Summary
السكتة الدماغية هي قضية عالمية مع الحد الأدنى من خيارات العلاج وليس العلاج السريري الحالي لتجديد أنسجة الدماغ المفقودة. هنا نحن وصف طرق لخلق السكتة الدماغية الضوئية دقيقة في القشرة الحركية من القوارض والحقن اللاحقة من المواد الحيوية هيدروجيل لدراسة آثارها على تجديد الأنسجة بعد السكتة الدماغية.
Abstract
السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي للإعاقة والسبب الخامس للوفاة في الولايات المتحدة. ما يقرب من 87٪ من جميع السكتات الدماغية هي السكتات الدماغية وتعرف بأنها انسداد مفاجئ للوعاء توريد الدم إلى الدماغ. في غضون دقائق من الانسداد ، تبدأ الخلايا في الموت وتؤدي إلى تلف الأنسجة الذي لا يمكن إصلاحه. تركز العلاجات العلاجية الحالية على إزالة الجلطة أو التحلل للسماح بإعادة التروية ومنع تلف الدماغ الأكثر حدة. على الرغم من أن اللدونة الدماغية العابرة قد تنقذ بعض الأنسجة التالفة مع مرور الوقت ، إلا أن أجزاء كبيرة من المرضى تترك مع عجز عصبي لن يحل أبدا. هناك نقص في الخيارات العلاجية لعلاج العجز العصبي الناجم عن السكتة الدماغية، مؤكدا على الحاجة إلى وضع استراتيجيات جديدة لعلاج هذه الفئة المتزايدة من المرضى. ويجري حاليا تصميم المواد الحيوية القابلة للحقن لتعزيز للدونة الدماغ وتحسين إصلاح الذاتية من خلال تسليم العوامل النشطة أو الخلايا الجذعية. طريقة واحدة لاختبار هذه النهج هو الاستفادة من نموذج السكتة الدماغية القوارض، وحقن المواد الحيوية في جوهر السكتة الدماغية، وتقييم الإصلاح. معرفة الموقع الدقيق لجوهر السكتة الدماغية أمر حتمي للعلاج الدقيق بعد السكتة الدماغية، لذلك، فإن نموذج السكتة الدماغية الذي يؤدي إلى موقع السكتة الدماغية يمكن التنبؤ بها هو الأفضل لتجنب الحاجة إلى التصوير قبل الحقن. البروتوكول التالي سوف تغطي كيفية الحث على السكتة الدماغية الضوئية، وكيفية حقن هيدروجيل بطريقة تسيطر عليها ودقيقة، وكيفية استخراج والتبريد الدماغ مع الحفاظ على المواد الحيوية سليمة. بالإضافة إلى ذلك، سوف نسلط الضوء على كيفية استخدام هذه المواد الهيدروجيل نفسها للتسليم المشترك للخلايا الجذعية. يمكن تعميم هذا البروتوكول على استخدام المواد الحيوية الأخرى القابلة للحقن في قلب السكتة الدماغية.
Introduction
السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي للإعاقة والسبب الرئيسي الخامس للوفاة في الولايات المتحدة1. ما يقرب من 87٪ من جميع السكتات الدماغية، في حين أن غالبية 13٪ المتبقية هينزفية 2. تعرف السكتة الدماغية بأنها انسداد تدفق الدم في الشريان إلى الأنسجة المحيطة. ويؤدي هذا الانسداد إلى الحرمان من الأكسجين والنخر اللاحق الذي يؤدي في كثير من الأحيان إلى إعاقة دائمة لدى المرضى الباقين على قيد الحياة. في حين كان هناك انخفاض في معدل وفيات السكتة الدماغية3، من المتوقع أن يرتفع انتشاره إلى 3.4 مليون شخص بحلول عام 20304. وقد أدت هذه الزيادة في عدد الناجين المعوقين وما يترتب على ذلك من عبء اقتصادي إلى دفع البحوث السكتة الدماغية التي تركز على آليات الإصلاح العصبي. بعد السكتة الدماغية هناك فترة التهابية تؤدي إلى تكوين ندبة تمنع المنطقة النخرية من التوسع. المنطقة المحيطة بالنواة النخرية عبارة عن "شبه احتشاء" وهناك دليل قوي على أن اللدونة في هذه المنطقة ، والتي تشمل زيادة تولد الأوعية ، وتولد الأعصاب ، وتنتشر المحورية ، ترتبط مباشرة بالانتعاش الملحوظ في النماذج الحيوانية والبشر5. نظرا لعدم وجود نماذج في المختبر يمكنها تكرار التفاعلات المعقدة بشكل صحيح بعد السكتة الدماغية ، فإن النماذج الحيوانية ضرورية لأبحاث السكتة الدماغية.
هناك العديد من النماذج في الجسم الحي التي يمكن استخدامها لإنتاج السكتة الدماغية. واحدة من النماذج الأكثر شيوعا المستخدمة في الفئران هو انسداد الشريان الدماغي الأوسط، أو MCAo، من خلال انسداد البعيدة أو القريبة (عن طريق خيوط داخل الشرايين). النموذج القريب، المعروف أيضا باسم خيوط MCAo (fMCAo)، وعادة ما يؤدي إلى السكتات الدماغية الكبيرة التي تشمل في أي مكان من 5٪ إلى 50٪ من نصف الكرة الدماغي، اعتمادا على عدد من العوامل6. في هذه النماذج، يتم التقدم خياطة أو خيوط من الشريان السباتي الداخلي إلى قاعدة الشريان الدماغي الأوسط (MCA) وأبقى في مكان لفترة محددة من الزمن. هذه الطريقة للانسداد، والتي يمكن أن تكون مؤقتة أو دائمة، وتنتج احتشاء التي تتركز في المخطط، وربما أو قد لا تنطوي على القشرة المفرطة6. حجم السكتة الدماغية الناتجة متغير للغاية ، وتقنيات التصوير ، مثل دوبلر الليزر ، مطلوبة لتأكيد فعالية الإجراء في كل فأر. ينتج انسداد خيوط داخل الشرايين أو داخل الإنارة يستمر لأكثر من 30 دقيقة ضربات في الطرف الأكبر من نطاق الحجم. وقد ركز بعض المحققين على أقصر خيوط انسداد مرات, التي تتطلب التركيز التجريبي كبيرة والتحقق من صحة المختبر7. تتبع نماذج خيوط MCAo في الفئران مراحل مماثلة من موت الخلايا ، والتقدم الإقفاري ، وتشكيل منطقة شبه احتشائية كما رأينا في حالات السكتة الدماغية البشرية ؛ ومع ذلك ، فإن السكتات الدماغية الأكبر تشبه إلى حد كبير حالة المرض من احتشاءات الدماغ الخبيثة ، والتي هي أقل شيوعا ، والسكتات الدماغية البشرية أقل قابلية للعلاج6. وفي الوقت نفسه، يتطلب انسداد MCA البعيدة جراحة أكثر مشاركة واستئصال القحف. في هذا النموذج، يتم انسداد الجزء القاصي من MCA الذي يمتد على طول سطح الدماغ مباشرة بربطة عنق خياطة أو الكي. في بعض الاختلافات في هذه التقنية ، يتم انسداد الشرايين السباتية من جانب واحد أو ثنائي عابر. فائدة MCAo البعيدة هو أنه ينتج السكتة الدماغية القائمة على القشرية التي هي أقل متغير في الحجم من نموذج خيوط. ومع ذلك ، فإن النموذج القاصي ينتج ناتجا سلوكيا أقل بسبب تحويل الشريان السباتي الخارجي (ECA) ، وهو أيضا مصدر قلق مع fMCAo6.
