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Genetics

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

doi: 10.3791/61453 Published: May 5, 2021

Summary

omics 연구에서 Caenorhabditis elegans (C. elegans)를사용하려면 비교 분석을 위해 플랫폼 간에 단일 샘플을 측정 할 수있는 많은 웜 인구를 생성하는 방법이 필요합니다. 여기서는 대규모 배양판(LSCP)에 대한 C. 예인대 인구를 배양하고 인구 증가를 문서화하는 방법이 제시된다.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans)는발달 생물학, 노화, 신경 생물학 및 유전학을 연구하는 귀중한 모델 유기체로 남아 있습니다. C. elegans에 대한 작업의 큰 몸은 복잡한 생물학적 구성 요소와 다른 유기체와의 관계를 해부하기 위해 대규모 인구, 전체 동물 연구에 통합하는 이상적인 후보입니다. 협업 -omics 연구에서 C. elegans를 사용하기 위해서는 비교 분석을 위해 다양한 플랫폼에서 단일 샘플을 분할하고 분석 할 수있는 많은 동물을 생성하는 방법이 필요합니다.

여기서, 대규모 배양판(LSCP)에 풍부한 혼합단계 C. 엘레간 집단을 배양하고 수집하는 방법과 후속 현상데이터가 제시된다. 이 파이프라인은 -omics 실험(예: 유전체학, 전사학, 프로테오믹스 및 메타볼로믹스)에 필요한 데이터와 함께 현상 및 인구 데이터를 수집하기에 충분한 수의 동물을 산출합니다. 또한 LSCP 방법은 동물 자체에 대한 최소한의 조작이 필요하며, 사용자 준비 시간이 적으며, 환경 제어를 강화하며, 전체 적인 재현성을 위해 연구 전반에 걸쳐 각 시료의 처리가 일관되도록 보장합니다. 마지막으로, 주어진 LSCP에서 C. elegans 생명 단계의 인구 규모 및 인구 분포를 문서화하는 방법이 제시됩니다.

Introduction

C. elegans는 다양한 자연 서식지1에서전 세계적으로 발견되는 작은 자유로운 살아있는 선충입니다. 성장의 상대적 용이성, 빠른 세대 시간, 재생 시스템 및 투명한 신체는 발달 생물학, 노화, 신경 생물학 및 유전학2,3에서널리 연구된 강력한 모델 유기체입니다. C. elegans에 대한 풍부한 작업은 표현형을 복잡한 생물학적 구성 요소와 포괄적으로 연결하는 -omics 연구에서 사용할 수있는 유력한 후보이며 주어진 유기체에서의 관계를 포괄적으로 연결합니다.

협업 -omics 연구에서 C. elegans를 사용하려면 단일 샘플을 분할하고 비교 분석을 위해 다양한 플랫폼과 기기에서 사용할 수있는 동물의 큰 혼합 단계 인구를 생성하는 방법이 필요합니다. 이러한 샘플을 생성하기 위해 파이프라인을 만들려면 식단, 환경, 스트레스, 인구 구조 및 샘플 처리 및 수집에 대한 예리한 인식이 필요합니다. 따라서 대규모 파이프라인에 통합된 표준 및 재현 가능한 배양 조건을 갖는 것이 중요합니다. C. elegans 연구에서는 아가 페트리 요리와 액체 문화4- 두 가지 전통적인 방법은 벌레를 문화하는 데 사용됩니다.

역사적으로, 대량의 C. 예인이 필요할 때, 그들은 액체 배양4에서재배된다. 액체 배양에서 벌레의 큰 인구를 생성하는 관련시킨 단계는 수시로 중력 성자 큐티클을 파열하기 위하여 표백제 동기화를 포함하는 다중 취급 단계를 요구합니다, 원하는 인구 크기를 달성하기 위하여 태아를 풀어 놓습니다. 그러나 표백제 동기화를 사용하면 인구 증가가 인구 조사 시작 크기에 따라 달라지므로 후속 증가와 인구 수에 영향을 미칩니다. 또한, C. 예레간 균주는 표백제 동기화에 대한 큐티클 감도, 노출 시간 및 응력 반응에 따라 달라지므로 한 번에 많은 균주를 분석하기가 어렵고5,6,7,8,9.

또한, 액체 배양의 벌레 성장은 여러 세대에 걸쳐 자라면 쉽게 발생하고식품(10)의존재에도 불구하고 다이어 형성으로 이어질 수 있기 때문에 수확하기 전에 한 세대의 벌레만 성장하는 것이 좋습니다 때 몇 가지 전송 단계가 필요합니다. Dauer 형성은 종종 "dauer 페로몬"11,12,13,14라고도하는 소신호 분자를 통해 발생하며, 액체 매체로 방출되어 인구의 성장에 영향을 미친다. 더욱이, 액체 배양에서 큰 벌레 인구증가는 배양에 있는 과잉 박테리아 축적으로 이끌어 내고, 다운스트림 phenotypic 분석은 위해 깨끗한 견본이 필요할 때 어려움을 만듭니다. 마지막으로, 액체 배양이 오염되면 곰팡이 포자 나 세균 세포가배지(15)에걸쳐 쉽게 분산되기 때문에 유지가 더 어려워진다.

