Summary
Vi beskriver förfarandet för in vitro differentiering av mus embryonala stamceller i neuronala celler med hjälp av hängande dropp metod. Dessutom utför vi en omfattande fenotypisk analys genom RT-qPCR, immunofluorescens, RNA-seq och flöde cytometri.
Abstract
Vi beskriver steg-för-steg förfarandet för odling och differentiering mus embryonala stamceller i neuronal härstamningar, följt av en serie analyser för att karakterisera de differentierade cellerna. E14 mus embryonala stamceller användes för att bilda embryoid kroppar genom hängande dropp metod, och sedan induceras att differentiera i neurala stamceller genom retinsyra, och slutligen differentieras i nervceller. Kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-qPCR) och immunofluorescens experiment visade att neurala stamceller och nervceller uppvisar motsvarande markörer (nestin för neurala stamceller och neurofilament för nervceller) dag 8 och 12 post-differentiering, respektive. Flöde cytometri experiment på en E14 linje uttrycker en Sox1 promotor-driven GFP reporter visade att cirka 60% av cellerna på dag 8 är GFP positiva, vilket indikerar den framgångsrika differentiering av neurala stamceller i detta skede. Slutligen användes RNA-seq-analys för att profilera de globala transkriptomiska förändringarna. Dessa metoder är användbara för att analysera inblandning av specifika gener och vägar i regleringen av cellidentitetsövergången under neuronal differentiering.
Introduction
Sedan deras första härledning från den inre cellmassan hos de framväxande mus blastocysts1,2, mus embryonala stamceller (mESC) har använts som kraftfulla verktyg för att studera stamceller självförnyelse och differentiering3. Att studera mESC-differentiering leder dessutom till en enorm förståelse för molekylära mekanismer som kan förbättra effektiviteten och säkerheten vid stamcellsbaserad terapi vid behandling av sjukdomar som neurodegenerativa sjukdomar4. Jämfört med djurmodeller ger detta in vitro-system många fördelar, inklusive enkelhet i praktiken och bedömning, låg kostnad för att upprätthålla cellinjer i motsats till djur och relativ lätthet i genetiska manipuleringar. Effektiviteten och kvaliteten hos differentierade celltyper påverkas dock ofta av olika linjer av mESC samt differentieringsmetoderna5,6. De traditionella analyserna för att utvärdera differentieringseffektiviteten bygger också på kvalitativ undersökning av utvalda markörgener som saknar robusthet och de därför inte förstår globala förändringar i genuttryck.
Här strävar vi efter att använda ett batteri av analyser för systematisk bedömning av neuronal differentiering. Med hjälp av både traditionella in vitro-analyser på utvalda markörer och RNA-seq etablerar vi en plattform för mätning av differentieringseffektiviteten samt transkriptomiska förändringar under denna process. Baserat på ett tidigare etablerat protokoll7genererade vi embryoidkroppar (EBs) genom hängande droppteknik, följt av induktion med suprafysiologic mängd retinsyra (RA) för att generera neurala stamceller (NPCs), som därefter differentierades till nervceller med neuralt induktionsmedium. För att undersöka effektiviteten i differentieringen, förutom traditionella RT-qPCR och immunofluorescens (IF) analyser, utförde vi RNA-seq och flöde cytometri. Dessa analyser ger omfattande mätning av utvecklingen av den stegspecifika differentieringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mESC-kultur
- Täck en 10 cm vävnadskulturbehandlad tallrik med 0,1% gelatin och låt gelatinet sättas i minst 15-30 minuter innan du aspirer ut det.
- Frö γ bestrålade mus embryonala fibroblaster (MEFs) en dag innan odling av mESC i det förvärmda mESC-mediet (Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) med 15% fetala nötkreaturserum (FBS), icke-essentiella aminosyror, β-mercaptoethanol, L-glutamin, penicillin/streptomycin, natrium pyruvat, LIF, PD0325901(PD032590).
- Låt de γ bestrålade MEF:erna sätta sig och fästas på plåtytan innan E14-celler odlas.
- Tina E14 ESCs i 37 °C vattenbad och överför snabbt cellerna i ett 15 cm koniskt rör med varmt mESC-medium. Pellet cellerna på 200 x g i 3 min och ta bort supernatanten.
