Summary
Этот протокол показывает, как использовать микроскопию супер-разрешения для изучения совместной локализации белка в первичных нейронных культурах.
Abstract
Синапсы являются функциональными элементами нейронов и их дефекты или потери находятся в основе нескольких нейродегенеративных и неврологических расстройств. Исследования изображений широко используются для исследования их функции и пластичности в физиологических и патологических условиях. Из-за их размера и структуры, локализация исследований белков требуют высокого разрешения методов визуализации. В этом протоколе мы описываем процедуру изучения в первичных нейронах совместной локализации целевых белков с синаптических маркерами на уровне супер-разрешения с использованием структурированной микроскопии освещения (SIM). SIM-карта – это метод освещения с узорным светом, который удваивает пространственное разрешение широкой микроскопии, достигая детализации около 100 нм. Протокол указывает необходимые элементы управления и настройки для надежных исследований совместной локализации и обзор статистических методов для правильного анализа данных изображений.
Introduction
Понимание и взгляд на синапсе сильно изменилось с момента его первого описания Фостер и Шеррингтон в 1897году 1. С тех пор наши знания нейрональной коммуникации и молекулярных процессов, стоящих за ней, выросли в геометрическойпрогрессии на 2. Стало ясно, что синапсы можно рассматривать как двухкомпанейную систему: до синаптический отсек, содержащий пузырьки для высвобождения нейротрансмиттеров и пост-синаптический отсек с рецепторами3. Этот упрощенный взгляд, в последние двадцать лет, превратилась в сложную сеть белков, необходимых для трансдуцирования передатчик связывания в сигнализации4.
Достижения в понимании частично из-за супер-разрешениеметодов,которые преодолели дифракционный предел обычной световой микроскопии в соответствии сизмерением синапсов лучше 5,6,,7,8,9,10. Из-за предела дифракции, оптический микроскоп не может достичь разрешения выше 200нм с другой стороны 11,12. Чтобы обойти этот предел, были созданы методы супер-разрешения, используя различные подходы и достигая различных разрешений предела субдифракции: SIM, STED (Стимулированная микроскопия истощения выбросов), PALM (ФотоАктивированная микроскопия локализации) и STORM (Стохастическая оптическая реконструкция микроскопии)13,14. SIM удваивает пространственное разрешение лазерной широкой полевой микроскопии систем, вставив дифракционную решетку в траекторию возбужденияпучка 15. Подвижная решетка дифрактов лазерных лучей для создания известного шаблона освещения, как правило, полосы. Этот намеренно структурированный световой узор накладывается на неизвестное пространственное распределение флуоресцентного красителя (образца). Интерференционные бахромы, образованные двумя шаблонами, кодируются для неразличимых мелких деталей с обычной широкой микроскопией. Окончательное сверхразрешеное изображение получено путем объединения и расшифровки математическими методами нескольких необработанных изображений одного и того же образца, полученных переводами и вращениями дифракционной решетки. Разрешение сверхпроверенные изображения достигает 100 нм в боковом и 500 нм в осяных направлениях для 2D-SIM15 или 100 нм в боковом и 250 нм в осяных направлениях для 3D-SIM16.
Новое понимание синапса является еще более важным в свете многих неврологических расстройств, где синаптическая дисфункция играет важную роль в наступлении ипрогрессии 17,18. Болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, болезнь Паркинсона, прионные заболевания, эпилепсия, расстройства аутистического спектра и хрупкий синдром Х среди других были связаны с аномалиями в синаптической композиции,морфологии и функции 19,20,21,22.
Недавно, используя набор SUMO-специфических антител, мы использовали SIM, чтобы показать ко-локализацию в первичных гиппокампа нейронов белков SUMO с до- и пост-синаптических маркеров синаптофизин и PSD95 на уровнесупер-разрешения 23. Это позволило нам подтвердить биохимические и конфокальные микроскопии доказательства локализации СУМО в нейронах.
