Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية استخدام المجهر فائقة الدقة لدراسة البروتين التعريب المشترك في الثقافات العصبية الأولية.
Abstract
نقاط الاشتباك العصبي هي العناصر الوظيفية للخلايا العصبية وعيوبها أو خسائرها هي في أساس العديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. وتستخدم على نطاق واسع دراسات التصوير للتحقيق في وظيفتها واللدونية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. بسبب حجمها وهيكلها، تتطلب دراسات توطين البروتينات تقنيات تصوير عالية الدقة. في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء لدراسة في الخلايا العصبية الأولية التعريب المشترك للبروتينات المستهدفة مع علامات متشابك على مستوى فائقة الدقة باستخدام المجهر الإضاءة منظم (SIM). SIM هي تقنية إضاءة منقوشة تعمل على مضاعفة الدقة المكانية للمجهر الواسع، لتصل إلى تفاصيل تبلغ حوالي 100 نانومتر. يشير البروتوكول إلى عناصر التحكم والإعدادات المطلوبة لإجراء دراسات قوية للترجمة المشتركة ونظرة عامة على الأساليب الإحصائية لتحليل بيانات التصوير بشكل صحيح.
Introduction
وقد تغير فهم وعرض المشبك بشكل كبير منذ وصفه الأول من قبل فوستر وشيرينغتون في 18971. ومنذ ذلك الحين، معرفتنا الاتصالات العصبية والعمليات الجزيئية وراء ذلك نمت أضعافامضاعفة 2. أصبح من الواضح أنه يمكن التفكير في نقاط الاشتباك العصبي كنظام حجرتين: حجرة ما قبل متشابك تحتوي على حويصلات للافراج عن الناقلات العصبية وحجرة ما بعد متشابك مع مستقبلات3. وقد تطورت هذه النظرة التبسيطية، في السنوات العشرين الماضية، إلى شبكة معقدة من البروتينات المطلوبة لتحويل الإرسال إلى إشارة4.
المكاسب في فهم جزئيا بسبب تقنيات فائقة الدقة التي تغلبت على الحد الأقصى للحجم المجهري الضوئي التقليدي لتتناسب مع البعد من نقاط الاشتباك العصبي أفضل5،6،7،8،9،10. بسبب الحد من الانعراج ، لا يمكن للمجهر البصري أن يصل إلى قرار فوق 200 نانومتر11،12. لتجاوز هذا الحد، تم إنشاء تقنيات فائقة الدقة، وذلك باستخدام نهج مختلفة والوصول إلى مختلف القرارات الحد من الحيود الفرعي: SIM، STED (المجهر استنفاد الانبعاثات المحفزة)، النخيل (PhotoActivated التعريب المجهري) و STORM (المجهر إعادة الإعمار البصرية العشوائية)13،14. تُضاعف SIM الدقة المكانية لأنظمة المجهر واسعة النطاق القائمة على الليزر عن طريق إدخال صرّار حيود في مسار شعاع الإثارة15. diffracts صر المنقولة أشعة الليزر لخلق نمط الإضاءة المعروفة، وعادة المشارب. يتم فرض هذا النمط من الضوء المنظم عن قصد إلى التوزيع المكاني غير معروف للصبغة الفلورية (من العينة). هامش التداخل التي شكلتها نمطين ترميز لتفاصيل دقيقة لا يمكن تحديدها خلاف ذلك مع المجهر العادي واسعة المجال. يتم الحصول على الصورة النهائية الفائقة من خلال الجمع بين وفك مع الأساليب الرياضية عدة صور خام من نفس العينة التي تم الحصول عليها من خلال ترجمات وتناوب الصريف الحيود. قرار فائقة حل الصور تصل إلى 100 نانومتر في الجانبي و 500 نانومتر في الاتجاهات المحورية ل2D-SIM15 أو 100 نانومتر في الجانبي و 250 نانومتر في الاتجاهات المحورية ل3D-SIM16.
الفهم الجديد للمشابك هو أكثر أهمية في ضوء العديد من الاضطرابات العصبية حيث خلل متشابك يلعب دورا رئيسيا في بداية وتقدم17,18. مرض الزهايمر، متلازمة داون، مرض باركنسون، أمراض البريون، الصرع، اضطرابات طيف التوحد ومتلازمة X الهشة من بين أمور أخرى قد تم ربطها بتشوهات في التركيب متشابك، مورفولوجيا وظيفة19،20،21،22.
في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام مجموعة من الأجسام المضادة سومو محددة، استخدمنا سيم لإظهار التعريب المشترك في الخلايا العصبية فرس النهر الأولية من البروتينات سومو مع علامات ما قبل وما بعد متشابك سينابتوفيسين و PSD95 على مستوى فائقة الدقة23. هذا مكننا من تأكيد الأدلة المجهرية الحيوية والمجهرية الميكولوجية لتوطين سومو في الخلايا العصبية.
