Summary
För att använda Caenorhabditis elegans (C. elegans) i omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av maskar där ett enda prov kan mätas över plattformar för jämförande analyser. Här presenteras en metod för att odla C. eleganspopulationer på storskaliga kulturplattor (LSCPs) och för att dokumentera befolkningstillväxten.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) har varit och förblir en värdefull modellorganism för att studera utvecklingsbiologi, åldrande, neurobiologi och genetik. Det stora arbetet med C. elegans gör det till en idealisk kandidat att integreras i stora, hela djurstudier för att dissekera de komplexa biologiska komponenterna och deras relationer med en annan organism. För att kunna använda C. elegans i kollaborativ omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av djur där ett enda prov kan delas upp och analyseras över olika plattformar för jämförande analyser.
Här presenteras en metod för att odla och samla in en riklig C. eleganspopulation i blandat stadium på en storskalig odlingsplatta (LSCP) och efterföljande fenotypiska data. Denna rörledning ger tillräckligt många djur för att samla in fenotypiska data och befolkningsdata, tillsammans med alla data som behövs för -omics experiment (dvs. genomik, transkriptomik, proteomik och metabolomik). Dessutom kräver LSCP-metoden minimal manipulering till djuren själva, mindre användarberedningstid, ger noggrann miljökontroll och säkerställer att hanteringen av varje prov är konsekvent under hela studien för övergripande reproducerbarhet. Slutligen presenteras metoder för att dokumentera befolkningsstorlek och befolkningsfördelning av C. elegans livsstadier i en viss LSCP.
Introduction
C. elegans är en liten fri levande nematod som finns över hela världen i en mängd olika naturliga livsmiljöer1. Dess relativa lätthet att växa, snabb generationstid, reproduktionssystem och transparent kropp gör det till en kraftfull modellorganism som har studerats i stor utsträckning i utvecklingsbiologi, åldrande, neurobiologi och genetik2,3. Det kopiösa arbetet med C. elegans gör det till en huvudkandidat att använda i -omics studier för att på ett omfattande sätt koppla fenotyper med komplexa biologiska komponenter och deras relationer i en viss organism.
För att använda C. elegans i kollaborativ omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av djur i blandat stadium där ett enda prov kan delas upp och användas över olika plattformar och instrument för jämförande analyser. Att skapa en pipeline för att generera ett sådant prov kräver stor medvetenhet om kost, miljö, stress, befolkningsstruktur och provhantering och insamling. Därför är det viktigt att standard- och reproducerbara odlingsförhållanden integreras i storskaliga rörledningar. I C. elegans forskning används två traditionella metoder för att odla maskar - agar Petri rätter och flytande kultur4.
Historiskt sett, när stora mängder C. elegans behövs, odlas de i flytande kultur4. Stegen som är involverade i att generera en stor population av maskar i flytande kultur kräver flera hanteringssteg som ofta inkluderar blekmedelssynkronisering för att spränga gravida vuxna nagelband och släppa embryon för att uppnå önskad populationsstorlek. Men när blekmedelssynkronisering används är befolkningstillväxten beroende av att folkräkningsstorleken börjar och påverkar därför efterföljande tillväxt och befolkningsantal. Dessutom varierar C. elegans-stammarna i nagelbandskänsligheten, exponeringstiden och stressresponsen på blekmedelssynkroniseringen, vilket gör det svårt att analysera många stammar åt gången5,6,7,8,9.
Dessutom kräver masktillväxt i flytande kultur ett par överföringssteg eftersom det ofta rekommenderas att växa bara en generation maskar före skörd eftersom överbeläggning lätt kan uppstå om den odlas i flera generationer och leda till dauerbildning trots närvaron av mat10. Dauer-formation sker genom små signalmolekyler som askarosides, ofta kallade "dauer feromoner"11,12,13,14, släpps ut i flytande medier och påverkar befolkningens tillväxt. Dessutom leder växande stora maskpopulationer i flytande kultur till överskott av bakterieackumulering i kulturen, vilket skapar svårigheter när ett rent prov behövs för fenotypiska analyser nedströms. Slutligen, när en flytande kultur blir förorenad, är det svårare att upprätthålla eftersom svampsporer eller bakterieceller lätt sprids i hela media15.
Den andra traditionella metoden att odla C. elegans är på agar Petri rätter. Kommersiellt tillgängliga Petri-rätter gör det möjligt för man att enkelt odla flera generationer av maskar i blandade steg utan de snabba effekterna av överbeläggning och hög dauerbildning som ses i flytande kulturer. En nackdel med masktillväxt på traditionella agar Petri-rätter är dock att den största kommersiellt tillgängliga Petri-skålen inte ger stora maskpopulationer för en -omics-studie utan att lägga till i ett blekmedelssynkroniseringssteg. Sammanfattningsvis är odling av blandade populationer av C. elegans på agar Petri-rätter mer lämplig för att samla in -omics-data, men vi behövde en metod för att generera mycket stora befolkningsstorlekar utan flytande odling.
Här presenterar vi en metod för kultur och samlar stora C. eleganspopulationer i blandat stadium på storskaliga odlingsplattor (LSCP). Insamling av prover genom denna pipeline ger tillräckligt med prov för att samla in fenotypiska data och befolkningsdata, tillsammans med data som behövs för -omics experiment(dvs.genomik, transkriptomik, proteomik och metabolomik). Dessutom kräver LSCP-metoden minimal manipulering av djuren, mindre förberedelsetid för användare, ger noggrann miljökontroll och säkerställer att hanteringen av varje prov är konsekvent under hela studien för övergripande reproducerbarhet.