- Resuspend cellerna i 10 ml mESC medium och plätera cellerna på odlingsplattan som innehåller γ bestrålade MEFs sådd tidigare. Inkubera cellkulturen i en 37 °C inkubator under 5% CO2.
- För odling passaging, aspirera e mediet och tvätta plattan med steril 1x PBS. Tillsätt tillräckligt med 0,05% trypsin för att täcka plåtytan och inkubera vid 37 °C i 3 min.
- Neutralisera trypsin med mESC medium och pipetten för att generera encellig suspension. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 minuter och ta bort supernatanten.
- Räkna cellerna med en hemocytometer eller cellräknare och frö ca 5,0 x 105 celler i en 10 cm odlingsplatta.
- Resuspend cellerna i 10 ml mESC medium, plätera cellerna på den gelatinbelagda vävnadsodlingsplattan och inkubera kulturer som beskrivits tidigare.
OBS: Det rekommenderas att mESCs passeras varannan dag för att förhindra att cellerna skiljer sig i sina kolonier. Fenolrött i mediet fungerar endast som en pH-indikator och beroende på cellulär densitet kan det bli gulaktigt (surare), tidigare än 2 dagar. Därför kan det vara nödvändigt att byta medium varje dag. De γ bestrålade GIF-filerna kommer så småningom att dö ut efter ett par passager.
2. EB,NPC och neurondifferentiering
- Utför kultur passaging protokoll som nämnts tidigare och räkna cellerna (steg 1.7–1.10).
- Hängande droppmetod(dag 0)
- För en 10 cm cellodlingsplatta, räkna ungefär 2,5 x 104 celler där 5,0 x 102 celler kommer att suspenderas i 20 μL differentieringsmedium (DMEM med 15% FBS, icke-essentiella aminosyror, β-mercaptoethanol, L-glutamin, penicillin/streptomycin och natriumpyveget). Ungefär femtio 20 μL droppar som innehåller cellerna kan pläteras på en 10 cm platta.
- Aliquot lämpligt antal celler, och centrifugera sedan cellerna vid 200 x g i 3 min och ta bort supernatanten.
- Återsuspend cellerna i lämplig volym differentieringsmedium för en celltäthet på 5,0 x 102 celler per 20 μL (t.ex. 2,5 x 104 celler i 1 ml differentieringsmedium).
- Använd en mikropipette eller en repeaterpipett och placera 20 μL droppar av cellupphängningen på locket på vävnadsodlingsplattan. Se till att dropparna inte är för nära varandra för att förhindra att de slås samman.
OBS: Dropparna kan pläteras på antingen en vävnadsodlingsbehandlad fästplatta eller upphängningsplatta eftersom de kommer att placeras på locket och inte själva plattan. För ett mer genomförbart och sterilt tillvägagångssätt, plätera dropparna på en vävnadsodlingsplatta och överför dem till en suspensionsplatta enligt beskrivningen nedan. - Fyll plattan med 5–10 ml 1x PBS och sätt försiktigt tillbaka locket på plattan. Inkubera kulturen i inkubatorn 37 °C.
OBS: PBS läggs till odlingsplattan för att förhindra att dropparna torkar ut.
- På dag 2, använd en mikropipette för att samla dropparna från locket och placera dem i en 10 cm cellkulturfjädringsplatta fylld med 10 ml differentieringsmedium. Inkubera kulturen på en orbital shaker som skakar med låg hastighet i inkubatorn.
- På dag 4, för att skörda EBs, samla cellerna, centrifugera vid 200 x g i 3 min och ta bort supernatanten.
OBS: EBs kan också tvättas med 1x PBS enligt kraven för efterföljande experiment. - För att fortsätta proceduren och inducera EB-differentiering i neurala stamceller (NPC), förbered differentieringsmediet med 5 μM retinsyra (RA).
- Ta bort det gamla mediet genom att pelletera EL-brickor på 100 x g i 3 minuter eller låt EBs sätta sig innan du aspirera ut det gamla mediet. Tillsätt 10 ml differentieringsmedium som innehåller 5 μM RA till odlingsplattan.
- På dag 6,ersätt minst hälften av mediet med färskt medium som innehåller 5 μM RA genom att luta plattan och pipettera ut mediet enligt beskrivningen ovan.