C. elegans를 재배하는 다른 전통적인 방법은 아가 페트리 요리에 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 Petri 접시를 사용하면 액체 배양에서 볼 수 있듯이 과밀과 높은 dauer 형성의 급속한 영향없이 여러 세대의 혼합 단계 벌레를 쉽게 성장시킬 수 있습니다. 그러나, 전통적인 한마페트리 요리에 벌레 성장에 단점은 가장 큰 상업적으로 사용할 수 페트리 접시표백제 동기화 단계에 추가하지 않고 -omics 연구에 대한 큰 벌레 인구를 산출하지 않는다는 것입니다. 요약하자면, 한천 페트리 접시에 C. elegans의 혼합 단계 인구를 배양하는 것은 -omics 데이터를 수집하는 데 더 적합하지만, 우리는 액체 배양없이 매우 큰 인구 크기를 생성하는 방법이 필요했습니다.

여기서는 대규모 배양판(LSCP)에서 대규모 혼합단계 C. 예레간 인구를 배양하고 수집하는 방법을 제시합니다. 이 파이프라인을 통해 샘플을 수집하면 -omics실험(예:유전체학, 전사학, 프로테오믹스 및 메타볼로믹스)에 필요한 데이터와 함께 현상 및 인구 데이터를 수집하기에 충분한 샘플을 얻을 수 있습니다. 또한 LSCP 방법은 동물의 최소한의 조작, 사용자 준비 시간 감소, 엄격한 환경 제어 제공, 전체 재현성을 위한 연구 전반에 걸쳐 각 시료의 처리가 일관되도록 보장합니다.

Protocol

1. LSCP 및 장비 소독

  1. 실험을 시작하기 전에 유리 LSPS를 손씻고 식기 세척 및 후속 오토클레이빙으로 준비하여 유리 제품이 오염물질이 없도록 합니다. 사용 전까지 는 자동 LSC를 깨끗한 건조한 위치에 보관하십시오.
    참고: LSCP가 식기 세척기와 오토클레이브안전성인지 확인하십시오. LSCP 뚜껑이 식기 세척기의 안전한지 확인하십시오.
  2. 식기 세척에 이어 손씻기로 LSCP 뚜껑을 준비하십시오. 필요할 때까지 LSCP 뚜껑을 깨끗한 쓰레기통에 보관하십시오.
  3. 이날 선충성장미디어 아가로즈(NGMA)가 준비된 날, LSCP 뚜껑을 10% 표백액으로 두 번 닦아70% 에탄올이 그 뒤를 잇고 있습니다. 표백제 10%와 에탄올 70%로 닦아지면 LSCP 뚜껑을 NGMA가 준비되는 라미나르 플로우 후드의 깨끗한 쓰레기통에 보관하십시오.

2. 선충 성장 미디어 아가로즈 준비 (NGMA)

  1. 다음 시약을 오토클레이브 2 L Erlenmeyer 플라스크에 교반 바에 스티드 바에 결합하여 NGMA를 준비하십시오: 2.5 g 펩톤, 3 g NaCl, 7 g 아가로즈, 10 g agar, 975 mL 멸균 물16. 총 볼륨이 1L. 테이프에 호일 캡과 같은지 확인합니다.
    참고: 여기에 설명된 NGMA에 대한 준비 단계는 2.5 LSCP에 충분한 재료를 산출합니다. 프로토콜은 지정된 실험에서 필요한 LSCP 배치 크기에 맞게 조정할 수 있습니다.
  2. 액체 사이클에 자동 클랩 121 °C 및 21 p.s.i. 45 분.
  3. 수조를 켜고 50 °C로 설정합니다. 50 °C로 식히기 위해 수조에 오토클레이브 NGMA를 가져옵니다.
  4. NGMA의 L Erlenmeyer 플라스크 2를 후드 또는 청소 공간에 넣고 교반 접시에 놓습니다. 온도계를 사용하여 NGMA 온도를 추적합니다.
  5. NGMA가 50°C에 도달한 후, 후드 또는 청소 공간 내부에 멸균 일회용 파이펫으로 나열된 순서에 다음을 추가하십시오: 1 M KH2PO4 (K 인산염 완충제)의 25 mL, 콜레스테롤 1mL (에탄올의 5mg /mL), 1 mL 의 1 M CaCl2,1 mMgSO4의1 mL, 1 mL nystatin (10mg/mL), 및 1 mL의 연쇄상 구균 (100 mg/mL)16.
  6. 400mL의 NGMA를 멸균 유리 LSCP에 넣고 깊이약 1.3cm로, LSCP가 후드의 평평한 표면에 고화하고 오토클레이브 호일 뚜껑을 LSCP에 다시 배치할 수 있도록 합니다.
  7. 한천이 설정되면 호일을 제거하고 깨끗한 공기 가밀 뚜껑을 LSCP에 놓고 저장을 위해 4 °C로 이동하십시오. 사용 및 5 일 이내에 사용할 때까지 LSCPs에 NGMA를 저장합니다.