Здесь мы описываем протокол для изучения локализации белков в гиппокампе мыши первичных нейронов. В то же время, этот протокол может быть адаптирован к различным типам первичных нейронных культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Начальные культуры
- Культура мыши гиппокампа первичных нейронов в камерных coverslips (таких, как Ibidi μ-Slide 8 Ну или Nunc Lab-Tek камерный Coverglass), которые соответствуют объективным требованиям для #1,5 (0,17 мм) крышка толщиной.
- Пальто камерные крышки со 100 йл поли-L-лизина (100 мкг/мл).
- На следующий день мыть камерные крышки дважды стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS).
- Для получения мыши первичных нейронов, изолировать гиппокампа от P1-P4 щенков23.
- Поместите расчлененный гиппокамп в 10 мл dissection Media(таблица 1) и дайте им отпустить в нижней части трубки.
- Используя стерильную пипетку, тщательно удалите средства вскрытия, оставляя гиппокамп спокойно на дне трубки.
- Добавьте 10 мл Media 1(таблица 1) в гиппокамп и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию.
- Используя стерильную пипетку, аккуратно удалите Media 1, оставив гиппокамп спокойно на дне трубки.
- Добавьте 10 мл Media 2(таблица 1) и оставьте (ограниченную) центрифугу трубку под капотом горизонтально в течение 45 минут.
- Пусть центрифуга трубки стоять вертикально, чтобы позволить ткани поселиться в нижней части трубки.
- Используя стерильную пипетку, аккуратно удалите Media 2, оставив гиппокамп нетронутым на дне центрифуги трубки.
- Добавить 2 мл media 3 ( Таблица1).
- Используя р1000 пипетку с отфильтрованным кончиком, механически отмежевать клетки от ткани.
- Перенесите супернатант, в котором расположены изолированные нейроны, в центрифугу 15 мл.
- Центрифуга клеточной подвески в течение 2 мин при температуре 300 х при комнатной температуре (RT).
- После центрифугации клетки расположены на дне центрифуги. С помощью стерильной пипетки отбросьте супернатант.
- Повторное приостановление ячеек в 1 мл Media 4.
- Используйте 70 мкм фильтр для устранения недисциированных клеток.
- Подсчитайте жизнеспособные клетки в камере Бюркера, добавив 1 МКЛ из 0,4% трипанового синего раствора до 19 МКЛ клеточной подвески.
- Клетки плиты на 70.000 клетках/хорошо в томе 200 l в наилучшим образом.
- Разрешить клеткам прикрепляться в течение 2 ч во влажном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
- Вынул камерные крышки из инкубатора и тщательно замените носитель на 200 МКЛ Культурных Медиа.
- Оставьте камерные крышки в увлажненные инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
- Заменить одну треть среды свежими средствами массовой информации культуры каждые 5-7 дней.
- Подождите, пока гиппокамп первичных нейронов полностью созрели (12-14 дней после покрытия), чтобы выполнить совместное обучение локализации.
2. Иммунофлуоресценция окрашивания
- Возьмите камерные крышки из инкубатора.
- Удалите носитель.
- Быстро промыть скважины с 200 йл PBS.
- Добавьте 4% параформальдегид (PFA) в PBS (200 йл/хорошо) к нейронам, чтобы исправить их быстро.
- Инкубировать клетки в течение 15 минут на RT.
- Удалите решение PFA.
- Permeabilize клетки, добавив PBS с 0,2% Тритон X-100 (200 йл / хорошо).
- Инкубация в течение 1 мин на RT.
- Удалите раствор и инкубировать образцы с 1% бычьей сыворотки альбумин (BSA) в PBS (200 йл / хорошо) в течение 1 ч на RT пассивно покрыть все свободные связывающие поверхности пластины с неуместным белка для анализа. Блокирующий буфер на основе BSA без Triton X-100 снижает фон антител более эффективно, чем тот же буфер с 0,2% Triton X-100.
- Удалите решение.