OBS: Det rekommenderas att minst hälften av mediet ersätts med färskt RA-innehållande medium dag 5 och 7. Notera fenol röd indikator; Om det blir gulaktigt är det bäst att byta ut hela mediet. - På dag 8, skörda NPCs genom att samla cellerna, centrifugera vid 200 x g i 3 min och ta bort supernatanten.
OBS: NPCs kan också tvättas med 1x PBS enligt behoven av efterföljande experiment. Vid behov kan nödlidande exponeringar frysas ner och tinas upp igen för senare kultur och analys. Om de ideella 2:erna ska odlas kan accutase också användas som ett alternativ till trypsin. - För att fortsätta proceduren och differentiera npcs i nervceller, samla npcs i ett 15 ml koniskt rör genom centrifugering, dissociera dem med trypsin och inkubera dem vid 37 °C i 3 min. Pipettera npc:erna för att säkerställa att alla NPC-aggregat är dissocierade och neutralisera trypsin med mediet.
- Filtrera cellerna med 40 μm nyloncellsil och räkna cellerna innan de pläterar dem med en densitet av 1,5 x 105/cm2 i N2-medium (DMEM/F12 medium + 3 mg/mL glukos + 3 mg/mL lipidrikt bovint serumalbumin (LBSA) + 1:100 N2 tillägg + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL eller på en vävnadskulturkammare för immunofluorescensexperiment.
- På dag 9, ersätt det gamla mediet med ett färskt N2-medium.
- På dag 10,byt N2 medium med N2 /B27 medium (50% DMEM/F12 och 50% neural basal, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 tillägg, 1:100 B27 tillägg, 50 U/mL penna/strep, och 1 mM L-glutamin).
- På dagarna 11-12, skörda nervcellerna enligt följande. Tvätta cellerna med 1x PBS, tillsätt trypsin och inkubera kulturen i 37 °C inkubatorn i 3 min innan du neutraliserar trypsin med medium och centrifug vid 200 x g i 3 min.
3. Karakterisering av mIC och differentierade celler
- Alkalisk fosfatas (AP) analys
- Använd ett kit för att bedöma alkalisk fosfatasaktivitet (se tabellen över material).
- Ta bort mediet från odlingsplattan och tvätta ESCs med 1x PBS.
- Tillsätt 1 ml fixlösning (består av formaldehyd och metanol) med satsen till plattan och inkubera den vid rumstemperatur i 2–5 min.
OBS: Överinkubation i fixlösningen kan äventyra AP-aktiviteten. - Ta bort fixlösningen, tvätta ESCs med 1x PBS och lämna en viss mängd PBS i plattan.
OBS: Håll ESCs fuktiga i PBS för att inte äventyra AP-aktiviteten. - Förbered AP-lösningen genom att blanda substratlösningarna A, B och C med förhållandet 1:1:1. Blanda A- och B-lösningarna först och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 2 min innan du tillsätter C-lösningen.
- Ta bort 1x PBS och lägg till AP-lösningen som förberetts tidigare.
- Inkubera ESCs i ca 15 min i mörkret genom att slå in odlingsplattan med aluminiumfolie eller utföra steg 3,5 i ett mörkt rum.
- Övervaka reaktionen och ta bort reaktionslösningen när lösningen blir ljus för att undvika icke-specifik färgning.
- Tvätta ESCs två gånger med 1x PBS.
- Förhindra att provet torkar genom att täcka ESC med 1x PBS eller monteringsmedium.
OBS: En röd eller lila fläck visas för AP-uttryck. Plattan kan förvaras i ett kylskåp på 4 °C.
- RT-qPCR
- Samla in celler i olika stadier genom att följa steg 1.6–1.7 respektive 2.4 för ESCs respektive EBs och NPCs.
- Isolera RNA med hjälp av RNA, DNA och proteinutvinningslösning (se Tabell över material).
- Generera cDNA med en omvänd transkriptassats (se tabellen över material) och följ tillverkarens handbok.
- Fixering och inbäddning
- Skörda EBs och NPC enligt beskrivningen ovan (steg 2.6) och fixera dem med 4% paraformaldehyd (PFA) lösning i 1x PBS i 30 min vid rumstemperatur.
- Ta bort PFA och tvätta provet med 1x PBS i 5 min.