Protocol
1. Sterilisera LSCP och utrustning
- Förbered LSCP:er i glas genom handtvätt, följt av diskning, och efterföljande autoklavering för att säkerställa att glas är fritt från föroreningar innan experimentet påbörjas. Förvara automatiskt enklavda LSCPs på en ren torr plats tills de används.
OBS: Se till att LSCPs är diskmaskin och autoklavskåp. Se till att LSCP-locken är diskmaskinssäkra. - Förbered LSCP-lock genom handtvätt följt av diskning. Förvara LSCP-locken i en ren behållare tills det behövs.
- Den dag Nematod Growth Media Agarose (NGMA) är förberedd, torka LSCP lock med 10% blekmedel lösning två gånger, följt av 70% etanol. När LSCP-locken har torkats av med 10% blekmedel och 70% etanol, förvara lscp-locken i en ren behållare i laminarflödeshuven där NGMA kommer att förberedas.
2. Förbered nematodtillväxtmedieagarosa (NGMA)
- Förbered NGMA genom att kombinera följande reagenser i en autoklaverad 2 L Erlenmeyerkolv med omrörningsstång på en omrörningsplatta: 2,5 g pepton, 3 g NaCl, 7 g agarose, 10 g agar och 975 ml steriltvatten 16. Se till att den totala volymen är lika med 1 L. Tejpa ett folielock till kolven.
OBS: Förberedelsestegen för NGMA som beskrivs här kommer att ge tillräckligt med material för 2,5 LSCPs. Protokollet kan skräddarsys efter den LSCP-batchstorlek som behövs i ett givet experiment. - Autoklav på vätskecykel vid 121 °C och 21 p.s.i. i 45 min.
- Sätt på vattenbadet och ställ in på 50 °C. Ta den autoklaverade NGMA till vattenbadet för att svalna till 50 °C.
- För in 2 L Erlenmeyerkolven NGMA i huven eller det rengjorda utrymmet och ställ på en omrörsplåt. Använd en termometer för att spåra NGMA-temperaturen.
- Efter att NGMA har nått 50 °C tillsätt följande i den ordning som anges med en steril engångspipett inuti huven eller rengjort utrymme: 25 ml 1 M KH2PO4 (K fosfatbuffert), 1 ml kolesterol (5 mg/ml i etanol), 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4,1 ml nystatin (10 mg/ml) och 1 ml streptomycin (100 mg/ml)16.
- Häll 400 ml NGMA i ett sterilt glas LSCP, ca 1,3 cm djupt, så att LSCP kan stelna på plan yta i huven och placera det autoklaverade folielocket tillbaka på LSCP.
- När agar är inställd, ta bort folien och placera ett rent lufttät lock på LSCP och flytta till 4 °C för förvaring. Förvara NGMA i LSCP vid 4 °C tills de används och används inom 5 dagar.
3. Generera E. coli-mat för NGMA på LSCP
- För att generera en stabil livsmedelskälla, generera partier av HT115 (DE3) E. coli med hjälp av ett litet batch genomsnittskoncept som överensstämmer med den centrala gränsen sats17. Förvara vid -80 °C. Vid behov dra E. coli bakterielager från -80 °C för att tina18.
OBS: I detta protokoll odlades E. coli bakteriella lager i en bioreaktor. I slutet av kulturtillväxten späddes kulturen ut 1:50 och uppmätta OD600 var 0,4. Således hade kulturen en effektiv OD600 av 20. Bakterier pelleterades, vägdes och återanvändes i K medium vid en koncentration av 0,5 g/ml (våt vikt), överfördes till 2 ml alikvoter och frystes19.
4. Bakteriell gräsmatta på NGMA
- Ta NGMA LSCPs ur 4 °C till rumstemperatur (RT) i flera timmar innan bakteriegräsmattan sprids så att hela LSCP kan nå RT.
- Dra ut nödvändiga E. coli bakteriella lager från -80 °C för att tina18.
- Späd E. coli bakterielager med 2 ml sterilt K-medium för att uppnå 0,5 g E. coli i 4 ml per NGMA LSCP. Försiktigt pipett 4 ml E. coli i mitten av NGMA LSCP.
- Använd en steril spridare för att sprida bakterier i en rektangel och lämna cirka 3,8 cm utrymme runt kanterna på NGMA E. coli-fri.
- Lämna NGMA LSCP med E. coli i huven med fläkten på i 1 timme för att säkerställa att E. coli-suspensionen torkar helt.
- När bakteriegräsmattan är torr, tryck på locket ordentligt och förvara vid 4 °C tills det används.
5. Bitmaskar för att minska stress och åldersvariationer mellan prover
- Strimma maskar från en frusen mask lager till en nysådd 6 cm tallrik4. Denna tallrik kommer att fungera som "master chunk" -plattan.
OBS: Chunking är en optimal metod för att överföra maskar från en homozygous stam20. Om en stam är heterozygous eller behöver bibehållas genom plockning och parning, är bitning inte tillrådligt. Segmenteringsfrekvensen kan behöva optimeras beroende på vilka maskgenotyper som används, vilken temperatur som valts för tillväxt och steg nedströms. - När master chunk-plattan är full av friska gravid vuxna (cirka 3 dagar) med gott om E. coli gräsmatta fortfarande närvarande, följ standard C. elegans chunking riktlinjer som beskrivs i WormBook för att producera fyra totala bitplattor4.
- Förvara alla bitplattor i ett kontrollerat temperaturrum (CT) vid 20 °C om inget annat anges för tillväxt.
OBS: Om användare av detta protokoll inte har tillgång till ett CT-rum enligt beskrivningen här rekommenderas att använda antingen en liten inkubator där temperaturen kan kontrolleras eller ett särskilt rum där miljöförhållandena kan kontrolleras så mycket som möjligt. Om inget av dessa alternativ är tillgängligt bör du notera att variationen i provtillväxten kan vara större. - När många gravida vuxna observeras i den4: e bitplattan, gå vidare till steg 6.