نموذج السكتة الدماغية البديلة التي تشتهر بأنها أقل الغازية هو نموذج photothrombotic (PT). ينتج عن نموذج PT موقع محدد جيدا من نقص التروية ويرتبط بمعدل بقاء مرتفع8. تعتمد هذه التقنية على صبغة حساسة للضوء يتم حقنها بشكل غير مرغوب فيه تسمح بأكسدة الصور داخل الأوعية الدموية ببساطة عن طريق تشعيع الأنسجة المطلوبة بضوء أو ليزر9. عند الإثارة ، تتشكل راديكاليات الأكسجين التي تسبب تلفا بطانة الرحم ، مما ينشط تجميع الصفائح الدموية وتكوين الجلطة في المنطقة المشععة8،9. الرقابة المشددة على حجم السكتة الدماغية وموقعها ، فضلا عن إعادة إنتاج عالية من نموذج PT ، يجعلها مثالية لدراسة المواد الحيوية. في حين يتم إجراء الدقة ممكن باستخدام الليزر والإحداثيات ستيريوتاكسيك، وهناك بعض العيوب التي قد تجعل هذا النموذج أقل مثالية لعدد قليل من الدراسات. على عكس نموذج fMCAo، لا يمكن إعادة عرض نموذج السكتة الدماغية PT. ولذلك، فإن المواد اللازمة للتحقيق في عوامل الحماية العصبية محددة للأضرار بعد إعادة التروية أو الآليات التالية إعادة التروية لن تكون مفيدة هنا8. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لإهانة الأوعية الدموية الدقيقة من نموذج PT، وينظر إلى البنومبرا الإقفارية صغيرة نسبيا. بدلا من ذلك ، تحدث وذمة الأوعية الدموية المحلية ، وهو أمر غير معهود للسكتة الدماغية البشرية ، مما يجعل هذا النموذج غير مرغوب فيه لدراسات الأدوية قبل السريرية التي تركز على منطقة المحيط بالحجرة6،8.
الهدف العام لاستراتيجيات المواد الحيوية في السكتة الدماغية هو إما تقديم عوامل نشطة بيولوجيا أو العمل كمصفوفة بديلة خارج الخلية لنمو أنسجة الدماغ. استراتيجية واحدة أننا سوف استكشاف باستخدام أساليبنا هو تقديم هيدروجيل مباشرة في جوهر السكتة الدماغية، بدلا من الأنسجة المحيطة بها حيث يتم تسليم العديد من العلاجات الخلية الحالية10. الأساس المنطقي لهذا النهج هو أن التسليم إلى الأنسجة النخرية الموجودة في اللب سيتجنب تعطيل الأنسجة السليمة أو المتعافية المحيطة. نفترض أن نشر أي عوامل نشطة مدرجة داخل المادة الحيوية سيكون قادرا على الوصول إلى شبه العصى من اللب ، خاصة وأننا نجد أن تسليم المواد الحيوية الهيدروجيل يقلل من سمك الندبةالدبقية 11. وهذا أمر مهم منذ أن ثبت أن منطقة المحيط بالحجرة تظهر مرونة عصبية بعد السكتة الدماغية ، مما يجعلها هدفا جذابا. وعلاوة على ذلك، يمكن تحميل تسليم مصفوفة بديلة إلى قلب السكتة الدماغية مع12 الأوعية أوالعصبية 13 عاملا لتوجيه تشكيل الأنسجة الجديدة، فضلا عن الخلايا لتسليم14. يتم تعزيز تسليم الخلية بشكل كبير باستخدام مصفوفة لأنه يحمي الخلايا من قوى الحقن القاسية والبيئة المحلية الموجودة أثناء الولادة ، وكذلك يشجع على التمايز والغراية15.
هذه المواد الحيوية العلاجية عن طريق الحقن لها أهمية سريرية في تطبيقات السكتة الدماغية، كما لا توجد حاليا العلاجات الطبية التي تحفز انتعاش الخلايا العصبية بعد السكتة الدماغية. الدوائر العصبية الكامنة المشاركة في الانتعاش تكمن في أنسجة الدماغ التي هي المتاخمة لجوهر السكتة الدماغية16, في حين أن جوهر السكتة الدماغية نفسها خالية من الأنسجة العصبية قابلة للحياة. نتوقع أن تسليم مادة بيولوجية في قلب السكتة الدماغية النخرية لديه القدرة على تحفيز الأنسجة المجاورة نحو العمليات التجديدية من خلال عدد من الآليات المذكورة سابقا، بما في ذلك إطلاق مستودع عوامل النمو13،وتحفيز الأنسجة في النمو وتعزيز استعادة نمو أنسجة الدماغ11،12،تغيير الاستجابات المناعية17،وتقديم العلاجات المشتقة من الخلايا الجذعية14، 18. ومع ذلك ، لدراسة فعالية إمكانية هذه التطبيقات ، هناك حاجة إلى طريقة متسقة وقابلة للاستنساخ لتحفيز السكتة الدماغية وحقن المواد الحيوية. يستخدم نموذج السكتة الدماغية PT التقنيات التي توفر تحكما دقيقا في اتجاه السكتة الدماغية وموقعها. ليزر تعلق على توجيهات جهاز ستيريوتاكسيك، ومضخات تعلق على الأجهزة ستيريوتاكيك التحكم في معدل حقن المواد دون الحاجة إلى أشكال إضافية من التصوير. لذلك ، اخترنا وصف طرق إجراء السكتة الدماغية PT في القشرة الحركية للفئران وحقن المواد الحيوية في جوهر السكتة الدماغية. هنا، نستخدم الجسيمات الصلبة المجهرية (MAP) الهيدروجيلات كمالحيوية للحقن مع عدم وجود خلايا إضافية أو عوامل النمو. بالإضافة إلى ذلك، نشرح كيفية استرداد الدماغ بنجاح مع المواد الحيوية سليمة، ونحن نناقش المقايسات الكيمياء المناعية المستخدمة لتحليل نتائج السكتة الدماغية مع وبدون حقن المواد الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب وفقا ل IUCAC في جامعة ديوك وجامعة كاليفورنيا في لوس انجليس. تم استخدام الفئران الذكور C57Bl/6J البالغ من العمر 8 إلى 12 أسبوعا في هذه الدراسة. تم إيواء الحيوانات تحت درجة حرارة خاضعة للرقابة (22 ± 2 درجة مئوية) ، مع فترة دورة خفيفة داكنة مدتها 12 ساعة والوصول إلى الطعام والماء الكريات libitum الإعلانية. توصف بروتوكولات التسكين والتخدير بأنها معتمدة من قبل IUCAC ولكنها قد تختلف عن البروتوكولات المستخدمة في مختبرات أخرى.