- Placera provet i en seriell utspädning på 1x PBS, 10%-, 20% och 30%-sackaroslösningar vid 25\u201228 °C där provet överförs till nästa lösning efter 30 minuters inkubation.
OBS: Provet kan förvaras i 30% sackaroslösning vid 4 °C innan det fortsätter med inbäddningssteget. - Fukta pipettens spets med sackaroslösning innan du placerar provet (utan att stapla dem) i mitten av kryoformen och pipetten ut överskottsvätskan.
OBS: Filterpapper kan också användas för att ta bort överskottslösningen. Att väta pipettens spets med sackaroslösning är viktigt för att förhindra att EBs och NPC:er fastnar på spetsens väggar. - Tillsätt försiktigt optimal skärtemperaturlösning (OCT) till formen utan att återanvända proverna och ta bort överflödiga bubblor med en pipett.
- Placera formen med provet på en laboratorieblandare vid låg hastighet för att milt omröra provet i 15 minuter. Detta hjälper till att lösa EBs och NPC: er till botten om de återanvänds i OCT-lösningen.
- Frys snabbt provet genom att placera formen i flytande kväve eller på torris.
OBS: Proverna kan förvaras i en frys på -70 °C innan de fortsätter till nästa steg.
- Cryosectioning
- Ställ in kryostaten så att den svalnar till -20 till -18 °C innan provet överförs till instrumentet.
- Lossa det frusna OCT-blocket från formen och fäst det på hållaren med en liten OCT-lösning placerad på hållarens yta.
- Justera OCT-blocket så att EBs och NPC:er är närmast bladet för att säkerställa att provet inte går förlorat under sektionering.
- Lägg försiktigt ut 10 μm av blocket och var uppmärksam på de skivor som innehåller provet.
- Placera snabbt OCT-skivan som innehåller provet på den vävnadsinbäddande glasrutschbanan och låt OCT-skivorna lufttorka i 1 h vid rumstemperatur.
OBS: Proverna kan förvaras vid -70 °C för senare användning.
- Immunofluorescens (OM)
- Blockera OCT sektioner eller kulturkammare som innehåller nervceller i 10% normala åsne serum/0,1% Triton X-100 i 1x PBS för 1 h vid rumstemperatur.
- Inkubera proverna i primär antikropp utspädd i 5% normalt åsneserum/0, 05% Triton X-100 i 1x PBS över natten vid 4 °C.
- Tvätta prover i 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre gånger i 5 min varje tvätt.
- Inkubera proverna med sekundär antikropp utspädd i 5% normalt åsneserum/0, 05% Triton X-100 i 1x PBS i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta proverna i 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre gånger i 5 min varje tvätt och inkubera sedan proverna i 1 μg/ml DAPI.
- Montera proverna med ett täckslip och lite monteringsmedium och låt det torka.
- Observera proverna under ett fluorescensmikroskop.
- RNA-seq analys
- Samla cellerna i olika steg och utför RNA-extraktion (se steg 3.2).
- Förbered cDNA-biblioteken, utför djup sekvensering och dataanalys enligt protokollet som beskrivs i Wang et al.8.
- Utför analysen av Gene Ontology (GO) med R-paketet clusterProfiler.
- Flödescytometri
- Samla in ESCs genom att följa stegen 1.6–1.7 och återanvända cellerna i medium. Samla in EBs och NPC genom att följa steg 2.4 och återanvända cellerna i medium.
- Filtrera cellfjädringen med hjälp av 40 μm nyloncellsil till ett nytt koniskt rör på 15 ml.
- Mät GFP-signalen från proverna med hjälp av flödescytometern (utförd av institutionens kärnanläggning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en representation av vår metod utförde vi ett EB, NPC och neuron differentiering experiment på E14 celler. E14-celler odlades på γ bestrålade MEF(figur 1A) tills den γ bestrålade MEF-populationen utspädd. Vi bekräftade pluripotency av E14 celler genom att utföra alkaliska fosfatas (AP) färgning (figur 1B) och senare RT-qPCR (se nedan) för Nanog och Oct4 markörer. De γ bestrålade MEF-fria E14-cellerna inducerades sedan för differentiering med hjälp av protokollet i figur 2A. Kortfattat såddes differentieringsmediedroppar på 20 μL innehållande 500 celler på odlingsplattans lock (se protokoll avsnitt 2 för detaljer). De EBs som bildades samlades sedan in och placerades i suspension i nya differentieringsmedier. Från dag 4 till dag 8 av differentiering lades 5 μM RA till odlingsplattorna för att induceranpcs. På dag 8, NPCs skördades och trypsinized, och sedan den resulterande encelliga suspensionen pläterades i en vävnad kulturkammare i DMEM/F12 medium med N2 tillägg och senare i B27 tillägg. Dag 10 verkar npcs som skiljer sig till nervceller ha långsträckt cellform (figur 2B).