- Добавьте первичное антитело выбора, разбавленное в растворе PBS, содержащем 1% BSA и 0,2% Triton X-100 (120-200 йл/колодец, в зависимости от разбавления антител и доступности). Инкубировать образцы в течение 2 ч.
- В качестве отрицательного контроля, не добавляйте никаких первичных антител к одной из скважин. Одновременно может использоваться несколько антител различных видов против различных целей. Используйте антитела против MAP2 (нейронный маркер), поднятый в курицу, антитела против либо PSD95 или синаптофизин, поднятый в мыши, и антитела против целевого белка, поднятого в кролика. Это позволяет анализировать трехцветную SIM-карту.
- Быстро промыть скважины три раза с PBS (200 йл / хорошо).
- Добавьте вторичные антитела (диЛайт и Alexa вторичные антитела могут быть использованы) разбавленные в растворе PBS, содержащем 1% BSA и 0,2% Triton X-100 (200 йл/колодец). Инкубировать образцы в течение 1 ч на RT.
- Быстро промыть скважины три раза с PBS (200 йл / хорошо).
- Добавьте краситель Hoechst в концентрации 1 мкг/мл, разбавленный в PBS (200 МКЛ/хорошо), чтобы окрасить ядра. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT.
- Быстро мыть колодцы дважды с PBS.
- Намонтировать ячейки с помощью SIM-совместимого крепления. Используйте 10 йл/колодец ProLong Glass Antifade Mountant.
- Накройте и защитите клетки стеклом (например, круглым стеклом диаметром 8 мм). Квадратные также могут быть использованы.
- Храните камерные крышки на RT и ждать по крайней мере 48 ч, прежде чем приобретать изображения. Diamond Glass требует по крайней мере два дня лечения до приобретения супер-разрешения.
3. Контроль специфичности антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте две стратегии, чтобы обеспечить специфичность антител. Первая стратегия заключается в использовании по крайней мере двух различных антител, нацеленных на один и тот же субстрат. Второй стратегией является нейтрализация антител путем инкубации с целью очищенного белка или эпитопа, используемого для повышения антител.
- Инкубировать антитела выбора с пяти раз превышает рекомбинантной цели или эпитоп для 1 ч на RT в 1% BSA в PBS.
- После инкубации используйте нейтрализованные антитела при обычной концентрации для окрашивания, как описано выше, с 2.11.
4. Калибровка микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы регулярно используем N-SIM Super-Resolution Микроскоп системы производства Nikon для супер-разрешения исследований. Тем не менее, некоторые другие компании также предлагают супер-разрешение микроскопов в своих каталогах. Хотя конкретные указания для системы N-SIM nikon описаны, инструкции, которые следуют, могут быть обобщены другим системам. Перед приобретением SIM-изображений система требует надлежащей калибровки с определенными флуоресцентными бусинками подпоколения. Примером могут быть микросферы TetraSpeck. Эти бусы окрашены различными флуоресцентными красителями, чтобы позволить калибровку различных лазеров с одним образцом.
- В водяной бане sonicate около 1,8 х 108 флуоресцентных микросфер в течение 10 минут. Система N-SIM компании Nikon требует малонаселенного образца разноцветных бусин для калибровки. Это может отличаться для других систем, которые требуют плотного одного слоя суб-разрешение размера флуоресцентных бусин. Соответствующим образом отрегулируйте количество флуоресцентных частиц.
- Разбавить флуоресцентные микросферы 1:500 в двойной дистиллированной воде.
- Sonicate второй раз в течение дополнительных 10 минут.
- Пипетки 15 йл разбавленных бусин в колодец камерной крышки.
- Дайте раствору высохнуть в течение 5 минут на RT.
- Добавьте 10 мкл монтажного раствора и поместите сверху 8-мм крышку.
- Подождите, по крайней мере 48 часов, чтобы надлежащее лечение.
- Включите микроскоп и лазеры.
- Пусть система прогреется, чтобы достичь теплового равновесия всех компонентов микроскопа. Микроскопная система N-SIM Super-Resolution требует не менее 3 часов.