قد يتم قتل الحيوانات قبل الأوان إذا كانت تعاني من الأرق المفرط ، والغناء (مما يشير إلى ألم لا يمكن السيطرة عليه) ، والصدمات الذاتية ، وانخفاض أو ضعف الحركة ، والعلامات الجسدية للعدوى الجلدية ، وفقدان الشهية و / أو فقدان الوزن أكثر من 10 ٪ - 15 ٪ نتيجة لجراحة البقاء على قيد الحياة. لا توجد آثار سلبية متوقعة من حقن الجل ، لأنه يتكون من بوليمر يحدث بشكل طبيعي داخل الدماغ. يجب مراقبة الحيوانات يوميا، بما في ذلك عطلات نهاية الأسبوع والعطلات، وإعادة ويجتها كل يومين. وقد وجدت الدراسات من مختبرنا وغيرها 'أي عجز في الاستمالة, فقدان وزن الجسم أو علامات / أعراض الانسحاب أو الإجهاد المزمن في الفئران بعد هذه السكتات الدماغية القشرية الصغيرة أو تحت القشرية. إذا كانت الحيوانات تظهر أي علامات على عدوى جرح الرأس المحلية ينبغي قتلها بالرصاص. كما يجب مراقبة الحيوانات لسوء الاستمالة، وحالة الجرح، والأدلة على القتال بين الحيوانات (جروح الظهر). إذا كان هناك دليل على القتال أو تأليه الجرح ، يجب أولا علاج الحيوانات بعد الاتصال بالأطباء البيطريين. وهذا غالبا ما ينطوي على المضادات الحيوية في الماء و / أو تطبيق المضادات الحيوية الموضعية المحلية. إذا فشلت هذه التدابير في إنتاج الشفاء ، يجب أن يتم تخريج الحيوانات.
1. إعداد المواد والأدوات
- إعداد صبغة فوتوثروثي قبل الجراحة. تزن 15 ملغ من روز البنغال في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 2 مل.
تحذير: روز البنغال يمكن أن يسبب تلف العين خطيرة / تهيج.- حل روز البنغال في 1.5 مل من عقيمة تصفية 1x برنامج تلفزيوني لجعل تركيز العمل من 10 ملغم / مل.
- دوامة الأنبوب حتى لا كتل مرئية، مما يدل على صبغ قد حلت تماما، ثم تغطية في احباط حتى مزيد من الاستخدام.
ملاحظة: كمية الصبغة المطلوبة تعتمد على عدد الفئران. يتم حقن الصبغة IP intraperitoneally بتركيز 10 ميكرولتر / غرام ، على سبيل المثال ، 200 ميكرولتر لفأر 20 غرام.
- قم بتشغيل لوحة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس أثناء التخدير (37 درجة مئوية).
- إعداد مقص autoclaved، ملقط، القطن، مرهم العين البيطري، الغراء الجراحية، أو مواد خياطة، علامة جراحية زرقاء أو سوداء، والكحول المعقمة ومناديل اليود بيتا. إعداد العظام الحفر مع رؤساء بت الحفر المعقمة.
- بدوره على تعقيم حبة إلى 160 درجة مئوية للسماح لتعقيم الأدوات بين جراحة الفئران. خصص أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل من محلول ملحي معقم أو محلول PBS 1x للاستخدام لاحقا في الحفاظ على منطقة عملية رطبة.
- إرفاق الليزر إلى جهاز ستيريوتاكسيك. ارتداء نظارات السلامة بالليزر، وقياس قوة الليزر (mW).
تنبيه: استخدم نظارات السلامة بالليزر كلما تم تشغيل الليزر في الإجراء.- ضبط التيار على وحدة التحكم بالليزر، باتباع تعليمات تصنيع الليزر، حتى يقرأ إخراج الطاقة بالليزر 10 كيلوواط، وتعيين التيار كوحدة تحكم مسبقة على الشاشة الرئيسية. ثم ضبط التيار مرة أخرى لإنشاء آخر قبل تعيين حيث قوة الانتاج الليزر يقرأ 40 كيلوواط. الآن إيقاف تشغيل الليزر حتى مزيد من الاستخدام.
ملاحظة: سيتم استخدام 10 كيلوواط لتوجيه الليزر قبل الاستخدام.
- ضبط التيار على وحدة التحكم بالليزر، باتباع تعليمات تصنيع الليزر، حتى يقرأ إخراج الطاقة بالليزر 10 كيلوواط، وتعيين التيار كوحدة تحكم مسبقة على الشاشة الرئيسية. ثم ضبط التيار مرة أخرى لإنشاء آخر قبل تعيين حيث قوة الانتاج الليزر يقرأ 40 كيلوواط. الآن إيقاف تشغيل الليزر حتى مزيد من الاستخدام.
- إعداد قفص نظيف للفئران بعد الجراحة. ثم ضع الماوس في غرفة التعريفي بتركيز isoflurane من 4٪ لتخديره حتى تتوقف الحركة العفوية ويأتي تنفسها إلى معدل بطيء وثابت.
- مرة واحدة نائما، تزن الماوس لتحديد كم روز البنغال صبغ لحقن. ثم نقل وتأمين الماوس إلى جهاز ستيريوتاكسيك مع تركيز isoflurane الصيانة من 1.5٪.
ملاحظة: زيادة تركيزات الأيزوفلوران يمكن أن توسع الأوعية وتمنع انسداد كافية أو السكتات الدماغية الحجم باستمرار بين الفئران. - تطبيق مرهم العين البيطري على كلتا العينين.
ملاحظة: مشاهدة التنفس ودرجة الحرارة طوال العملية وقرصة أصابع في بعض الأحيان للتأكد من أن الماوس لا يمكن أن يشعر أي شيء.
2. نموذج السكتة الدماغية الضوئية9
- حلق الفراء قبالة رأس الماوس وإعداد المنطقة بشكل مطهر باستخدام مسح الكحول تليها مسح اليود بيتا. كرر ثلاث مرات.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم مسح الكحول إضافية في نهاية لتنظيف جميع اليود بيتا لأنه يسبب تهيج الجلد مما يؤدي الفئران إلى حكة جمجمتهم بعد الجراحة. - باستخدام مقص عملية صغيرة، وجعل شق الجانبي بين الأذنين إلى العينين، حوالي 1-2 سم. القيام بذلك عن طريق سحب الجلد إلى أعلى مع ملقط لإنشاء خيمة، وقطع مرة واحدة إلى أسفل، ثم إدراج مقص في الافتتاح وخلق شق خط الوسط المستمر.
- فصل الجلد واضغط بخفة على العظام الجدارية مع ملقط لتحديد موقع bregma. وضع علامة على bregma مع نقطة باستخدام علامة الجراحية.
