Summary
نحن نصف الإجراء للتمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الخلايا العصبية باستخدام طريقة إسقاط شنقا. وعلاوة على ذلك، نقوم بإجراء تحليل phenotypic شامل من خلال RT-qPCR، immunofluorescence، RNA-seq، وتدفق قياس الخلايا.
Abstract
نحن نصف الإجراء خطوة بخطوة لزراعة وتمييج الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الأنساب العصبية، تليها سلسلة من المقايسات لتوصيف الخلايا المتمايزة. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأرة E14 لتشكيل أجسام جنينية من خلال طريقة الإسقاط المعلق ، ثم تم حثها على التفريق إلى خلايا السلف العصبي بواسطة حمض الريتينويك ، وتم تمييزها أخيرا إلى خلايا عصبية. كشفت تجارب النسخ العكسي الكمي البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR) وتجارب immunofluorescence أن السلف العصبي والخلايا العصبية تظهر علامات المقابلة (نستين للسلف العصبية والتشخيص العصبي للخلايا العصبية) في اليوم 8 و 12 بعد التمايز، على التوالي. أظهرت تجارب قياس التدفق الخلوي على خط E14 التي تعبر عن مراسل GFP مدفوع من قبل Sox1 أن حوالي 60٪ من الخلايا في اليوم 8 إيجابية GFP ، مما يشير إلى التمايز الناجح لخلايا السلف العصبي في هذه المرحلة. وأخيرا، استخدم تحليل الحمض النووي الريبي-seq لتحليل التغيرات العالمية في النسخ. هذه الأساليب مفيدة لتحليل مشاركة جينات ومسارات محددة في تنظيم انتقال هوية الخلية أثناء التمايز العصبي.
Introduction
منذ اشتقاقها الأول من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الكيسية الماوسالنامية 1،2، وقد استخدمت الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESC) كأدوات قوية لدراسة الخلايا الجذعية التجديد الذاتي والتمايز3. وعلاوة على ذلك، فإن دراسة التمايز mESC يؤدي إلى فهم هائل للآليات الجزيئية التي قد تحسن الكفاءة والسلامة في العلاج القائم على الخلايا الجذعية في علاج أمراض مثل الاضطرابات العصبية4. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية، يوفر هذا النظام في المختبر العديد من المزايا بما في ذلك البساطة في الممارسة والتقييم، وانخفاض التكلفة في الحفاظ على خطوط الخلايا على النقيض من الحيوانات، وسهولة نسبية في التلاعب الجيني. ومع ذلك، فإن كفاءة وجودة أنواع الخلايا المتمايزة تتأثر في كثير من الأحيان بخطوط مختلفة من mESCs وكذلك طرق التفريق5و6. كما أن المقايسات التقليدية لتقييم كفاءة التمايز تعتمد على الفحص النوعي لجينات العلامات المختارة التي تفتقر إلى القوة، وبالتالي فهي تفشل في فهم التغيرات العالمية في التعبير الجيني.
هنا نهدف إلى استخدام بطارية من المقايسات لتقييم منهجي للتمايز العصبي. باستخدام كل من التحليلات التقليدية في المختبر على علامات مختارة ورنا-seq، ونحن إنشاء منصة لقياس كفاءة التمايز، فضلا عن التغيرات النسخية خلال هذه العملية. استنادا إلى بروتوكولالمنشأةسابقا 7 , أنشأنا الأجسام الجنينية (EBs) من خلال تقنية إسقاط شنقا, تليها التعريفي باستخدام كمية فوقفيزيولوجية من حمض الريتينويك (RA) لتوليد خلايا السلف العصبية (NPCs), التي تم تمييزها في وقت لاحق إلى الخلايا العصبية مع وسيط التعريفي العصبي. لدراسة كفاءة التمايز ، بالإضافة إلى المقايسات التقليدية RT-qPCR والمناعة (IF) ، قمنا بإجراء قياس الخلايا الحمض النووي الريبي والتدفق. وتوفر هذه التحليلات قياسا شاملا لتطور التمايز الخاص بالمرحلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ثقافة mESC
- معطف 10 سم الأنسجة الثقافة المعالجة لوحة مع 0.1٪ الجيلاتين والسماح للجيلاتين لتعيين ما لا يقل عن 15-30 دقيقة قبل أسبيراتينغ بها.