6. Spot blekning gravid vuxna på LSCP
OBS: Denna blekningsteknik används för att utrota de flesta föroreningar och lösa upp nagelbandet på hermafroditerna som frigör embryon från den vuxna masken. Blekmedelslösningen kommer att suga in i NGMA före embryona kläckning.
- Ta LSCPs ut till RT i flera timmar innan du upptäcker blekmaskar.
- Förbered ett 7:2:1-förhållande mellan ddH2O: blekmedel: 5 M NaOH. Gör denna alkaliska hypokloritlösning fräsch strax före användning.
OBS: Använd samma lager av blekmedel och NaOH under hela ett givet experiment för att undvika blekmedelssats påverkar. Blekmedel som används i detta protokoll var 5-10% natriumhypoklorit. - Tänd en Bunsen-brännare och flamma en maskplockning innan du fortsätter. Skopa färsk E. coli på en steril plockning från kanten av bakteriegräsmattan på LSCP.
- Välj en enda gravid vuxen från den4: e bitplattan för spotblekning.
- Pipett 5 μL av den alkaliska hypokloritlösningen i ett hörn av LSCP bort från E. coli gräsmattan.
- Placera den plockade gravid vuxna i 5 μL alkalisk hypokloritlösning. Tryck på nematoden för att störa nagelbandet och släppa ägg.
- Upprepa steg 6,4 – 6,6 för totalt 4x och placera 5 gravida vuxna jämnt runt E. coli gräsmattan. Välj alla 5 gravida vuxna från samma4: e bitplatta för att säkerställa att nästan genetiskt isogena individer läggs till ett givet prov.
- Placera locket på LSCP igen.
- Upprepa steg för alla LSCP:er.
7. Masktillväxt i kontrollerat temperaturrum (CT)
- Efter punktblekning, placera locket tätt på LSCP och placera i CT-rummet inställt på 20 °C med konstant luftflöde och en 12L:12D fotoperiod (12 h ljus och 12 h mörker).
- Notera den tid och position där provet placerades i CT-rummet.
OBS: Position i rummet bör alltid dokumenteras för att registrera eventuella miljöskillnader som prover potentiellt kan stöta på under odling. När provet är i CT-rummet bör det förbli på sin tilldelade plats ostört. Öppna inte locket på LSCP i CT-rummet för att minska risken för kontaminering. - Ta LSCP till ett mikroskop, utanför CT-rummet, för att observera befolkningstillväxten och densiteten.
OBS: Varje C. elegans stam och prov kommer att variera i sin tillväxt, så övervaka prover noggrant. Medan det rekommenderas att inte störa tillväxten av LSCP medan i CT rummet, LSCPs transporterades ut ur CT rummet och lock öppnades varannan dag för att övervaka prov tillväxt. Genom att ta bort de förseglade locken från LSCP var 2: e dag kan också O2 strömma in i LSCP. - Innan skörden se till att LSCP har blivit full av en stor population av maskar. Använd följande kriterier för att avgöra om LSCP är redo att samlas in.
- Se till att LSCP är full av gravida vuxna maskar.
- Se till att plattan innehåller en stor populationsstorlek (dvs. maskar täcker hela agarens yta).
- Se till att plattan inte har många äggpå agarensyta ( dvs. det maximala antalet maskar borde ha kläckts).
- Se till att plattan har minimal till ingen E. coli kvar, vilket indikerar att maskarna skulle svälta och generera dauer larver om de lämnades på plattan i ytterligare två dagar.
OBS: Även om de flesta LSCP är redo att skörda mellan 10 och 20 dagar, beroende på stam och prov, kontrollera varje LSCP ofta när du upprättar detta protokoll för att bestämma normala skördetider.
- Rengör handskar och område med 70% etanol mellan hantering av LSCPs för att undvika korskontaminering mellan stammar.
8. Skörd av LSCP-provet
- Slå på och låt centrifugen svalna till 4 °C innan du skördar prover.
- Förbered tre 50 ml koniska rör med 50 ml M9-lösning per LSCP som ska skördas.
- Etikett ett 15 ml koniskt rör per LSCP.
OBS: Alla centrifugationssteg utförs i det koniska röret på 15 ml, eftersom maskar tenderar att pelletsa bra i dessa rör. - Häll 50 ml M9-lösning (från ett koniskt rör på 50 ml i steg 8.2) på LSCP-ytan och snurra runt för att säkerställa att M9 täcker hela NGMA-ytan.
- Medan M9 sitter på LSCP-ytan, prime en steril serologisk pipett med M9.
OBS: Genom att priming den sterila serologiska pipetten med M9 säkerställer detta att färre maskar fastnar på insidan av plastpipetten, vilket förhindrar provförlust. - Luta LSCP så M9 och maskpopulationen samlas i ett hörn av LSCP.
OBS: Blandningen av M9-lösning och maskar från LSCP kommer att kallas "maskupphängning" i nedströmssteg. - Använd en primerad serologisk pipett med en automatisk pipett, pipettmaskupphängning och placera i det ursprungliga 50 ml koniska röret. När 50 ml maskfjädring har samlats in, placera det koniska röret på en rocker för att störa bakterier klumpar och skräp.
- Upprepa steg 8,4 - 8,7 samla 150 ml maskfjädring per LSCP.
- Överför 15 ml maskfjädring från ett av de tre koniska rören på 50 ml genom att hälla i ett märkt 15 ml koniskt rör som avsatts i steg 8.3. Centrifugera det koniska röret på 15 ml vid 884 x g i 1 min vid 4 °C. Majoriteten av maskarna kommer att pelleta i botten av röret.