ملاحظة: حركة جزء العظام يسلط الضوء على الحدود الأمامية للعظام الجدارية. و bregma هو نقطة الوسط التي الأمامية وشظايا العظام الجدارية تلبية (الشكل 1A). - ارتداء نظارات السلامة بالليزر، وتحريك الليزر على جمجمة الماوس، وتحديد الجهاز ستيريوتاكسيك بزاوية 90 درجة. حدد مجموعة 10 كيلوواط مسبقا ثم قم بتشغيل الليزر.
- ضبط الليزر x- و ص محور حتى يكون مباشرة على bregma. أعد تعيين x و y على وحدة التحكم بالشاشة الرقمية، ثم حرك الليزر 1.8 مم إلى اليسار من البريغما. الآن أحضر الليزر إلى أقرب ما يمكن إلى الجمجمة دون السماح لها بلمس الجمجمة.
- نقل الليزر إلى 2.2 ملم اليسار من bregma لضمان أنه يمكن أن تتحرك دون أي عوائق. أطفئ الليزر
- حقن الكمية المناسبة من صبغة روز البنغال intraperitoneally (IP) باستخدام إبرة 29 G المتاح. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت فورا لمدة 7 دقائق للسماح صبغ تعميم نظاميا. حدد المجموعة المسبقة ل 40 كيلوواط دون تشغيل الليزر.
ملاحظة: مرة واحدة مريحة مع الإجراء، يمكن حقن الصبغة قبل إعداد مطهر من الماوس وانتهت قبل 7 دقائق قد انتهت لتوفير الوقت. - قم بتشغيل الليزر (40 كيلوواط) عندما ينطلق المؤقت الذي يعمل ب 7 دقائق، بينما يرتدي نظارات واقية للسلامة بالليزر، وحدد مؤقت 10 دقائق.
- بعد 10 دقائق، نقل الليزر إلى 2.2 ملم اليسار من bregma دون إيقاف تشغيله، وتعيين آخر 10 دقيقة الموقت.
- مرة واحدة في الثانية 10 دقيقة الموقت قد انفجرت، تغيير الليزر مرة أخرى إلى 10 كيلوواط ونقل الليزر إلى 2.0 ملم اليسار من bregma. ضع علامة على هذه البقعة مع علامة الجراحة. ثم إيقاف الليزر.
- ارفع الليزر وافتحه من زاوية 90 درجة بحيث يمكن نقله بعيدا عن الماوس. عند هذه النقطة، وتطبيق المالحة العقيمة أو برنامج تلفزيوني مع القطن إذا كانت المنطقة الجراحية جافة.
- حفر في رشقات نارية صغيرة في علامة 2.0 ملم عمودي على سطح الجمجمة.
ملاحظة: كن حذرا لحفر ببطء لتجنب الحفر بعمق كبير جدا وضرب الدماغ. سيكون هناك انخفاض طفيف / تغيير في المقاومة بمجرد أن يمر الحفر من خلال الجمجمة ، والحفر قد يسبب النزيف.- استخدام القطن لامتصاص أي فائض في الدم. ومن المعتاد أن نرى بعض الدم من الشرايين التي سرقت في الجمجمة بعد الحفر – الدم المفرط يعني بت الحفر ضرب الدماغ. إذا حدث هذا، تسجيل معرف الماوس، والمضي قدما.
- ضع مسحة صغيرة بجوار الماوس. باستخدام ملقط، سحب الجلد قريبة من بعضها البعض للتحضير للصق.
ملاحظة: يمكن إجراء خياطة هنا بدلا من ذلك. خياطة يتطلب عادة فقط 3 خياطة.- باستخدام ملقط، والاستيلاء على الجانبين من الجلد وسحبها معا وصعودا. الداب قبالة أي قطرات كبيرة من الغراء الجراحية في نهاية تلميح على مسح قبل تطبيقها على الماوس.
- تطبيق الغراء الجراحية لماما وعقد الجلد جنبا إلى جنب مع ملقط لمدة 10 ق. استمر حتى لا توجد فتحات مرئية.
ملاحظة: الغراء يخرج بسرعة - لا تضغط على زجاجة. تجنب لصق الجلد على الجمجمة أو الحصول على الغراء في العين.
- بعد الإلتصاق، أو خياطة، ضع الماوس في القفص الجديد للتعافي من التخدير. يستغرق 5-10 دقيقة للحيوان لاسترداد، وأنه يساعد على بقية نصف القفص على وسادة التدفئة.
3. عملية السكتة الدماغية الشام
- إجراء جميع الإجراءات مطابقة للعملية المذكورة أعلاه في القسم 2 باستثناء حقن 1x PBS أو المالحة بدلا من صبغة روز البنغال.
4. حقن الهيدروجيل أو المواد الحيوية الأخرى
- إجراء حقن المواد الحيوية في وقت محدد من قبل المستخدم. في هذه التجربة تم إجراء الحقن بين 5-و 7 أيام بعد السكتة الدماغية. 2 - 6 ميكرولتر من الهيدروجيل يتم حقنها (معرفة من قبل المستخدم).
- قم بتشغيل لوحة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس أثناء التخدير (37 درجة مئوية).
- إعداد مقص autoclaved، ملقط، القطن، مرهم العين البيطرية، الغراء الجراحية أو مواد خياطة، والكحول المعقمة ومناديل اليود بيتا. إعداد الحفر العظام مع رؤساء بت الحفر العقيمة و25 ميكروغرام الزجاج هاملتون المحاقن مع الإبر المعدنية 30 G.
- بدوره على تعقيم حبة إلى 160 درجة مئوية للسماح لتعقيم الأدوات بين الفئران.
- إرفاق مضخات الحقن إلى الجهاز ستيريوتاكسيك. تعيين معدل التدفق إلى 1 ميكرولتر/دقيقة وتعيين الحجم إلى 4 ميكرولتر.
- إعداد قفص نظيف للفئران بعد الجراحة.
- ضع الماوس في غرفة التعريفي مع تركيز isoflurane من 4٪ لتخديره حتى تتوقف الحركة العفوية والتنفس يأتي إلى معدل بطيء وثابت.
- مرة واحدة نائما، ونقل وتأمين الماوس إلى جهاز ستيريوتاكسيك مع تركيز isoflurane الصيانة من 1.5٪.
- تطبيق مرهم العين البيطري على كلتا العينين.
- حلق أي الفراء التي قد نمت من رأس الماوس، وإعداد المنطقة بشكل مطهر باستخدام مسح الكحول تليها مسح اليود بيتا. كرر ثلاث مرات.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم مسح الكحول إضافية في نهاية لتنظيف جميع اليود بيتا لأنه يسبب تهيج الجلد ويؤدي الفئران إلى حكة جمجمتهم بعد الجراحة.
- باستخدام مقص صغير و / أو ملقط، إعادة فتح الجلد فوق الدماغ. استخدام القطن مع المالحة المعقمة أو برنامج تلفزيوني لتنظيف أي حطام من الجمجمة. دائرة بيضاء صفراء (السكتة الدماغية، الشكل 1B)وثقب التجشؤ من الحفر ستكون مرئية. إذا لم يكن النسيج الميت مرئيا ، فمن المرجح أنه لم تحدث أي سكتة دماغية. إذا لم يتم توسيط ثقب التجشؤ فوق السكتة الدماغية، إعادة حفر لمركزه.