هنا، ونحن وصف بروتوكول لدراسة توطين البروتينات في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر الماوس. في الوقت نفسه، قد يتم تكييف هذا البروتوكول مع أنواع مختلفة من الثقافات العصبية الأولية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- الثقافات الأساسية
- الثقافة الماوس فرس النهر الخلايا العصبية الأولية في أغطية الغرف (مثل ibidi μ-الشريحة 8 Well أو Nunc Lab-Tek Coverglass) التي تتطابق مع الشرط الموضوعي لسمك الغطاء #1.5 (0.17 مم).
- يغطي معطف مع 100 ميكرولتر من بولي-L-ليسين (100 ميكروغرام/مل).
- في اليوم التالي، غسل الأغطية الغرف مرتين مع المالحة المعقمة الفوسفات المخزنة (PBS).
- للحصول على الخلايا العصبية الأساسية الماوس، عزل فرس النهر من الجراء P1-P423.
- مكان تشريح فرس النهر في 10 مل من وسائل الإعلام تشريح (الجدول 1) والسماح لهم إيداع في الجزء السفلي من الأنبوب.
- باستخدام ماصة معقمة، وإزالة بعناية وسائل الإعلام تشريح، وترك فرس النهر دون عائق في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إضافة 10 مل من وسائل الإعلام 1 (الجدول 1) إلى فرس النهر واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- باستخدام ماصة معقمة، وإزالة بعناية وسائل الإعلام 1، وترك فرس النهر دون عائق في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إضافة 10 مل من وسائل الإعلام 2(الجدول 1) وترك أنبوب (توج) الطرد المركزي تحت غطاء محرك السيارة أفقيا لمدة 45 دقيقة.
- دع أنبوب الطرد المركزي يقف عموديًا للسماح للأنسجة بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب.
- باستخدام ماصة معقمة، وإزالة بعناية وسائل الإعلام 2، وترك فرس النهر دون عائق في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
- إضافة 2 مل من وسائل الإعلام 3 (الجدول 1).
- باستخدام ماصة p1000 مع طرف مصفى، ميكانيكيا فصل الخلايا من الأنسجة.
- نقل فائقة, التي تقع في الخلايا العصبية المعزولة, إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 مل.
- الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 2 دقيقة في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT).
- بعد الطرد المركزي، تقع الخلايا في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. باستخدام ماصة معقمة تجاهل المابس.
- خلايا إعادة الإنفاق في 1 مل من وسائل الإعلام 4.
- استخدم فلتر 70 ميكرومتر للقضاء على الخلايا غير المُزَوّسة.
- عد الخلايا القابلة للحياة في غرفة Bürker بإضافة 1 ميكرولتر من 0.4 ٪ Trypan حل أزرق إلى 19 ميكرولتر من تعليق الخلية.
- خلايا لوحة في 70،000 خلايا / جيدا في حجم 200 ميكرولتر في البئر.
- السماح للخلايا لإرفاق لمدة 2 ساعة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- أخرج الأغطية المُغطّاة من الحاضنة واستبدلها بعناية مع 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية.
- اترك الغطاءات المُغطّاة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و5% CO2.
- استبدال ثلث الوسط مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة كل 5-7 أيام.
- انتظر حتى تنضج الخلايا العصبية الأساسية في فرس النهر (12-14 يومًا بعد الطلاء) لإجراء دراسات التعريب المشترك.
2. تلطّخ المناعة
- خذ الأغطية المُغطّية من الحاضنة.
- إزالة الوسيطة.
- اغسل الآبار بسرعة بـ 200 ميكرولتر من برنامج PBS.
- إضافة 4٪ شبهformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيدا) إلى الخلايا العصبية لإصلاحها بسرعة.
- احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT.
- إزالة حل PFA.
- Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ تريتون X-100 (200 ميكرولتر / بئر).
- احتضان لمدة 1 دقيقة في RT.
- إزالة الحل واحتضان العينات مع 1٪ البوم مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيدا) لمدة 1 ساعة في RT لتغطية بشكل سلبي جميع الأسطح ملزمة الحرة من لوحة مع بروتين غير ذي صلة للتحليل. يقلل المخزن المؤقت القائم على BSA بدون Triton X-100 من خلفية الأجسام المضادة بكفاءة أكبر من نفس المخزن المؤقت مع 0.2٪ Triton X-100.
- إزالة الحل.
- إضافة الأجسام المضادة الأولية من اختيار المخفف في محلول PBS التي تحتوي على 1٪ BSA و 0.2٪ تريتون X-100 (120-200 μL / جيدا، اعتمادا على تخفيف الجسم المضاد وتوافر). احتضان العينات لمدة 2 ساعة.