3. LSCP에 NGMA를 위한 대장균 사료 생성

  1. 안정적인 식품 원을 생성하려면 중앙 한계정리(17)와일치하는 작은 배치 평균 개념을 사용하여 HT115(DE3) 대장균의 배치를 생성한다. -80 °C에 보관하십시오. 필요한 경우 대장균 세균 육수(들)를 -80°C에서18해동으로끌어당깁니다.
    참고 : 이 프로토콜에서 대장균 균증은 생물 반응기에서 재배되었습니다. 문화가 성장하면 문화가 1:50으로 희석되었고 측정된 OD600은 0.4였습니다. 따라서, 문화는 20의 효과적인 OD600을 가졌다. 박테리아는 0.5 g/mL(젖은 중량)의 농도로 K 배지에서 펠릿, 계량 및 재중단되었고, 2mL 알리쿼트로이송되고, 냉동 19.

4. NGMA의 세균 잔디

  1. 전체 LSCP가 RT에 도달 할 수 있도록 세균 잔디를 확산하기 전에 몇 시간 동안 실온 (RT)에 4 ° C에서 NGMA LSC를 가져옵니다.
  2. -80°C에서18년해동까지 필요한 대장균 육수를 빼낸다.
  3. 희석 대장균 세균 육수 (들)와 2 mL의 멸균 K-배지는 NGMA LSCP 당 4 mL에서 0.5 g E. 대장균을 달성한다. NGMA LSCP의 중간에 E. 대장균의 조심스럽게 파이펫 4 mL.
  4. 멸균 스프레더를 사용하여 박테리아를 사각형으로 퍼뜨리면 NGMA E. 대장균의 가장자리 주위에 약 3.8cm의 공간이 없습니다.
  5. E. 대장균 서스펜션이 완전히 건조되도록 하기 위해 1h에 팬과 함께 후드에 E. 대장균을 사용하여 NGMA LSCP를 둡니다.
  6. 세균 잔디가 건조되면 뚜껑을 단단히 밀고 사용할 때까지 4 °C에 보관하십시오.

5. 샘플 전반에 걸친 스트레스와 연령 변동성을 줄이기 위해 벌레를 청크

  1. 새로 시드 된 6cm 플레이트4에냉동 웜 주식에서 줄무늬 벌레. 이 플레이트는 "마스터 청크" 플레이트역할을 합니다.
    참고 : 청크는 동종 균주(20)에서웜을 전송하는 최적의 방법입니다. 균주가 이종화구스이거나 따기와 짝짓기로 유지관리해야 하는 경우 청크는 바람직하지 않습니다. 청크 주파수는 사용되는 웜 유전자형, 성장을 위해 선택한 온도 및 다운스트림 단계에 따라 최적화해야 할 수 있습니다.
  2. 마스터 청크 플레이트가 건강한 그레이드 성인(약 3일)으로 가득 차서 여전히 존재하는 대장균 잔디가 많이 있는 후, 웜북에 설명된 바와 같이 표준 C. elegans 청크 가이드라인을 따라 총 4개의 총 청크 플레이트4를생성한다.
  3. 그렇지 않으면 성장을 위해 지정하지 않는 한 제어 온도 (CT) 방에 모든 청크 플레이트를 저장합니다.
    참고: 이 프로토콜의 사용자가 여기에 설명된 대로 CT 룸에 액세스할 수 없는 경우 온도를 조절할 수 있는 작은 인큐베이터 또는 환경 조건을 가능한 한 많이 제어할 수 있는 지정된 방을 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 대체 옵션을 사용할 수 없는 경우 샘플 증가의 변동이 더 클 수 있습니다.
  4. 4th 청크 플레이트에서 많은 중력 성인이 관찰되면 6 단계로 이동하십시오.

6. LSCP에 표백 중력 성인을 스팟

참고 : 이 표백 기술은 대부분의 오염 물질을 근절하고 성인 벌레에서 배아를 방출하는 헤르마프로디테인의 큐티클을 용해시키는 데 사용됩니다. 표백제 용액은 태아부화 전에 NGMA에 흡수됩니다.

  1. 표백 벌레를 발견하기 전에 몇 시간 동안 LSCP를 RT로 가져옵니다.
  2. ddH2O의 7:2:1 비율을 준비 : 표백 : 5 M NaOH. 이 알칼리성 하이포염소염 용액을 사용하기 직전에 신선하게 만드십시오.
    참고: 표백제 배치에 영향을 주지 않도록 주어진 실험 기간 동안 동일한 표백제와 NaOH를 사용하십시오. 이 프로토콜에 사용된 표백제는 5-10% 하이포염소산나트륨이었다.
  3. 번센 버너를 밝히고 벌레 를 불태우기 전에 불을 붙입니다. LSCP의 세균 잔디 가장자리에서 멸균 된 선택에 신선한 대장균을 국자합니다.
  4. 스팟 표백을 위해 4번째 청크 플레이트에서 하나의 그레이드 성인을 선택합니다.
  5. 알칼리성 하이포염소염용의 피펫 5 μL이 대장균 잔디밭에서 멀리 떨어진 LSCP의 한 구석으로 들어갑니다.
  6. 수확한 그레이드 성인을 5 μL 알칼리성 하이포염 용액에 넣습니다. 선충을 탭하여 표피를 방해하고 계란을 방출하십시오.
  7. 총 4배의 경우 6.4 - 6.6단계를 반복하고 대장균 잔디밭 주변에 5명의 중력 성인을 고르게 배치합니다. 거의 유전적 동위 원소 개인이 주어진 샘플에 추가되도록 동일한 4th 청크 플레이트에서 5 명의 gravid 성인을 모두 선택하십시오.
  8. 뚜껑을 LSCP에 다시 놓습니다.
  9. 모든 LSPS에 대한 단계를 반복합니다.

