diagnostic moléculaire du virus dans différents types d’échantillons, car il est capable de détecter des quantités minimales du génome viral. Son plus grand avantage par rapport à d’autres méthodes telles que le DFA est qu’il est plus sensible et peut être utilisé ante mortem, comme cela a été suggéré par d’autres auteurs.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par l’Institut national de recherche agricole, forestière et animale (INIFAP). Nous remercions Jerzayn Fraustro Esquivel pour sa collaboration dans le développement de la vidéo associée à ce document.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
References
- Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
- CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
- Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
- Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
- Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
- David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
- Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
- Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
- Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
- Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
- Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
- Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
- Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
- Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
- Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
- Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
- Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
- Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
- Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
- Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
- Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
- Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
- Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).