- Aspirera av supernaten och se till att inte störa maskpelleten.
- Fortsätt att lägga till cirka 13 ml maskfjädring till samma 15 ml koniska rör som upprepar steg 8,9 och 8,10 tills alla 150 ml maskfjädring förbrukas. Vänd röret och stör pelleten mellan centrifugationerna för att tvätta och aspirera bort så mycket bakterier och skräp som möjligt.
OBS: I detta steg kondenseras innehållet från alla tre 50 ml koniska rör i ett enda 15 ml-rör. - Tillsätt 10 ml ren M9 till det koniska röret på 15 ml och omrör maskpelleten genom att invertera. Centrifugera det koniska röret på 15 ml vid 884 x g i 1 min vid 4 °C. Aspirera av supernaten och se till att inte störa maskpelleten. Upprepa två gånger.
OBS: Om det finns en stor mängd skräp eller bakterier i prov, upprepa steg 8.12 tills provet är rent. - När provet är rent, tillsätt ddH2O till maskpelleten för totalt 10 ml ddH2O och maskar. Agitera maskpelleten genom att invertera. Flytta snabbt in i steg 9.1, eftersom maskar måste förbli i ddH2O i 5 min eller mindre för att undvika osmotisk stress.
OBS: Suspendering av maskpellets i ddH2O är det föredragna lösningsmedlet för steg nedströms- omics. Maskar kan suspenderas i andra lösningsmedel eller buffertar om de är kompatibla med ett visst experimentellt arbetsflöde.
9. Uppskatta befolkningsstorleken
OBS: Gå igenom steg 9.1 – 9.7 snabbt. Blandningen av ddH2O och maskar från steg 8.13 kallas "maskprovet" i efterföljande steg.
- Innan maskprovet pipetting, prime pipeette tip som ska användas med M9 för att undvika maskar som fastnar på insidan av plastpipetten förhindrar provförlust och minskar variationen i antalet.
- Ta en 100 μL alikvot av maskprov och späd den till 900 μL M9. Blanda väl och gör en seriell utspädning (1:10, 1:100, 1:1000). Upprepa det här steget två gånger för att uppnå totalt tre uppsättningar alikvot replikat.
OBS: Pipettingmaskar kan orsaka hög variation i antalet provpopulationer. Se till att maskprovet är homogent innan du rör önskad alikvot. - Ställ in det koniska röret på 15 ml på en rocker för att fortsätta flytta kulturen medan alikvoter räknas.
- Se till att maskprovet är väl blandat och homogent. Pipett 5 μL från 1:10 maskprovet, dela ut den på en mikroskopibild och räkna antalet maskar. Om detta tal är mindre än cirka 50 maskar, räkna också utspädningarna 1:100 och 1:1000. Om det är mer än 50, flytta till nästa seriell utspädning.
OBS: Om för många maskar inte kan räknas korrekt, använd nästa seriell utspädning för att räkna istället. - Räkna varje alikvot replikat av varje utspädning 3x. I slutet av räkningen, för de flesta kulturer, kommer 9 totala räkningar att dokumenteras (dvs.3 totala räkningar för varje alikvot replikat).
- Genomsnittlig utspädning räknas för att bestämma den uppskattade populationsstorleken för maskprovet. Dessa utspädningstal kommer att bestämma volymen av maskprov som behövs för att skapa önskad alikvotstorlek för -omics-steg.
OBS: I detta experiment genererades alikvoter av cirka 200 000 maskar i blandat stadium. Dessutom avsattes en alikvot på cirka 50 000 maskar i blandat stadium för sortering i en stor partikelflödescytometer (beskriven i steg 10). - När maskprovet har delats upp i lämpliga alikvoter, blixtfrys i flytande kväve och förvara provet vid -80 °C.
OBS: Frys inte in alikvoten avsedd för stor partikelflödescytometri.
10. (Valfritt) Preppingprov för stor partikelflödescytometri
OBS: Steg 10, 11 och 12 är författarnas föredragna metod för att registrera provtillväxt (dvs. befolkningsstorlek ochbefolkningsfördelning av C. elegans livscykelstadier) och bestämma framgång för en kultur. Användare av det här protokollet kan ersätta valfria steg 10, 11 och 12 med sina egna mått på tillväxtframgång. Steg 10, 11 och 12 beskrivs här av två skäl; Först kan användare som har utrustning som används i steg 10, 11 och 12 replikera dessa steg och andra för att visa validering av den här tillväxtmetoden. Steg 9 ovan ger en bra uppskattning av det totala antalet maskar för att bestämma alikvotstorlekar, och steg 10 är ett mer kvantitativt mått för att uppskatta antalet och populationsfördelningen av maskar i ett visst prov.
- Ta med alikvoten på cirka 50 000 maskar i blandat steg (åt sidan i steg 9,6) upp till 10 ml total volym i M9-lösning.
- Gör en lösning bestående av 1 mg/ml E. coli och en utspädning på 1:50 på 0,5 μM röda fluorescerande mikrosfärer19.
- Tillsätt 200 μL av denna lösning till 10 ml maskar i blandade steg i M9 och inkubera medan du gungar i 20 minuter.
- Efter 20 min, centrifugera det koniska röret på 15 ml vid 884 x g i 1 min vid 4 °C.
- Aspirera av supernaten och se till att inte störa maskpelleten.
- Tvätta maskpelleten två gånger med M9-lösning för att eliminera överflödiga bakterier och röda fluorescerande mikrosfärer.
- Tillsätt 5 ml M9 till maskpelleten och se till att pelleten ser ren ut. Om pelleten är ren, tillsätt 5 ml M9 med 50 mM natriumazid för att både räta ut och döda maskarna för noggrann räkning och storlek21.
