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Neuroscience

प्राथमिक न्यूरॉन्स में प्रोटीन और सिनैप्टिक मार्कर के सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

Published: October 31, 2020 doi: 10.3791/61434
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

Summary

इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों में प्रोटीन सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को कैसे नियोजित किया जाए।

Abstract

Synapses न्यूरॉन्स के कार्यात्मक तत्व हैं और उनके दोष या नुकसान कई न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोलॉजिकल विकारों के आधार पर हैं। इमेजिंग अध्ययन व्यापक रूप से शारीरिक और रोग स्थितियों में उनके समारोह और प्लास्टिसिटी की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। उनके आकार और संरचना के कारण, प्रोटीन के स्थानीयकरण अध्ययनों के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स में अध्ययन करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जो संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन स्तर पर सिनैप्टिक मार्कर के साथ लक्षित प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण को कम करता है। सिम एक पैटर्न-प्रकाश रोशनी तकनीक है जो व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प को दोगुना करती है, जो लगभग 100 एनएम की विस्तार तक पहुंचती है। प्रोटोकॉल मजबूत सह-स्थानीयकरण अध्ययनों के लिए आवश्यक नियंत्रण और सेटिंग्स और इमेजिंग डेटा का ठीक से विश्लेषण करने के लिए सांख्यिकीय तरीकों का अवलोकन इंगित करता है।

Introduction

1897 1 में फोस्टर और शेरिंगटन द्वारा अपने पहले वर्णन के बाद1से सिनैप्स की समझ और दृष्टिकोण में काफी परिवर्तन हुआ है । तब से, न्यूरोनल संचार और इसके पीछे आणविक प्रक्रियाओं के बारे में हमारा ज्ञान तेजी से2हो गया है । यह स्पष्ट हो गया है कि सिनैप्स को दो-डिब्बे प्रणाली के रूप में सोचा जा सकता है: न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई के लिए वेसिकल युक्त एक पूर्व-सिनैप्टिक डिब्बा और रिसेप्टर्स3के साथ एक पोस्ट-सिनैप्टिक डिब्बे। यह सरलीकृत दृष्टिकोण, पिछले बीस वर्षों में,4संकेत में बाध्यकारी ट्रांसमीटर ट्रांसड्यूस करने के लिए आवश्यक प्रोटीन के एक जटिल नेटवर्क के रूप में विकसित हुआ है ।

समझ में लाभ आंशिक रूप से सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के कारण होता है जो सिनैप्स के आयाम के अनुरूप पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा को बेहतर 5 ,,6,7,,7,8, 9,,910से आगे ले जाता है। विवर्तन सीमा के कारण, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप 200 एनएम पार्श्व में11, 12,से ऊपर के संकल्प तक नहीं पहुंच सकताहै। इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकें बनाई गई थीं, विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके और विभिन्न उप-विवर्तन सीमा संकल्पों तक पहुंचने: सिम, एसटीईड (उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी), पाम (फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी) और स्टॉर्म (स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी)13,,14। सिम एक्सिटेशन बीम पथ15में एक विवर्तन झंझरी डालने से लेजर आधारित वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी सिस्टम के स्थानिक संकल्प को दोगुना कर देता है । चल झंझरी एक ज्ञात रोशनी पैटर्न, आमतौर पर धारियों बनाने के लिए लेजर बीम विवर्तित करता है। यह जानबूझकर संरचित प्रकाश पैटर्न फ्लोरोसेंट डाई (नमूने के) के अज्ञात स्थानिक वितरण के लिए आरोपित है। दो पैटर्न द्वारा गठित हस्तक्षेप किनारे सामान्य व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ अन्यथा अविवेच्य ठीक विवरण के लिए एन्कोड करते हैं। अंतिम सुपर-हल छवि को गणितीय विधियों के साथ संयोजन और डिकोडिंग करके प्राप्त किया जाता है, जो विवर्तन झंझरी के अनुवाद और घूर्णन द्वारा प्राप्त एक ही नमूने की कई कच्ची छवियों के साथ होता है। सुपर-हल छवियों का संकल्प पार्श्व में 100 एनएम और पार्श्व में 2डी-सिम 15 या 100 एनएम के लिए अक्षीय दिशाओं में500 एनएम तक पहुंचता है और 3डी-सिम16के लिए अक्षीय दिशाओं में 250 एनएम।

सिनैप्स की नई समझ कई न्यूरोलॉजिकल विकारों के आलोक में और भी महत्वपूर्ण है जहां सिनैप्टिक रोग शुरुआत और प्रगति में प्रमुख भूमिका निभाता है17,18. अल्जाइमर रोग, डाउन सिंड्रोम, पार्किंसंस रोग, प्रिन रोग, मिर्गी, ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार और नाजुक एक्स सिंड्रोम को सिनैप्टिक संरचना, आकृति विज्ञान और कार्य19,20, 21,,,22में असामान्यताओं से जोड़ा गया है।,21

हाल ही में, सुमो-विशिष्ट एंटीबॉडी के एक सेट का उपयोग करके, हमने सुपर-रिज़ॉल्यूशन स्तर23पर पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक मार्कर सिंप्टोफिजिन और PSD95 के साथ सूमो प्रोटीन के प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में सह-स्थानीयकरण दिखाने के लिए सिम का उपयोग किया। इसने हमें न्यूरॉन्स में सुमो स्थानीयकरण के जैव रासायनिक और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी साक्ष्य की पुष्टि करने में सक्षम बनाया।

यहां, हम माउस हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स में प्रोटीन के स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। साथ ही, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार की प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों के अनुकूल बनाया जा सकता है।

