Summary
Dit protocol laat zien hoe je microscopie met superresolutie gebruiken om eiwitcolokalisatie te bestuderen in primaire neuronale culturen.
Abstract
Synapsen zijn de functionele elementen van neuronen en hun gebreken of verliezen zijn aan de basis van verschillende neurodegeneratieve en neurologische aandoeningen. Beeldvormingsstudies worden veel gebruikt om hun functie en plasticiteit in fysiologische en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Vanwege hun grootte en structuur vereisen lokalisatiestudies van eiwitten beeldvormingstechnieken met hoge resolutie. In dit protocol beschrijven we een procedure om in primaire neuronen de colokalisatie van doelproteïnen met synaptische markers op een superresolutieniveau te bestuderen met behulp van gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM). SIM is een patroon-licht verlichting techniek die de ruimtelijke resolutie van breed-veld microscopie verdubbelt, het bereiken van een detail van ongeveer 100 nm. Het protocol geeft de vereiste besturingselementen en instellingen aan voor robuuste colokalisatiestudies en een overzicht van de statistische methoden om de beeldgegevens goed te analyseren.
Introduction
Het begrip en de mening van de synaps is enorm veranderd sinds de eerste beschrijving door Foster en Sherrington in 18971. Sindsdien is onze kennis van neuronale communicatie en de moleculaire processen erachter exponentieel gegroeid2. Het is duidelijk geworden dat synapsen kunnen worden gezien als een systeem met twee compartimenten: een pre-synaptisch compartiment met vesikels voor het vrijkomen van neurotransmitters en een post-synaptisch compartiment met receptoren3. Deze simplistische visie, in de afgelopen twintig jaar, is uitgegroeid tot een complex netwerk van de eiwitten die nodig zijn om zenderbinding om te zetten in signalering4.
De winst in het begrip zijn deels te wijten aan super-resolutie technieken die de diffractie limiet van conventionele licht microscopie om de dimensie van synapsen beter aan te passen5,6,7,8,9,10. Vanwege de diffractielimiet kan een optische microscoop geen resolutie bereiken van meer dan 200 nm lateraal11,12. Om deze limiet te omzeilen, werden superresolutietechnieken gemaakt, met behulp van verschillende benaderingen en het bereiken van verschillende subdiffractielimietresoluties: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) en STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM verdubbelt de ruimtelijke resolutie van lasergebaseerde microscopiesystemen op basis van laservelden door een diffractierooster in het excitatiestraalpad15in te voegen. De beweegbare rooster diffracts de laserstralen om een bekende verlichting patroon, meestal strepen te creëren. Dit doelbewust gestructureerde lichtpatroon wordt bovenop de onbekende ruimtelijke verdeling van de fluorescerende kleurstof (van het monster) geplaatst. De interferentie franjes gevormd door de twee patronen coderen voor anders niet te onderscheiden fijne details met normale breedveld microscopie. De uiteindelijke super-resolved beeld wordt verkregen door het combineren en decoderen met wiskundige methoden verschillende ruwe beelden van hetzelfde monster verkregen door de vertalingen en rotaties van de diffractie rooster. De resolutie van de super-opgeloste beelden bereikt 100 nm in de laterale en 500 nm in de axiale richtingen voor 2D-SIM15 of 100 nm in de laterale en 250 nm in de axiale richtingen voor 3D-SIM16.
Het nieuwe begrip van de synaps is nog belangrijker in het licht van de vele neurologische aandoeningen waarbij synaptische disfunctie een belangrijke rol speelt bij het begin en progressie17,18. De ziekte van Alzheimer, Het syndroom van Down, de ziekte van Parkinson, prionziekten, epilepsie, autismespectrumstoornissen en fragiel x-syndroom zijn onder andere gekoppeld aan afwijkingen in synaptische samenstelling, morfologie en functie19,20,21,22.
Onlangs, met behulp van een set van SUMO-specifieke antilichamen, gebruikten we SIM om co-lokalisatie te tonen in primaire hippocampal neuronen van de SUMO eiwitten met de pre- en post-synaptische markers synaptophysine en PSD95 op super-resolutie niveau23. Dit stelde ons in staat om biochemische en confocale microscopie bewijs van SUMO lokalisatie in neuronen te bevestigen.
Hier beschrijven we een protocol om de lokalisatie van eiwitten in muis hippocampal primaire neuronen te bestuderen. Tegelijkertijd kan dit protocol worden aangepast aan verschillende soorten primaire neuronale culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primaire culturen
- Cultuur muis hippocampal primaire neuronen in chambered coverslips (zoals Ibidi μ-Slide 8 Well of Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) die overeenkomen met de objectieve eis voor #1,5 (0,17 mm) coverslip dikte.