- Dokumentera tid och datum då natriumazid tillsätts i prov.
- Ställ provet åt sidan på rocker tills det behövs för stor partikelflödescytometri.
OBS: Natriumazid är känt för att påverka nematodfysiologi(dvs.kroppslängd, metabolism och termotolerans). Därför är det viktigt att notera den tid maskar utsätts för natriumazid eftersom många av dessa fysiologiska effekter händer inom några minuter22. På grund av de kända fysiologiska effekterna av natriumazid på maskar kommer denna behandling att påverka nedströms bildkvalitet och bör övervägas.
11. (Valfritt) Dokumentera befolkningsfördelning och förbereda 384-brunnsplatta för avbildning
OBS: Steg 11 använder en stor partikelflödescytometer (LPFC). Grundläggande kunskaper om en LPFC antas i detta protokoll. Andra metoder kan ersättas för att dokumentera provs tillväxt och populationsfördelning. Steg som dokumenteras här är för användare som planerar att använda en LPFC i sin pipeline23.
- Slå på, rengör och prime LPFC och låt laser(er) värma i 1 timme före sortering av prover.
- När lasern har värmts upp öppnar du" Histogram" -profilen och skalar till en flygtid (TOF) från 2050.
- Lägg till ett stapelområde i "Histogrammet" som sträcker sig över ett TOF-intervall på 100. Den första barregionen täcker en TOF på 50-150.
- Fortsätt att skapa tjugo stapelområden som var och en sträcker sig över ett TOF-intervall på 100. Dessa barregioner kommer att sträcka sig över hela TOF-intervallet från 50 till 2050. Se tilläggstabell 1 för de exakta gated-regionerna som ska användas i distributionen av innehållsförteckningar.
- Spara detta histogram som ställts in som ett "experiment" som ska användas i framtida LPFC-körningar.
- Välj kalibrerad 384-brunnsplatta eller kalibrera instrumentet till en 384-brunnsplatta för att dela ut föremål i.
- En gång i den kalibrerade 384-brunnsplåtmallen ställer du in mallen för att dela ut 20 gated objects i fyra brunnar (fyra tekniska replikat av varje gated region) för var och en av de 20 barregioner som skapades under steg 11.3-4. Se tilläggstabell 2 för en exempellayout för hur maskar ska fördelas i 384-brunnsplattan.
- Överför prov från steg 10,9 till ett koniskt rör på 50 ml och tillsätt ytterligare M9-lösning för att uppnå cirka 40 ml total volym.
- Börja automatiskt sortera provet enligt de parametrar som anges i steg 11.7 samtidigt som du kontinuerligt rör om provet för att förhindra sedimentering och samtidigt dela ut föremål från provet i den kalibrerade 384-brunnsplattan.
OBS: Se till att LPFC:s flödeshastighet fungerar mellan 15-20 objekt per sekund och ange inga dubblar som ska sorteras. - När hela provet har sorterats och det maximala antalet gated regions har dispenserats i 384-brunnsplattan, ta bort provet från LPFC och rengör instrumentet.
OBS: När större TOF-regioner nås kan det bli utmanande att fortsätta fylla 384-brunnsplattan på grund av låga händelseantal i den TOF-regionen. Fyll så många av de gated regionerna som möjligt för att få den bästa idén om var C. elegans livsstadier faller inom LPFC-distributionen innan provet tar. - Placera en tätningsfilm ovanpå 384-brunnsplattan tills den är avbildad.
OBS: Bildskylt så snabbt som möjligt efter sortering eftersom prover behandlas med natriumazid22. Röda fluorescerande mikrosfärer kan ses i de insamladeLPFC-datafilerna (dvs. PH-röda data i utdatatextfilen) baserat på nivån av röd fluorescens som avges i varje sorterat objekt för att identifiera vilka objekt som lever maskar, döda maskar, dauers eller skräp24.
12. (tillval) Imaging 384-brunnsplatta
OBS: Steg 12 använder ett mikromikroskop med plåtavläsning. Grundläggande kunskaper om ett mikroskop antas i detta protokoll. Andra metoder kan ersättas för att dokumentera provs tillväxt och populationsfördelning.
- Använda ett plattavläsningsmikroskop med en 20x lins.
- Öppna fliken "Mål och kamera" och ställ in på "10x Plan ApoLambda" -läge.
- Öppna fliken "Kamerafackning" och ställ in på "2".
- Öppna fliken "Sites to Visit on Plate" och ställ in på "4" webbplatser per brunn och "överlappa webbplatser 10 %" för att senare sy ihop bilder.
- Öppna fliken" Wavelength" och ställ in på "Brightfield 1".
- Öppna fliken" Belysning" och ställ in på "Överfört ljus, ljust prov".
- Placera 384-brunnsplattan i mikroskopet och ställ in "Z Stack" på "Beräkna offset" och hitta rätt brännplan för proverna i 384-brunnsplattan.
- Kör 384-brunnsplattan på mikroskopet som samlar fyra bilder per brunn.
- Montera de fyra bilderna tillsammans för att skapa en bild per brunn.
Representative Results
Tillväxten av C. elegans med LSCP-metoden ger i genomsnitt cirka 2,4 miljoner maskar i blandat stadium per prov under 12,2 dagar. Tillväxt av C. elegans med LSCP-metoden gör det möjligt för användare att generera stora populationer av C. elegans i blandat stadium med liten hantering och manipulering av djuren, vilket är idealiskt för storskaliga omikstudier ( Figur1). När en LSCP har blivit full av vuxna maskar, nått en stor befolkningsstorlek och har minimala bakterier kvar, kan användare skörda och uppskatta befolkningsstorleken. Denna punkt kan också fungera som en kvalitetskontroll genom att utvärdera om populationen är tillräcklig för att användas i en -omics-pipeline (figur 2). Populationsdynamiken är beroende av själva stammen, stammens beteende (dvs.grävande stammar tenderade att ha lägre maskåtervinning)och tillväxtframgång (dvs.förorening). LSCP-metoden testades på 15 stammar av C. elegans som innehåller en blandning av Caenorhabditis Genetics Center (CGC) mutanter och Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) vildastammar 25. Stamgenotyper beskrivs i kompletterande tabell 3.