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Protocol

1. प्राथमिक संस्कृतियां

  1. संस्कृति माउस हिप्पोकैम्पल प्राथमिक न्यूरॉन्स चैंबर कवर्लिप्स में (जैसे इबीदी μ-स्लाइड 8 वेल या नुर्क लैब-टेक चेम्बरड कवरग्लास) जो #1.5 (0.17 मिमी) के लिए उद्देश्य आवश्यकता से मेल खाते हैं।
  2. पॉली-एल-लिसिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) के 100 माइक्रोन के साथ कोट चैंबर कवर्लिप्स।
  3. अगले दिन, बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ दो बार चैंबर कवरस्लिप धोएं।
  4. माउस प्राथमिक न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए, P1-P4 पिल्ले23से हिप्पोकैम्पी को अलग करें।
  5. विच्छेदन मीडिया (टेबल 1) के 10 एमएल में विच्छेदित हिप्पोकैम्पी रखें और उन्हें ट्यूब केनीचेजमा करने दें।
  6. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से विच्छेदन मीडिया को हटा दें, जिससे हिप्पोकैम्पी ट्यूब के नीचे अव्यवस्थित हो जाती है।
  7. हिप्पोकैम्पी में मीडिया 1(टेबल 1) की 10मिलीएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से मीडिया 1 को हटा दें, जिससे हिप्पोकैम्पी ट्यूब के नीचे अव्यवस्थित हो जाए।
  9. मीडिया 2 (टेबल 1) के10एमएल जोड़ें और हुड के नीचे (छाया हुआ) अपकेंद्रित्र ट्यूब को 45 मिनट के लिए क्षैतिज रूप से छोड़ दें।
  10. अपकेंद्रित्र ट्यूब को ट्यूब के नीचे व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए खड़ी खड़ी होने दें।
  11. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से मीडिया 2 को हटा दें, हिप्पोकैम्पी को अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे अविचलित छोड़ दें।
  12. मीडिया 3(तालिका 1)के 2 एमएल जोड़ें।
  13. फ़िल्टर किए गए टिप के साथ एक p1000 पिपेट का उपयोग करना, यांत्रिक रूप से ऊतक से कोशिकाओं को अलग करें।
  14. सुपरनैंट को स्थानांतरित करें, जिसमें अलग न्यूरॉन्स स्थित हैं, 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में।
  15. कमरे के तापमान (आरटी) पर 300 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें।
  16. अपकेंद्रित्र के बाद, कोशिकाएं अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल पर स्थित होती हैं। एक बाँझ पिपेट का उपयोग करना सुपरनैट को त्यागें।
  17. मीडिया 4 के 1 एमसीएल में रीसुस्पेंड कोशिकाएं।
  18. असोसिएटेड कोशिकाओं को खत्म करने के लिए 70 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करें।
  19. सेल निलंबन के 19 माइक्रोन में 0.4% ट्राइपैन ब्लू समाधान के 1 माइक्रोन जोड़कर एक Bürker कक्ष में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
  20. 70,000 कोशिकाओं पर प्लेट कोशिकाओं / अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 200 μL की मात्रा में.
  21. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में2घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें।
  22. इनक्यूबेटर से कक्षित कवरस्लिप को बाहर निकालें और ध्यान से संस्कृति मीडिया के 200 माइक्रोन के साथ माध्यम को बदलें।
  23. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में कक्ष कवर्लिप छोड़ दें।
  24. हर 5-7 दिनों में ताजा संस्कृति मीडिया के साथ माध्यम के एक तिहाई की जगह ।
  25. हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स पूरी तरह से परिपक्व (चढ़ाना के बाद 12-14 दिन) सह स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए जब तक रुको।

2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. इनक्यूबेटर से चैंबर कवर्लिप्स लें।
  2. माध्यम निकालें।
  3. पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ जल्दी से कुओं को धोएं।
  4. उन्हें जल्दी ठीक करने के लिए न्यूरॉन्स में पीबीएस (200 μL/well) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) जोड़ें।
  5. आर टी में 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. पीएफए समाधान निकालें।
  7. 0.2% ट्राइटन एक्स-100 (200 μL/well) के साथ पीबीएस जोड़कर कोशिकाओं को पार करें।
  8. आरटी में 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  9. समाधान निकालें और विश्लेषण के लिए एक अप्रासंगिक प्रोटीन के साथ थाली के सभी मुक्त बाध्यकारी सतहों को कवर करने के लिए आरटी में 1 घंटे के लिए पीबीएस (२०० μL/well) में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें । ट्राइटन एक्स-100 के बिना बीएसए-आधारित अवरुद्ध बफर एंटीबॉडी पृष्ठभूमि को 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के साथ एक ही बफर की तुलना में अधिक कुशलता से कम कर देता है।
  10. समाधान निकालें।
  11. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने और उपलब्धता के आधार पर 1% बीएसए और 0.2% ट्राइटन एक्स-100 (120-200 माइक्रोन/ वेल) वाले पीबीएस समाधान में पतला पसंद की प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 2 घंटे के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    1. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, कुओं में से किसी एक के लिए किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी न जोड़ें। विभिन्न लक्ष्यों के खिलाफ विभिन्न प्रजातियों के कई एंटीबॉडी एक ही समय में इस्तेमाल किया जा सकता है। चिकन में उठाए गए MAP2 (एक न्यूरोनल मार्कर) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करें, या तो PSD95 या माउस में उठाए गए सिनेप्टोफिजिन के खिलाफ एक एंटीबॉडी, और खरगोश में उठाए गए लक्षित प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी। यह तीन रंग सिम विश्लेषण की अनुमति देता है।
  12. जल्दी से पीबीएस (२०० μL/अच्छी तरह से) के साथ तीन बार कुओं को धोते हैं ।
  13. माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (डाइलाइट और एलेक्सा माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों का उपयोग किया जा सकता है) 1% बीएसए और 0.2% ट्राइटन एक्स-100 (200 माइक्रोल/वेल) वाले पीबीएस समाधान में पतला किया जाता है। आरटी में 1 घंटे के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
  14. जल्दी से पीबीएस (२०० μL/अच्छी तरह से) के साथ तीन बार कुओं को धोते हैं ।
  15. पीबीएस (200 μL/well) में पतला 1 μg/ml की एकाग्रता पर Hoechst डाई जोड़ें नाभिक दाग करने के लिए । आरटी में 10 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
  16. पीबीएस के साथ दो बार कुओं को जल्दी से धोएं।
  17. एक सिम संगत माउंटेंट का उपयोग कर माउंट कोशिकाओं। प्रोलोंग ग्लास एंटीफैड माउंटेंट के 10 माइक्रोन/वेल का उपयोग करें।
  18. कवर और एक कवरग्लास के साथ कोशिकाओं की रक्षा (उदाहरण के लिए, 8 मिमी के व्यास के साथ एक गोल कवरग्लास) । वर्ग वाले भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  19. चेंबर किए गए कवरस्लिप को आरटी पर स्टोर करें और छवियों को प्राप्त करने से पहले कम से कम 48 घंटे इंतजार करें। डायमंड ग्लास सुपर संकल्प अधिग्रहण से पहले इलाज के कम से दो दिनों की आवश्यकता है ।