- كتحكم سلبي، لا تضيف أي جسم مضاد أساسي إلى أحد الآبار. ويمكن استخدام أجسام مضادة متعددة من أنواع مختلفة ضد أهداف مختلفة في نفس الوقت. استخدام جسم مضاد ضد MAP2 (علامة الخلايا العصبية) التي أثيرت في الدجاج، وهو جسم مضاد ضد إما PSD95 أو synaptophysin التي أثيرت في الماوس، والأجسام المضادة ضد البروتين الهدف التي أثيرت في أرنب. يسمح هذا بتحليلات SIM ثلاثية الألوان.
- سرعان ما يغسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيدا).
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية (dyLight و Alexa الأجسام المضادة الثانوية على حد سواء يمكن استخدامها) المخفف في حل PBS التي تحتوي على 1٪ BSA و 0.2٪ تريتون X-100 (200 ميكرولتر / بئر). احتضان العينات لمدة 1 ساعة في RT.
- سرعان ما يغسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيدا).
- أضف صبغة Hoechst بتركيز 1 ميكروغرام/مل مخفف في PBS (200 ميكرولتر/بئر) لنوى وصمة عار. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT.
- سرعان ما غسلت الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- قم بتحميل الخلايا باستخدام محمول متوافق مع SIM. استخدام 10 μL / بئر من ProLong زجاج Antifade Mountant.
- تغطية وحماية الخلايا مع غطاء (على سبيل المثال، غلاف دائري بقطر 8 مم). ويمكن أيضا أن تكون تلك المربعة المستخدمة.
- تخزين الأغطية الغرف في RT والانتظار على الأقل 48 ساعة قبل الحصول على الصور. يتطلب الماس زجاج ما لا يقل عن يومين من العلاج قبل الاستحواذ فائقة القرار.
3. التحكم في خصوصية الأجسام المضادة
ملاحظة: استخدم استراتيجيتين لضمان خصوصية الأجسام المضادة. الاستراتيجية الأولى هي استخدام ما لا يقل عن اثنين من الأجسام المضادة المختلفة التي تستهدف الركيزة نفسها. الاستراتيجية الثانية هي تحييد الأجسام المضادة عن طريق الحضانة مع هدف البروتين النقي أو epitope المستخدمة لرفع الأجسام المضادة.
- احتضان الأجسام المضادة من اختيار مع خمس مرات زائدة من الهدف المؤتلف أو epitope ل 1 ساعة في RT في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
- بعد الحضانة، واستخدام الأجسام المضادة تحييد في التركيز المعتاد للتلوين كما هو موضح أعلاه من 2.11.
4. معايرة المجهر
ملاحظة: نحن نستخدم بشكل روتيني نظام المجهر فائق الدقة من قبل نيكون من قبل نيكون من أجل دراسات فائقة الدقة. ومع ذلك، تقدم العديد من الشركات الأخرى أيضاً مجاهر فائقة الدقة في كتالوجاتها. على الرغم من أن يتم وصف مؤشرات محددة لنظام N-SIM من نيكون، يمكن تعميم التعليمات التالية على أنظمة أخرى. قبل الحصول على صور SIM ، يتطلب النظام معايرة مناسبة مع حبات فلورية ذات حجم دون دقة محددة. ومن الأمثلة على ذلك مصغرة TetraSpeck. هذه الخرز ملطخة بأصباغ فلورية مختلفة للسماح بمعايرة أشعة الليزر المختلفة مع عينة واحدة.
- في حمام مائي سونيكات حول 1.8 × 108 الفلورسنت microspheres لمدة 10 دقيقة. يتطلب نظام N-SIM من نيكون عينة من الخرز متعدد الألوان قليلة السكان للمعايرة. قد يختلف هذا بالنسبة للأنظمة الأخرى التي تتطلب طبقة واحدة كثيفة من الخرز الفلورسنت بحجم دون دقة. ضبط عدد الجزيئات الفلورية وفقا لذلك.
- تمييع الفلورسنت microspheres 1:500 في الماء المقطر مزدوجة.
- سونيكات للمرة الثانية لمدة 10 دقائق إضافية.
- بايبت 15 ميكرولتر من الخرز المخفف إلى بئر من غطاء الغرف.
- اترك المحلّف جافًا لمدة 5 دقائق في RT.
- أضف 10 ميكرولتر من محلول التركيب ووضع غطاء 8 مم على القمة.
- انتظر 48 ساعة على الأقل للسماح بالمعالجة المناسبة.
- بدوره على المجهر وأشعة الليزر.
- دع النظام يسخّن للوصول إلى التوازن الحراري لجميع مكونات المجهر. N-SIM سوبر القرار المجهر نظام يتطلب 3 ساعات على الأقل.
- حدد الهدف 100x.
- بدء المعايرة عن طريق محاذاة أشعة الليزر إلى مركز كتلة صرع الحيود. في نظام N-SIM، يسمح مقبض ميكرومتر وكاميرا مخصصة بتمركز الحزم الضوئية إلى الهدف.