- توجيه مضخة الحقن فوق الماوس وقفل في 90 درجة. تنظيف المحاقن مع محلول ملحي معقم أو محلول PBS قبل تحميل المواد.
- مرة واحدة نظيفة، تفكيك حقنة الزجاج بحيث لا يوجد إبرة. تحميل الحقنة باستخدام ماصة إزاحة موجبة 25 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر من الهيدروجيل (أو غيرها من المواد الحيوية هنا مع أو بدون خلايا).
- باستخدام المكبس حقنة، ودفع هلام على طول الطريق إلى الجزء الأمامي من الحقنة. ثم، إعادة تجميع الحقنة ومواصلة دفع حتى هلام ينضح بشكل واضح من الإبرة.
- ضع الحقنة على المضخة. قد تحتاج الجزء الخلفي من المضخة إلى تعديل بحيث تناسبها الحقنة. قم بذلك عن طريق ضبط معدل التدفق إلى 30 ميكرولتر/دقيقة، وحدد السحب أو الحقن وفقا للاتجاه الذي تحتاج إليه للتحرك، ثم اضغط على ابدأ. ضرب توقف عندما الجزء الخلفي من المضخة في الموقع الصحيح.
- المسمار الجزء الخلفي من المضخة حتى حقنة آمنة. إذا تم إجراء تعديلات مسبقا، تأكد من تعيين معدل التدفق مرة أخرى إلى 1 ميكرولتر/دقيقة ويتم تعيينه للحقن.
- تحريك المضخة في اتجاه س و ص لتوجيهه عبر الحفرة. تحريك المضخة إلى أسفل في الاتجاه z حتى الإبرة من المحقنة يمس الجزء العلوي من الحفرة.
- إعادة تعيين z على وحدة التحكم العرض الرقمية. ثم، نقل الحقنة إلى أسفل في الاتجاه z 0.750 مم. إذا انحنت الحقنة أو كانت هناك مقاومة ، فإن الجمجمة إما شفيت أو لم يتم حفرها بالكامل وتحتاج إلى إعادة حفرها.
- اضغط على بدء تشغيل على وحدة ضخ لحقن 4 - 6 ميكرولتر من الهيدروجيل بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة.
- تعيين جهاز توقيت 5 دقائق عندما تتوقف المضخة عن الحقن للسماح للجل لبدء الربط المتبادل.
- بعد 5 دقائق، سحب ببطء حتى المحقنة عن طريق تحويل ز نوس. مشاهدة لمعرفة ما إذا كان يتم سحب أي مادة عن طريق الخطأ أو تسرب من الحفرة. فتح المضخة ونقله بعيدا عن الماوس عندما الإبرة بعيدة بما فيه الكفاية بعيدا عن الجمجمة.
- باستخدام ملقط، الغراء الجراحية، أو الغرز، وإغلاق الجلد فوق الرأس. ضع الماوس في القفص النظيف ولاحظ تعافيه. يجب أن يستغرق حوالي 5 - 10 دقيقة للفأر للتعافي من التخدير.
5. التغلغل وجمع العينات
- تخدير الماوس باستخدام ايزوفلوران.
- إصلاح الحيوان في موقف سوبين وفتح تجويف البطن مع خفض متوسط. اختياريا، المشبك الشريان الأورطي البطن تنازلي لاستخدام أقل مثبتة وبرنامج تلفزيوني.
- قطع فتح الحجاب الحاجز والتحرك حتى الجانبين من القفص الصدري لفتح تجويف الصدر. أدخل قنية تغلغل في البطين الأيسر وقطع فتحة في الأذين الأيمن. تبدأ في perfuse ببطء مع 10-20 مل من برنامج تلفزيوني أو حتى السائل يعمل شبه واضحة.
- مرة واحدة واضحة، والتحول إلى 4٪ PFA لآخر 10 - 20 مل. فك الأسلحة يسمح لهم بالانكماش كما يبث PFA. بمجرد أن يتوقفوا عن الحركة، انتظروا 30 ثانية أخرى.
- قطع رأس الحيوان وسحب الجلد لكشف الجمجمة. باستخدام ملقط حاد ورقيق ، قم بإزالة أجزاء الجمجمة بعناية لفضح الدماغ. يجب توخي الحذر عند إزالة الجمجمة فوق موقع السكتة الدماغية. يمكن استخدام مقص جراحي صغير هنا للمساعدة في قطع الجمجمة. التحدي الأكبر هو هلام تتعثر في الجمجمة والخروج من الدماغ كما تتم إزالة الجمجمة.
- مرة واحدة يتم فصل الدماغ, مكان في 10 – 15 مل من 4٪ PFA بين عشية وضحاها (لا يزيد عن 24 ح).
- نقل الأدمغة من PFA إلى السكروز 30٪ في اليوم التالي. الدماغ جاهز لهذه الصرخة بمجرد أن يغرق إلى أسفل (حوالي 2 - 3 أيام). ويمكن أيضا أن تترك للتخزين في هذه المرحلة.
6. Cryosectioning وتلطيخ
- أخرج الدماغ من السكروز وضعيه على شريحة زجاجية. قطع جزء صغير من الجزء الخلفي من الدماغ قبالة مع شفرة حلاقة لإنشاء جزء مسطح ليتم تركيبها على تشاك.
- وضع dollop من مركب درجة الحرارة قطع الأمثل (أكتوبر) على تشاك، ومن ثم وضع الدماغ، الجانب المسطح إلى أسفل، على تشاك في أكتوبر.
ملاحظة: يمكن إضافة OCT لتشمل الدماغ بالكامل للمساعدة في منع المواد من الانفصال عن الدماغ أثناء المقطع.
- وضع dollop من مركب درجة الحرارة قطع الأمثل (أكتوبر) على تشاك، ومن ثم وضع الدماغ، الجانب المسطح إلى أسفل، على تشاك في أكتوبر.
- قطع العقول بشكل متسلسل على cryostat في -20 درجة مئوية في 30 ميكرومتر أقسام سميكة عبر 10 شرائح الجيلاتين المغلفة. الحرص عند تقسيم ضمان عدم فقدان الهيدروجيل. إذا كان هذا الجزء من الصعب، ووضع بعض أكتوبر على الجزء العلوي من الدماغ على هلام(الشكل 3). يخزن عند -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامه مرة أخرى.
- أخرج الشرائح من -80 درجة مئوية وضعها على صينية تلطيخ للسماح لها بالجفاف. الشرائح التي لم يتم تجميدها ولكن فقط مقطعة يمكن أيضا أن تكون ملطخة على الفور.
- باستخدام قلم كاره للماء، ارسم دائرة حول شرائح الدماغ على الشريحة. مرة واحدة جافة، إعادة ترطيب شرائح الدماغ مع 1x PBS تصفيتها ووضعها على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. هذا يستغرق حوالي 1 مل من العازلة لكل شريحة مع 9 - 12 أقسام الدماغ.