3. एंटीबॉडी विशिष्टता नियंत्रण

नोट: एंटीबॉडी विशिष्टता को आश्वस्त करने के लिए दो रणनीतियों का उपयोग करें। पहली रणनीति एक ही सब्सट्रेट को लक्षित करते हुए कम से कम दो अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग करना है। दूसरी रणनीति शुद्ध प्रोटीन लक्ष्य या एंटीबॉडी बढ़ाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एपिटोप के साथ इनक्यूबेशन द्वारा एंटीबॉडी बेअसर है।

  1. पीबीएस में 1% बीएसए में आरटी में 1 एच के लिए पुनर्संयोजन लक्ष्य या एपिटोप से पांच गुना अधिक के साथ पसंद के एंटीबॉडी को इनक्यूबेट करें।
  2. इनक्यूबेशन के बाद, 2.11 से ऊपर वर्णित धुंधला करने के लिए सामान्य एकाग्रता पर निष्प्रभावी एंटीबॉडी का उपयोग करें।

4. माइक्रोस्कोप अंशांकन

नोट: हम नियमित रूप से सुपर-रिज़ॉल्यूशन अध्ययनों के लिए निकॉन द्वारा निर्मित एन-सिम सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग करते हैं। हालांकि, कई अन्य कंपनियां भी अपने कैटलॉग में सुपर-रिजॉल्यूशन माइक्रोस्कोप पेश करती हैं । हालांकि निकॉन के एन-सिम सिस्टम के लिए विशिष्ट संकेत वर्णित हैं, लेकिन पालन करने वाले निर्देशों को अन्य प्रणालियों के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। सिम छवियों के अधिग्रहण से पहले, सिस्टम को विशिष्ट उप-संकल्प आकार फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एक उचित अंशांकन की आवश्यकता होती है। इसका एक उदाहरण टेट्रास्पेक माइक्रोस्फीयर है। ये मोती एक नमूने के साथ विभिन्न लेजर के अंशांकन की अनुमति देने के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों से सना हुआ है।

  1. पानी के स्नान में 1.8 x 108 फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर 10 मिनट के लिए है। निकॉन के एन-सिम सिस्टम को अंशांकन के लिए विरल आबादी वाले मल्टीकलर मोतियों के नमूने की आवश्यकता होती है। यह अन्य प्रणालियों के लिए अलग हो सकता है जिन्हें उप-संकल्प आकार फ्लोरोसेंट मोतियों की एक घनी एकल परत की आवश्यकता होती है। तदनुसार फ्लोरोसेंट कणों की संख्या को समायोजित करें।
  2. डबल आसुत पानी में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर 1:500 को पतला करें।
  3. एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए दूसरी बार सोनीकेट करें।
  4. पतला मोतियों का 15 माइक्रोल एक कक्षीकृत कवर्लिप के कुएं में।
  5. समाधान को आरटी में 5 मिनट के लिए सूखने दें।
  6. बढ़ते समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें और शीर्ष पर एक 8 मिमी कवरलिप रखें।
  7. उचित इलाज की अनुमति देने के लिए कम से कम 48 घंटे प्रतीक्षा करें।
  8. माइक्रोस्कोप और लेजर चालू करें।
  9. सिस्टम को सभी माइक्रोस्कोप घटकों के थर्मल संतुलन तक पहुंचने के लिए गर्म होने दें। एन-सिम सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप सिस्टम के लिए कम से कम 3 घंटे की जरूरत होती है।
  10. 100x उद्देश्य का चयन करें।
  11. डिफरेंट झंझरी ब्लॉक के केंद्र में लेजर को संरेखित करके अंशांकन शुरू करें। एन-सिम सिस्टम में, एक माइक्रोमीटर नॉब और एक समर्पित कैमरा लक्ष्य के लिए प्रकाश बीम के केंद्र की अनुमति देते हैं।
  12. देखने के लिए माइक्रोस्कोप में कक्ष कवरस्लिप डालें। उद्देश्य सुधार कॉलर को समायोजित करके सिस्टम को कक्षित कवरलिप मोटाई में सेट करें। एनआईएस सॉफ्टवेयर, एन-सिम सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप सिस्टम के साथ प्रदान किए गए मालिकाना सॉफ्टवेयर में सुधार कॉलर को विनियमित करने के लिए एक स्वचालित कार्य है।
  13. नमूने पर केंद्रित संरचित पैटर्न रोशनी सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए झंझरी ब्लॉक फोकस समायोजित करें। एनआईएस सॉफ्टवेयर इस कार्य के लिए एक स्वचालित कार्य प्रदान करता है।
  14. इसके बाद, मल्टीकलर माइक्रोस्फीयर की कच्ची 3डी-सिम छवियां प्राप्त करें। जैविक छवियों इमेजजे24 और प्लगइन फेयरसिम25के विश्लेषण के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर या ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर प्लेटफॉर्म का उपयोग करके एक सुपर-हल छवि प्राप्त करने के लिए कच्चे छवियों का पुनर्निर्माण करें।
  15. प्रत्येक अलग तरंगदैर्ध्य के लिए गणना करें, 4.14 में प्राप्त सुपर-हल छवि का फोरियर ट्रांसफॉर्म। यदि परिवर्तित छवि एक सही फूल की तरह पैटर्न प्राप्त करने में विफल रहता है, ४.११ से अंशांकन पुनः आरंभ के बाद से सुपर संकल्प प्राप्त नहीं किया गया है ।
  16. सुपर-हल छवि में, एक माइक्रोस्फीयर का चयन करें और प्राप्त संकल्प को मापने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए इसकी तीव्रता प्रोफ़ाइल की गणना करें। अब यह 100 एनएम के करीब होना चाहिए।
  17. इसके बाद, माइक्रोस्फीयर के मल्टीचैनल अधिग्रहण को ओवरले करके चैनल पंजीकरण करें। लक्ष्य के लिए सभी चैनल संकेतों को बाद में और स्वयंसंबद्ध collimate है । यह विभिन्न चैनलों के गलत संरेखण के कारण रंगीन विचलन को समाप्त करेगा और सह-स्थानीयकरण विश्लेषण में मदद करेगा।
  18. ओपन-सोर्स एप्लीकेशन इमेजजे के लिए प्लगइन्स के एक सूट, सिमचेक26के "रोशनी चरण चरण" और "रोशनी पैटर्न फोकस" के कार्यों का उपयोग करके अंशांकन की गुणवत्ता की पुष्टि करें। इस उद्देश्य के लिए, टेट्रास्पेक माइक्रोस्फीयर की एक घनी एकल परत प्राप्त करने और नमूने की 3डी-सिम छवि प्राप्त करने के लिए एक कक्षीकृत कवरस्लिप तैयार करें। इमेजजे में छवि का विश्लेषण करें और, यदि विपथनों का पता लगाया जाता है, तो चरण 4.11 से माइक्रोस्कोप अंशांकन पुनः आरंभ करें।