- البذور γ المشععة الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) قبل يوم واحد من زرع mESCs في المتوسط mESC قبل الاحماء (دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) مع 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، والأحماض الأمينية غير الأساسية، β ميركابتوثانول، إل-غلوتامين، البنسلين/الستربتومايسين، بيروفات الصوديوم، LIF، PD0325901 (PD)، وChir99021 (CH)).
- السماح للماء المشع γ لتسوية ونلتصق على سطح لوحة قبل زراعة الخلايا E14.
- تذوب E14 ESCs في حمام مائي 37 درجة مئوية ونقل الخلايا بسرعة في أنبوب مخروطي 15 سم مع المتوسطة mESC الدافئة. بيليه الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.
- إعادة تشغيل الخلايا في 10 مل من المتوسط mESC ولوحة الخلايا على لوحة الثقافة التي تحتوي على MEFs المشع γ المصنفة في وقت سابق. احتضان ثقافة الخلية في حاضنة 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- لثقافة passaging، يستنشق ه المتوسطة وغسل لوحة معقمة 1x PBS. إضافة ما يكفي من 0.05٪ تريبسين لتغطية سطح لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- تحييد التريبسين مع المتوسطة mESC وماصة لتوليد تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.
- عد الخلايا مع عداد الدم أو عداد الخلية والبذور حوالي 5.0 × 105 خلايا في لوحة ثقافة 10 سم.
- Resuspend الخلايا في 10 مل من المتوسطة mESC، لوحة الخلايا على لوحة زراعة الأنسجة المغلفة الجيلاتين واحتضان الثقافات كما هو موضح سابقا.
ملاحظة: من المستحسن أن يتم تمرير mESCs كل يومين لمنع الخلايا من التفريق في مستعمراتها. فينول الأحمر في وظائف متوسطة فقط كمؤشر درجة الحموضة واعتمادا على الكثافة الخلوية، فإنه يمكن أن تتحول مصفر (أكثر حمضية)، في وقت أقرب من 2 أيام. وبالتالي، قد يكون من الضروري تغيير الوسط كل يوم. سوف تموت صناديق الاستثمار متعددة الإشعاعات γ في نهاية المطاف بعد بضعة مقاطع.
2. EB، المجلس الوطني للصحافه، والتمايز العصبي
- تنفيذ بروتوكول تمرير الثقافة المذكورة سابقا، وعدد الخلايا (الخطوات 1.7-1.10).
- طريقة إسقاط شنقا (يوم 0)
- للوحة زراعة الخلية 10 سم، عد ما يقرب من 2.5 × 104 خلايا حيث سيتم تعليق 5.0 ×10 2 خلايا في 20 ميكرولتر متوسط التمايز (DMEM مع 15٪ FBS، والأحماض الأمينية غير الأساسية، β ميركابتوثانول، L-الجلوتامين، البنسلين / streptomycin، وبيروفات الصوديوم). يمكن أن تكون مطلية ما يقرب من خمسين قطرات 20 ميكرولتر التي تحتوي على الخلايا على لوحة واحدة 10 سم.
- Aliquot العدد المناسب من الخلايا، ومن ثم الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.
- إعادة إنفاق الخلايا في الحجم المناسب من وسيط التمايز لكثافة الخلية من 5.0 × 102 خلايا لكل 20 ميكرولتر (على سبيل المثال، 2.5 × 104 خلايا في 1 مل من متوسط التمايز).
- باستخدام ميكروباينيت أو ماصة مكررة، ضع قطرات 20 ميكرولتر من تعليق الخلية على غطاء لوحة زراعة الأنسجة. تأكد من أن قطرات ليست قريبة جدا من بعضها البعض لمنعهم من الاندماج.
ملاحظة: يمكن أن تكون مطلية قطرات على لوحة مرفق الأنسجة الثقافة المعالجة أو لوحة تعليق كما سيتم وضعها على الغطاء وليس لوحة نفسها. لنهج أكثر جدوى وعقيمة، لوحة قطرات على لوحة مرفق الأنسجة والثقافة ونقلها إلى لوحة تعليق كما هو موضح أدناه. - ملء لوحة مع 5-10 مل من برنامج تلفزيوني 1x ووضع بعناية الغطاء مرة أخرى على لوحة. احتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم إضافة برنامج تلفزيوني إلى لوحة الثقافة لمنع قطرات من الجفاف.
- في اليوم 2، استخدم micropipette لجمع قطرات من الغطاء ووضعها في لوحة تعليق خلية 10 سم مليئة 10 مل من وسيط التمايز. احتضان الثقافة على شاكر المداري تهتز بسرعة منخفضة في الحاضنة.