- أدخل غطاء الأغطية المُغطّى في المجهر للعرض. تعيين النظام إلى سمك الأغطية الغرف عن طريق ضبط طوق التصحيح الموضوعي. برنامج NIS، والبرمجيات الملكية المقدمة مع نظم المجهر N-SIM فائقة الدقة، لديه وظيفة تلقائية لتنظيم الياقات التصحيح.
- ضبط تركيز كتلة الصريف لكل قناة لضمان تركيز الإضاءة نمط منظم على العينة. يوفر برنامج NIS دالة تلقائية لهذه المهمة.
- بعد ذلك، احصل على صور 3D-SIM الخام من microspheres متعددة الألوان. إعادة بناء الصور الخام للحصول على صورة فائقة حل باستخدام برنامج المجهر أو منصة البرمجيات مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية ImageJ24 وspersIM المساعد25.
- حساب، لكل طول موجي منفصل، تحويل فورييه للصورة فائقة الحل التي تم الحصول عليها في 4.14. إذا فشلت الصورة المحولة في الحصول على نمط مثل الزهور الصحيحة، إعادة تشغيل المعايرة من 4.11 منذ لم يتم تحقيق فائقة الدقة.
- في الصورة فائقة الحل، حدد ميكروسير واحد وحساب ملفه الشخصي كثافة لكل قناة لقياس دقة التي تحققت. وينبغي أن يكون الآن على مقربة من 100 نانومتر بشكل مؤقت.
- بعد ذلك، تنفيذ تسجيل القناة عن طريق تراكب اقتناء متعددة القنوات من microspheres. والهدف هو أن collimate جميع إشارات القناة بشكلٍ مُشَرَق وبديهي. هذا سوف القضاء على الانحرافات لوني بسبب عدم محاذاة القنوات المختلفة ويساعد على تحليل التعريب المشترك.
- تأكيد جودة المعايرة باستخدام وظائف "خطوات مرحلة الإضاءة" و "تركيز نمط الإضاءة" من SIMcheck26، مجموعة من الإضافات للتطبيق مفتوح المصدر ImageJ. وتحقيقاً لهذه الغاية، قم بإعداد غطاء مكسو بحجر للحصول على طبقة واحدة كثيفة من مجهر TetraSpeck والحصول على صورة 3D-SIM للعينة. تحليل الصورة في ImageJ، وإذا تم الكشف عن انحرافات، إعادة تشغيل معايرة المجهر من الخطوة 4.11.
5 - الاقتناء
- ابدأ في تحليل العينة باستخدام هدف 40x في وضع confocal أو widefield. وهذا يسمح الملاحة إلى العينة، والحفاظ على التفاصيل الجيدة ومجال كبير من الرؤية.
- استخدم إشارة الأجسام المضادة MAP2 لتحديد منطقة تمثل العمليات العصبية.
- الحصول على صور للعينة في وضع confocal لتحديد نوعية تلطيخ. وسوف تعكس نوعية confocal الفقراء في نوعية SIM الفقراء، وبالتالي تتطلب العينات التي يجب التخلص منها.
- إذا كانت المنطقة وجودة الصور مرضية، قم بتبديل الهدف إلى 100x.
- تطبيق النفط على الهدف 100x.
- الحصول على صورة واسعة أو confocal التي سيتم استخدامها في وقت لاحق لتقييم نوعية الصورة فائقة حل (الشكل 1A, B).
- التبديل إلى وضع SIM 3D.
- باستخدام إطارات الحوار لتعيين معلمات للحصول على، حدد أعلى إعداد عمق بت متوفر لزيادة معلومات اللون إلى أقصى حد. عادةً ما يكون 16-بت هو الخيار القياسي. وعلاوة على ذلك، ولتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، حدد قيمة تردد منخفض للاستحواذ، مثل MHz 1.
- باستخدام النوافذ المدرج التكراري، تعيين الليزر السلطة للحصول على استجابة خطية من إشارة. لتجنب فقدان المعلومات، حد من البيكسلات المشبعة في الصور. يستخدم نظام N-SIM كاميرا أندور iXon3. عند العمل عند 16 بت، اختر كثافة الهدف 16,000 لضمان الاستجابة الخطية للكاميرا. وبدلاً من ذلك، اختر نطاقًا يتراوح بين 30,000-45,000 لزيادة النطاق الديناميكي لعملية الاستحواذ إلى أقصى حد.
- تعيين قوة الليزر بين 0.1٪ و 50٪ عند تصوير العينات وأوقات التعرض بين 50 مللي ثانية و2 ثانية. قد القوى الليزر فوق 50% يسبب photobleaching سريع من الفلوروفوريس في الاستخدام.
- ابدأ في الحصول على الصور في وضع SIM 3D.
- استخدم SIMcheck ، وهو عبارة عن مجموعة من الإضافات المجانية لـ ImageJ ، لتقييم جودة الحصول على الصور الخام.
- إذا لم يكشف SIMCheck عن أي آثار أو مشكلات تتعلق بالجودة ، فاقتناء ما لا يقل عن 10 صور من 4 نسخ فنية للسماح بالتحليل الإحصائي.