7. 제어 온도 (CT) 방의 벌레 성장

  1. 스팟 표백에 따라 뚜껑을 LSCP에 단단히 놓고 CT 룸에 일정한 기류와 12L:12D 포토기간(12h 광및 12h 어둠)으로 설정된 CT 룸에 놓습니다.
  2. 샘플이 CT 룸에 배치된 시간과 위치를 기록합니다.
    참고: 실내의 위치는 항상 기록되어 성장하면서 발생할 수 있는 샘플이 발생할 수 있는 환경 적 차이를 기록해야 합니다. 샘플이 CT 룸에 있으면 지정된 자리에 방해받지 않고 있어야 합니다. 오염 가능성을 줄이기 위해 CT 룸에서 LSCP의 뚜껑을 열지 마십시오.
  3. LSCP를 CT 실 외부의 현미경으로 가져가서 인구 증가와 밀도를 관찰하십시오.
    참고: 각 C. elegans 변형 및 샘플의 성장에 따라 달라집니다., 그래서 밀접 하 게 샘플을 모니터링. CT 룸에있는 동안 LSCP의 성장을 방해하지 않는 것이 좋습니다 동안, LSCP는 CT 방에서 전송하고 뚜껑은 샘플 성장을 모니터링하기 위해 2 일마다 열렸다. 밀봉된 뚜껑을 2일마다 LSCP에서 떼어내어O2가 LSCP로 유입될 수 있습니다.
  4. 수확하기 전에 LSCP가 많은 웜 개체수로 가득 차 있는지 확인합니다. 다음 기준을 사용하여 LSCP를 수집할 준비가 되었는지 여부를 결정합니다.
    1. LSCP가 중력 성 병으로 가득 차 있는지 확인하십시오.
    2. 플레이트에 큰 모집단 크기(즉, 벌레가 한천의 전체 표면을 덮는)가 포함되어 있는지 확인합니다.
    3. 접시에 한고 표면에 많은 계란이 없는지 확인하십시오(즉,최대 웜 수가 부화했어야합니다).
    4. 접시에 대장균이 최소한 지 확인하여 벌레가 굶어 지고 접시에 2일 동안 방치하면 더 많은 것을 생성합니다.
      참고: 대부분의 LSCP는 변형및 시료에 따라 10일에서 20일 사이에 수확할 준비가 되어 있지만, 정상적인 수확 시간을 결정하기 위해 이 프로토콜을 수립할 때 각 LSCP를 자주 확인하십시오.
  5. 균주 간 교차 오염을 방지하기 위해 LSC를 처리하는 사이에 70 %의 에탄올이있는 깨끗한 장갑과 영역.

8. LSCP 샘플 수확

  1. 시료를 채우기 전에 원심분리기를 4°C로 식힙니다.
  2. LSCP당 50mL의 M9 용액을 수확할 수 있는 50mL 원추형 튜브 3개.
  3. LSCP당 15mL 원뿔튜브를 라벨로 지정합니다.
    참고: 모든 원심 분리 단계는 15mL 원추형 튜브에서 수행되는데, 이는 벌레가 이러한 튜브에서 잘 펠릿하는 경향이 있기 때문입니다.
  4. 50mL의 M9 용액(8.2단계 50mL 원뿔관에서)을 LSCP 표면에 붓고 소용돌이쳐 M9이 NGMA 표면 전체를 덮도록 합니다.
  5. M9이 LSCP 표면에 있는 동안 M9이 있는 멸균 세로지컬 파이펫을 프라임합니다.
    참고: M9로 멸균 세로지학적 파이펫을 프라이밍하여 덜 웜이 플라스틱 파이펫 내부에 달라붙어 시료 손실을 방지합니다.
  6. LSCP를 기울여 M9과 웜 모집단이 LSCP의 한 구석에 모이게 됩니다.
    참고: LSCP의 M9 용액과 웜의 혼합물을 다운스트림 단계의 "웜 서스펜션"이라고 합니다.
  7. 자동 파이펫, 파이펫 웜 서스펜션이 있는 프라이밍 세로지피펫을 사용하여 원래 50mL 원판 튜브에 넣습니다. 50mL의 벌레 현탁액이 수집되면 원추형 튜브를 로커에 배치하여 박테리아 덩어리와 파편을 방해합니다.
  8. LSCP당 웜 서스펜션 150mL를 수집하여 8.4 - 8.7단계를 반복한다.
  9. 3개의 50mL 원뿔관 중 하나에서 15mL의 벌레 서스펜션을 전송하여, 8.3단계에서 따로 따로 설정된 15mL 원뿔관에 부어 넣습니다. 원심분리기 는 4°C에서 1분 동안 884 x g에서 15mL 원원형 튜브를 원심분리합니다. 벌레의 대부분은 튜브의 바닥에 펠릿 것입니다.
  10. 웜 펠릿을 방해하지 않도록 하는 상류체를 흡입합니다.
  11. 동일한 15mL 원문 튜브 반복 단계에 약 13mL의 웜 서스펜션을 계속 추가하여 150mL의 웜 서스펜션이 모두 소모될 때까지 8.9 및 8.10단계를 반복한다. 튜브를 반전시키고 원심분리 사이에 펠릿을 방해하여 가능한 한 많은 박테리아와 이물질을 씻어내십시오.
    참고: 이 단계에서, 3개의 50mL 원판 관의 내용물모두 15mL 튜브 하나에 응축됩니다.
  12. 15mL 원추형 튜브에 깨끗한 M9 10mL를 추가하고 반전하여 벌레 펠릿을 교반합니다. 원심분리기 는 4°C에서 1분 동안 884 x g에서 15mL 원원형 튜브를 원심분리합니다. 웜 펠릿을 방해하지 않도록 하는 상류체를 흡입합니다. 두 번 반복합니다.
    참고: 시료에 많은 양의 이물질이나 박테리아가 있는 경우 샘플이 깨끗할 때까지 8.12단계를 반복하십시오.
  13. 샘플이 깨끗해지면 총 10mL의 ddH2O 및 웜에 ddH2O를 웜 펠릿에 추가합니다. 반전하여 벌레 펠릿을 동요. 웜이 삼투압을 피하기 위해 5분 이하의 ddH2O에 있어야 하므로 9.1 단계로 빠르게 이동하십시오.
    참고: ddH2O에서 웜 펠릿을 일시 중단하는 것은 다운스트림-omics 단계에 가장 선호하는 용매이다. 지정된 실험 워크플로우와 호환되는 경우 웜을 다른 용매 또는 버퍼에서 일시 중단할 수 있습니다.