5. अधिग्रहण

  1. कॉन्फोकल या वाइडफील्ड मोड में 40x उद्देश्य का उपयोग करके नमूने का विश्लेषण शुरू करें। यह नमूने के लिए नेविगेशन की अनुमति देता है, अच्छा विवरण और देखने का एक बड़ा क्षेत्र बनाए रखने ।
  2. न्यूरोनल प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले क्षेत्र की पहचान करने के लिए MAP2 एंटीबॉडी सिग्नल का उपयोग करें।
  3. धुंधला की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल मोड में नमूने की छवियों को प्राप्त करें। खराब कॉन्फोकल गुणवत्ता खराब सिम गुणवत्ता में प्रतिबिंबित होगी, इसलिए नमूनों को छोड़ने की आवश्यकता होगी।
  4. यदि छवियों का क्षेत्र और गुणवत्ता संतोषजनक है, तो उद्देश्य को 100x पर स्विच करें।
  5. 100x उद्देश्य के लिए तेल लागू करें।
  6. एक वाइडफील्ड या कॉन्फोकल छवि प्राप्त करें जिसका उपयोग बाद में सुपर-हल की गई छवि(चित्रा 1ए, बी)की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया जाएगा।
  7. 3डी-सिम मोड पर स्विच करें।
  8. अधिग्रहण के लिए पैरामीटर सेट करने के लिए संवाद खिड़कियों का उपयोग करना, रंग जानकारी को अधिकतम करने के लिए उपलब्ध उच्चतम बिट-गहराई सेटिंग का चयन करें। आमतौर पर, 16-बिट मानक विकल्प है। इसके अलावा, सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करने के लिए, अधिग्रहण के लिए कम आवृत्ति मूल्य का चयन करें, जैसे 1 मेगाहर्ट्ज।
  9. हिस्टोग्राम खिड़कियों का उपयोग करना, सिग्नल की रैखिक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए लेजर शक्ति सेट करें। जानकारी के नुकसान से बचने के लिए, छवियों में संतृप्त पिक्सेल को सीमित करें। एन-सिम सिस्टम में एंडोर iXon3 कैमरा का इस्तेमाल किया गया है। 16-बिट पर काम करते समय, कैमरे की रैखिक प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए 16,000 की लक्ष्य तीव्रता चुनें। वैकल्पिक रूप से, अधिग्रहण की गतिशील सीमा को अधिकतम करने के लिए 30,000-45,000 के बीच एक सीमा चुनें।
  10. 50 एमएस और 2 एस के बीच नमूने और एक्सपोजर समय इमेजिंग करते समय 0.1% और 50% के बीच लेजर पावर सेट करें। 50% से ऊपर लेजर शक्तियों के उपयोग में फ्लोरोफोरस की तेजी से फोटोब्लैचिंग का कारण बन सकता है।
  11. 3डी-सिम मोड में छवियों को प्राप्त करना शुरू करें।
  12. कच्चे छवियों के अधिग्रहण की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, इमेजजे के लिए मुफ्त प्लगइन्स के एक सूट सिमचेक का उपयोग करें।
  13. यदि सिमचेक किसी भी कलाकृतियों या गुणवत्ता के मुद्दों का पता नहीं लगाता है, तो सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देने के लिए 4 तकनीकी प्रतिकृति से न्यूनतम 10 छवियों को प्राप्त करें।

6. पोस्ट-प्रोडक्शन: छवि पुनर्निर्माण

नोट: 3D-सिम अधिग्रहीत छवियां कच्ची छवियां हैं जिन्हें पुनर्निर्मित सुपर-हल छवियों को प्राप्त करने के लिए संसाधित करने की आवश्यकता है। कच्चे चित्रों के गलत पुनर्निर्माण कलाकृतियों कि नमूनों के विश्लेषण को प्रभावित करेगा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए पुनर्निर्माण मापदंडों को ठीक से चुनने के लिए बहुत ध्यान दिया जाना चाहिए ।