- في اليوم 4، لحصاد EBs ، وجمع الخلايا ، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقائق ، وإزالة supernatant.
ملاحظة: يمكن غسل EBs أيضا مع برنامج تلفزيوني 1x وفقا لمتطلبات التجارب اللاحقة. - لمواصلة الإجراء والحث على التمايز EB في خلايا السلف العصبي (NPCs)، وإعداد وسيط التمايز مع حمض الريتينويك 5 ميكرومتر (RA).
- إزالة المتوسطة القديمة عن طريق بيليه EBs في 100 × ز لمدة 3 دقائق أو السماح لEBs لتسوية قبل أسبيراتينغ خارج المتوسطة القديمة. أضف 10 مل من وسيط التمايز الذي يحتوي على 5 ميكرومتر RA إلى لوحة الثقافة.
- في اليوم 6، استبدل ما لا يقل عن نصف الوسط بوسط طازج يحتوي على 5 ميكرومتر RA عن طريق إمالة اللوحة وأنابيب الوسط كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: من المستحسن أن يتم استبدال نصف المتوسط على الأقل مع وسيطة جديدة تحتوي على RA في اليومين 5 و 7. يحيط علما مؤشر فينول الأحمر; إذا كان يتحول مصفر، فمن الأفضل أن تحل محل كل من المتوسط. - في اليوم 8، حصاد الشخصيات الوطنية عن طريق جمع الخلايا ، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقائق ، وإزالة supernatant.
ملاحظة: يمكن غسل الشخصيات أيضا مع برنامج تلفزيوني 1x وفقا لاحتياجات التجارب اللاحقة. وإذا لزم الأمر، يمكن تجميد المركبات غير الوطنية وذوبانها مرة أخرى من أجل الثقافة والتحليل في وقت لاحق. إذا كان ل NPCs أن تكون مثقفة، يمكن أيضا استخدام accutase كبديل للتريبسين. - لمواصلة الإجراء وتمييز الشخصيات في الخلايا العصبية، وجمع الخلايا العصبية في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق الطرد المركزي، وتفكيكها مع التريبسين واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. ماصة الشخصيات لضمان أن يتم فصل جميع المجاميع المجلس الوطني لنواب الشعب وتحييد التريبسين مع المتوسطة.
- تصفية الخلايا مع 40 ميكرومتر مصفاة خلايا النايلون والعد الخلايا قبل الطلاء لهم في كثافة 1.5 × 105/ سم2 في N2 المتوسطة (DMEM / F12 المتوسطة + 3 ملغ / مل الجلوكوز + 3 ملغ / مل الدهون الغنية مصل البقري الألبومين (LBSA) + 1:100 N2 الملحق + 10 نانوغرام / مل bFGF + 50 U / مل القلم / العقدية + 1 mM L-الجلوتامين) على لوحة الأنسجة والثقافة المعالجة لPCR اللاحقة والتجارب لطخة الغربية; أو على غرفة زراعة الأنسجة لتجارب immunofluorescence.
- في اليوم 9، استبدل الوسط القديم بوسط N2 طازج.
- في اليوم 10, تبديل المتوسط N2 مع N2/B27 المتوسطة (50٪ DMEM/F12 و 50٪ القاعدية العصبية, 3 ملغم/مل LBA, 1:200 N2 الملحق, 1:100 B27 الملحق, 50 U/mL القلم / العقدية, و 1 MM L-الجلوتامين).
- في الأيام 11-12، حصاد الخلايا العصبية على النحو التالي. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x، إضافة تريبسين، واحتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق قبل تحييد التريبسين مع أجهزة الطرد المركزي والمتوسطة في 200 × ز لمدة 3 دقائق.
3. توصيف mESCs والخلايا المتمايزة
- الفوسفاتاز القلوية (AP) المقايسة
- استخدم مجموعة لتقييم نشاط الفوسفاتاز القلوية (انظر جدول المواد).
- إزالة المتوسطة من لوحة الثقافة وغسل ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x.
- إضافة 1 مل من حل الإصلاح (يتكون من الفورمالديهايد والميثانول) المقدمة مع عدة إلى لوحة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق.
ملاحظة: الإفراط في الحضانة في حل الإصلاح يمكن أن يعرض نشاط AP للخطر. - إزالة الحل الإصلاح، وغسل ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x وترك بعض كمية من برنامج تلفزيوني في لوحة.