- Выберите цель 100x.
- Начните калибровку путем выравнивания лазеров к центру блока решетки дифракции. В системе N-SIM микрометровая ручка и специальная камера позволяют центрирование световых лучей к цели.
- Вставьте камерный крышки в микроскоп для просмотра. Установите систему на толщину камерного покрытия, регулируя воротник объективной коррекции. Программное обеспечение NIS, несвободное программное обеспечение, предоставляемое системами N-SIM Super-Resolution Microscope, имеет автоматическую функцию регулирования коррекционных воротников.
- Отрегулируйте фокус блока решетки для каждого канала для того чтобы обеспечить сфокусированное структурированное освещение картины на образце. Программное обеспечение NIS обеспечивает автоматическую функцию для этой задачи.
- Далее приобрету необработанные 3D-SIM изображения многоцветных микросфер. Реконструкция необработанных изображений для получения супер-решенного изображения с помощью программного обеспечения микроскопа или программной платформы с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений ImageJ24 и плагина fairSIM25.
- Рассчитайте, для каждой отделенной длины волны, Преобразование Фурье супер-решенного изображения, полученного в 4.14. Если преобразованное изображение не может получить правильный цветок, как шаблон, перезапустить калибровку от 4.11, так как супер-разрешение не было достигнуто.
- На супер-решенном изображении выберите единую микросферу и вычислите ее профиль интенсивности для каждого канала для измерения достигнутого разрешения. Теперь она должна быть близка к 100 нм с боковой стороны.
- Далее выполните регистрацию канала, наложить многоканальный приобретение микросфер. Цель состоит в том, чтобы коллиматировать все сигналы канала с боковой и аксиально. Это позволит устранить хроматические аберрации из-за несогласованности различных каналов и поможет анализу совместной локализации.
- Подтвердите качество калибровки с помощью функций "Шаги фазы освещения" и "Фокус освещения шаблона" SIMcheck26, набор плагинов для приложения с открытым исходным кодом ImageJ. С этой целью подготовьте камерную крышку, чтобы получить плотный один слой микросфер TetraSpeck и получить 3D-SIM изображение образца. Проанализируйте изображение в ImageJ и, если обнаружены аберрации, перезапустите калибровку микроскопа с шага 4.11.
5. Приобретение
- Начните анализировать образец с помощью 40-х целей в конфокальном или широкоугольном режиме. Это позволяет навигации по образцу, сохраняя хорошие детали и большое поле зрения.
- Используйте сигнал антител MAP2 для определения области, представляющей нейронные процессы.
- Приобретайте изображения образца в конфокальцном режиме, чтобы определить качество окрашивания. Низкое конфокальные качества будут отражаться в плохом качестве SIM-карты, поэтому требуется отказаться от образцов.
- Если область и качество изображения являются удовлетворительными, переключитесь на цель в 100 раз.
- Нанесите масло на цель 100x.
- Приобрети широкое поле или конфокальные изображения, которые будут использоваться позже для оценки качества супер-разрешенного изображения(рисунок 1A,B).
- Переключитесь в режим 3D-SIM.
- Используя диалоговые окна для настройки параметров для приобретения, выберите самый высокий бит-глубокий параметр, доступный для максимизации информации о цвете. Как правило, 16-битный является стандартным выбором. Кроме того, чтобы улучшить соотношение сигнала к шуму, выберите низкочастотное значение для приобретения, например 1 МГц.
- Используя гистограммы окна, установить лазеры власти для получения линейной реакции сигнала. Чтобы избежать потери информации, ограничьте насыщенные пиксели на изображениях. Система N-SIM использует камеру Andor iXon3. При работе на 16-битной, выбрать целевую интенсивность 16000 для обеспечения линейной реакции камеры. Кроме того, выберите диапазон от 30 000 до 45 000, чтобы максимизировать динамический диапазон приобретения.
- Установите мощность лазера от 0,1% до 50% при визуализации образцов и времени экспозиции от 50 мс до 2 с. Лазерные силы выше 50% могут вызвать быстрое фотоотлив флюорофоров в использовании.