För att ytterligare utvärdera vårt differentieringsexperiment utförde vi immunofluorescensexperiment (IF) på E14 NPCs dag 8 och E14 nervceller på dag 12. Vi observerade positiva färgning för nestin i NPCs och neurofilament (NF) signal för nervceller(figur 3A). Alternativt bekräftade RT-qPCR och RNA-seq induktion av NPC-markörgener och förlust av pluripotensgener i NPC(figur 3B, D,F). Som en kvantitativ metod för att testa framgången för ESC-differentiering differentierade vi en mus ESC-linje som uttrycker en Sox1-promotordriven GFP-reporter9, följt av flödescytometrianalys på ESCs och NPCs. Vi fann att 58,7 % av de totala cellerna i NPC-stadiet är GFP-positiva medan GFP-signalen är 0,0 % i ESC-stadiet(figur 3C). För att profilera transkriptomiska förändringar under differentiering utfördes RNA-seq experiment för E14 ESCs, EB dag 3 och NPC dag 8 och avslöjade genkluster associerade med respektive stadier(figur 3D). Generna i RNA-seq värmekartan sorterades baserat på deras uttrycksnivåer för att identifiera differentiellt uttryckta gener i de olika stadierna under differentiering. Gene Ontology (GO) analys för de fyra genklustren visade att dessa kluster motsvarar distinkta cellulära funktioner eller vägar som indikerar att de tre cellstadierna i mESC neuronal differentiering var och en har en grupp gener som uttrycks mycket i deras respektive stadium men inte andra (figur 3E). Gener i kluster 3 uttrycks till exempel starkt i E14 NPCs jämfört med andra stadier och motsvarar vägar relaterade till neuronal utveckling. Kluster 1, 2 och 4 innehåller inte högt uttryckta gener relaterade till några specifikationer för könsceller, men de är relaterade till cellulär tillväxt och spridning. Således visade RNA-seq och åtföljande GO-analysen att E14-cellerna har differentierats till neuronal härstamning dag 8 av differentiering.
Figur 1: E14 ESC i kultur. ( A) Ljusmikroskopbilderna visar E14-celler (svart pil) som växer i kolonier ovanpå de γ bestrålade MEF: erna. E14 kolonier fortsätter att föröka sig sett i kolonistorleksskillnaden mellan dag 1 och dag 3 kulturer. b)Bekräftelse av pluripotensen hos E14 ESCs av alkaliska fosfatasfläcken (AP). Lila pilar anger mESCs som var positiva för AP fläck. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: E14 differentiering till EBs, NPCs och nervceller. (A) Schemat sammanfattar de viktigaste stegen för att differentiera E14-celler till EBs, NPC och nervceller. b)E14 ESC odlade i medium utan LIF och 2i i en suspensionsplatta bildar enskilda sfärer av EB som är synliga på dag 2 där de fortsätter att växa och expandera i storlek under de följande dagarna. RA läggs till dag 4 av differentiering för att inducera differentiering till NPC. Efter 4 dagars induktion pläteras dessa NPCs för differentiering till nervceller, som visas i bottenpanelen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Karakterisering av differentierade celler. (A) Immunofluorescensbilder i den övre panelen visar NPC-innehållande EBs på dag 8 som undersöks för nestin (grön) och kärnor (DAPI, blå). Den nedre panelen visar immunofluorescens bilder för nervceller på dag 12 undersökt för neurofilament (grön). Den röda rutan i de sammanfogade bilderna zoomas in 3x för bättre vy. b)RT-qPCR-analys som visar pluripotency markörer (Nanog och Oct4) och NPC markörer (Pax6, NeuroD1och Nes) av E14 ESCs och NPCs. Felstaplar är medelvärden ± SD. (C) E14 celler som uttrycker en Sox1 promotor-driven GFP-reporter differentierades i npcs. Både ESCs och NPCs på dag 8 kvantifierades för positiva GFP fluorescerande signal med flöde cytometry. (D) Värmekartan visar z-poängen för den fastställda FPKM av generna uttryckta i ESC-, EB- och NPC-stadierna. Fyra distinkta gen kluster identifierades betecknande grupper av gener som är differentiellt uttryckta i