ملاحظة: حافظ على رطوبة ESCs في PBS لعدم تعريض نشاط AP للخطر. - قم بإعداد حل AP عن طريق خلط حلول الركيزة A وB وC بنسبة 1:1:1. امزجي المحاليل A وB أولا واحتضني الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين قبل إضافة محلول C.
- إزالة برنامج تلفزيوني 1x وإضافة الحل AP أعدت في وقت سابق.
- احتضان ESCs لمدة 15 دقيقة في الظلام عن طريق التفاف لوحة الثقافة مع رقائق الألومنيوم أو أداء الخطوة 3.5 في غرفة مظلمة.
- مراقبة رد الفعل وإزالة محلول رد الفعل عندما يتحول الحل مشرق لتجنب تلطيخ غير محددة.
- غسل ESCs مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.
- منع العينة من التجفيف عن طريق تغطية ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x أو تركيب المتوسطة.
ملاحظة: سوف تظهر وصمة عار حمراء أو أرجوانية للتعبير عن AP. يمكن تخزين الطبق في ثلاجة 4 °C.
- RT-qPCR
- جمع الخلايا في مراحل مختلفة باتباع الخطوات 1.6-1.7 و 2.4 لESCs وEBs وNPCs، على التوالي.
- عزل الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، واستخراج البروتين الحل (انظر جدول المواد).
- إنشاء cDNA مع عدة النسخ العكسي (انظر جدول المواد)واتبع دليل الشركة المصنعة.
- التثبيت والتضمين
- حصاد EBs وNPCs كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.6) وإصلاحها مع 4٪ paraformaldehyde (PFA) الحل في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة PFA وغسل العينة مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق.
- ضع العينة في مخفف متسلسل من حلول 1x PBS و 10٪ - و 20 ٪ - و 30 ٪ سكروز في 25 درجة مئوية حيث يتم نقل العينة إلى الحل التالي بعد 30 دقيقة من الحضانة.
ملاحظة: يمكن تخزين العينة في محلول السكروز بنسبة 30٪ عند 4 درجات مئوية قبل المتابعة مع خطوة التضمين. - الرطب تلميح ماصة مع محلول السكروز قبل وضع العينة (دون التراص لهم) في وسط العفن cryo وماصة من السائل الزائد.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام ورقة التصفية لإزالة الحل الزائد. التبول تلميح ماصة مع محلول السكروز مهم لمنع EBs وNPCs من الالتصاق بجدران الطرف. - إضافة بعناية درجة الحرارة خفض الأمثل (أكتوبر) حل للقالب دون إعادة تعليق العينات وإزالة الفقاعات الزائدة مع ماصة.
- ضع القالب مع العينة على خلاط مختبر بسرعة منخفضة لإثارة العينة بشكل معتدل لمدة 15 دقيقة. وهذا يساعد على تسوية EBs و NPCs إلى أسفل إذا تم إعادة إنفاقها في حل OCT.
- تجميد العينة بسرعة عن طريق وضع القالب في النيتروجين السائل أو على الجليد الجاف.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في ثلاجة -70 درجة مئوية قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
- بكاء
- تعيين cryostat لتهدئة إلى -20 إلى -18 درجة مئوية قبل نقل العينة إلى الصك.
- فصل كتلة أكتوبر المجمدة من القالب وتأمينه على حامل مع حل أكتوبر قليلا وضعت على سطح حامل.
- قم بمحاذاة كتلة OCT بحيث تكون EBs وNPCs الأقرب إلى النصل لضمان عدم فقدان العينة أثناء المقطع.
- بعناية القسم 10 ميكرومتر من كتلة وإيلاء اهتمام وثيق لشرائح التي تحتوي على العينة.
- ضع بسرعة شريحة OCT التي تحتوي على العينة على الشريحة الزجاجية التي تتضمن الأنسجة والسماح لشرائح OCT بتجفيف الهواء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند -70 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
- الفلورة المناعية (IF)
- كتلة أقسام أكتوبر أو غرف الثقافة التي تحتوي على الخلايا العصبية في 10٪ مصل الحمير العادية / 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العينات في الأجسام المضادة الأولية المخففة في 5٪ مصل الحمير العادي/0.05٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- غسل العينات في 1x PBS/0.1٪ تريتون X-100 ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل غسل.
- احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 5٪ مصل الحمير العادي /0.05٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل العينات في 1x PBS/0.1٪ تريتون X-100 ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل غسل ثم احتضان العينات في 1 ميكروغرام / مل DAPI.