- غسل الشرائح مع 1x PBS تصفيتها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، كرر ثلاث مرات.
- كتلة الشرائح لمدة 30 دقيقة إلى ساعة مع مصل حمار 10٪ في 0.01٪ PBS-Triton X في درجة حرارة الغرفة على راقصة البطن. يستغرق هذا حوالي 200 ميكرولتر لكل شريحة.
- احتضان الأجسام المضادة الأولية في مصل حمار 10٪ مع 0.01٪ PBS-Triton X بين عشية وضحاها في 4°C على شاكر. اختبار الأجسام المضادة الأولية أولا لتحديد تركيزات الصحيح. هنا GFAP (1:400) ، Iba1 (1:250) ، Glut1 (1:500) (الشكل 4) استخدمت.
- غسل الشرائح مع 1x PBS تصفيتها في اليوم التالي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، كرر ثلاث مرات.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية في مصل حمار 10٪ في 0.01٪ PBS-تريتون X وDAPI لمدة 2 ساعة على شاكر المختبر في درجة حرارة الغرفة. 1:1,000 تم استخدامه لجميع الثواني وDAPI.
- غسل الشرائح لمدة 5 دقائق مع 1x PBS تصفيتها.
- السماح للأقسام بالجفاف في درجة حرارة الغرفة في الظلام. هذا يمكن أن يستغرق 20 دقيقة إلى 4 ساعة; وضع الشرائح في desiccator يمكن تسريع العملية.
- الشرائح المجففة في تركيزات تصاعدية من الكحول (1 دقيقة لكل محلول) من 50٪، 70٪، 95٪، 100٪، و 100٪.
- إزالة الدهون في الحمام الأول من الزيلين لمدة 1 دقيقة، ثم حمام الثاني من الزيلين لمدة 5 دقائق.
- بسرعة تأخذ الشرائح من واحد تلو الآخر وإضافة تصاعد المتوسطة في حين أن أقسام الدماغ مبللة مع xylene. إضافة بسرعة غطاء زجاجي على القمة. استخدم زلة غطاء ذات طول وسمك صحيحين مطلوبين للشريحة والمجهر المستخدم للتصوير، على التوالي.
- تخلص من أي فقاعات تحت غطاء الغطاء بالضغط برفق مع طرف ماصة في حركة خارجية من وسط الشريحة. السماح DPX لتجف لمدة 4 ساعات إلى بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام شفرة حلاقة لكشط قبالة أي وسيلة تصاعد المجففة التي تسربت على الشرائح. امسح الشرائح باستخدام منظف العدسة. يمكن الآن تصوير الشرائح باستخدام المجهر الفلوري.
ملاحظة: من الأفضل تخزين الشريحة في الظلام أو عند 4 درجات مئوية حتى يتم الانتهاء من التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الهدف من هذه الطريقة هو إظهار كيفية حقن المواد الحيوية في الدماغ بعد السكتة الدماغية. تم استخدام نموذج photothrombotic مع البنغال الوردي والليزر 520 نانومتر للتوجه الخاضع للرقابة من آفة السكتة الدماغية في كل من الحجم والموقع. خمسة أيام بعد السكتة الدماغية يمكن تصور احتشاء أثناء الجراحة (الشكل 1B) وTC والتصوير IHC الشرائح الملطخة (الشكل 2). زيادة في قطر الليزر مع عدسة 2x يؤدي إلى زيادة بصرية في آفة السكتة الدماغية التي امتدت أكثر من 2.5 ملم مقابل مقطع واحد 1 ملم مع الليزر فقط (الشكل 2). نادرا ما حدثت الوفيات أثناء الجراحة مع نموذج PT ، أقل من 1 ٪ ، بسبب الإجراء طفيفة التوغل. وكان الموت بعد الجراحة منخفضا أيضا وشوهد في أقل من 5٪ من الفئران.
حقنت الجسيمات الدقيقة الهيدروجيلة القائمة على حمض الهيالورونيكس (HMPs) بعد خمسة أيام من السكتة الدماغية(الشكل 3). وHMPs قبلي بعد الحقن في آفة السكتة الدماغية لتشكيل الجسيمات microannealed (MAP) مع سقالة مسامية التي سمحت لهجرة الخلية في جوهر السكتة الدماغية(الشكل 4). بعد عشرة أيام من حقن الفئران كانت متغلغلة مع 4٪ PFA وتم استخراج أدمغتهم، وضعت في 4٪ PFA بين عشية وضحاها، ومن ثم في السكروز 30٪ لمدة يومين قبل أن يتم تجميدها وتقسم لتلطيخ IHC وتحليلها.
أظهر العمل السابق في مختبرنا حقن هيدروجيلس MAP في آفة السكتة الدماغية بعد خمسة أيام من السكتة الدماغية26. أدى حقن الهيدروجيلات الهيالوروليكية التي تتطابق مع معامل القشرة إلى انخفاض كبير في الخلايا الفلكية التفاعلية داخل القشرة المحيطة وكذلك داخل هلام MAP. وعلاوة على ذلك، أعرب microglia التي كانت أيضا داخل هيدروجيل المؤيدة للإصلاح علامات M2. وهذا يشير إلى أن ماب هيدروجيل يمكن أن تقلل من تفاعل الخلايا الفلكية في يومين فقط بعد الحقن وتعزيز بيئة أكثر المضادة للالتهابات مع الخلايا الفلكية المؤيدة للانتعاش وmicroglia (الشكل 5).