9. 인구 규모 추정

참고: 9.1 단계 - 9.7 단계를 빠르게 통과하십시오. 8.13 단계에서 ddH2O 및 웜의 혼합물을 후속 단계에서 "웜 샘플"이라고 합니다.

  1. 웜 샘플을 피펫팅하기 전에 M9과 함께 사용할 수 있는 프라임 파이펫 팁은 플라스틱 파이펫 내부에 달라붙는 웜을 방지하여 시료 손실을 방지하고 개수 변동을 감소시킵니다.
  2. 웜 샘플의 100 μL 알리쿼트를 가져 와서 900 μL의 M9로 희석하십시오. 잘 섞어서 직렬 희석을 합니다(1:10, 1:100, 1:1000). 이 단계를 두 번 반복하여 총 3세트의 알리쿼트 복제를 달성합니다.
    참고: 피펫팅 웜은 샘플 채우기 수의 가변성을 유발할 수 있습니다. 원하는 알리쿼트 파이프를 피펫하기 전에 웜 샘플이 균일한지 확인합니다.
  3. 알리쿼트계산하는 동안 이동 문화를 계속 로커에 15 mL 원원 튜브를 설정합니다.
  4. 웜 샘플이 잘 혼합되고 균일한지 확인합니다. 1:10 웜 샘플에서 파이펫 5 μL을 분배하여 현미경 슬라이드에 분배하고 웜 수를 계산합니다. 이 숫자가 약 50개의 웜 미만인 경우 1:100 및 1:1000 희석제도 계산합니다. 50 이상인 경우 다음 직렬 희석으로 이동합니다.
    참고: 웜을 너무 많이 계산할 수 없는 경우 다음 직렬 희석을 사용하여 계산합니다.
  5. 각 희석 3배의 각 알리쿼트 복제를 계산합니다. 계산의 끝에서, 대부분의 문화권에 대 한, 9 총 카운트 문서화 됩니다(즉,3 각 aliquot 복제에 대 한 총 카운트).
  6. 희석 수를 평균하여 웜 샘플의 예상 인구 크기를 결정합니다. 이러한 희석 카운트는 -omics 단계에 대해 원하는 알리쿼트 크기를 만드는 데 필요한 웜 샘플의 부피를 결정합니다.
    참고: 이 실험에서는 약 200,000개의 혼합 단계 웜의 알리쿼트가 생성되었습니다. 또한, 약 50,000개의 혼합단계 웜의 한 알리쿼트가 큰 입자 흐름 사이토미터(10단계에서 설명)에서 정렬하기 위해 따로 설정되었다.
  7. 웜 샘플이 적절한 알리쿼트로 분할되면 액체 질소에 플래시가 고정되어 샘플을 -80 °C에 저장합니다.
    참고: 큰 입자 흐름 세포측정을 위한 알리쿼시를 동결하지 마십시오.