antingen ESC, EB eller NPC scenen. (E) GO-analysen utfördes med hjälp av R-paketet, clusterProfiler, på de fyra kluster som identifierades i RNA-seq. (F) Diagrammet visar FPKM-värdena för tre andra pluripotensmarkörer, Sox2, Klf4och Myc samt neurala markörer, NeuN, Map2och Tubb3 för E14-celler i ESC-, EB-dag 3- och NPC-dag 8-stadierna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden för neural differentiering av mus embryonala stamceller har fastställts i årtionden och forskare har fortsatt att modifiera de tidigare protokollen eller skapa nya för olika ändamål7,10,11. Vi använde en serie analyser för att omfattande analysera effektiviteten och framstegen av differentiering stadier av mESCs till nervceller, som kan användas i analys av andra härstamning differentiering av mus eller mänskliga ESCs. Dessutom har våra tillvägagångssätt visat sig vara användbara verktyg för att utvärdera effekten av specifika gener eller vägar på neuronal differentiering in vitro8.
Med våra metoder, pluripotenta oengagerade ESCs behandlas med retinsyra (RA) engagera sig i neural härstamning med hög effektivitet och induceras ytterligare för att generera nervceller7. För att förbättra den framgångsrika differentieringen av ES-celler till neurala celler och minska heterogeniteten är det viktigt att hålla ES-cellerna i ett odifferentierat tillstånd12. Icke-proliferativa MEF: er, behandlade med γ bestrålning eller mitomycin C, funktion för att upprätthålla ESCs pluripotens och ge en byggnadsställning för deras tillväxt13,14. För att få konsekventa resultat startar vi varje differentieringsexperiment med mESCs odlade på γ bestrålade MEF: er. Efter några passager dör de γ bestrålade MEF: erna ut och kulturen blir så småningom homogen för mESC-celler. Alternativt kan mESCs förplas på gelatin i ca 45 min innan γ bestrålade MEFs sås för att bättre ta bort dem vid nästa passage. Leukemi hämmande faktor (LIF) har länge använts för att upprätthålla pluripotency tillstånd av odlade mus ES celler genom att aktivera JAK / STAT utbildningsavsnitt15,16,17. Mer nyligen konstaterades PD0325901 (PD, en MEK-hämmare) och CHIR99021 (CH, en GSK-hämmare) ge ytterligare pluripotensunderhåll av ES-cellerna3,18. I vårt protokoll odlar vi mESCs med dessa hämmare tillsammans med LIF för att upprätthålla hög pluripotens hos mESCs.
En annan viktig faktor för att uppnå en framgångsrik differentiering är kvaliteten på EBs. Vi utför differentiering av E14-celler med hängande droppmetod, som har tillämpats av andra utredare5,19,20. Med denna metod får enstaka ES-celler suspenderas i differentieringsmediet droppe i 2 dagar där de spontant aggregerar och bildar EBs. De resulterande EBs är vanligtvis mer väldefinierade när det gäller deras morfologi(figur 2B) jämfört med metoden för att suspendera isolerade mBC i medium, vilket resulterar i EB-storlekar i ett mycket bredare intervall i vår erfarenhet (data visas inte). För att förhindra att EL-BS fästs på plattorna är det viktigt att göra en låghastighetsrotation från och med dag 3 och fortsätta genom differentieringsprocessen. EBs induceras att differentiera sig till npcs genom att behandla dem med RA. De resulterande NPCs från RA behandling vid EB dag 4 är vanligtvis heterogena för neurala celler såsom oligodendrocyter och astrocyter21. Med hjälp av RT-qPCR eller immunofluorescens kan NPC-populationen undersökas för neuron och andra neurala härstamningsmarkörer som Gfap för astrocyter och Olig2 för oligodendrocyter. För att ytterligare inducera differentiering av NPCs i nervceller, NPCs odlas i optimal neuron medium där de viktigaste komponenterna är N2 och B27 kosttillskott. N2 tillägg främst funktioner för att hjälpa NPCs att engagera sig i neuronal härstamning medan B27 tillägg funktioner för att upprätthålla livslängden av nervcellerna.