6- ما بعد الإنتاج: إعادة بناء الصورة
ملاحظة: الصور التي تم الحصول عليها من 3D-SIM هي صور خام تحتاج إلى المعالجة للحصول على صور تم إعادة تشكيلها فائقة الحل. إعادة بناء غير صحيحة من الصور الخام يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية التي من شأنها أن تؤثر على تحليل العينات. ولذلك ينبغي إيلاء اهتمام كبير لاختيار معايير إعادة الإعمار على النحو الصحيح.
- معالجة الصور الخام باستخدام برنامج تحليل إعادة بناء المجهر للحصول على صورة فائقة الحل(الشكل 1C). بدلا من ذلك ، استخدم البرنامج المساعد ImageJ المتاح مجانا fairSIM لإعادة بناء الصور الخام.
- حساب تحويل فورييه من الصور فائقة حل باستخدام برنامج إعادة بناء المجهر أو برنامج إيمج البرنامج المساعد SIMCheck. يجب أن تعود صورة جيدة أعيد بناؤها ، لكل قناة ، صورة تشبه الزهرة. إذا فشلت الصور المعاد بناؤها في إعادة إنشاء شكل يشبه الزهور ، فعاود تشغيل الصور الخام وإعادة بنائها عن طريق تعديل معلمات إعادة الإعمار مثل تصفية Wiener و apodization وقمع النظامالصفري 27. في برنامج NIS ، باستخدام المعاينة لمراقبة كيفية تأثير تغيير المعلمات على الصورة النهائية التي تم حلها ، قم بتعديل المعلمات i) الإضاءة Contrast تعديل ، ii) عالية الدقة منع الضوضاء و3) خارج التركيز قمع.
- بعد ذلك ، قم بتحليل الصورة المعاد بناؤها للكشف عن القطع الأثرية بشكل غير متحيز باستخدام NanoJ-SQUIRREL28، وهو مكون إضافي يستند إلى ImageJ لتقييم جودة الصور فائقة الحل.
- إذا NanoJ سنجاب يكشف التحف ، وإعادة تشغيل من الصور الخام وإعادة بنائها عن طريق تعديل المعلمات إعادة الإعمار مثل Wiener تصفية ، apodization وقمع الصفر من أجل. في برنامج NIS، باستخدام المعاينة لمراقبة كيفية تأثير تغيير المعلمات على الصورة النهائية التي تم حلها، قم بتعديل المعلمات تباين تعديل الإضاءة، و منع الضوضاء عالية الدقة، و إلغاء التركيز.
- استخدم الصور فائقة الحل لحساب ملف تعريف الترجمة المشتركة و/أو معاملات Pearson و Mander.
7. التعريب المشترك مع تحليل الملف الشخصي
ملاحظة: كخطوة أولى لدراسة التعريب المشترك بين علامات متشابكة والبروتين من الفائدة، واتخاذ صورة فائقة حل وتحليل مكان واحد لتحديد تداخل إشارة.
- تحديد موضع واحد على الصورة فائقة الحل.
- الحصول على ملامح كثافة الإشارات الفلورية من موضع الفائدة.
- تصدير البيانات.
- استخدم GraphPad Prism، أو برنامج تحليل مشابه، لتطبيع جميع قمم الإشارة والحصول على كثافة إشارة مماثلة لكل قناة مع الهدف النهائي المتمثل في تحديد مكان محدد للتعريب المشترك.
8. القياس الكمي لمعاملات بيرسون وماندر
ملاحظة: إذا اقترح تحليل ملف تعريف واحد موضع المشاركة التعريب، يمكن إجراء تحليل أكثر عمومية للصورة بأكملها من خلال حساب معاملات بيرسون وماندر29،30.
- استخدم JACoP31، وهو مكون إضافي من ImageJ ، لتحديد المعلمتين للتعريب المشترك: Pearson's و Mander.
9 - التحليل الإحصائي
- استخدم برنامج GraphPad Prism، أو برنامج مماثل للتحليل والرسوم البيانية، لمعالجة البيانات التي تم جمعها باستخدام JACoP.