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبريغما وتوطين السكتة الدماغية. (أ) الفصوص الجدارية يجتمع في الجزء العلوي لتشكيل bregma. وتركزت موضع الليزر 2.0 ملم اليسار من bregma. (ب)وشوهد تشكيل البصرية من السكتة الدماغية وحفرة بور 5 أيام بعد السكتة الدماغية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المقاطع التاجية التي تمتد على المستقيم. (أ) أقسام IHC المسلسل من العقول بعد 5 أيام من السكتة الدماغية، والسكتة الدماغية مع الليزر فقط (أعلى) وعدسة 2X (أسفل). وكانت شرائح 30 ميكرومتر سميكة مع كل قسم 300 ميكرومتر بعيدا عن القسم السابق. (ب) بقعة IHC الموسعة، شريط مقياس 500 ميكرومتر. تظهر النوى (DAPI) باللون الأزرق، والخلايا الفلكية (GFAP+) باللون الأحمر، والميكروغليال (Iba1+) باللون الأخضر، والتكبير 4x. (ج) أقسام من العقول ملطخة TTC لتصور حجم الآفة 5 أيام بعد السكتة الدماغية، 1 مم أقسام سميكة مع 1 سم scalebar. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: حقن المواد الحيوية وتصورها. (أ) البصرية من حقن هلام أثناء الجراحة. (ب)يمكن تصور الجل بالعين عند إزالة الجمجمة. (ج) مرة واحدة المجمدة وشنت، وكان الجل مرئية في الدماغ أثناء تقسيم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: وصم الكيمياء المناعية للسكتة الدماغية فقط بالمقارنة مع السكتة الدماغية مع الهيدروجيل. (أ)تخطيطي للأدمغة المبردة 30 ميكرومتر سميكة. تم اختيار عدة أقسام في الوسط لتحليل الصور. (ب) السكتة الدماغية فقط، الكيمياء المناعية (IHC) البقع بعد 15 يوما من السكتة الدماغية. تظهر خلايا الخلايا الفلكية (GFAP+) باللون الأحمر، والميكروجليا (Iba1+) خضراء، والأوعية (GLUT1+) بيضاء. السكتة الدماغية + حالة هيدروجيل، IHC 10D حقن آخر، 15 يوما بعد السكتة الدماغية. تظهر خلايا الخلايا الفلكية (GFAP+) باللون الأحمر ، والميكروجليا (Iba1 +) خضراء ، ومواد الهيدروجيل بيضاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: آثار هيدروجيلات الجسيمات الصلبة المجهرية على الخلايا الفلكية التفاعلية والميكروجليا بعد السكتة الدماغية. (أ) التخطيطي من الجدول الزمني التجريبي حيث السهم يدل على يوم السكتة الدماغية، + يدل على يوم الحقن، و x يدل على التضحية وتحليل نقطة زمنية. (ب) تخطيطي لإعداد التحليل الذي يوضح أين تم تصوير المقاطع وتحليلها. (C) صور IHC تظهر التفاعل الخلايا الفلكية من خلال pERK, S100b, GFAP. (د)تحديد كمي من pERK / GFAP في المئة من الخلايا الفلكية التي كانت رد الفعل للغاية. (ه)تحديد كمي من S100b/GFAP في المئة من الخلايا الفلكية التي كانت رد الفعل للغاية. (F) صور IHC من التفاعل microglia من خلال CD11b، Arg1، و تلطيخ iNOS. (G)تحديد كمي من iNOS / دابي لتحديد النمط الظاهري microglial الموالية للالتهابات. (H) تحديد كمي من Arg1/Dapi لتحديد الفينوتيب الظاهري microglial المؤيدة للإصلاح. جميع شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم إجراء التحليل الإحصائي في GraphPad Prism. * تم تحليل البيانات المشار إليها باستخدام اختبار توكي اللاحق وفترة ثقة 95٪ مع P<0.05. وأشارت القيم p الفردية T-اختبار. تم تعديل هذا الرقم من المرجع26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نظهر نموذج السكتة الدماغية الدائمة القابلة للاستنساخ بسهولة ، والحد الأدنى من الغازية ، ووصف كيفية حقن مادة بيولوجية في احتشاء بعد خمسة أيام من السكتة الدماغية. استخدام صبغة photothrombotic روز البنغال والليزر 520 نانومتر collimated متصلة الجهاز stereotaxic يعطينا القدرة على وضع السكتة الدماغية في القشرة الحركية للفأرة بدقة معززة. بعد خمسة أيام من السكتة الدماغية ، يكون موقع العقوت مرئيا بالعين في مركز التشعيع ، 2.0 مم ثنائي الجانب إلى البريغما. ثم يتم حقن هيدروجيل بدقة في جوهر السكتة الدماغية باستخدام مضخات حقنة. الوفيات أثناء الجراحة وبعد السكتة الدماغية في هذا النموذج غائبة تقريبا، مع عدد قليل فقط من الفئران يموتون بعد الجراحة بسبب مضاعفات التخدير. على الرغم من مزايا استخدام السكتة الدماغية PT لتطبيقات المواد الحيوية، وهناك العديد من القيود البيولوجية والصعوبات التقنية التي ينبغي معالجتها.
من حيث القيود البيولوجية، PT ليس نموذج السكتة الدماغية التي توفر الخيار لإعادة التروية الدماغية، وهي العملية التي يمكن أن تحدث تلقائيا في السكتات الدماغية البشرية أو استجابة لاسترجاع جلطة الأوعية الدموية/ تحلل. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس نموذج MCAo الذي يحاكي مسببات معظم السكتات الدماغية البشرية عن طريق انسداد وعاء دماغي رئيسي ، يضعف PT تدفق الدم عبر العديد من الأوعية الصغيرة. وهناك صعوبة تقنية لحقن المواد الحيوية هيدروجيل هو ميلهم إلى الالتزام المحاقن أثناء الجراحة أو إلى الجمجمة أثناء عمليات الاستخراج. تصميم هيدروجيل الذي يبقى كسائل أثناء الحقن ومن ثم المواد الهلامية في الموقع يمكن معالجة القضية الأولى; ومع ذلك ، فإن منع الجل من الالتصاق بماطر دورا غالبا ما يكون أمرا لا مفر منه نظرا لأن موقع الحقن وجوهر السكتة الدماغية يقيمان على سطح الدماغ. وهذا يمكن أن يجعل من الصعب استخراج أنسجة الدماغ مع الحفاظ على المواد الحيوية سليمة. على هذا النحو، يجب توخي الحذر الخاص عند إزالة قطع الجمجمة من الدماغ لضمان أن الأم دورا لا يرفع مع الجمجمة واقتلاع عن غير قصد هلام. تتطلب أدمغة Cryosectioning أيضا مهارة تقنية لأن كل من عملية المناولة وشفط النصل يمكن أن يفصلا الجل بسهولة عن الأنسجة المحيطة به ، مما يحد من جمع البيانات المتعلقة بتسلل الخلايا. يتفاقم الانفصال عندما لا يتم دمج المادة بشكل كامل مع الأنسجة. إعداد العينة مع أكتوبر يخلق قذيفة التعزيز التي تساعد على تقليل فصل المواد أثناء القطع.