10. (선택 사항) 큰 입자 흐름 세포측정을 위한 샘플 준비

참고: 10, 11, 12단계는 저자가 선호하는 방법으로 표본증가(즉,인구 규모 및 C. elegans 수명 주기 단계의 인구 분포)를 기록하고 문화의 성공을 결정하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 사용자는 옵션 단계 10, 11 및 12를 자체 성장 성공 지표로 대체할 수 있습니다. 10, 11, 12단계는 두 가지 이유로 여기에 설명되어 있습니다. 첫째, 10단계, 11, 12단계에서 장비를 사용하는 사용자가 이러한 단계와 두 번째 단계를 복제하여 이 성장 방법의 유효성 검사를 표시할 수 있습니다. 위의 9단계는 aliquot 크기를 결정하기 위해 총 벌레 수를 양호하게 추정하고, 10단계는 주어진 샘플에서 웜의 수와 인구 분포를 추정하기 위한 보다 정량적인 지표이다.

  1. M9 용액에서 약 50,000개의 혼합 단계 벌레(9.6단계에서 따로 설정)의 알리쿼트(aliquot)를 최대 10mL의 총 부피로 가져옵니다.
  2. 대장균 1 mg/mL및 0.5 μM 적색 형광 마이크로스피어19의1:50 희석으로 구성된 용액을 만든다.
  3. 이 솔루션의 200 μL을 M9의 혼합 단계 웜 10mL에 추가하고 20 분 동안 흔들면서 인큐베이션하십시오.
  4. 20 분 후, 원심 분리기는 4 °C에서 1 분 동안 884 x g에서 15 mL 원심 관을 원심 분리합니다.
  5. 웜 펠릿을 방해하지 않도록 하는 상류체를 흡입합니다.
  6. 과도한 박테리아와 적색 형광 마이크로스피어를 제거하기 위해 M9 용액으로 웜 펠릿을 두 번 세척합니다.
  7. 벌레 펠릿에 5mL의 M9을 추가하고 펠릿이 깨끗하게 보이도록 하십시오. 펠릿이 깨끗한 경우, 50mM 나트륨 아지드와 M9의 5mL를 추가하여 정확한 계산 및 크기 조정21을위해 벌레를 곧게 펴고 죽입니다.
  8. 아지드 나트륨을 샘플에 첨가할 때 문서 시간과 날짜를 문서화합니다.
  9. 큰 입자 흐름 세포측정에 필요할 때까지 로커에 샘플을 따로 놓습니다.
    참고: 아지드 나트륨은 선충생리학(즉,신체 길이, 신진 대사 및 열성 편도)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 따라서, 이러한 생리적 영향의 대부분이 분22의 문제 내에서 발생으로 벌레가 나트륨 아지드에 노출되는 시간을 주의하는 것이 중요합니다. 벌레에 나트륨 아지드의 알려진 생리적 효과로 인해,이 치료는 다운 스트림 이미지 품질에 영향을 미치고 고려해야합니다.

11. (선택 사항) 인구 분포를 문서화하고 이미징을 위한 384웰 플레이트 준비

참고: 11단계는 큰 입자 흐름 사이토미터(LPFC)를 사용합니다. LPFC에 대한 기본 지식은 이 프로토콜에서 가정됩니다. 다른 방법은 샘플의 증가 및 인구 분포를 문서화하기 위해 대체 될 수있다. 여기에 문서화된 단계는 파이프라인23에서LPFC를 사용할 계획인 사용자를 위한 것입니다.

  1. LPFC를 켜고, 청소하고, 프라임하고, 레이저(들)가 샘플을 정렬하기 전에 1시간 동안 따뜻하게 할 수 있도록 합니다.
  2. 레이저가 따뜻해진 후 ,"히스토그램"프로필을열고 2050년 비행 시간(TOF)으로 확장합니다.
  3. TOF 범위가 100에 달하는"히스토그램"에막대 영역을 추가합니다. 첫 번째 바 영역은 50-150T의 TOF를 다룹니다.
  4. TOF 범위가 100에 걸쳐 각각 20개의 막대 영역을 계속 만듭니다. 이 바 지역은 50~2050년의 전체 TOF 범위에 걸쳐 있습니다. TOF 배포에서 사용할 정확한 게이트 영역의 보충 표 1을 참조하십시오.
  5. 이 히스토그램을 저장"실험"향후 LPFC 실행에 사용할 수 있습니다.
  6. 보정된 384웰 플레이트 또는 교정 장비를 384웰 플레이트로 선택하여 물체를 분배합니다.
  7. 보정된 384웰 플레이트 템플릿에 들어가면 템플릿을 설정하여 11.3-4 단계 동안 생성된 20개의 막대 영역 각각에 대해 게이트된 개체 20개를 4개의 우물(각 게이트 영역의 4개의 기술 복제)에 분배하도록 설정합니다. 384웰 플레이트에 웜을 분배하는 방법의 예를 들어 보충 표 2를 참조하십시오.
  8. 10.9단계에서 50mL 원물 튜브로 샘플을 전송하고 M9 솔루션을 추가하여 약 40mL 의 총 부피를 달성합니다.
  9. 11.7 단계에서 설정된 파라미터당 샘플을 자동으로 정렬하는 동시에 샘플을 지속적으로 교반하여 샘플에서 보정된 384웰 플레이트로 물체를 침전하고 동시에 분배하는 것을 방지합니다.
    참고: LPFC의 유속량이 초당 15~20개의 객체를 작동하고 정렬할 더블을 지정하지 않도록 합니다.
  10. 전체 샘플을 정렬하고 최대 게이트 영역 수가 384웰 플레이트에 분배되면 LPFC 및 클린 기기에서 샘플을 제거하십시오.
    참고: TOF 영역이 클수록 해당 TOF 지역의 낮은 이벤트 수로 인해 384웰 플레이트를 계속 채우는 것이 어려울 수 있습니다. C. elegans 생명 단계가 샘플부족 이전에 LPFC 분포 내에 속하는 위치를 최대한 잘 알아내기 위해 가능한 한 많은 문이 있는 영역을 채웁니다.
  11. 384웰 플레이트 위에 밀봉 필름을 놓습니다.
    참고: 샘플이 아지드나트륨(22)으로처리되기 때문에 선별 후 가능한 한 빨리 이미지 플레이트. 적색 형광 마이크로스피어는 수집된 LPFC 데이터파일(즉, 출력 텍스트 파일의 PH Red 데이터)에서 볼 수 있으며, 각 정렬된 개체에서 방출되는 적색 형광 의 수준에 기초하여 어떤 물체가 살아있는 벌레, 죽은 벌레, dauers, 또는정크(24)인지식별할 수 있다.