- Начните приобретать изображения в режиме 3D-SIM.
- Используйте SIMcheck, набор бесплатных плагинов для ImageJ, чтобы оценить качество приобретения необработанных изображений.
- Если SIMCheck не обнаруживает никаких артефактов или проблем с качеством, приобрети как минимум 10 изображений из 4 технических репликаций, чтобы позволить статистический анализ.
6. Пост-продукция: реконструкция изображения
ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-SIM приобретенные изображения являются необработанными изображениями, которые должны быть обработаны для получения реконструированных изображений с супер-разрешением. Неправильная реконструкция необработанных изображений может привести к артефактам, которые повлияют на анализ образцов. Поэтому большое внимание следует уделить правильному выбору параметров реконструкции.
- Обработка необработанных изображений с помощью программного обеспечения для анализа реконструкции микроскопа для получения сверхобучтеемогоизображения (рисунок 1C). Кроме того, используйте свободно доступный плагин ImageJ fairSIM для восстановления необработанных изображений.
- Рассчитайте преобразование Fourier супер-решенных изображений с помощью программного обеспечения для реконструкции микроскопа или плагина ImageJ SIMCheck. Хорошее реконструированное изображение должно вернуть для каждого канала изображение, похожее на цветок. Если реконструированные изображения не воссоздают форму, похожую на цветок, перезапустите необработанные изображения и реконструируете их, изменив параметры реконструкции, такие как фильтрация Винера, аподизация и подавлениенулевого порядка 27. В программном обеспечении NIS, используя предварительный просмотр для мониторинга того, как изменение параметров влияет на окончательное разрешение изображения, изменить параметры i) Контраст модуляции освещения, ii) подавление шума высокого разрешения и iii) Из фокуса подавления.
- Затем проанализируйте реконструированное изображение, чтобы объективно обнаружить артефакты с помощью NanoJ-SQUIRREL28, плагина на основе ImageJ для оценки качества сверхразображенных изображений.
- Если NanoJ-SQUIRREL обнаруживает артефакты, перезапустите необработанные изображения и реконструируете их, изменив параметры реконструкции, такие как фильтрация Винера, аподизация и подавление нулевого порядка. В программном обеспечении NIS, используя предварительный просмотр для мониторинга того, как изменение параметров влияет на окончательное разрешение изображения, изменить параметры модуляции освещения Контраст, подавление шума высокого разрешения и из фокуса подавления.
- Используйте сверхпровереные изображения для расчета профиля совместной локализации и/или коэффициентов Пирсона и Мандера.
7. Ко-локализация с анализом профиля
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве первого шага к изучению совместной локализации между синаптических маркеров и белка интереса, принять супер-разрешенное изображение и проанализировать один локус для определения перекрытия сигнала.
- Определите один локус на супер-решенное изображение.
- Получить интенсивности профилей флуоресцентных сигналов локуса интереса.
- Экспорт данных.
- Используйте GraphPad Prism, или аналогичное программное обеспечение для анализа, чтобы нормализовать все пики сигнала и получить сопоставимую интенсивность сигнала для каждого канала с конечной целью определения локуса конкретной совместной локализации.
8. Количественная оценка коэффициентов Пирсона и Мандера
ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализ профиля предложил один локус совместной локализации, более общий анализ всего изображения может быть проведен путем расчета коэффициентов Пирсона иМандера 29,30.
- Используйте JACoP31, плагин ImageJ, чтобы определить два параметра совместной локализации: Pearson's и Mander's.
9. Статистический анализ
- Используйте GraphPad Prism или аналогичное программное обеспечение для анализа и графикирования для обработки данных, собранных с помощью JACoP.