- Coat chambered coverslips met 100 μL poly-L-lysine (100 μg/mL).
- De volgende dag was je de chambered coverslips twee maal met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Om muis primaire neuronen te verkrijgen, isoleren hippocampi van P1-P4 pups23.
- Plaats ontleed hippocampi in 10 mL dissectie media (Tabel 1) en laat ze storten aan de onderkant van de buis.
- Verwijder met behulp van een steriele pipet voorzichtig de Dissection Media, waardoor de hippocampi ongestoord aan de onderkant van de buis blijft.
- Voeg 10 mL Media 1(Tabel 1)toe aan de hippocampi en broed gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Verwijder media 1 voorzichtig met behulp van een steriele pipet, waardoor de hippocampi ongestoord aan de onderkant van de buis blijft.
- Voeg 10 mL Media 2(tabel 1)toe en laat de (afgetopte) centrifugebuis gedurende 45 minuten horizontaal onder de motorkap liggen.
- Laat de centrifugebuis verticaal staan zodat het weefsel zich aan de onderkant van de buis kan nestelen.
- Verwijder media 2 voorzichtig met behulp van een steriele pipet, waardoor de hippocampi ongestoord op de bodem van de centrifugebuis blijft.
- Voeg 2 mL Media 3(tabel 1) toe.
- Met behulp van een p1000 pipet met een gefilterde punt, mechanisch scheiden cellen van het weefsel.
- Breng de supernatant, waarin zich de geïsoleerde neuronen, op een 15 mL centrifuge buis.
- Centrifugeren de celsuspensie gedurende 2 min bij 300 x g bij kamertemperatuur (RT).
- Na centrifugatie bevinden zich cellen aan de onderkant van de centrifugebuis. Met behulp van een steriele pipet gooi de supernatant.
- Resuspend cellen in 1 mL van Media 4.
- Gebruik een filter van 70 μm om niet-gedissocieerde cellen te elimineren.
- Tel levensvatbare cellen in een Bürker-kamer door 1 μL van 0,4 % Trypan-blauwe oplossing toe te voegen aan 19 μL van de celsuspensie.
- Plaatcellen bij 70.000 cellen/put in een volume van 200 μL per put.
- Laat de cellen 2 uur in een bevochtigde couveuse hechten bij 37 °C en 5% CO2.
- Haal de chambered covers uit de couveuse en vervang het medium zorgvuldig door 200 μL cultuurmedia.
- Laat de chambered coverslips achter in een bevochtigde couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
- Vervang elke 5-7 dagen een derde van het medium door verse cultuurmedia.
- Wacht tot hippocampal primaire neuronen zijn volledig gerijpt (12-14 dagen na beplating) om co-lokalisatie studies uit te voeren.
2. Kleuring van immunofluorescentie
- Neem de chambered covers uit de couveuse.
- Verwijder het medium.
- Was de putten snel met 200 μL PBS.
- Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) toe in PBS (200 μL/well) aan neuronen om ze snel te repareren.
- Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij RT.
- Verwijder de PFA-oplossing.
- Permeabiliseren van de cellen door het toevoegen van PBS met 0,2% Triton X-100 (200 μL/well).
- Incubeer voor 1 min bij RT.
- Verwijder de oplossing en ontcubeer de monsters met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS (200 μL/well) voor 1 uur bij RT om passief alle vrije bindingsoppervlakken van de plaat te bedekken met een irrelevant eiwit voor de analyse. Een op BSA gebaseerde blokkeringsbuffer zonder Triton X-100 vermindert de achtergrond van antilichamen efficiënter dan dezelfde buffer met 0,2% Triton X-100.
- Verwijder de oplossing.
- Voeg het primaire antilichaam naar keuze verdund toe in een PBS-oplossing die 1% BSA en 0,2% Triton X-100 bevat (120-200 μL/well, afhankelijk van de verdunning en beschikbaarheid van antilichamen). De monsters 2 uur uitbroeden.
- Voeg als negatieve controle geen primair antilichaam toe aan een van de putten. Meerdere antilichamen van verschillende soorten tegen verschillende doelen kunnen tegelijkertijd worden gebruikt. Gebruik een antilichaam tegen MAP2 (een neuronale marker) verhoogd in kip, een antilichaam tegen PSD95 of synaptophysine verhoogd in de muis, en een antilichaam tegen een doeleiwit verhoogd in konijn. Dit maakt sim-analyses met drie kleuren mogelijk.