- استخدم على الأقل 40 صورة SIM لكل حالة تم تحليلها للحصول على الرسوم البيانية وللحصول على صلة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن نقدم هنا سير العمل القياسية لدراسة البروتينات العصبية شارك في التعريب. قمنا أولاً بمعايرة المجهر وبعد ذلك قمنا بإجراء تحليل SIM للعينات. لمعايرة النظام، استخدمنا الفلورسنت microspheres من 0.1 ميكرومتر القطر. عند الحصول على صور 3D-SIM فائقة الحل من الخرز ، فإن بيانات الصورة الأساسية هي فورييه - تحويلها لإعادة تحويلها إلى تمثيل تردد مكاني. في الشكل 2A، يتم تقديم نمط الزهرة المتميزة كمؤشر على مستويات التفاصيل فائقة الدقة. نحن بعد ذلك قياس القرار الذي تحقق عن طريق حساب العرض الكامل في نصف الحد الأقصى (FWHM) من ذروة ملف تعريف كثافة حبة واحدة(الشكل 2B، C). وأخيرا، قمنا بتصحيح انحراف لوني عن طريق تسجيل القناة، مرة أخرى باستخدام microspheres الفلورسنت (الشكل 3A, B). بعد ذلك ، بدأنا في تحليل العينة بهدف 100x وحصلنا على صور 3D-SIM. استخدمنا SIMCheck لتقييم تكافؤ الإضاءة الحقلية أو الحركة أثناء الاستحواذ(الشكل 4A). نحن التحقق من الاختلافات في كثافة بين زوايا نمط الإضاءة (الشكل 4B) و حسبنا نسبة التباين التشكيل إلى الضوضاء لقياس تباين الشريط المحلي(الشكل 4C). وأخيرا، قدّرنا القرار الفعال لإعادة الإعمار(الشكل 4D).
وأكدنا بعد ذلك جودة الصور فائقة حل باستخدام NanoJ-SQUIRREL. في أول صورة أعيد بناؤها (الشكل 5A)، اكتشف NanoJ-SQUIRREL وجود القطع الأثرية (الشكل 5C). لقد غيرنا المعلمات إعادة الإعمار للحصول على صورة جديدة فائقة حل(الشكل 5B)و NanoJ-SQUIRREL أكد عدم وجود القطع الأثرية (الشكل 5D). بعد معايرة النظام وتقييم جودة الصور المعاد بناؤها ، بدأنا بعد ذلك في تحليل الثقافات العصبية الأولية الملطخة باجسام مضادة ضد MAP2 ، علامة عصبية ، PSD95 ، علامة ما بعد متشابك والبروتين المستهدف SUMO1. قمنا أولا بتحليل عينة أداء أربع قنوات المجهر confocal مع هدف 40x(الشكل 6A). عند اختيار منطقة تمثل العمليات العصبية، انتقلنا إلى هدف 100x. لقد حصلنا على صور confocal و SIM لنفس المنطقة لتقييم جودة إعادة الإعمار مع NanoJ-SQUIRREL وإجراء تحليل التعريب المشترك. في الشكل 6B، نعرض صورة 3D-SIM فائقة العزم من الخلايا العصبية الملطخة لـ SENP1 و drebrin. يمكن تحليل التعريب المشترك في الصور فائقة الحل مع تحليل الملف الشخصي (الشكل 7A) وتحديد كمي من معاملات بيرسون وماندر(الشكل 7B).
الشكل 1: مقارنة بين عمليات الاستحواذ على النطاق العريض والتكون وبطاقة SIM. (A) Widefield صورة من الخلايا العصبية فرس النهر الأولية المثبطة للمناعة SENP1 (الأخضر)، drebrin (الأحمر) و MAP2 (ماوف). DAPI كان يستخدم لطخة النوى. شريط مقياس 5 ميكرومتر(B) صورة Confocal لنفس العينة من لوحة A. (C) صورة SIM لنفس العينة من لوحة A و B. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل صورة 3D-SIM من microspheres لمعايرة المجهر. (أ)سريع فورييه تحويل من اقتناء microspheres مع شكلها مثل زهرة. (ب) اختيار طبقة مجهرية واحدة لتحديد الدقة المكانية الجانبي. (C) كثافة الملف الشخصي للميكروسفير واحد في B مع قياس FWHM لها. وتمثل القيم القرار الذي حققه الصك. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسجيل ثلاث قنوات. (أ)اقتناء ألواح متعددة (أطوال موجية 488nm، 555nm و 647nm) TetraSpeck microspheres قبل التسجيل. (ب) الحصول على نفس العينة بعد المعايرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تقييم جودة الصور الخام وإعادة بنائها باستخدام SIMcheck. (A) تحليل تباين الحركة والإضاءة باستخدام SIMCheck. الإشارة الرمادية إلى البيضاء تمثل الإضاءة المتجانسة وغياب الحركة أثناء الاكتساب. (B) قناة كثافة الملف الشخصي التي تم الحصول عليها من خلال تحليل الصورة الخام. في هذا المثال هناك كثافة الاختلاف هو الحد الأدنى، تشير إلى نقص أو تبييض أو تقلبات. (C) تباين التشكيل الخام لحساب نسبة التشكيل التباين إلى الضوضاء داخل الصورة. تُظهر خريطة الحرارة اختلافات التباين في التشكيل. (د ) إعادة بناء فورييه مؤامرة لتحليل سعة الطيف فورييه لتحديد القرار الفعال لإعادة الإعمار.D الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقييم جودة الصورة فائقة الدقة باستخدام NanoJ-SQUIRREL. (أ) مرجع فائقة الدقة مع صورة القطع الأثرية. (B) مرجع فائقة الدقة صورة ذات نوعية جيدة. (C) صورة تمثل خريطة خطأ NanoJ-SQUIRREL من A. مناطق أخف تمثل التحف واسعة النطاق، في حين أن قتامة منها تمثل إعادة الإعمار الصحيح. (D)NanoJ-SQUIRREL خريطة خطأ من B. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: عينة صورة SIM. (أ) المجهر Confocal من الخلايا العصبية الأولية. تم اختيار هدف 40X للحصول على نظرة عامة على العينة مع الحفاظ على دقة جيدة. كانت الخلايا مُطَهَمَة بالمناعة لـ SUMO1 (الأخضر) و PSD95 (أحمر) و MAP2 (mauve). DAPI كان يستخدم لطخة النوى. مقياس شريط 50 μm. تم عرض الصور كصورة Z. (B) صور SIM لـ SUMO1 و PSD95 على المنطقة التي تم تمييزها في المربع الأخضر في اللوحة A باستخدام هدف 100X. تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى موضع inset المعروض في A المستخدم لحساب ملف تعريف الكثافة. شريط مقياس 5 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليل التعريب المشترك. (أ) فائقة حل صورة من الخلايا العصبية الأولية الملطخة مع جسم مضاد ضد SENP1 (باللون الأخضر) وdebrin (باللون الأحمر) ، شريط مقياس 0.5 μm ، والتشكيل به كثافة. تم تطبيع قيم الرسم البياني لكل قناة إلى 100 (وحدة عشوائية) وتطابق كثافة البكسل التي يظهرها السهم الأزرق. (ب)تحليل باستخدام JACoP لحساب معامل الارتباط Pearson ومعامل ماندر بين SENP1 و drebrin. يتم عرض الإطارات من المكونات في إعداد وعتبة مرئية. يتم التعبير عن معامل Mander بواسطة قيمتين - كسر SENP1 الذي يشترك في ترجمة مع drebrin (M1) وكسر drebrin الذي يشترك في ترجمة SENP1 (M2). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن توضيح بنية وتكوين المشبك أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية التي تنظم الذاكرة والإدراك. بينما في الحالة الطبيعية، نقاط الاشتباك العصبي هي لبنات بناء الذاكرة، كما أنها تكمن وراء الاضطرابات العصبية المعقدة مثل مرض الزهايمر32. البروتوكول الموصوف هنا يعمل على دراسة التعريب المشترك للبروتينات العصبية مع تقنية المجهر فائقة الدقة تسمى SIM. وباستخدام نمط معين من الإضاءة، يمكن أن تصل بطاقة SIM إلى دقة تبلغ حوالي 0.1 ميكرومتر، وهي مناسبة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي، والتي تقيس عادة ما بين 0.03 و 0.15 ميكرومتر. لمزيد من التفاصيل ، وغيرها من تقنيات فائقة الدقة مثل STED (المجهر نضوب الانبعاثات المحفزة) ، والنخيل (PhotoActivated التعريب المجهري) أو STORM (المجهر إعادة الإعمار البصرية العشوائية) ، التي يمكن أن تصل إلى قرار من 10-20 نانومتر ، يمكن تطبيق33.
هنا، نحن وصف تحليل التعريب المشترك للبروتينات المستهدفة مع علامات متشابك في الخلايا العصبية الأولية. يمكن تطبيق البروتوكول على أي ثقافة أولية للخلايا العصبية، مثل فرس النهر، المخيخ أو الخلايا العصبية القشرية وحتى على ثقافات الخلايا العصبية الأولية التي لا تنتمي إلى الجهاز العصبي المركزي، مثل الخلايا العصبية الجهاز العصبي المعوي. بيد أن مفتاح التحليل على مستوى الدقة الفائقة هو الكواشف المستخدمة أثناء الاقتناء، مثل الأغطية المُغطّاة بالمغلفات والحلول المتصاعدة المتوافقة مع مؤشر الحيود للهدف. استخدمنا الأغطية الغرف لسهولة استخدامها، ولكن الطريقة الكلاسيكية، أرخص من الخلايا العصبية الأولية المتنامية على غطاء مغلفة غير مع ذلك صالحة، لا سيما مع دقة عالية #1.5H (0.17 مم) غطاء. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي استخدام وسائط متصاعدة يمكنها الوصول إلى مؤشر انكسار أقرب ما يمكن إلى مؤشر الانكسار للزجاج (1.52) وزيت الغمر لهدف 100x بمؤشر انكسار 1.515. درجة حرارة الغرفة الثابتة والجداول استقرت هي أيضا إلزامية لضمان دقة عمليات الاستحواذ.
نستخدم كل من dyLight و Alexa الأجسام المضادة الثانوية في دراسات SIM. نظراً لقممها الضيقة من الإثارة والانبعاثات والعائد الكمي الجيد ، يشار إليها لتقنيات فائقة الدقة التي تتطلب أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء. ديمبسي وآخرون مقارنة اليكسا، dyLight وغيرها من الفلوروهور للتصوير فائقة الدقة34.