12. (선택 사항) 이미징 384 웰 플레이트

참고: 12단계는 판읽기 마이크로 공초점 현미경을 사용합니다. 마이크로 공초점 현미경의 기본 지식은이 프로토콜에서 가정된다. 다른 방법은 샘플의 증가 및 인구 분포를 문서화하기 위해 대체 될 수있다.

  1. 20x 렌즈가 있는 플레이트 판독 마이크로 공초점 현미경을 사용합니다.
  2. "목표와카메라"탭을 열고"10x 계획 ApoLambda"모드로설정합니다.
  3. "카메라비닝"탭을열고"2"로설정합니다.
  4. "플레이트에 방문 하는 사이트"탭 및 설정"4"잘 당 사이트 및"중복 사이트 10%"나중에 함께 이미지를 스티치.
  5. "파장"탭을 열고"브라이트필드 1"로설정합니다.
  6. "일루미네이션"탭을 열고"전송된 빛, 밝은 샘플"로설정합니다.
  7. 현미경에 384웰 플레이트를 놓고"Z 스택"을"오프셋 계산"으로설정하고 384 웰 플레이트의 시료에 적합한 초점 평면을 찾습니다.
  8. 마이크로 공초점 현미경에서 384웰 플레이트를 잘 하여 4개의 이미지를 수집합니다.
  9. 네 개의 이미지를 함께 몽타주하여 잘 이미지 한 개씩 만듭니다.

Representative Results

LSCP 방법을 사용하는 C. elegans의 성장은 12.2 일 동안 샘플 당 평균 약 240 만 개의 혼합 단계 웜을 산출합니다. LSCP 방법을 사용하여 C. elegans의 성장을 통해 사용자는 대규모 -omics 연구(그림 1)에이상적인 동물의 처리 및 조작이 거의없는 C. elegans의 큰 혼합 단계 인구를 생성 할 수 있습니다. LSCP가 성인 벌레로 가득차 있고, 인구 규모에 도달하고, 최소한의 박테리아가 남아 있으면 사용자는 인구 크기를 수확하고 추정할 수 있습니다. 이 점은 또한 인구가 -omics파이프라인(그림 2)에서사용하기에 충분한지 여부를 평가하여 품질 관리역할을 할 수 있다. 인구 역학은 변형 자체, 균주의동작(즉,잠복 균주가 웜 회수율이 낮은 경향이 있음) 및 성장성공(즉,오염)에 의존한다. LSCP 방법은 15개의 C. 엘레간에서 Caenorhabditis 유전학 센터(CGC) 돌연변이및 케노르하비티스 엘레간 천연 다양성 자원(CeNDR) 야생균주(25)의혼합물을 포함하는 C. 엘레건의 균주에 대해 시험하였다. 균주 유전형은 보충표 3에 기재되어있다.

LSCP 방법은 약 94,500에서 9,290,000까지의 인구 크기를 산출했습니다. 기준 균주, PD1074 및 균주 전반에 걸쳐 평균 인구 크기는 약 240만 개의웜(그림3)이었다. 평균 12.2 LSCP 성장일(그림4)의과정에서 C. elegans 균주 사이의 추정 인구 규모에서 유의한 차이가 발견되지 않았습니다. PD1074 LSPS는 전체 혼합 단계 인구로 성장하는 데 10 - 14 일 사이에 걸렸다. PD1074의 평균 성장률시간은 10일이었다. 가장 느린 성장균은 최대 20일 동안 증가했으며, 가장 빠르게 성장하는 균주는 최소 10일 동안 증가하였다(그림4).

따라서 이 LSCP 방법을 사용하면 개발 타이밍 및 배경 전문 지식에 대한 지식이 거의 없는 새로운 관심 있는 균주를 연구에 쉽게 통합할 수 있습니다. 피킹에 의해 유지되어야 하는 균주와 표현형, fecundity 결함이 있거나 이종화구스이거나 성장 결함이 있는 경우이 파이프라인에서 잘 작동하지 않을 수 있습니다.