- Was de putten snel drie keer met PBS (200 μL/well).
- Voeg secundaire antilichamen (dyLight en Alexa secundaire antilichamen kunnen beide worden gebruikt) verdund in een PBS-oplossing met 1% BSA en 0,2% Triton X-100 (200 μL/well). Incubeer de monsters voor 1 uur bij RT.
- Was de putten snel drie keer met PBS (200 μL/well).
- Voeg Hoechst-kleurstof toe met een concentratie van 1 μg/mL verdund in PBS (200 μL/well) om kernen te bevlekken. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT.
- Was de putten snel twee keer met PBS.
- Zet cellen met behulp van een SIM-compatibele mountant. Gebruik 10 μL/put van ProLong Glass Antifade Mountant.
- Dek af en bescherm de cellen met een afdekglas (bijvoorbeeld een rond afdekglas met een diameter van 8 mm). Vierkante kunnen ook worden gebruikt.
- Bewaar de chambered coverslips bij RT en wacht minstens 48 uur voordat u afbeeldingen verwerft. Diamond Glass vereist ten minste twee dagen van het genezen voor super-resolutie overnames.
3. Antilichaam specificiteitscontrole
OPMERKING: Gebruik twee strategieën om de specificiteit van antilichamen te verzekeren. De eerste strategie is het gebruik van ten minste twee verschillende antilichamen gericht op hetzelfde substraat. De tweede strategie is antilichaamneutralisatie door incubatie met het gezuiverde eiwitdoel of de epitoop die wordt gebruikt om het antilichaam op te wekken.
- Incubeer het antilichaam naar keuze met vijf keer overmaat van het recombinant doel of epitoop voor 1 uur bij RT in 1% BSA in PBS.
- Gebruik na de incubatie het geneutraliseerde antilichaam bij de gebruikelijke concentratie voor kleuring zoals hierboven beschreven vanaf 2.11.
4. Microscoopkalibratie
OPMERKING: We gebruiken routinematig een N-SIM Super-Resolution Microscope System vervaardigd door Nikon voor de super-resolutie studies. Echter, verschillende andere bedrijven bieden ook super-resolutie microscopen in hun catalogi. Hoewel specifieke indicaties voor Nikon's N-SIM systeem worden beschreven, kunnen de instructies die volgen worden gegeneraliseerd naar andere systemen. Voor de aankoop van SIM-beelden vereist het systeem een goede kalibratie met specifieke subresolutiegrootte fluorescerende kralen. Een voorbeeld is de TetraSpeck microsferen. Deze kralen zijn gekleurd met verschillende fluorescerende kleurstoffen om de kalibratie van verschillende lasers met een monster mogelijk te maken.
- In een waterbad sonicate ongeveer 1,8 x 108 fluorescerende microsferen gedurende 10 minuten. Nikon's N-SIM systeem vereist een dunbevolkte veelkleurige kralen monster voor de kalibratie. Dit kan verschillen voor andere systemen die een dichte enkele laag van subresolutie grootte fluorescerende kralen vereisen. Pas het aantal tl-deeltjes dienovereenkomstig aan.
- Verdun de fluorescerende microsferen 1:500 in dubbel gedestilleerd water.
- Sonicate een tweede keer voor een extra 10 minuten.
- Pipet 15 μL van de verdunde kralen in een put van een chambered coverslip.
- Laat de oplossing 5 minuten drogen bij RT.
- Voeg 10 μL van de montageoplossing toe en plaats er een afdekkenlip van 8 mm op.
- Wacht minstens 48 uur om een goede genezing mogelijk te maken.
- Zet de microscoop en lasers aan.
- Laat het systeem opwarmen om het thermische evenwicht van alle microscoopcomponenten te bereiken. N-SIM Super-Resolution Microscope System vereist minstens 3 uur.
- Selecteer de doelstelling 100x.
- Start de kalibratie door de lasers uit te lijnen naar het midden van het diffractie rooster blok. In het N-SIM-systeem maken een micrometerknop en een speciale camera het mogelijk om de lichtstralen naar het doel te centreren.
- Plaats de chambered coverslip in de microscoop voor het bekijken. Stel het systeem in op de chambered coverslip dikte door de objectieve correctiekraag aan te passen. NIS software, de propriëtaire software voorzien van N-SIM Super-Resolution Microscope systemen, heeft een automatische functie om correctiekragen te regelen.