LSCP-metoden gav befolkningsstorlekar från cirka 94 500 till 9 290 000. Den genomsnittliga populationsstorleken inom referensstammen PD1074 och över stammar var cirka 2,4 miljoner maskar (figur 3). Inga signifikanta skillnader konstaterades i uppskattade populationsstorlekar mellan C. elegans-stammar under i genomsnitt 12,2 LSCP-tillväxtdagar (figur 4). PD1074 LSCPs tog mellan 10 och 14 dagar att växa till en full blandad befolkning. Den genomsnittliga tillväxttiden över PD1074 var 10 dagar. Den långsammaste växande stammen ökade under maximalt 20 dagar, och den snabbast växande stammen växte under minst 10 dagar (figur 4).
Därför kan användare med hjälp av denna LSCP-metod enkelt integrera nya intressestammar i en studie med liten kunskap om utvecklings timing och bakgrundsexpertis. Observera att stammar och fenotyper som måste upprätthållas genom plockning, har fecundity defekter, är heterozygous eller har tillväxt defekter kanske inte fungerar bra i denna pipeline.
Stor partikelflödescytometri och avbildning av prover gör det möjligt för användare att dokumentera befolkningsfördelningen. Ett brett utbud av plattformar kan användas för att mäta framgångsrik befolkningstillväxt.
För reproducerbara -omics mätningar är det viktigt att växa konsekventa kulturer. Måtten för kultur reproducerbarhet är antal maskar och en konsekvent storleksfördelning för en viss stam. Vi visar provfördelningen för referensstammen PD1074 – en variant av den ursprungliga N2 Bristol-stammen, med hjälp av LPFC23,26 och mikroskopbilder som proxyservrar för tillväxtframgång. Eftersom maskar mättes från L1-scenen genom gravid vuxen på LPFC-fördelningen (figur 5), efterföljande avbildning (figur 6), och variationen i befolkningsfördelningen mellan prover (figur 7), kan vi se att denna pipeline genererade en blandad befolkning av C. elegans.
För att titta närmare på befolkningsfördelningen av våra prover i blandat stadium tittade vi på fördelningen av 35 PD1074 LSCPs genom att titta på procenten av maskar som faller inom varje region under hela flygtiden (TOF)(dvs.kroppslängd) fördelningen(figur 7A, B).
Figur 1: Översikt över LSCP-masktillväxtpipelinen. A)När de väl mottagits i labbet har alla stammar förberetts och frysts för långtidslagring vid -80 °C2. B)En "master chunk"-platta har framställts av ett fryst maskbestånd och lagrats vid 15 °C och skall användas i högst en månad. C)Varje prov gick igenom fyra på varandra följande segmenteringssteg för att minska generationsstressen innan det växte på LSCP. (D) 5 enskilda gravida vuxna plockades från "bit 4" 6 cm plattan i steg (D) och spot bleks på fem givna områden i LSCP. ( E) LSCP placerades i ett kontrollerat temperaturrum och odlades vid 20 °C tills LSCP var fullt av vuxna maskar, nådde en stor befolkningsstorlek och hade minimala bakterier kvar. (F) Maskpopulationen skördades och samlades in för steg nedströms. G)Alikvoter skapades från LSCP och blixtfrystes för önskade tillämpningar nedströms. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Översikt över LSCP-avverkning och uppskattning av populationens storlek. (A) 50 ml M9 användes för att tvätta maskar från NGMA-ytan. Mask fjädring var pipetted i en 50 mL koniska rör. Steg (A) upprepades två gånger. (B) 15 ml mask suspension hälldes i en ny 15 mL koniska rör. Maskar pelleterades av centrifugering. M9 + skräp aspirerades av utan störande maskpellet. Steg (B) upprepades tills alla 150 ml mask suspension samlades in. (C) Maskpelleten tvättades och centrifugerades tre gånger med M9 för att eliminera återstående skräp. När provet var rent återanvändes maskpelleten i 10 ml ddH2O. (D) En seriell utspädning av provet skapades för att uppskatta maskpopulationens storlek. Utspädningsfaktorn som gjorde det möjligt att räkna maskar korrekt användes. Utspädningsfaktorn som används ändrades beroende på LSCP:s populationsstorlek. (E) När utspädningsfaktorn(erna) har valts, var alla maskar från alla tre alikvotrepliker av denna utspädning pipetted på en ren glidning och maskar räknades under ett dissekerande mikroskop. F)Provet delades upp i lämpliga alikvoter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: LSCP-metoden genererade i genomsnitt en population på 2,4 miljoner maskar i blandat stadium. LSCP ger befolkningsstorlekar i de minsta befolkningstillväxterna på cirka 94 500 och med den största befolkningstillväxten på cirka 9 290 000. Den genomsnittliga befolkningsstorleken för alla stammar var 2,4 miljoner maskar. Staplar under C. elegans stam namn indikerar om en stam är en CGC mutant eller CeNDR naturliga isolatet. LSCP-provstorlek visas för varje stam. Jämförelser för alla par med Tukeys HSD-test utfördes. Inga signifikanta skillnader observerades mellan uppskattade populationsstorlekar mellan C. elegansstammar (F(14 108) = 0,7, p = 0,77). Färgade staplar anger standardfärgdisplayer för respektive C. elegans stamrepresentation. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: LSCP-metoden genererade stora populationer av maskar i 10 –20 dagar. En given C. elegans LSCP växte tills provet var fullt av vuxna maskar, nådde en stor befolkningsstorlek och hade minimal bakteriell gräsmatta kvar. LSCPs tog mellan 10 och 20 dagar att växa till en full blandad befolkning, beroende på stammen. Den genomsnittliga tillväxttiden över stammarna var 12,2 dagar. LSCP-provstorlek visas för varje stam. Varje felfält konstruerades med 1 standardavvikelse från medelvärdet. Nivåer som inte är anslutna med samma brev är betydligt olika. Jämförelser för alla par med Tukeys HSD-test. En betydande skillnad konstaterades i den tillväxttid på LSCP som behövdes över C. elegans stammar (F(14,108) = 8,8, p < 0,0001*). Färgade staplar anger standardfärgdisplayer för respektive C. elegans stamrepresentation. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Blandad population och tillväxtmätning av referensstammen av vildtyp, PD1074. En representativ LPFC-fördelning av en LSCP-tillväxt av referensstammen av vild typ, en variant av den ursprungliga N2 Bristol-stammen (PD1074) dokumenterar storleksfördelningen och händelseantalet för en population i blandat stadium. X-axeln visar längden (flygtid, TOF) för de sorterade maskarna. Y-axeln visar den optiska densiteten (optisk utrotning, EXT) hos de sorterade maskarna. Varje datapunkt är en mask som dokumenterades i exemplet. Varje TOF-region som användes för bildanalys visas i en annan färg. Tjugo TOF-regioner skapades (R2 – R21) från en tof på 50 till 2050. Information om varje TOF-region finns i kompletterande tabell 1. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 6: Bilder av maskar sorterade från TOF-regioner från R2 – R12 visar PD1074 LPFC-distributionen. I region R2 kan L1-maskar identifieras och i region R9 identifieras främst gravida vuxna, som spänner över de två utvecklings larv ytterligheter som ger oss ungefärliga regioner inom flöde cytometer fördelningen av var stadier förväntas i fördelningen. Skalstången representerar 1 mm. Representativa bilder togs från LPFC-fördelningen som visas i figur 5, och de färgade rutorna motsvarar regioner från figur 5. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Befolkningsfördelning över flygtidsregioner i referensstammen av vildtyp, PD1074. Distribution av maskar över hela TOF-regionen som visar de regioner där maskar hittades. Varje PD1074 LSCP representeras som en enskild färg. (A) X-axeln visar de tjugo TOF-regioner (R2 – R21) som observerats och räknats för LSCP och som visar hela storleksfördelningen. Y-axeln visar procent av maskar från en viss LSCP som hade en kroppsstorlek som föll i en viss TOF-region. (B) Eftersom en mindre del av maskpopulationen faller mellan R7-R21-regionerna togs loggen över procenten av maskar som föll inom varje region för att visa befolkningsfördelningen. X-axeln visar R7-R21 TOF-regionerna. Y-axeln visar loggen för procent av maskar från en viss LSCP som hade en kroppsstorlek som föll i en viss TOF-region. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Genomsnittlig dygnstemperatur (°C) för tillväxtförhållanden under vilka LSCP odlades och hanterades. Rapporterade temperaturer i ct-rummet dokumenterades och samlades in under hela sexmånadersperioden av provtillväxt och insamling. Den genomsnittliga dagstemperaturen rapporteras här. Inga signifikanta skillnader observerades mellan den temperatur i vilken LCSP växte under projektets varaktighet (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Hela temperaturskillnaden sträckte sig inte över 0,003 °C under hela sexmånadersperioden för provtillväxt och generering. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Tilläggstabell 1: TOF-gated regioner som används för att sortera maskar i 384-brunnsplattor för avbildning. Binned-regioner skapades för att spänna över en TOF på 100 över hela TOF-distributionen från 50 till 2050. Gated-regioner kan ändras och optimeras för att passa dina behov. Varje TOF-region som användes för bildanalys visas i en annan färg. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tilläggstabell 2: 384-brunnsplåtmall för TOF-regioner och replikeringslayout. Varje prov sorterades i en 384-brunnsplatta för avbildning. Fyra repliker skapades för varje region som valts för sortering. Gated-regioner kan ändras och optimeras för att passa dina behov. Se tilläggstabell 1 för specifika gated-regioner som skapats och använts i det här protokollet. Varje TOF-region som användes för bildanalys visas i en annan färg. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell 3: C. elegansstammar som används i detta protokoll innehåller en blandning av CGC- och CeNDR-stammar. Stammen, genotypen, stamkällan och detaljerna beskrivs i den här tabellen. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
En mängd olika fartyg kan användas som LSCP. I detta protokoll användes en vanlig glasbakform. LSPC:erna som används hade yttermått på 35,56 x 20,32 cm, innermått på 27,94 x 17,78 cm och cirka 4,45 cm djupa och kom med ett monterat lock. Således har mängden bakterier som används här optimerats för en LSCP med ovanstående dimensioner för att ge en stor population av maskar i blandat stadium. Bakterievolym och koncentration kan justeras för att passa de experimentella behoven.
Kontaminering genom mögel, svampar eller andra bakteriekällor kan uppstå i vilket steg som helst i LSCP-metoden, så hantera prover med försiktighet. Innan du påbörjar något steg i protokollet, se till att arbetsutrymmet rengörs med 70% etanol och 10% blekmedel. Om tillgängligt, behandla använda områden med UV-ljus i 30 min och slå på ett HEPA-luftfilter 30 minuter innan du startar varje steg.