قبل حقن المواد الحيوية، نوصي بتحسين حجم السكتة الدماغية المطلوب اعتمادا على سلالة القوارض والإعداد المختبري. يمكن إجراء احتشاءات أصغر أو أكبر عن طريق ضبط ثلاثة معلمات رئيسية: كثافة إخراج الليزر ، وتكبير الحزم ، ووقت التشعيع. وتشمل العوامل الأخرى التي ثبت أيضا أن تؤثر على حجم السكتة الدماغية تركيز isoflurane19 ومقدار الوقت يسمح للصبغة لتعميم قبل التشعيع. فيما يتعلق بكثافة إخراج الليزر (الطاقة / المنطقة أو mW / cm2) ، وجدنا أن قوة الليزر 10 mW كانت كافية لإنتاج احتشاء صغير بقطر أفقي أصغر قليلا من شعاع الليزر. وأسفرت طاقة الليزر الأعلى عن احتشاءات أوسع بشكل هامشي ولكنها أعمق بكثير (البيانات غير مبينة) بسبب شعاع الليزر الذي له ملف تشعيع غاوسي. من خلال زيادة الكثافة ، يمكن أن تخترق النقطة المركزية للإشعاع الأقصى أعمق بعد الجمجمة ، وكذلك تسبب زيادة طفيفة في اختراق حجم البقعة لليزر. نماذج السكتة الدماغية الأخرى قد خففت الجمجمة عن طريق الرملي قبل تطبيق الضوء أو الليزر من أجل زيادة اختراق الضوء وإعادة إنتاج لاحقة من تخثر مع الحفاظ على كثافة الليزر أقل20; ومع ذلك، يمكن أن يسبب هذا نزيف في الجمجمة ويستغرق قدرا لا بأس به من الوقت أثناء الجراحة والمهارة لإتقان دون الإضرار بالدماغ عن طريق الخطأ في هذه العملية. على غرار كثافة, زيادة قطر شعاع الليزر أيضا زيادة حجم العجش; ومع ذلك، كثافة الليزر وقطر شعاع لا مقياس خطيا فيما يتعلق بعضها البعض ولكن اتبع المعادلة، وكثافة الطاقة = قوة الليزر (ث)/πr 2،حيث هي نصف قطر شعاع. من حيث وقت التشعيع ، وجدنا أن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 10 دقائق لتحقيق السكتات الدماغية القابلة للاستنساخ. لزيادة القطر الأفقي للشبق مع الحفاظ على عمق عمودي ثابت، طبقنا الليزر على المواقع المجاورة لمدة 10 دقائق لكل منها، على التوالي. لمعالجة تأثير تركيز isoflurane ووقت الدورة الدموية من ارتفع البنغال، وجدنا أن تركيز isoflurane 1.5٪ و 7 دقيقة من الدورة الدموية بعد حقن الملكية الفكرية أدى إلى تشكيل ثابت من السكتات الدماغية. تم تحسين هذه المعلمات الخمسة لاستخدامنا الخاص. لقد طلبنا سكتة دماغية كبيرة بما يكفي لإحداث تغييرات سلوكية ولكن لا تتداخل مع المنطقة البطينية ، حيث كنا نهدف إلى دراسة تأثير موادنا على خلايا السلف العصبية. بالإضافة إلى حجم السكتة الدماغية، ونحن بحاجة أيضا لتحديد حجم هلام الأمثل لحقن. على الأقل، كنا بحاجة إلى هلام كاف لملء تجويف السكتة الدماغية بالكامل لأننا وجدنا أن الفجوات بين الجل والأنسجة المحيطة أدت إلى نتائج مماثلة لمجموعات التحكم لدينا، في حين أن الاتصال بين الجل والأنسجة أدى إلى عدد أقل من الخلايا الفلكية التفاعلية وزيادة التسلل الخلوي. وصلنا إلى حد أدنى من 4-6 ميكرولتر من الجل ، والتي لم تنتج أي آثار سلبية بعد حقنها (بيانات غير منشورة).
فيما يتعلق بتقييم نتيجة السكتة الدماغية هناك العديد من الخيارات وراء تلطيخ IHC ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ، والاختبارات السلوكية ، والتحليل النسيجي ، وTTC (2،3،5 -ثلاثية الثيل ترازوليوم كلوريد) تلطيخ. من المستحسن جدا استخدام TTC للتحسين الأولي للسكتة الدماغية بسبب سهولة الاستخدام والنتائج الفورية. وقد نظرت الاختبارات السلوكية السابقة في مختبرنا في اختبار اسطوانة / مهمة الأطراف الأمامية عفوية، واختبار المشي الشبكة، واختبار المعكرونة12،21. وتجدر الإشارة إلى أن اختبار الروتروتود لم يظهر انخفاضا كبيرا في النتائج السلوكية بعد تطبيق طريقة السكتة الدماغية PT (البيانات غير مبينة). وبالتالي، ينبغي أن الاختبارات السلوكية تقييم المهام المعقدة للغاية التي تتطلب مدخلات القشرية كبيرة.
هنا أظهرنا تقنية حقن الهيدروجيلات بعد السكتة الدماغية دون تسليم عوامل النمو أو الخلايا. ومع ذلك ، فقد استخدمت الهيدروجيل أيضا لزرع الخلايا ، فضلا عن تسليم المخدرات وعامل النمو ، ويمكن أن يثبت أنه مورد قيم لكل من دراسة البيولوجيا بعد السكتة الدماغية والتحقيق في طرق جديدة للعلاج. في سياق السكتة الدماغية، حقن مختبرنا كبسولات هيدروجيل حمض الهيالورونيكس غير المسامية التي تغلف خلايا السلف العصبية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية14،18 بتركيزات تتراوح بين 25000 خلية / ميكرولتر إلى 50000 خلية / ميكرولتر من الجل. أدى استخدام الهيدروجيل إلى زيادة في صلاحية الخلية والتمايز. وأفادت مختبرات أخرى أيضا تمايز الخلايا وزيادة تجديد الأنسجة استجابة لhydgels المستخدمة لزرع الخلايا الجذعية بعد السكتة الدماغية 22-24. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بحقن الهيدروجيلات بعوامل النمو بعد السكتة الدماغية التي تؤدي إلى تجديد الأنسجة وتحسين السلوك بعد السكتة الدماغية13،14. من حيث تصميم المواد، الحقن هو سمة قيمة التي تعمل على تقليل الغازية. لذلك، ينبغي صياغة الهيدروجيلات إما سول-جل (السائل إلى الصلب)، ترقق القص (G' > G" في ظل ظروف ثابتة؛ G" > G' أثناء التدفق) ، أو المواد الهلامية الحبيبية المكونة من لبنات البناء التي قطرها أقل من القطر الداخلي لإبرة12،25،26. ثم ينبغي إجراء التحسين لاختبار انتشار الأدوية أو عوامل النمو، وقابلية الخلية للحياة تحت مجموعة من تركيزات الخلايا، وظروف هلام، ومعلمات الحقن، مثل السرعة، وقياس إبرة، وعمق الحقن، ويوم من الحقن بالنسبة عندما تم تحريض السكتة الدماغية. على سبيل المثال، تراوحت يوم حقن المواد من يوم واحد بعد السكتة الدماغية إلى، طالما ثلاثة أسابيع بعد السكتة الدماغية27،28. هنا، نبلغ عن خمسة أيام ولكن سبق أن حقننا بعد سبعة أيام من السكتة الدماغية عند زرع الخلايا. تم اختيار هذه الأيام بناء على الجدول الزمني للاستجابة الالتهابية وكذلك ذروة نشاط تولد الأوعية وتولد الأعصاب التي شوهدت بعد أسبوع واحد من السكتة الدماغية5و29و30و31. يجب أيضا إجراء توصيف الحجم في كل نقطة زمنية للحقن ، حيث سينخفض حجم السكتة الدماغية بمرور الوقت بسبب الضمور. وبالنظر إلى أن هذه المعلمات هي الأمثل قبل الحقن، وأساليب هنا كافية لتوجيه المستخدمين لحقن المواد الحيوية مع إضافة الخلايا و / أو عوامل النمو والمخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أن TS هو مؤسس في تيمبو العلاجية ، والتي تسعى إلى تسويق هيدروجيلس MAP.
Acknowledgments
نود أن نعترف المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية للتمويل (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