- Используйте не менее 40 SIM-изображений для каждого анализируемого состояния для получения графиков и статистической значимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы представляем здесь стандартный рабочий процесс для изучения совместной локализации нейрональных белков. Сначала мы откалибровали микроскоп, а затем провели SIM-анализ образцов. Для калибровки системы мы использовали флуоресцентные микросферы диаметром 0,1 мкм. После получения супер-решенных 3D-SIM изображений бисера, базовые данные изображения преобразуются, чтобы преобразовать их в пространственное представление частоты. На рисунке 2A,различные цветочный узор представлен как признак супер-разрешение уровней детализации. Затем мы измерили разрешение, достигнутое путем расчета полной ширины в половину максимума (FWHM) пика профиля интенсивности одного шарика(рисунок 2B,C). Наконец, мы исправили хроматические аберрации путем регистрации канала, опять же с помощью флуоресцентных микросфер(рисунок 3A,B). Затем мы начали анализировать образец с целью 100x и мы приобрели 3D-SIM изображения. Мы использовали SIMCheck для оценки равномерности освещения поля или движения во время приобретения(рисунок 4A). Мы проверили различия в интенсивности между углами освещенности(рисунок 4B)и вычислили соотношение контраста модуляции с шумом для измерения контраста локальной полосы(рисунок 4C). Наконец, мы оценили эффективное разрешение реконструкции(рисунок 4D).
Затем мы подтвердили качество супер-решенных изображений с помощью NanoJ-SQUIRREL. На первом реконструированном изображении(рисунок 5A),NanoJ-SQUIRREL обнаружил наличие артефактов(рисунок 5C). Мы изменили параметры реконструкции, чтобы получить новое супер-решенное изображение(рисунок 5B)и NanoJ-SQUIRREL подтвердил отсутствие артефактов(рисунок 5D). После калибровки системы и оценки качества реконструированных изображений, мы затем начали анализировать первичные нейронные культуры, окрашенные антителом против MAP2, нейронального маркера, PSD95, пост-синаптический маркер и целевой белок SUMO1. Сначала мы проанализировали образец, выполняющий четырехканайную конфокальцную микроскопию с целью 40x(рисунок 6A). Выбрав область, представляющую нейронные процессы, мы перешли к 100-й цели. Мы приобрели как конфокальные, так и SIM-изображения одной и той же области для оценки качества реконструкции с NanoJ-SQUIRREL и проведения анализа совместной локализации. На рисунке 6Bмы показываем супер-решенное 3D-SIM изображение нейронов, окрашенных для SENP1 и drebrin. Ко-локализация в супер-разрешенных изображениях может быть проанализирована с помощьюанализа профиля (рисунок 7A)и количественной оценки коэффициентов Пирсона иМандера (рисунок 7B).
Рисунок 1: Сравнение широких, конфокальных и SIM-приобретений. (A) Широкое изображение первичных гиппокампа нейронов иммунолимов для SENP1 (зеленый), drebrin (красный) и MAP2 (лиловый). DAPI использовался для окрашивания ядер. Шкала бар 5 мкм.( B) Confocal изображение той же выборки панели . (C) SIM-изображение одного и того же образца панели A и B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Анализ 3D-SIM изображения микросфер для калибровки микроскопа. (A) Быстрая трансформация Фурье приобретения микросфер с его цветочной формой. (B)Выбор одной микросферы для определения бокового пространственного разрешения. (C)Интенсивность профиля одной микросферы в B с измерением его FWHM. Ценности представляют собой резолюцию, достигнутую в документе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Регистрация трех каналов. (A) Приобретение многоцветных (длин волн 488nm, 555nm и 647nm) TetraSpeck микросферы до регистрации. (B)Приобретение одного и того же образца после калибровки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Оценка качества необработанных и реконструированных изображений с помощью SIMcheck. (A)Анализ вариаций движения и освещения с помощью SIMCheck. Сигнал серый к белому представляет однородное освещение и отсутствие движения во время приобретения. (B) Профиль интенсивности канала, полученный путем анализа необработанную информацию. В этом примере разница интенсивности минимальна, что свидетельствует об отсутствии или обесцвечивании или колебаниях. (C) Сырье Модуляция Контраст для расчета соотношения модуляции контраста