- Pas de roosterblokfocus voor elk kanaal aan om te zorgen voor gerichte gestructureerde patroonverlichting op het monster. NIS-software biedt een automatische functie voor deze taak.
- Vervolgens krijgen ruwe 3D-SIM beelden van de multicolor microsferen. Reconstrueren van de ruwe beelden om een super-resolved beeld te verkrijgen met behulp van de microscoop software of de open-source software platform voor de analyse van biologische beelden ImageJ24 en de plugin fairSIM25.
- Bereken voor elke gescheiden golflengte de Fourier-transformatie van het super-opgeloste beeld verkregen in 4,14. Als de getransformeerde afbeelding geen correct bloemachtig patroon krijgt, start u de kalibratie van 4.11 opnieuw op omdat de superresolutie niet is bereikt.
- Selecteer in de superopte afbeelding één microsfeer en bereken het intensiteitsprofiel voor elk kanaal om de bereikte resolutie te meten. Het moet nu dicht bij 100 nm lateraal.
- Voer vervolgens kanaalregistratie uit door een multichannel-acquisitie van de microsferen te overlayen. Het doel is om alle kanaalsignalen lateraal en axiaal te verzamelen. Dit elimineert chromatische aberraties als gevolg van de verkeerde uitlijning van de verschillende kanalen en helpen de co-lokalisatie analyse.
- Bevestig de kwaliteit van de kalibratie met behulp van de functies "Illumination Phase Steps" en "Illumination Pattern Focus" van SIMcheck26, een suite van plugins voor de open-source applicatie ImageJ. Maak hiervoor een chambered coverslip om een dichte enkele laag TetraSpeck-microsferen te verkrijgen en een 3D-SIM-beeld van het monster te verkrijgen. Analyseer de afbeelding in ImageJ en start, als er afwijkingen worden gedetecteerd, de kalibratie van de microscoop vanaf stap 4.11 opnieuw op.
5. Acquisitie
- Begin met het analyseren van het monster met behulp van een 40x doelstelling in confocale of widefield-modus. Dit maakt navigatie naar het monster, met behoud van goede details en een groot gezichtsveld.
- Gebruik MAP2-signaal om een gebied te identificeren dat neuronale processen weergeeft.
- Verwerf afbeeldingen van het monster in confocale modus om de kwaliteit van de kleuring te bepalen. Slechte confocale kwaliteit zal weerspiegelen in slechte SIM-kwaliteit, dus waarbij de monsters worden weggegooid.
- Als het gebied en de kwaliteit van de beelden bevredigend zijn, schakelt u de doelstelling over op 100x.
- Breng olie aan op de 100x doelstelling.
- Verwerf een breedveld of confocale afbeelding die later zal worden gebruikt om de kwaliteit van de super-opgeloste afbeelding te beoordelen(figuur 1A,B).
- Schakel over naar de 3D-simmodus.
- Selecteer met dialoogvenstervensters om parameters voor acquisitie in te stellen de hoogste instelling voor bitdiepte die beschikbaar is om kleurinformatie te maximaliseren. Typisch, 16-bits is de standaard keuze. Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, selecteert u bovendien een lage frequentiewaarde voor acquisitie, zoals 1 MHz.
- Met behulp van histogram vensters, stel lasers macht om een lineaire reactie van het signaal te verkrijgen. Om verlies van informatie te voorkomen, beperkt u verzadigde pixels in de afbeeldingen. Het N-SIM systeem maakt gebruik van een Andor iXon3 camera. Wanneer u op 16-bits werkt, kiest u een doelintensiteit van 16.000 om de lineaire respons van de camera te garanderen. U ook kiezen voor een bereik tussen 30.000-45.000 om het dynamisch bereik van de acquisitie te maximaliseren.
- Stel laservermogen in tussen 0,1% en 50% bij het beeldvorming van de monsters en blootstellingstijden tussen 50 ms en 2 s. Laserkrachten boven de 50% kunnen leiden tot snelle fotobleaching van de fluoroforen in gebruik.
- Begin met het verwerven van de afbeeldingen in de 3D-SIM-modus.
- Gebruik SIMcheck, een suite van gratis plug-ins voor ImageJ, om de kwaliteit van de verwerving van de ruwe afbeeldingen te beoordelen.
- Als SIMCheck geen artefacten of kwaliteitsproblemen detecteert, verwerft u minimaal 10 afbeeldingen van 4 technische replica's om statistische analyse mogelijk te maken.