  1. एक सुपर-हल छवि(चित्रा 1C)प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप पुनर्निर्माण विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कच्चे चित्रों को संसाधित करें। वैकल्पिक रूप से, कच्चे चित्रों के पुनर्निर्माण के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे प्लगइन फेयरसिम का उपयोग करें।
  2. माइक्रोस्कोप पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर या ImageJ प्लगइन सिमचेक का उपयोग करके सुपर-हल छवियों के फोरियर ट्रांसफॉर्म की गणना करें। एक अच्छी खंगाली गई छवि, प्रत्येक चैनल के लिए, फूल जैसी छवि वापस आनी चाहिए। यदि पुनर्निर्मित छवियां फूल की तरह आकार को फिर से बनाने में विफल रहती हैं, तो कच्ची छवियों से पुनः आरंभ करें और वीनर फ़िल्टरिंग, अपोडाइजेशन और शून्य-क्रम दमन27जैसे पुनर्निर्माण मापदंडों को संशोधित करके उनका पुनर्निर्माण करें। एनआईएस सॉफ्टवेयर में, पूर्वावलोकन का उपयोग करके यह निगरानी करने के लिए कि मापदंडों को बदलने से अंतिम हल की गई छवि कैसे प्रभावित होती है, प्रभावों को संशोधित करता है मैं) रोशनी मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट, ii) उच्च संकल्प शोर दमन और iii) फोकस दमन से बाहर।
  3. इसके बाद, सुपर-हल छवियों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए नैनोजे-गिलहरी28,एक इमेजजे-आधारित प्लगइन का उपयोग करके कलाकृतियों का निष्पक्ष रूप से पता लगाने के लिए पुनर्निर्मित छवि का विश्लेषण करें।
  4. यदि नैनोज-गिलहरी कलाकृतियों का पता लगाता है, तो कच्चे चित्रों से पुनः आरंभ करें और वीनर फ़िल्टरिंग, अपोडाइजेशन और शून्य-आदेश दमन जैसे पुनर्निर्माण मापदंडों को संशोधित करके उनका पुनर्निर्माण करें। एनआईएस सॉफ्टवेयर में, पूर्वावलोकन का उपयोग करके यह निगरानी करने के लिए कि मापदंडों को बदलने से अंतिम हल की गई छवि कैसे प्रभावित होती है, मापदंडों को रोशनी मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट, उच्च रिज़ॉल्यूशन शोर दमन और फोकस दमन से बाहर संशोधित करें।
  5. सह-स्थानीयकरण प्रोफ़ाइल और/या पियर्सन और मांडर के गुणांकों की गणना करने के लिए सुपर-हल छवियों का उपयोग करें।

7. प्रोफ़ाइल विश्लेषण के साथ सह-स्थानीयकरण

नोट: सिनैप्टिक मार्कर और ब्याज के प्रोटीन के बीच सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए पहले कदम के रूप में, एक सुपर-हल छवि लें और सिग्नल ओवरलैप निर्धारित करने के लिए एक ही लोकस का विश्लेषण करें।

  1. सुपर-हल छवि पर एक ही लोकस की पहचान करें।
  2. ब्याज के लोकस के फ्लोरोसेंट संकेतों की तीव्रता प्रोफाइल प्राप्त करें।
  3. डेटा निर्यात करें।
  4. सभी सिग्नल चोटियों को सामान्य बनाने और लोकस विशिष्ट सह-स्थानीयकरण का निर्धारण करने के अंतिम लक्ष्य के साथ प्रत्येक चैनल के लिए तुलनीय संकेत तीव्रता प्राप्त करने के लिए ग्राफपैड चश्मे, या इसी तरह के विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

8. पियर्सन और मांडर के गुणांकों का मात्राकरण

नोट: यदि प्रोफ़ाइल विश्लेषण ने एकल लोकस सह-स्थानीयकरण का सुझाव दिया है, तो पियर्सन और मांडर के गुणांक29,,30की गणना करके पूरी छवि का अधिक सामान्य विश्लेषण किया जा सकता है।

  1. सह-स्थानीयकरण के दो मापदंडों का निर्धारण करने के लिए JACoP31,एक इमेजजे प्लग-इन का उपयोग करें: पियर्सन और मांडर।

9. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. JACoP के साथ एकत्र किए गए डेटा को संसाधित करने के लिए ग्राफपैड चश्मे, या इसी तरह के विश्लेषण और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  2. रेखांकन प्राप्त करने और सांख्यिकीय प्रासंगिकता के लिए विश्लेषण की गई प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम 40 सिम छवियों का उपयोग करें।

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Representative Results

हम यहां न्यूरोनल प्रोटीन सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए मानक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं। हमने पहले माइक्रोस्कोप को कैलिब्रेट किया और अगले हमने नमूनों का सिम विश्लेषण किया। सिस्टम को कैलिब्रेट करने के लिए, हमने 0.1 माइक्रोसेम व्यास के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर का उपयोग किया। मोतियों की सुपर-हल 3डी-सिम छवियां प्राप्त करने पर, अंतर्निहित छवि डेटा को उन्हें स्थानिक आवृत्ति प्रतिनिधित्व में फिर से परिवर्तित करने के लिए फोरियर-रूपांतरित किया जाता है। चित्रा 2Aमें, अलग फूल पैटर्न सुपर संकल्प विस्तार स्तर के एक संकेत के रूप में प्रस्तुत किया है । हमने अगले एक मनका की तीव्रता प्रोफ़ाइल(चित्रा 2बी, सी)के शिखर की आधी अधिकतम (FWHM) पर पूर्ण चौड़ाई की गणना करके प्राप्त संकल्प को मापा। अंत में, हमने चैनल पंजीकरण द्वारा रंगीन विपथन को ठीक किया, फिर से फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर(चित्रा 3ए, बी)का उपयोग करके। इसके बाद, हमने 100x उद्देश्य के साथ नमूने का विश्लेषण करना शुरू कर दिया और हमने 3डी-सिम छवियों का अधिग्रहण किया। हमने अधिग्रहण(चित्रा 4A)के दौरान क्षेत्र-रोशनी या आंदोलन की समानता का आकलन करने के लिए सिमचेक का उपयोग किया। हमने रोशनी पैटर्न कोण(चित्रा 4B) केबीच तीव्रता में अंतर की जांच की और हमने स्थानीय धारी विपरीत(चित्रा 4C)को मापने के लिए शोर के मॉड्यूलेशन विपरीत के अनुपात की गणना की। अंत में, हमने पुनर्निर्माण के प्रभावी समाधान(चित्र 4डी)का अनुमान लगाया।