- جبل العينات مع غطاء وبعض المتوسطة المتصاعدة والسماح لها لتجف.
- مراقبة العينات تحت المجهر الفلوري.
- تحليل الحمض النووي الريبي-seq
- جمع الخلايا في مراحل مختلفة وأداء استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الخطوة 3.2).
- إعداد مكتبات cDNA، وإجراء تسلسل عميق وتحليل البيانات وفقا للبروتوكول الموصوف في وانغوآخرون.
- إجراء تحليل علم الأنتولوجيا الجينية (GO) باستخدام حزمة R، clusterProfiler.
- قياس التدفق الخلوي
- جمع ESCs باتباع الخطوات 1.6-1.7 وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط. جمع EBs و NPCs باتباع الخطوة 2.4 وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط.
- تصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية النايلون 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 15 مل.
- قياس إشارة GFP للعينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي (الذي يؤديه المرفق الأساسي للمؤسسة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كتمثيل لطريقتنا ، قمنا بإجراء تجربة تمايز EB و NPC والخلايا العصبية على خلايا E14. تم استزراع خلايا E14 على γ المشععة MEFs(الشكل 1A)حتى تم تخفيف مجموعة MEF المشععة γ. أكدنا pluripotency من الخلايا E14 من خلال أداء الفوسفاتاز القلوية (ا ف ب)تلطيخ (الشكل 1B)وRT-qPCR في وقت لاحق (انظر أدناه) لعلامات نانوغ و Oct4. ثم تم تحريض خلايا E14 الخالية من ال MEF γ المشعة على التمايز باستخدام البروتوكول المبين في الشكل 2A. باختصار، تم زرع قطرات الوسائط المتمايزة من 20 ميكرولتر التي تحتوي على 500 خلية على غطاء لوحة الثقافة (انظر القسم 2 من البروتوكول للحصول على التفاصيل). ثم تم جمع ال EBs التي تم تشكيلها ووضعها في تعليق في وسائل الإعلام التمايز جديدة. من اليوم 4 إلى اليوم 8 من التمايز، تمت إضافة 5 ميكرومتر RA إلى لوحات الثقافة لحث الشخصيات. في اليوم 8، تم حصادها NPCs وتجريبها، ومن ثم تم مطلي تعليق خلية واحدة الناتجة في غرفة زراعة الأنسجة في المتوسط DMEM/F12 مع ملحق N2 وبعد ذلك في ملحق B27. بحلول اليوم 10، يبدو أن الشخصيات التي تتمايز في الخلايا العصبية لديها شكل خلية ممدود(الشكل 2B).
لمزيد من التقييم لدينا تجربة التمايز، قمنا بإجراء تجارب immunofluorescence (IF) على الخلايا العصبية E14 في اليوم 8 و E14 الخلايا العصبية في اليوم 12. لاحظنا تلطيخ إيجابية للنستين في NPCs و إشارة neurofilament (NF) للخلايا العصبية(الشكل 3A). بدلا من ذلك، أكد RT-qPCR و RNA-seq تحريض جينات علامة NPC وفقدان جينات متعددة الشخصيات في الNPCs(الشكل 3B، D، F). كطريقة كمية لاختبار نجاح التمايز ESC، قمنا بتمايز خط ESC الماوس الذي يعبر عن مراسل GFP9الذي يحركه المروجون ل Sox1 ، يليه تحليل قياس التدفق الخلوي على ESCs و NPCs. وجدنا أن 58.7٪ من إجمالي الخلايا في مرحلة NPC هي GFP إيجابية في حين أن إشارة GFP هي 0.0٪ في مرحلة ESC(الشكل 3C). لمحة عن التغيرات النسخية أثناء التمايز ، تم إجراء تجارب RNA-seq ل E14 ESCs ، EB اليوم 3 ، ويوم المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني 8 وكشفت عن مجموعات الجينات المرتبطة بالمراحل المعنية(الشكل 3D). تم فرز الجينات في خريطة الحرارة RNA-seq على أساس مستويات التعبير الخاصة بهم لتحديد الجينات المعرب عنها بشكل تفاضلي في المراحل المختلفة أثناء التمايز. أظهر تحليل علم الأنتولوجيا الجينية (GO) للمجموعات الجينية الأربع أن هذه المجموعات تتوافق مع وظائف أو مسارات خلوية متميزة تشير إلى أن مراحل الخلية الثلاث للتمايز العصبي mESC لكل منها مجموعة من الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في مرحلة كل منها ولكن ليس غيرها(الشكل 3E). على سبيل المثال، يتم التعبير عن الجينات في الكتلة 3 بشكل كبير في الشخصيات E14 مقارنة بالمراحل الأخرى وتتوافق مع المسارات المتعلقة بتطوير الخلايا العصبية. لا تحتوي المجموعات 1 و2 و4 على جينات عالية التعبير تتعلق بأي مواصفات نسب طبقة جرثومية ولكنها مرتبطة بالنمو الخلوي والانتشار. وهكذا، أظهر تحليل RNA-seq وما يصاحبه من GO أن خلايا E14 قد تمايزت في النسب العصبي بحلول اليوم 8 من التمايز.