6. Na de productie: beeldreconstructie
OPMERKING: 3D-SIM verworven afbeeldingen zijn ruwe afbeeldingen die moeten worden verwerkt om gereconstrueerde super-resolved beelden te verkrijgen. Onjuiste reconstructie van ruwe afbeeldingen kan leiden tot artefacten die de analyse van de monsters zouden beïnvloeden. Daarom moet er veel aandacht worden besteed aan het goed kiezen van reconstructieparameters.
- Verwerk de ruwe beelden met behulp van de microscoop reconstructie analyse software om een super-resolved beeld te verkrijgen (Figuur 1C). U ook de vrij beschikbare ImageJ plugin fairSIM gebruiken om ruwe beelden te reconstrueren.
- Bereken de Fourier-transformatie van de super-opgeloste beelden met behulp van de microscoop reconstructie software of ImageJ plugin SIMCheck. Een goed gereconstrueerd beeld moet voor elk kanaal een bloemachtig beeld terugbrengen. Als de gereconstrueerde afbeeldingen een bloemachtige vorm niet opnieuw maken, start u de ruwe afbeeldingen opnieuw op en reconstrueert u deze door de reconstructieparameters zoals Wienerfiltering, apodisatie en zero-orderonderdrukking27te wijzigen. In NIS-software, met behulp van de preview om te controleren hoe het wijzigen van de parameters van invloed op de uiteindelijke opgeloste afbeelding, wijzigen van de parameters i) Verlichting Modulatie Contrast, ii) Hoge resolutie ruisonderdrukking en iii) Out of Focus Suppression.
- Analyseer vervolgens de gereconstrueerde afbeelding om artefacten onbevooroordeeld te detecteren met Behulp van NanoJ-SQUIRREL28, een Op ImageJ gebaseerde plug-in om de kwaliteit van superbe loste beelden te beoordelen.
- Als NanoJ-SQUIRREL artefacten detecteert, start u opnieuw op van de ruwe afbeeldingen en reconstrueren deze door de reconstructieparameters zoals Wiener-filtering, apodisatie en zero-order onderdrukking te wijzigen. In NIS-software, met behulp van de preview om te controleren hoe het wijzigen van de parameters van invloed op de uiteindelijke opgeloste afbeelding, wijzigen van de parameters Verlichting Modulatie Contrast, Hoge resolutie ruisonderdrukking en Out of Focus Suppression.
- Gebruik de super-opgeloste afbeeldingen om het colokalisatieprofiel en/of pearson's en Mander's coëfficiënten te berekenen.
7. Co-lokalisatie met profielanalyse
OPMERKING: Als een eerste stap om co-lokalisatie te bestuderen tussen synaptische markers en een eiwit van belang, neem een super-opgelost beeld en analyseer een enkele locus om signaal overlap te bepalen.
- Identificeer een enkele locus op de super-opgeloste afbeelding.
- Verkrijg de intensiteitsprofielen van de fluorescerende signalen van de locus van belang.
- Exporteer de gegevens.
- Gebruik GraphPad Prism, of een vergelijkbare analysesoftware, om alle signaalpieken te normaliseren en vergelijkbare signaalintensiteiten voor elk kanaal te verkrijgen met als uiteindelijk doel het bepalen van locusspecifieke colokalisatie.
8. Kwantificering van de coëfficiënten van Pearson en Mander
OPMERKING: Als profielanalyse heeft gesuggereerd enkele locus co-lokalisatie, een meer algemene analyse van het hele beeld kan worden uitgevoerd door het berekenen van Pearson's en Mander coëfficiënten29,30.
- Gebruik JACoP31, een ImageJ plug-in, om de twee parameters van co-lokalisatie te bepalen: Pearson's en Mander's.
9. Statistische analyse
- Gebruik GraphPad Prism, of een vergelijkbare analyse- en grafieksoftware, om gegevens te verwerken die zijn verzameld met JACoP.