Proverna kan samlas in under differentieringsperioden (t.ex. ESC-steg, EB dag 2, EB dag 4, NPC dag 6, NPC dag 8, nervceller dag 10 och nervceller dag 12) för att spåra differentieringsprocessen genom att utföra RT-qPCR för pluripotens och ektoderm markörer. Om du jämför pluripotensmarkörerna som Oct4, Nanog, Sox2, Klf4och Myc mellan de olika cellstegen kommer det att verifiera mESCs pluripotens(figur 3B,F). För att undersöka effektiviteten hos neural differentiering, markörer för mesodermskiktet som Hand1, Snai1och Tbxt; och endoderm lager som Eomes och Gata4 kan också undersökas för (data visas inte). Ytterligare verifiering kan utföras med immunofluorescens (IF) sondering för NPC eller neuronala markörer(figur 3A). Dessa metoder är dock inte kvantitativa och partiska mot de valda markörerna. För att övervinna dessa begränsningar införlivar vi flödescytometri och RNA-seq-analyser (figur 3C\u2012F). Cellinjen som används i flödescytometriexperimentet är en Sox1-GFP E14-cellinje, som användes specifikt i detta experiment för att bedöma kvaliteten på NPC-differentieringsförfarandet. Sox1 är en av de tidigaste specifika neuronala markörer under neuroectoderm utveckling22 därmed gör det en utmärkt markör för NPC härstamning. Sox1 kan undersökas för att använda RT-qPCR eller Western blot för att utvärdera NPC-populationen. Dessa analyser är särskilt fördelaktiga för att undersöka differentieringsdefekten som orsakas av genmanipulation eller kemisk behandling.
Det är viktigt att notera att det finns några begränsningar i vårt protokoll som presenteras här. Först och främst presenterar vi bara den omfattande analysen för en mESC-cellinje av vild typ. Andra ESC-linjer som kommer från möss eller människor kan kräva ändringar och ytterligare optimering i protokollet för att säkerställa framgångsrik och effektiv neurondifferentiering. För det andra presenterar vi en in vitro neuron differentieringsmetod, som naturligtvis bär sin egen uppsättning begränsningar. Som nämnts tidigare behandlas EBs med en suprafysiologisk nivå av RA för att driva dem mot NPC-härstamningen. De resulterande NPC placeras sedan i neuron-optimala medier för att efterlikna de fysiologiska förhållandena och uppmuntra neuron härstamning engagemang, tillväxt och livslängd. Här, N2 och B27 kosttillskott används för att odla nervceller men andra kosttillskott finns också tillgängliga såsom NS2123 för liknande ändamål, vilket kan förändra framgången och effektiviteten av neuron differentiering. Dessa tillstånd rekonstitueras syntetiskt i cellodlingsanalyserna, som kanske inte helt representerar fysiologiska förhållanden. Kvaliteten på EBs, NPC och nervceller beror i hög grad på start mESCs. mESCs som har passagets för många gånger och hållits i kultur i mer än 1 vecka börjar vanligtvis förlora pluripotency och kanske inte framgångsrikt genomgår differentiering. Således är det viktigt att upprätthålla mESCs i ett optimalt skick för att säkerställa att de effektivt kan differentieras till EBs, NPCs och nervceller. Andra neuronkulturmetoder som 3D-modeller har också föreslagits för att bättre efterlikna fysiologiska förhållanden24,25,26 ibland på bekostnad av genomströmning och genomförbarhet27,28. Vi tror att våra protokoll är användbara för att karakterisera dessa 3D-kulturmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare förklarar att det inte finns några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (1R35GM133496-01) till Z. Gao. Vi vill tacka dr Ryan Hobbs för hjälpen med sektionsavsnittet. Vi tackar Penn State College of Medicine kärnanläggningar, inklusive genomvetenskap och bioinformatik, Advanced Light Microscopy Imaging och Flow Cytometry. Vi tackar också Dr. Yuka Imamura för hjälpen i RNA-seq-analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