हमने अगले नैनोज-गिलहरी का उपयोग करके सुपर-हल छवियों की गुणवत्ता की पुष्टि की। पहली खंगाली गई छवि(चित्रा 5A)में, नैनोज-गिलहरी ने कलाकृतियों(चित्रा 5C)की उपस्थिति का पता लगाया। हमने एक नई सुपर-हल छवि(चित्रा 5B)प्राप्त करने के लिए पुनर्निर्माण मापदंडों को बदल दिया और नैनोज-गिलहरी ने कलाकृतियों की कमी(चित्रा 5D)की पुष्टि की। प्रणाली को कैलिब्रेट करने और पुनर्निर्मित छवियों की गुणवत्ता का आकलन करने के बाद, हमने अगले मानचित्र 2, एक न्यूरोनल मार्कर, PSD95, एक पोस्ट-सिनेप्टिक मार्कर और लक्ष्य प्रोटीन SUMO1 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों का विश्लेषण करना शुरू कर दिया। हमने सबसे पहले 40x उद्देश्य(चित्रा 6A)के साथ चार-चैनल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने वाले नमूने का विश्लेषण किया। न्यूरोनल प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले क्षेत्र का चयन करने पर, हमने 100x उद्देश्य पर स्विच किया। हमने नैनोज-गिलहरी के साथ पुनर्निर्माण की गुणवत्ता का आकलन करने और सह-स्थानीयकरण विश्लेषण करने के लिए एक ही क्षेत्र की कॉन्फोकल और सिम छवियों दोनों का अधिग्रहण किया। चित्रा 6Bमें, हम SENP1 और drebrin के लिए दाग न्यूरॉन्स की सुपर हल 3 डी सिम छवि दिखाते हैं । सुपर-हल छवियों में सह-स्थानीयकरण का प्रोफाइल विश्लेषण(चित्रा 7A)और पियर्सन और मांडर के गुणांक(चित्रा 7B)के परिमाणीकरण के साथ विश्लेषण किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: वाइडफील्ड, कॉन्फोकल और सिम अधिग्रहण की तुलना। (A)प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की वाइडफील्ड छवि सेनप 1 (हरी), ड्रेब्राइन (लाल) और MAP2 (mauve) के लिए इम्यूनोडाम्पटन । DAPI का इस्तेमाल नाभिक को दागने के लिए किया जाता था। स्केल बार 5 माइक्रोन (B)पैनल एके एक ही नमूने की कॉन्फोकल छवि । (C)पैनल ए और बीके एक ही नमूने की सिम छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोस्कोप अंशांकन के लिए माइक्रोस्फीयर की 3डी-सिम छवि का विश्लेषण। (क)फास्ट फोरियर अपने फूलों की तरह आकार के साथ माइक्रोस्फीयर के अधिग्रहण का रूपांतरण । (ख)पार्श्व स्थानिक संकल्प निर्धारित करने के लिए एकल माइक्रोस्फीयर का चयन। (ग)बी में एकल माइक्रोस्फीयर की तीव्रता प्रोफ़ाइल अपने FWHM के माप के साथ । मूल्य साधन द्वारा प्राप्त संकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: तीन चैनल पंजीकरण। }Aपंजीकरण से पहले मल्टीकलर (तरंगदैर्ध्य 488एनएम, 555एनएम और 647एनएम) टेट्रास्पेक माइक्रोस्फीयर का अधिग्रहण। (ख)अंशांकन के बाद एक ही नमूने का अधिग्रहण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: सिमचेक का उपयोग करके कच्चे और पुनर्निर्मित छवियों का गुणवत्ता मूल्यांकन। (A)सिमचेक का उपयोग करके मोशन एंड रोशनी भिन्नता विश्लेषण। सिग्नल ग्रे टू व्हाइट सजातीय रोशनी और अधिग्रहण के दौरान आंदोलन की अनुपस्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। (ख) चैनल तीव्रता प्रोफाइल कच्चे छवि का विश्लेषण करके प्राप्त की गई । इस उदाहरण में कमी या ब्लीचिंग या उतार-चढ़ाव का सुझाव देने के लिए तीव्रता भिन्नता कम है। (ग) रॉ मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट छवि के भीतर मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट-टू-शोर के अनुपात की गणना करने के लिए । हीटमैप मॉडुलन विपरीत विविधताओं को दर्शाता है। (घ)पुनर्निर्माण के प्रभावी समाधान का निर्धारण करने के लिए आयाम फोरियर स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करने के लिए फोरियर प्लॉट को खंगाला गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: नैनोज-गिलहरी का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि गुणवत्ता का आकलन। (A)कलाकृतियों के साथ संदर्भ सुपर-रिजॉल्यूशन इमेज। (ख)अच्छी गुणवत्ता की संदर्भ सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि। (ग) एकके नैनोज-गिलहरी त्रुटि मानचित्र का प्रतिनिधित्व छवि । लाइटर क्षेत्र बड़े पैमाने पर कलाकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि गहरे रंग के लोग सही पुनर्निर्माण का प्रतिनिधित्व करते हैं। (घ)नैनोज-गिलहरी त्रुटि मानचित्र बी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: सिम छवि नमूना। (ए)प्राथमिक न्यूरॉन्स की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी। अच्छे संकल्प को बनाए रखते हुए नमूने का अवलोकन प्राप्त करने के लिए 40X-उद्देश्य चुना गया था। कोशिकाओं को SUMO1 (हरा), PSD95 (लाल) और MAP2 (mauve) के लिए इम्यूनो दाग थे । DAPI का इस्तेमाल नाभिक को दागने के लिए किया जाता था। स्केल बार 50 माइक्रोन। छवियों को जेड प्रक्षेपण के रूप में प्रदर्शित किया गया । (ख)100X उद्देश्य का उपयोग कर पैनल ए में हरे बॉक्स में हाइलाइट किए गए क्षेत्र पर SUMO1 और PSD95 के लिए सिम छवियां । लाल तीर सिर तीव्रता प्रोफ़ाइल की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया एक में दिखाया इनसेट की स्थिति का संकेत मिलता है। स्केल बार 5 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: सह-स्थानीयकरण विश्लेषण। (A)प्राथमिक न्यूरॉन्स की सुपर-हल छवि SENP1 (हरे रंग में) और ड्रेब्राइन (लाल रंग में), स्केल बार 0.5 माइक्रोन, और इसकी तीव्रता प्रोफ़ाइल के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ दाग। ग्राफ के मानों को प्रत्येक चैनल के लिए 100 (मनमाने ढंग से इकाई) तक सामान्यीकृत किया गया था और नीले तीर द्वारा दिखाए गए पिक्सेल तीव्रता के अनुरूप था। (ख)जेकोप का उपयोग करके विश्लेषण सेन्प 1 और ड्रेब्रिन के बीच पियर्सन के सहसंबंध गुणांक और मंडेर के गुणांक की गणना करने के लिए। प्लग-इन सेट अप और दृश्य सीमा की खिड़कियां दिखाई जाती हैं। मांडर के गुणांक को दो मूल्यों द्वारा व्यक्त किया जाता है - SENP1 अंश जो ड्रेब्राइन (एम 1) और ड्रेब्रिन अंश के साथ सह-स्थानीयकरण करता है जो एसईएनपी 1 (एम 2) के साथ सह-स्थानीयकरण करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