- Gebruik ten minste 40 SIM-afbeeldingen voor elke geanalyseerde aandoening om grafieken te verkrijgen en voor statistische relevantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We presenteren hier de standaard workflow om neuronale eiwitten co-lokalisatie te bestuderen. We kalibreerden eerst de microscoop en vervolgens voerden we SIM-analyse van de monsters uit. Om het systeem te kalibreren, gebruikten we fluorescerende microsferen met een diameter van 0,1 μm. Bij het verkrijgen van super-opgeloste 3D-SIM beelden van de kralen, de onderliggende beeldgegevens zijn Fourier-getransformeerd om ze opnieuw om te zetten in een ruimtelijke frequentie representatie. In figuur 2Awordt het duidelijke bloempatroon gepresenteerd als een indicatie van details met een superresolutie. Vervolgens hebben we de bereikte resolutie gemeten door de volledige breedte op halve maximum (FWHM) van de piek van het intensiteitsprofiel van een enkele kraal te berekenen(figuur 2B,C). Ten slotte hebben we chromatische aberratie gecorrigeerd door kanaalregistratie, opnieuw met behulp van fluorescerende microsferen (figuur 3A,B). Vervolgens zijn we begonnen met het analyseren van het monster met een 100x doelstelling en we verworven 3D-SIM beelden. We gebruikten SIMCheck om de gelijkmatigheid van veldverlichting of beweging te beoordelen tijdens de overname(figuur 4A). We controleerden verschillen in intensiteit tussen de hoeken van het verlichtingspatroon(figuur 4B)en we berekenden de verhouding van het modulatiecontrast met ruis om het lokale streepcontrast te meten(figuur 4C). Ten slotte schatten we de effectieve oplossing van de reconstructie (figuur 4D).
Vervolgens bevestigden we de kwaliteit van de super-opgeloste beelden met behulp van NanoJ-SQUIRREL. In de eerste gereconstrueerde afbeelding (figuur 5A) ontdekte NanoJ-SQUIRREL de aanwezigheid van artefacten (figuur 5C). We veranderden de reconstructie parameters om een nieuwe super-resolved afbeelding te verkrijgen (Figuur 5B) en NanoJ-SQUIRREL bevestigde het gebrek aan artefacten (Figuur 5D). Nadat we het systeem hadden gekalibreerd en de kwaliteit van de gereconstrueerde beelden hadden beoordeeld, zijn we vervolgens begonnen met het analyseren van de primaire neuronale culturen bevlekt met een antilichaam tegen MAP2, een neuronale marker, PSD95, een post-synaptische marker en het doeleiwit SUMO1. We analyseerden eerst het monster dat vierkanaals confocale microscopie uitvoerde met een doelstelling van 40x (figuur 6A). Bij het selecteren van een gebied dat neuronale processen vertegenwoordigt, zijn we overgestapt op een 100x-doelstelling. We verwierven zowel confocale als SIM-beelden van hetzelfde gebied om de kwaliteit van de wederopbouw te beoordelen met NanoJ-SQUIRREL en colokalisatie-analyse uit te voeren. In figuur 6Btonen we het super-opgeloste 3D-SIM beeld van neuronen gekleurd voor SENP1 en drebrin. Co-lokalisatie in super-opgeloste beelden kan worden geanalyseerd met profielanalyse(figuur 7A) en kwantificering van de coëfficiënten van Pearson en Mander (figuur 7B).
Figuur 1: Vergelijking van widefield, confocale en SIM-acquisities. (A) Widefield beeld van primaire hippocampal neuronen immunostained voor SENP1 (groen), drebrin (rood) en MAP2 (mauve). DAPI werd gebruikt om kernen te bevlekken. Schaalbalk 5 μm. (B) Confocale afbeelding van hetzelfde voorbeeld van paneel A. cC) simafbeelding van hetzelfde voorbeeld van paneel A en B. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Analyse van een 3D-SIM beeld van microsferen voor microkalibratie. (A) Fast Fourier transformeren van een overname van microsferen met zijn bloem-achtige vorm. (B) Selectie van één microsfeer om de zijdelingse ruimtelijke resolutie te bepalen. (C) Intensiteitsprofiel van de enkele microsfeer in B met de meting van de FWHM. De waarden vertegenwoordigen de resolutie die door het instrument wordt bereikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Drie kanaalregistratie. (A) Overname van multicolor (golflengten 488nm, 555nm en 647nm) TetraSpeck microsferen voor registratie. (B) Verwerving van hetzelfde monster na kalibratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Kwaliteitsbeoordeling van ruwe en gereconstrueerde beelden met behulp van SIMcheck. (A) Beweging en Verlichting Variatie analyse met behulp van SIMCheck. Signaal grijs naar wit staat voor homogene verlichting en afwezigheid van beweging tijdens de overname. (B) Channel Intensity Profile verkregen door het analyseren van de ruwe afbeelding. In dit voorbeeld is er intensiteitsvariatie minimaal, om gebrek of het bleken of schommelingen voor te stellen. (C) Raw Modulatie Contrast om de verhouding van de modulatie contrast-ruis in de afbeelding te berekenen. De heatmap toont modulatie contrastvariaties. (D) Gereconstrueerd Fourier Plot om de amplitude Fourier spectrum te analyseren om de effectieve oplossing van de reconstructie te bepalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Beoordeling van de beeldkwaliteit met superresolutie met behulp van NanoJ-SQUIRREL. (A) Referentie super-resolutie beeld met artefacten. (B) Referentie super-resolutie beeld van goede kwaliteit. (C) Afbeelding die NanoJ-SQUIRREL foutkaart van Avertegenwoordigt . Lichtere gebieden vertegenwoordigen grootschalige artefacten, terwijl donkere objecten een correcte reconstructie vertegenwoordigen. (D) NanoJ-SQUIRREL foutkaart van B. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: SIM-beeldvoorbeeld. (A) Confocale microscopie van primaire neuronen. Er is gekozen voor een 40X-doelstelling om een overzicht van het monster te verkrijgen met behoud van een goede resolutie. Cellen werden immunostained voor SUMO1 (groen), PSD95 (rood) en MAP2 (mauve). DAPI werd gebruikt om kernen te bevlekken. Schaalbalk 50 μm. Beelden werden weergegeven als Z projectie. (B) SIM-beelden voor SUMO1 en PSD95 op het gebied gemarkeerd in de groene doos in paneel A met behulp van een 100X doelstelling. Rode pijlpunten geven de positie aan van de inzet in A die wordt gebruikt om het intensiteitsprofiel te berekenen. Schaalbalk 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Colokalisatieanalyse. (A) Super-resolved beeld van primaire neuronen bevlekt met een antilichaam tegen SENP1 (in het groen) en drebrin (in het rood), schaal bar 0,5 μm, en de intensiteit profiel. De waarden van de grafiek werden genormaliseerd voor elk kanaal tot 100 (willekeurige eenheid) en komen overeen met de pixelintensiteit die door de blauwe pijl wordt weergegeven. (B) Analyse met behulp van JACoP om pearson's correlatiecoëfficiënt en mandercoëfficiënt tussen SENP1 en drebrin te berekenen. Vensters van de insteekset en visuele drempel worden weergegeven. Mander's coëfficiënt wordt uitgedrukt door twee waarden - SENP1 fractie die co-localizes met drebrin (M1) en de drebrin fractie die co-localizes met SENP1 (M2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ophelderen van de structuur en samenstelling van de synaps is cruciaal voor het begrijpen van de fysiologische en pathologische processen die geheugen en cognitie reguleren. Terwijl in de normale staat, synapsen zijn de bouwstenen van het geheugen, ze ook ten grondslag liggen aan complexe neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer32. Het hier beschreven protocol dient om de colokalisatie van neuronale eiwitten te bestuderen met een microscopietechniek met superresolutie genaamd SIM. Met behulp van een bepaald patroon van verlichting kan SIM een resolutie van ongeveer 0,1 μm bereiken, wat geschikt is voor de studie van synapsen, die normaal gesproken tussen 0,03 en 0,15 μm meten. Voor nog meer details kunnen andere superresolutietechnieken zoals STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) of STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), die een resolutie van 10-20 nm kunnen bereiken, worden toegepast33.
Hier beschrijven we de analyse van colokalisatie van doeleiwitten met synaptische markers in primaire neuronen. Het protocol kan worden toegepast op elke primaire cultuur van neuronale cellen, zoals hippocampal, cerebellar of corticale neuronen en zelfs op culturen van primaire neuronen die niet behoren tot het centrale zenuwstelsel, zoals enterische zenuwstelsel neuronen. De sleutel tot de analyse op het niveau van superresolutie is echter de reagentia die worden gebruikt bij de verwerving, zoals chambered coverslips en montageoplossingen die compatibel zijn met de diffractie-index van de doelstelling. We gebruikten chambered coverslips voor hun gebruiksgemak, maar de klassieke, goedkopere methode om primaire neuronen te kweken op gecoate coverglass is niettemin geldig, vooral met een hoge precisie #1.5H (0.17 mm) coverglass. Daarnaast moet een oplopende media worden gebruikt die een brekingsindex zo dicht mogelijk bij de brekingsindex van glas (1,52) en een onderdompelingsolie voor de 100x-doelstelling met een brekingsindex van 1.515 kan bereiken. Constante kamertemperatuur en gestabiliseerde tafels zijn ook verplicht om de nauwkeurigheid van de acquisities te garanderen.
We gebruiken zowel dyLight als Alexa secundaire antilichamen in de SIM-studies. Door hun smalle pieken van opwinding en emissie en een goede kwantumopbrengst, zijn ze geïndiceerd voor superresolutietechnieken die de beste signaal-ruisverhouding vereisen. Dempsey et al. vergeleken Alexa, dyLight en andere fluoroforen voor super-resolutie imaging34.