أثناء الاستحواذ، نقوم بتعيين الكاميرا بشكل روتيني عند 1 ميجاهرتز على MHz 10 MHz. 1 ميغاهرتز، وذلك بفضل سرعة الاستحواذ الأبطأ، ويعطي الصور دقة أكبر وضوضاء أقل من MHz 10. يمكن أيضًا تسجيل وضع القراءة 1 MHz بعمق بت يبلغ 16 بت (مقارنة بالحد الأقصى 14 بت من 10 ميجاهرتز)، مما يعطي المزيد من المعلومات اللونية وتدرجًا أكثر دقة للصور. ومع ذلك، 10 ميغاهيرتز، مع سرعته، مفيد للصور الحية. لتجنب التبييض والحفاظ على الفلوروفور، وضعنا أيضا قوة الليزر منخفضة قدر الإمكان. لتحسين كثافة الإشارة، يمكن زيادة قيم الكسب. ومن الجدير بالذكر أن انخفاض كسب يضمن الصور أنظف دون تعزيز الضوضاء. بشكل عام، يتم الحصول على أفضل النتائج أثناء التصوير داخل 7 ميكرومتر من الجزء السفلي من غطاء الغرف. وهذا مهم بشكل خاص عند استخدام هدف 100x مع غمر الزيت. إذا كان مطلوبا الحصول على أعمق عبر الخلايا / الأنسجة، قد يكون أفضل خيار استخدام هدف 60x مع غمر المياه.
واحدة من التحديات الرئيسية في أداء الدراسات SIM هو إعادة بناء الصورة35. يتطلب الحصول على صور فائقة الحل بدون قطع أثرية وانحراف ليس فقط استخدام ظروف تجريبية مخصصة ، ولكن أيضًا المعايرة الدقيقة للنظام وتحسين المعلمة للحصول على الصور النهائية. في البروتوكول، نحن وصف كيفية تجنب بعض الأخطاء الأكثر شيوعا من خلال تقييم معايرة النظام وتحليل الجودة من الصور الخام وإعادة بنائها. على وجه التحديد ، نحن وصف استخدام ImageJ الإضافات SIMCheck و NanoJ السنجاب لضمان إعدادات الصك الصحيح لمنع التحف المشتركة من الصور فائقة حل. تسمح التطبيقات بتقييم جودة غير متحيز للصور النهائية التي لا تستند إلى قياس ذاتي للنتائج مقابل المعرفة المسبقة بهياكل الدراسة.
نقترح استخدام synaptophysin و PSD95 أو drebrin كعلامات ما قبل وما بعد متشابك، على الرغم من علامات أخرى صالحة أيضا. يصف مجموعة ضخمة من الأدب البروتينات مثل باسون علامات متشابك36,37. ومن الجدير بالذكر أن علامات ما قبل وما بعد يناببيك موجودة في جميع أنحاء الخلية، باستثناء النواة. الكثير من إشاراتهم غير متشابكة ولكنها تمثل البروتينات في النقل أو التدهور أو الخلفية أو غيرها من القطع الأثرية. ولذلك، من المهم اختيار مجال التحليل بعناية. نستخدم MAP2 إشارة الأجسام المضادة لاختيار محاور عصبي ودندريتيك المحطات.
في تحليل التعريب المشترك نستخدم نهجين. الأول هو نهج مرئي، يستند إلى تحليل الملف الشخصي الذي يعرض أحداثًا فردية للتعريب المشترك ويحدد مساهمة كل قناة. بيد أن من المحاذير لهذا النهج ضعف القوة الإحصائية. لهذا السبب، قررنا أيضا استخدام طريقة ثانية على أساس تحليل عدد أكبر من الأحداث ممثلة للمجال بأكمله من كل صورة. وتستند هذه الطريقة إلى حساب معامل الارتباط في Pearson ومعاملات M1 و M2 من Mander. نحن نستخدم معامل الارتباط بيرسون لوصف تداخل الإشارات في الصورة و M1 M2 و M2 ماندر لوصف التعريب المشترك المتبادل بين إشارات الاهتمام38. لحساب, نحن نستخدم ImageJ البرنامج المساعد JACoP, نظرا لأنه يحتوي على ميزة التي تسمح لك لتعيين عتبة دليل لتجاهل أي مساهمة خلفية في التحليل, خاصة حاسمة لتحليل Mander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يشكرا إدواردو ميكوتي على انتقاده البناء للمخطوطة. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل BrightFocus A2019296F، من قبل فوندو دي Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC)، من قبل Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ومن قبل شبكة التدريب المبتكرة ماري Skłodowska-Curie (JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | - | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
- Choquet, D., Triller, A.
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T.
- Won, R.
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P.
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H.
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