к шуму в изображении. Тепловая карта показывает вариации контрастности модуляции. (D) Реконструированный участок Фурье для анализа амплитуды спектра Фурье, чтобы определить эффективное разрешение реконструкции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Оценка качества изображения с супер-разрешением с помощью NanoJ-SQUIRREL. (A)Справочное изображение супер-разрешения с артефактами. (B)Справочное изображение с супер-разрешением хорошего качества. (C) Изображение, представляющее карту ошибок NanoJ-SQUIRREL A. Более светлые области представляют собой крупномасштабные артефакты, в то время как более темные представляют собой правильную реконструкцию. (D)Карта ошибок NanoJ-SQUIRREL B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: образец изображения SIM. (A)Конфокальцавная микроскопия первичных нейронов. Для получения обзора образца при сохранении хорошего разрешения была выбрана цель 40X. Клетки были иммунотелены для SUMO1 (зеленый), PSD95 (красный) и MAP2 (лиловый). DAPI использовался для окрашивания ядер. Шкала бар 50 мкм. Изображения отображались в качестве проекции. (B) SIM-изображения для SUMO1 и PSD95 на области, выделенной в зеленой коробке в панели А с использованием цели 100X. Красные наконечники стрел указывают на положение вставки, показанной в A, используемой для расчета профиля интенсивности. Масштабная планка 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Анализ совместной локализации. (A) Супер-разрешенное изображение первичных нейронов, окрашенных антителом против SENP1 (зеленым цветом) и drebrin (красным цветом), планка масштаба 0,5 мкм, и ее профиль интенсивности. Значения графика нормализовались для каждого канала до 100 (произвольный блок) и соответствуют интенсивности пикселей, показанной синей стрелкой. (B)Анализ с использованием JACoP для расчета коэффициента корреляции Пирсона и коэффициента Мандера между SENP1 и drebrin. Отображаются окна настройки плагина и визуального порога. Коэффициент Мандера выражается в двух значениях - фракции SENP1, которая ко локализуется с drebrin (M1) и фракцией drebrin, которая ко локализуется с SENP1 (M2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выяснение структуры и состава синапса имеет решающее значение для понимания физиологических и патологических процессов, которые регулируют память и познание. В то время как в нормальном состоянии, синапсы являются строительными блоками памяти, они также лежат в основе сложных неврологических расстройств, таких как болезньАльцгеймера 32. Описанный здесь протокол служит для изучения совместной локализации нейронных белков с помощью метода микроскопии супер-разрешения под названием SIM. Используя определенную модель освещения, SIM может достичь разрешения около 0,1 мкм, что подходит для изучения синапсов, которые обычно измеряют от 0,03 до 0,15 мкм. Для еще более подробно, другие методы супер-разрешения, такие как STED (Стимулированная микроскопия истощения выбросов), PALM (ФотоАктивированная микроскопия локализации) или STORM (Стохастическая оптическая микроскопия реконструкции), которые могут достигать разрешения 10-20 нм, могут бытьприменены 33.
Здесь мы описываем анализ совместной локализации целевых белков с синаптических маркеров в первичных нейронах. Протокол может быть применен к любой основной культуре нейронных клеток, таких как гиппокамп, мозжечок или корковые нейроны и даже к культурам первичных нейронов, которые не принадлежат к центральной нервной системе, таких как нейроны энтерической нервной системы. Ключом к анализу на уровне супер-разрешения, однако, являются реагенты, используемые при приобретении, такие как камерные крышки и монтажные решения, совместимые с индексом дифракции цели. Мы использовали камерные крышки для их простоты использования, но классический, более дешевый метод выращивания первичных нейронов на покрытом стеклом, тем не менее, действителен, особенно с высокой точностью #1,5H (0,17 мм) стекловолокна. Кроме того, следует использовать монтажные средства, которые могут достичь индекса преломления как можно ближе к индексу преломления стекла (1,52) и масло погружения для цели 100x с индексом преломления 1.515. Постоянная комнатная температура и стабилизированные таблицы также обязательны для обеспечения точности приобретений.