Tijdens de aanschaf stellen we de camera routinematig in op 1 MHz boven 10 MHz. 1 MHz, dankzij een lagere acquisitiesnelheid, geeft de beelden meer nauwkeurigheid en minder ruis dan 10 MHz. 1 MHz uitleesmodus kan ook opnemen met een bitdiepte van 16 bit (in vergelijking met de maximale 14 bit van 10 MHz), waardoor meer kleurinformatie en een preciezere kleur van de beelden. Echter, 10 MHz, met zijn snelheid, is handig voor live beelden. Om te voorkomen dat bleken en fluorofoof te behouden, stellen we ook laservermogen zo laag mogelijk. Om de signaalintensiteit te verbeteren, kunnen de winstwaarden worden verhoogd. Het is vermeldenswaard dat lagere winst schonere beelden garandeert zonder ruis te verbeteren. In het algemeen worden de beste resultaten verkregen terwijl de beeldvorming binnen 7 μm van de onderkant van de chambered coverslip. Dit is vooral belangrijk bij het gebruik van een 100x doelstelling met olie onderdompeling. Als diepere acquisitie over de cellen / weefsels nodig is, kan een betere keuze het gebruik van een 60x doelstelling met wateronderdompeling zijn.
Een van de belangrijkste uitdagingen bij het uitvoeren van SIM-studies is beeldreconstructie35. Het verkrijgen van super-opgeloste beelden zonder artefacten en aberratie vereist niet alleen het gebruik van ad-hoc experimentele omstandigheden, maar ook zorgvuldige kalibratie van het systeem en parameter optimalisatie om de uiteindelijke beelden te verkrijgen. In het protocol beschrijven we hoe we enkele van de meest voorkomende fouten kunnen voorkomen door de kalibratie van het systeem en de kwaliteitsanalyse van ruwe en gereconstrueerde beelden te beoordelen. Concreet beschrijven we het gebruik van de ImageJ plugins SIMCheck en NanoJ-SQUIRREL om de juiste instrumentinstellingen te garanderen om veelvoorkomende artefacten van superopte beelden te voorkomen. De toepassingen maken een onbevooroordeelde kwaliteitsbeoordeling mogelijk van de uiteindelijke beelden die niet gebaseerd zijn op subjectieve benchmarking van de resultaten aan de hand van voorkennis van de studiestructuren.
We raden aan synaptophysine en PSD95 of drebrin te gebruiken als pre- en post-synaptische markers, hoewel andere markers ook geldig zijn. Een enorme hoeveelheid literatuur beschrijft eiwitten zoals fagot als synaptische markers36,37. Het is vermeldenswaard dat pre- en postsynaptische markers zijn echter aanwezig in de hele cel, met uitzondering van de kern. Veel van hun signaal is niet-synaptisch, maar vertegenwoordigt eiwitten in transport of afbraak, achtergrond of andere artefacten. Het is daarom belangrijk om zorgvuldig te kiezen op het gebied van de analyse. We gebruiken MAP2 antilichaam signaal om axon en dendritische terminals te kiezen.
Bij de analyse van colokalisatie gebruiken we twee benaderingen. De eerste is een visuele benadering, gebaseerd op profielanalyse die afzonderlijke gebeurtenissen van colokalisatie toont en de bijdrage van elk kanaal identificeert. Een voorbehoud van deze aanpak is echter de slechte statistische macht. Om deze reden hebben we ook besloten om een tweede methode te gebruiken op basis van analyse van een groter aantal gebeurtenissen die representatief zijn voor het hele veld van elke afbeelding. Deze methode is gebaseerd op de berekening van de correlatiecoëfficiënt van pearson en de M1- en M2-coëfficiënten van Mander. We gebruiken de correlatiecoëfficiënt van pearson om de overlap van signalen in het beeld en Mander's M1 en M2 te beschrijven om wederzijdse colokalisatie tussen signalen van belang38te beschrijven. Voor de berekening maken we gebruik van de ImageJ plugin JACoP, omdat het een functie heeft waarmee u een handmatige drempel instellen om elke achtergrondbijdrage aan de analyse te verwijderen, vooral cruciaal voor de analyse van Mander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Edoardo Micotti bedanken voor de opbouwende kritiek op het manuscript. Deze studie werd ondersteund door BrightFocus A2019296F, door Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), door Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) en door het Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | - | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
- Choquet, D., Triller, A.
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T.
- Won, R.
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P.
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H.
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