الشكل 1: E14 ESCs في الثقافة. (أ)تظهر صور المجهر الخفيف خلايا E14 (السهم الأسود) تنمو في المستعمرات فوق صور MEFs المشععة γ. تستمر مستعمرات E14 في الانتشار كما رأينا في فرق حجم المستعمرة بين ثقافات اليوم 1 واليوم 3. (ب)تأكيد متعددة المراحل من E14 ESCs بواسطة بقعة الفوسفاتاز القلوية (AP). تشير الأسهم الأرجوانية إلى mESCs التي كانت إيجابية للبقع AP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التمايز E14 في EBs، NPCs، والخلايا العصبية. (أ)يلخص التخطيطي الخطوات الرئيسية للتمييز بين خلايا E14 إلى EBs وNPCs والخلايا العصبية. (ب)E14 ESCs المستزرعة في المتوسط دون LIF و 2i في لوحة تعليق تشكل مجالات فردية من EBs مرئية في اليوم 2 حيث أنها لا تزال تنمو وتتوسع في الحجم في الأيام اللاحقة. يضاف RA في اليوم 4 من التمايز للحث على التمايز في الشخصيات غير الوطنية. بعد 4 أيام من التعريفي، مطلي هذه الشخصيات للتمايز في الخلايا العصبية، والتي تظهر في اللوحة السفلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف الخلايا المتمايزة. (أ)تظهر صور Immunofluorescence في اللوحة العليا EBs التي تحتوي على NPC في اليوم 8 بحث عن nestin (الأخضر) والنواة (DAPI ، الأزرق). تظهر اللوحة السفلية صور الفلورة المناعية للخلايا العصبية في اليوم 12 التي تم بحثها عن الفلترة العصبية (الخضراء). يتم تكبير المربع الأحمر في الصور المدمجة في 3x للحصول على عرض أفضل. (ب)تحليل RT-qPCR يظهر علامات متعددة الخلايا (نانوغ و Oct4) وعلامات NPC (Pax6، NeuroD1، و Nes) من E14 ESCs و NPCs. أشرطة الخطأ هي متوسط ± SD. (C) تم تمييز خلايا E14 التي تعبر عن مراسل GFP مدفوع من قبل Sox1 إلى NPCs. وقد تم تحديد كمية كل من ESCs وNPCs في اليوم 8 للإشارة الفلورية GFP الإيجابية مع قياس التدفق الخلوي. (د)تظهر خريطة الحرارة درجات z ل FPKM المحدد للجينات المعبر عنها في مراحل ESC و EB و NPC. تم تحديد أربع مجموعات جينية متميزة تدل على مجموعات من الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل متفاوت إما في مرحلة ESC أو EB أو NPC. (ه)تم إجراء تحليل GO باستخدام حزمة R، clusterProfiler، على المجموعات الأربع المحددة في RNA-seq. (F) الرسم البياني يظهر القيم FPKM لثلاث علامات متعددة الأطراف أخرى، Sox2، Klf4،و Myc وكذلك علامات العصبية، NeuN، Map2،و Tubb3 لخلايا E14 في ESC، EB اليوم 3، ومراحل المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني اليوم 8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم إنشاء طريقة التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس لعقود واستمر الباحثون في تعديل البروتوكولات السابقة أو إنشاء بروتوكولات جديدة لأغراض مختلفة7و10و11. استخدمنا سلسلة من المقايسات لتحليل شامل لكفاءة وتقدم مراحل التمايز من mESCs إلى الخلايا العصبية ، والتي يمكن استخدامها في تحليل تمايز النسب الأخرى من الماوس أو ESCs الإنسان. وعلاوة على ذلك، أثبتت نهجنا أن تكون أدوات مفيدة لتقييم تأثير جينات محددة أو مسارات على التمايز العصبي في المختبر8.