Мы используем как dyLight, так и вторичные антитела Alexa в исследованиях SIM. Из-за их узких пиков возбуждения и выбросов и хорошей квантовой урожайности, они показаны для методов супер-разрешения, которые требуют наилучшего соотношения сигнала к шуму. Демпси и др. сравнили Alexa, dyLight и другие флюорофоры для визуализации супер-разрешения34.
Во время приобретения, мы регулярно устанавливаем камеру на 1 МГц более 10 МГц. 1 МГц, благодаря более медленной скорости приобретения, дает изображениям больше точности и меньше шума, чем 10 МГц. 1 МГц режим считыв также может записывать с немного глубиной 16 бит (по сравнению с максимальным 14 бит 10 МГц), давая больше цветовой информации и более точный градиент цвета изображения. Тем не менее, 10 МГц, с его скоростью, полезно для живых изображений. Чтобы избежать отбеливания и сохранить фторфор, мы также установили мощность лазера как можно меньше. Для повышения интенсивности сигнала значения усиления могут быть увеличены. Стоит отметить, что более низкий выигрыш гарантирует более чистые изображения без повышения шума. Как правило, наилучшие результаты получены при визуализации в пределах 7 мкм от нижней части камерной крышки. Это особенно важно при использовании 100x цели с погружением в нефть. Если требуется более глубокое приобретение клеток/тканей, лучшим выбором может быть использование 60-х целей с погружением в воду.
Одной из основных задач при проведении исследований SIM-карты является реконструкцияизображения 35. Получение сверхображенных изображений без артефактов и аберрации требует не только использования специальных экспериментальных условий, но и тщательной калибровки системы и оптимизации параметров для получения окончательных изображений. В протоколе мы описываем, как избежать некоторых наиболее распространенных ошибок, оценивая калибровку системы и анализ качества необработанных и реконструированных изображений. В частности, мы описываем использование плагинов ImageJ SIMCheck и NanoJ-SQUIRREL для обеспечения правильных настроек инструмента для предотвращения общих артефактов сверхпровереных изображений. Заявки позволяют объективно оценить качество окончательных изображений, которая не основана на субъективном бенчмаркинге результатов с предварительного знания структур исследования.
Мы предлагаем использовать синаптофизин и PSD95 или drebrin в качестве до- и пост-синаптических маркеров, хотя другие маркеры являются действительными, а также. Огромное количество литературы описывает белки, такие как фагот, как синаптическиемаркеры 36,37. Стоит отметить, что до- и постсинаптические маркеры, однако, присутствуют по всей клетке, за исключением ядра. Большая часть их сигнала не синаптическая, но представляет белки в транспорте или деградации, фон или другие артефакты. Поэтому важно тщательно выбрать область анализа. Мы используем сигнал антител MAP2 для выбора аксонов и дендритных терминалов.
При анализе совместной локализации мы используем два подхода. Во-первых, это визуальный подход, основанный на анализе профиля, который показывает отдельные события совместной локализации и определяет вклад каждого канала. Однако оговоркой такого подхода является низкая статистическая мощь. По этой причине мы решили также использовать второй метод, основанный на анализе большего числа событий, репрезентативных для всего поля каждого изображения. Этот метод основан на расчете коэффициента корреляции Пирсона и коэффициентов М1 и М2 М2. Мы используем коэффициент корреляции Пирсона для описания перекрытия сигналов на изображении и M1 и M2 М2 Мандера для описания взаимной совместной локализации между сигналамиинтереса 38. Для расчета мы используем плагин ImageJ JACoP, так как он имеет функцию, которая позволяет установить ручной порог, чтобы отказаться от любого фонового вклада в анализ, особенно критический для анализа Мандера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Эдоардо Микотти за конструктивную критику рукописи. Это исследование было поддержано BrightFocus A2019296F, Фондом ди Бенефикенза - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) и Мари Склодовской-Кюри Innovative Training Network (JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | - | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