संरचना और सिनैप्स की संरचना को स्पष्ट करना शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है जो स्मृति और अनुभूति को विनियमित करते हैं। जबकि सामान्य स्थिति में, सिनेप्स स्मृति के निर्माण खंड हैं, वे अल्जाइमर रोग32जैसे जटिल न्यूरोलॉजिकल विकारों को भी रेखांकित करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सिम नामक सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ न्यूरोनल प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने का कार्य करता है। रोशनी के एक विशेष पैटर्न का उपयोग करके, सिम लगभग 0.1 माइक्रोन के संकल्प तक पहुंच सकता है, जो सिनेप्स के अध्ययन के लिए उपयुक्त है, जो सामान्य रूप से 0.03 और 0.15 माइक्रोन के बीच मापता है। इससे भी अधिक विस्तार के लिए, एसटीईड (उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी), पाम (फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी) या स्टॉर्म (स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी) जैसी अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकें, जो 10-20 एनएम के संकल्प तक पहुंच सकती हैं,33लागू हो सकती हैं।

यहां, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स में सिनैप्टिक मार्कर के साथ लक्षित प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण के विश्लेषण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल न्यूरोनल कोशिकाओं की किसी भी प्राथमिक संस्कृति, जैसे हिप्पोकैम्पल, सेरिबेलर या कॉर्टिकल न्यूरॉन्स और यहां तक कि प्राथमिक न्यूरॉन्स की संस्कृतियों के लिए भी लागू किया जा सकता है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से संबंधित नहीं हैं, जैसे कि आंत्र तंत्रिका तंत्र न्यूरॉन्स। सुपर-रिज़ॉल्यूशन स्तर पर विश्लेषण की कुंजी, हालांकि, अधिग्रहण के दौरान उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक हैं, जैसे कि चैम्बर्ड कवरस्लिप और बढ़ते समाधान उद्देश्य के विवर्तन सूचकांक के साथ संगत। हमने उनके उपयोग में आसानी के लिए कक्षित कवर्लिप्स का उपयोग किया, लेकिन लेपित कवरग्लास पर प्राथमिक न्यूरॉन्स को बढ़ाने की शास्त्रीय, सस्ती विधि फिर भी मान्य है, विशेष रूप से एक उच्च परिशुद्धता #1.5H (0.17 मिमी) कवरग्लास के साथ। इसके अलावा, एक बढ़ते मीडिया जो कांच (1.52) के अपवर्तन सूचकांक और 1.515 के अपवर्तन सूचकांक के साथ 100x उद्देश्य के लिए एक विसर्जन तेल के रूप में संभव के रूप में एक अपवर्तन सूचकांक तक पहुंच सकता है का उपयोग किया जाना चाहिए। अधिग्रहण की सटीकता की गारंटी देने के लिए निरंतर कमरे का तापमान और स्थिर टेबल भी अनिवार्य हैं।

हम सिम अध्ययन में डाइलाइट और एलेक्सा माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों का उपयोग करते हैं। उत्तेजन और उत्सर्जन और अच्छी क्वांटम उपज की अपनी संकीर्ण चोटियों के कारण, उन्हें सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के लिए इंगित किया जाता है जिसके लिए शोर अनुपात के लिए सबसे अच्छा संकेत की आवश्यकता होती है। डेम्पसे एट अल ने सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग३४के लिए एलेक्सा, डाइलाइट और अन्य फ्लोरोफोरस की तुलना की ।

अधिग्रहण के दौरान, हम नियमित रूप से 10 मेगाहर्ट्ज से अधिक 1 मेगाहर्ट्ज पर कैमरा सेट करते हैं। 1 मेगाहर्ट्ज, धीमी अधिग्रहण गति के लिए धन्यवाद, छवियों को 10 मेगाहर्ट्ज की तुलना में अधिक सटीकता और कम शोर देता है। 1 मेगाहर्ट्ज रीड-आउट मोड 16 बिट की थोड़ी गहराई के साथ रिकॉर्ड भी कर सकता है (10 मेगाहर्ट्ज के अधिकतम 14 बिट की तुलना में), अधिक रंग जानकारी और छवियों को अधिक सटीक रंग ढाल देता है। हालांकि, इसकी गति के साथ 10 मेगाहर्ट्ज, लाइव छवियों के लिए उपयोगी है। ब्लीचिंग से बचने और फ्लोरोफोर को संरक्षित करने के लिए, हम लेजर पावर को भी यथासंभव कम सेट करते हैं। संकेत तीव्रता में सुधार करने के लिए, लाभ मूल्यों को बढ़ाया जा सकता है। यह ध्यान देने योग्य है कि कम लाभ शोर को बढ़ाने के बिना क्लीनर छवियों की गारंटी देता है। सामान्य तौर पर, कक्ष कवर्लिप के नीचे से 7 माइक्रोन के भीतर इमेजिंग करते समय सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए जाते हैं। तेल विसर्जन के साथ 100x उद्देश्य का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। यदि कोशिकाओं/ऊतकों में गहरे अधिग्रहण की आवश्यकता है, एक बेहतर विकल्प पानी विसर्जन के साथ एक 60x उद्देश्य का उपयोग हो सकता है ।