مع أساليبنا، متعدد القدرات غير ملتزمة ESCs تعامل مع حمض الريتينويك (RA) تلتزم النسب العصبي بكفاءة عالية ويتم حث مزيد من لتوليد الخلايا العصبية7. لتحسين التمايز الناجح لخلايا ES إلى خلايا عصبية وتقليل التغايرية ، من المهم الحفاظ على خلايا ES في حالة غير متمايزة12. غير التكاثرية MEFs، تعامل مع γ الإشعاع أو mitomycin C، وظيفة للحفاظ على pluripotency من ESCs وتوفير سقالة لنموها13،14. للحصول على نتائج متسقة، نبدأ كل تجربة تمايز مع mESCs المستزرعة على γ المشععة MEFs. بعد بضعة مقاطع ، تموت ملفات MEFs المشععة γ وتصبح الثقافة متجانسة في نهاية المطاف لخلايا mESC. وبدلا من ذلك، يمكن طلاء المي إس سي مسبقا على الجيلاتين لمدة 45 دقيقة تقريبا قبل أن يتم بذر ال MFs المشععة γ لإزالتها بشكل أفضل في المقطع التالي. عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) منذ فترة طويلة تستخدم للحفاظ على حالة متعددة الخلايا الماوس ES المستزرعة عن طريق تفعيل مسار JAK / STAT15،16،17. في الآونة الأخيرة ، تم العثور على PD0325901 (PD ، مثبط MEK) وCHIR99021 (CH ، مثبط GSK) لتوفير صيانة متعددة الخلايا متعددة الخلايا ES3،18. في بروتوكولنا، ونحن ثقافة mESCs مع هذه المثبطات جنبا إلى جنب مع LIF للحفاظ على متعددة الثقافات عالية من mESCs.
وثمة عامل حاسم آخر لتحقيق التمايز الناجح هو نوعية المركبات ثنائية الفينيل. نحن نؤدي التفريق بين خلايا E14 بواسطة طريقة الإسقاط المعلق ، والتي تم تطبيقها من قبل المحققين الآخرين5و19و20. مع هذه الطريقة، يسمح للخلايا ES واحدة لتعليق في قطرات متوسطة التمايز لمدة 2 أيام حيث أنها تجمع تلقائيا وتشكيل EBs. وعادة ما تكون المركبات الناشئة أكثر تحديدا من حيث مورفولوجيا(الشكل 2B)مقارنة بطريقة تعليق mESCs المعزولة في المتوسط ، مما يؤدي إلى أحجام EB في نطاق أوسع بكثير في تجربتنا (البيانات غير مبينة). لمنع EBs من إرفاق لوحات، من المهم أن تفعل دوران سرعة منخفضة بدءا من اليوم 3 المستمر من خلال عملية التمايز. يتم حث EBs على التفريق إلى NPCs من خلال التعامل معها مع RA. الشخصيات الناتجة من العلاج RA في EB اليوم 4 وعادة ما تكون غير متجانسة للخلايا العصبية مثل oligodendrocytes والخلايا الفلكية21. باستخدام RT-qPCR أو immunofluorescence، يمكن بحث السكان المجلس الوطني للصحافه للخلايا العصبية وعلامات النسب العصبية الأخرى مثل Gfap للخلايا الفلكية وOlig2 لoligodendrocytes. للحث على مزيد من التمايز من الخلايا العصبية في الخلايا العصبية, يتم استزراع الخلايا العصبية في الوسط الأمثل حيث المكونات الأكثر أهمية هي N2 و B27 ملاحق. N2 الملحق وظائف أساسا لمساعدة NPCs على الالتزام النسب العصبية في حين أن وظائف الملحق B27 للحفاظ على طول عمر الخلايا العصبية.