Genom att odla LSCP i en kontrollerad miljö(dvs. i ett CT-rumvid 20 °C) kan användaren lättare spåra tillväxten av provet och dokumentera potentiell kontaminering. Om LSCP:s yta blir kontaminerad, antingen skära ut kontamineringen när det är möjligt och låt provet fortsätta att växa eller kassera provet om föroreningen inte är möjlig att kontrollera. Det är absolut nödvändigt att snabbt ta itu med kontaminering för att minska oönskad tillväxt och se till att den inte konkurrerar ut maskar för resurser.
Denna metod är avsedd för dem som vill odla storskaliga kulturer med blandad befolkning av C. elegans. Även om det kan vara möjligt att odla synkroniserade populationer av maskar på LSCP som gjorts på kommersiellt tillgängliga Petri-rätter och i flytande kultur, har författarna inte testat detta alternativ. Dessutom, om användare vill växa mer än cirka 2,4 miljoner maskar i genomsnitt i ett visst prov, rekommenderas en annan metod4. Tillväxtframgången är beroende av den påfrestning som bearbetas i pipelinen. Författarna kunde framgångsrikt växa populationer av cirka 2,4 miljoner maskar i minst fem biologiska replikat av 15 C. elegans stammar, vilket indikerar att metoden är robust.
Innan experimentet påbörjas bör du notera att åldern och hälsan hos en viss mask kan påverka fecundity och efterföljande befolkningstillväxttid. Se till att maskar hålls under hälsosamma förhållanden med minimal stress innan de används i denna pipeline. Det antas att lagerprover har skapats, frysts och hållits vid -80 °C för att minska genetisk drift över tid.
Beroende på behoven hos ett visst experiment kan antalet startande gravida vuxna på en LSCP ändras. Att ändra antalet startelvan vuxna på LSCP kommer att förändra tillväxttakten och därmed tiden att skörda. Fem gravida vuxna används för att så varje LSCP av följande skäl: (1) Ett enkelt, snabbt och effektivt sätt att så många C. elegans stammar på LSCPs på en gång behövdes och (2) för att minska åldersskillnaderna mellan de gravida vuxna plockas som kan leda till tillväxt heterogenitet.
Denna metod gör det möjligt för användaren att skörda stora populationer av maskar med alla livscykelstadier närvarande. Med nuvarande metoder tillgängliga kräver insamling av storskaliga prover av C. elegans blekmedelssynkronisering för att få det antal maskar som önskas för nedströmsarbete. Med tanke på detta tillvägagångssätt kan man nu odla så många maskar som tidigare möjligt i fermentorer eller storskaliga flytande kulturer utan svårigheter i samband med blekmedelssynkronisering och flera hanteringssteg. Vårt protokoll gör det möjligt att rikta in sig på stammar av intresse effektivt, använda minimal hanteringstid för att odla själva provet och isolera stadier av maskar eller befolkningen efter behov i nedströmsledningar.
En LPFC användes som ett verktyg för att dokumentera befolkningsfördelningen och storleken i en viss LSCP. LPFC som används är ett kontinuerligt flödessystem som analyserar, sorterar och dispenserar maskar baserat på deras storlek (TOF) och optisk densitet. När en given mask passerar genom flödescellen fångar den axiella ljusförlustdetektorn mängden signalljus som blockeras av en 488 nm-solid state-laser under den tid det tar en mask att passera igenom, vilket ger användaren TOF och maskens optiska densitet. Fluorescens insamlingsoptik och detektorer kan också användas för att maximera fluorescenskänsligheten och insamlingen på varje prov. LPFC-insamlingsparametrarna varierar beroende på instrument. Användare kan använda en mängd olika plattformar för att fånga maskstorlek och är inte begränsade till att använda det här protokollet om en LPFC inte är tillgänglig.
Författarna använder prover som odlas i den metod som beskrivs här för att identifiera okända metaboliter i olika stammar av C. elegans via flytande kromatografi - Masspektrometri, NMR-spektroskopi och RNA-sekvensering. Författarna planerar att fortsätta att använda denna metod för tillväxt av prover i denna pipeline med en mängd olika C. elegans stammar som nya stammar av intresse kan enkelt bearbetas med denna pipeline.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i Edison Lab för hjälpsamma diskussioner och feedback om detta manuskript; I synnerhet B.M. Garcia. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) och CeNDR, som finansieras av NSF Living Collections CSBR 1930382. Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (U2CES030167).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| 10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
| 100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
| 1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
| 1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
| 190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
| 2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
| Agar | Sigma | 05040-100G | |
| Agarose | Sigma | A9539-500G | |
| BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
| Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
| Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
| Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
| Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
| Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
| Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
| Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
| Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
| HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
| Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
| Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
| Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
| MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
| Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
| Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
| Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
| Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
| Peptone | Sigma | P7750-100G | |
| Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
| Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
| Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
| Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
| Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
| Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
| Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |
References
- Félix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Brenner, S. The genetics of behaviour. British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).
- Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment. Scientific Reports. 7 (1), 9839 (2017).
- Loer, C. M., et al. Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4). Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).
- Li, Y., Paik, Y. K. A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans. BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).
- Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).
- Fritz, J. A., Behm, C. A. CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity. PloS One. 4 (4), 5117 (2009).
- Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
- Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Kaplan, F., et al. Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage. PLoS One. 6 (3), 17804 (2011).
- Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
- Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology. PLoS Genetics. 10 (2), 1004156 (2014).
- Rosenblatt, M. A central limit theorem and a strong mixing condition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology. Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).
- Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
- Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
- Kevin, S., Pulak, R. Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System. C. elegans. Methods in Molecular Biology. Strange, K. 351, Humana Press. 275-286 (2006).
- Lee, D., et al. Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).
- Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).