सिम अध्ययन करने में मुख्य चुनौतियों में से एक छवि पुनर्निर्माण35है. कलाकृतियों और विचलन के बिना सुपर-हल छवियों को प्राप्त करने के लिए न केवल तदर्थ प्रायोगिक स्थितियों का उपयोग करना आवश्यक है, बल्कि अंतिम छवियों को प्राप्त करने के लिए सिस्टम और पैरामीटर अनुकूलन का सावधानीपूर्वक अंशांकन भी आवश्यक है। प्रोटोकॉल में, हम वर्णन करते हैं कि सिस्टम के अंशांकन और कच्चे और पुनर्निर्मित छवियों के गुणवत्ता विश्लेषण का आकलन करके कुछ सबसे आम गलतियों से कैसे बचा जाए। विशेष रूप से, हम सुपर-हल छवियों की आम कलाकृतियों को रोकने के लिए सही साधन सेटिंग्स को आश्वस्त करने के लिए इमेजजे प्लगइन्स सिमचेक और नैनोजे-गिलहरी के उपयोग का वर्णन करते हैं। अनुप्रयोग अंतिम छवियों के निष्पक्ष गुणवत्ता मूल्यांकन की अनुमति देते हैं जो अध्ययन की संरचनाओं के पूर्व ज्ञान के खिलाफ परिणामों को व्यक्तिपरक बेंचमार्किंग पर आधारित नहीं है।

हम सुझाव देते हैं कि सिनेप्टोफिजिन और PSD95 या ड्रेब्रिन को प्री-और पोस्ट-सिनैप्टिक मार्कर के रूप में उपयोग करना, हालांकि अन्य मार्कर भी मान्य हैं। साहित्य का एक विशाल शरीर बाससून जैसे प्रोटीन 36,37के रूप मेंसिनैप्टिकमार्कर का वर्णन करता है । यह ध्यान देने योग्य है कि नाभिक को छोड़कर पूरे सेल में पूर्व और पोस्टसिनैप्टिक मार्कर मौजूद हैं। उनके संकेत के अधिकांश गैर सिनैप्टिक है, लेकिन परिवहन या गिरावट, पृष्ठभूमि या अंय कलाकृतियों में प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है । इसलिए विश्लेषण के क्षेत्र को सावधानीपूर्वक चुनना महत्वपूर्ण है। हम अक्षतंश और डेंड्रिटिक टर्मिनल चुनने के लिए MAP2 एंटीबॉडी सिग्नल का उपयोग करते हैं।

सह-स्थानीयकरण के विश्लेषण में हम दो दृष्टिकोणों का उपयोग करते हैं। पहला एक दृश्य दृष्टिकोण है, जो प्रोफ़ाइल विश्लेषण पर आधारित है जो सह-स्थानीयकरण की एकल घटनाओं को दिखाता है और प्रत्येक चैनल के योगदान की पहचान करता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की एक चेतावनी खराब सांख्यिकीय शक्ति है । इस कारण से, हमने प्रत्येक छवि के पूरे क्षेत्र के बड़ी संख्या में घटनाओं के प्रतिनिधि के विश्लेषण के आधार पर एक दूसरी विधि का उपयोग करने का भी फैसला किया। यह विधि पियर्सन के सहसंबंध गुणांक और मांडर के एम1 और एम 2 गुणांक की गणना पर आधारित है। हम छवि और मांडर के M1 और M2 में संकेतों के ओवरलैप का वर्णन करने के लिए पियर्सन के सहसंबंध गुणांक का उपयोग ब्याज३८के संकेतों के बीच पारस्परिक सह-स्थानीयकरण का वर्णन करने के लिए करते हैं । गणना के लिए, हम इमेजजे प्लगइन JACoP को नियोजित करते हैं, क्योंकि इसमें एक सुविधा है जो आपको विश्लेषण में किसी भी पृष्ठभूमि योगदान को त्यागने के लिए एक मैनुअल सीमा निर्धारित करने की अनुमति देती है, विशेष रूप से मंडेर के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि की रचनात्मक आलोचना के लिए एडोआर्डो मिकोटी का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस अध्ययन को ब्राइटफोकस A2019296F द्वारा समर्थित किया गया था, फोडो डी बेनेफिसेंज़ा - ग्रुप्पो इंटेसा सैंपाओलो (एलसी), फोंडाजिओन रीजनल प्रति ला राइसरिका बायोमेडिका (Care4NeuroRare CP_20/2018) (सीएन) और मैरी स्कोलोडोवस्का-क्यूरी इनोवेटिव ट्रेनिंग नेटवर्क (जेके) द्वारा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan blue solution  Thermo Fisher Scientific 15250061 Chemical
70 µm filter  Corning 352350 Equiment
Alexa Thermo Fisher Scientific - Antibody
Antibody SENP1 Santa Cruz sc-271360 Antibody
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Chemical
Bovine serum albumin  Merck 5470 Chemical
CaCl2 Merck Life Science 21115 Chemical
Chambered coverslips Ibidi 80826 Equiment
DyLight Thermo Fisher Scientific - Antibody
FBS (Hyclone) GIBCO SH3007002 (CHA1111L) Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent Thermo Fisher Scientific F8803 Equiment
Glucose Merck Life Science G8769 Chemical
Glutamax GIBCO 35050061 Chemical
HEPES Merck Life Science H3537 Chemical
L-Cystein  Merck Life Science  C6852-25g Chemical
MAP2 Merck AB15452 Antibody
MEM  Life Technologies 21575022 Medium
MgCl Merck Life Science M8266 Chemical
NaOH VWR International 1,091,371,000 Chemical
Neurobasal A Life Technologies 10888022 Medium
N-SIM Super Resolution Microscope Nikon - Instrument
Papain Merck Life Science  P-3125 Chemical
paraformaldehyde  Thermo Fisher Scientific 28908 Chemical
Pen/Strep 10x Life Technologies 15140122 Chemical
phosphate-buffered saline  Gibco 10010023 Chemical
Poly-L lysine Sigma P2636 Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Chemical
PSD95  NeuroMab K28/43 Antibody
Round coverglass Thermo 12052712 Equiment
SUMO1 Abcam ab32058 Antibody
Synaptophysin  Merck S5768  Antibody
Triton X-100  Merck T8787 Chemical
Trypsin inhibitor  Merck Life Science  T9003-500MG Chemical

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तंत्रिका विज्ञान अंक 164 तंत्रिका विज्ञान मस्तिष्क प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृति माइक्रोस्कोपी सुपर-रिज़ॉल्यूशन
प्राथमिक न्यूरॉन्स में प्रोटीन और सिनैप्टिक मार्कर के सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग
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Russo, L., Natale, C., Conz, A.,… More

Russo, L., Natale, C., Conz, A., Kelk, J., Restelli, E., Chiesa, R., Salmona, M., Fioriti, L., Colnaghi, L. Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61434, doi:10.3791/61434 (2020).

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