يمكن جمع العينات عبر فترة التمايز (على سبيل المثال ، مرحلة ESC ، EB اليوم 2 ، EB اليوم 4 ، يوم المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني 6 ، يوم المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني 8 ، يوم الخلايا العصبية 10 ، والخلايا العصبية اليوم 12) لتتبع عملية التمايز من خلال أداء RT-qPCR لعلامات متعددة الخلايا والكرات. مقارنة علامات متعددة الخلايا مثل Oct4، نانوغ، Sox2، Klf4، و Myc بين مراحل الخلية المختلفة سوف تحقق من pluripotency من mESCs (الشكل 3B ، F). للتحقيق في كفاءة التمايز العصبي ، علامات لطبقة mesoderm مثل Hand1، Snai1، وTbxt؛ وطبقة endoderm مثل Eomes و Gata4 يمكن أيضا أن يكون بحث عن (البيانات غير المعروضة). ويمكن إجراء مزيد من التحقق مع immunofluorescence (IF) التحقيق لعلامات NPC أو الخلايا العصبية (الشكل 3A). ومع ذلك، هذه الأساليب ليست كمية ومتحيزة نحو علامات مختارة. للتغلب على هذه القيود، ونحن دمج تدفق الخلايا وتحليلات الحمض النووي الريبي-seq (الشكل 3C\u2012F). خط الخلية المستخدمة في تجربة قياس التدفق الخلوي هو Sox1-GFP E14 خط الخلية، والتي استخدمت على وجه التحديد في هذه التجربة لتقييم نوعية الإجراء التمايز المجلس الوطني للصحافه. Sox1 هي واحدة من أقرب علامة الخلايا العصبية محددة خلال تطوير neuroectoderm22 مما يجعلها علامة ممتازة لنسب المجلس الوطني للصحافه. Sox1 يمكن بحثها لاستخدام RT- qPCR أو لطخة الغربية لتقييم السكان المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني. هذه التحليلات مفيدة بشكل خاص للتحقيق في عيب التمايز الناجم عن التلاعب الجيني أو العلاج الكيميائي.
ومن المهم ملاحظة أن هناك بعض القيود على بروتوكولنا المعروض هنا. أولا وقبل كل شيء، نحن نقدم فقط التحليل الشامل لخط خلية mESC واحد من النوع البري. خطوط ESC الأخرى الناشئة من الفئران أو البشر قد تتطلب تغييرات ومزيد من التحسين في البروتوكول لضمان تمايز الخلايا العصبية الناجحة والفعالة. ثانيا، نقدم طريقة تمايز الخلايا العصبية في المختبر، والتي تحمل بطبيعة الحال مجموعتها الخاصة من القيود. كما ذكر من قبل ، يتم التعامل مع EBs مع مستوى فوقفيزيولوجي من RA لدفعهم نحو نسب المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني. ثم يتم وضع الNPCs الناتجة في وسائل الإعلام الخلايا العصبية الأمثل لمحاكاة الظروف الفسيولوجية وتشجيع التزام نسب الخلايا العصبية, نمو, وطول العمر. هنا, وتستخدم N2 و B27 ملاحق لثقافة الخلايا العصبية ولكن المكملات الغذائية الأخرى متاحة أيضا مثل NS2123 لأغراض مماثلة, والتي قد تغير نجاح وكفاءة التمايز العصبية. يتم إعادة تشكيل هذه الحالات صناعيا في مقايسات ثقافة الخلية ، والتي قد لا تمثل بشكل كامل الظروف الفسيولوجية. نوعية EBs، NPCs، والخلايا العصبية تعتمد اعتمادا كبيرا على mESCs البداية. mESCs التي تم تمريرها لعدة مرات والاحتفاظ بها في الثقافة لأكثر من أسبوع واحد تبدأ عادة في فقدان pluripotency وقد لا تخضع بنجاح للتمايز. وبالتالي، فإن الحفاظ على mESCs في حالة مثلى هو المفتاح في ضمان أنها يمكن أن تفرق بشكل فعال في EBs، NPCs، والخلايا العصبية. كما تم اقتراح أساليب أخرى ثقافة الخلايا العصبية مثل نماذج 3D لمحاكاة أفضل الظروف الفسيولوجية24،25،26 في بعض الأحيان على حساب الإنتاجية والجدوى27،28. ونحن نعتقد أن بروتوكولاتنا مفيدة لوصف هذه النماذج الثقافية ثلاثية الأبعاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد القومية للصحة (1R35GM133496-01) إلى Z. Gao. نود أن نشكر الدكتور ريان هوبز على المساعدة في القسم. نشكر المرافق الأساسية لكلية ولاية بنسلفانيا للطب، بما في ذلك علوم الجينوم والمعلوماتية الحيوية، والتصوير المجهري الضوئي المتقدم، وقياس التدفق الخلوي. كما نشكر الدكتور يوكا إيمامورا على المساعدة في تحليل الحمض النووي الريبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