큰 입자 흐름 세포측정및 샘플 이미징을 통해 사용자는 인구 분포를 문서화할 수 있습니다. 성공적인 인구 증가를 측정하는 데 다양한 플랫폼을 사용할 수 있습니다.

재현 가능한 -omics 측정의 경우 일관된 문화를 성장시키는 것이 중요합니다. 배양 재현성 메트릭은 웜 수와 지정된 변형에 대한 일관된 크기 분포입니다. 우리는 LPFC23,26 및 마이크로 공초점 현미경 이미지를 성장 성공을위한 프록시로 사용하여 원래 N2 브리스톨 변형인 PD1074에 대한 샘플 분포를 보여줍니다. LPFC분포(그림 5),후속영상(도 6)에대한 중력성인을 통해 L1 단계에서 벌레를 측정한 바와 같이, 샘플(그림 7)에 대한 인구 분포의 변화(도7),이 파이프라인이 C. elegans의혼합단계 인구를 생성한 것을 볼 수 있다.

혼합단계 샘플의 인구 분포를 자세히 살펴보기 위해, 비행 시간(TOF) (즉, 신체 길이) 분포(그림7A,B)에걸쳐 각 지역에 속하는 웜의 백분율을 살펴보면서 35개의 PD1074 LSCPs의 분포를 살펴보았습니다.

Figure 1
그림 1: LSCP 웜 성장 파이프라인 개요입니다. (A)일단 실험실에서 접수되면, 모든 균주가 -80 °C2에서장기 저장을 위해 준비및 냉동되었다. (B)"마스터 청크" 플레이트는 냉동 웜 스톡으로부터 제조되어 15°C로 저장되어 1개월 이상 사용하지 않았다. (C)각 샘플은 LSCP에서 성장하기 전에 세대 스트레스를 줄이기 위해 4개의 연속 청크 단계를 거쳤습니다. (D)5 개의 개별 그라비드 성인은 단계 (D)에서 "덩어리 4"6cm 플레이트에서 선택되었으며 LSCP의 5 개 주어진 부위에 표백된 것을 발견하였다. (E)LSCP는 제어 온도실에 배치되어 LSCP가 성인 웜으로 가득 차서, 큰 인구 크기에 도달하고, 최소한의 박테리아가 남아있을 때까지 20°C에서 성장하였다. (F)웜 개체수가 하류 단계에 대해 수확및 수집하였다. (G)알리쿼트LS는 LSCP에서 만들어졌으며 다운스트림 원하는 응용 프로그램에 대해 플래시가 동결되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: LSCP 수확 및 추정 인구 규모 개요입니다. (A)M9의 50mL는 NGMA 표면에서 벌레를 씻어 내도록 사용되었다. 웜 서스펜션은 50mL 원원형 튜브로 피펫되었다. 단계(A)는 두 번 반복하였다. (B)15mL의 벌레 현탁액을 새로운 15mL 원심관에 부어졌다. 벌레는 원심분리에 의해 펠릿되었다. M9 + 파편은 벌레 펠릿을 방해하지 않고 흡입되었다. 단계(B)는 150mL의 모든 웜 서스펜션이 수집될 때까지 반복되었다. (C)벌레 펠릿은 남은 잔해를 제거하기 위해 M9로 세 번 세척및 원심분리되었다. 시료가 깨끗해지면, 벌레 펠릿은 ddH 2O.(D)의 10mL에서 재중단되었다(D) 샘플의 직렬 희석이 웜 인구 크기를 추정하기 위해 만들어졌다. 웜을 정확하게 계산할 수 있도록 허용한 희석 계수가 사용되었습니다. 사용되는 희석 계수는 LSCP의 모집단 크기에 따라 변경되었습니다. (E)희석 계수가 선택되면, 그 희석의 모든 3개의 알리쿼트 복제체로부터의 모든 웜이 깨끗한 슬라이드에 파이펫화되었고 벌레는 해부 현미경으로 계산되었다. (F)샘플은 적절한 크기의 알리쿼트로 분할되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: LSCP 방법은 평균 240만 개의 혼합 단계 웜 을 생성합니다. LSCP는 인구 증가율이 약 94,500명이며 인구 증가율은 약 9,290,000명으로 가장 큽습니다. 모든 균주에 걸쳐 평균 인구 규모는 240 만 웜이었다. C. elegans 변형 이름 아래의 막대는 변형이 CGC 돌연변이인지 또는 CeNDR 자연 분리인지 여부를 나타냅니다. LSCP 샘플 크기는 각 스트레인에 대해 표시됩니다. Tukey의 HSD 테스트를 사용하여 모든 쌍에 대한 비교가 수행되었습니다. C. elegans 균주 (F (14,108) = 0.7, p = 0.77)에 걸쳐 추정 된 인구 크기 사이에 는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 색상 막대는 각각의 C. elegans 변형 표현에 대한 표준 색상 디스플레이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: LSCP 방법은 10-20일 동안 큰 혼합 단계의 웜 집단을 생성했습니다. 주어진 C. elegans LSCP는 견본이 성인 벌레의 가득 차 있고, 큰 인구 규모에 도달하고, 최소한의 세균성 잔디가 남아 있었다 때까지 성장했습니다. LSCPs는 긴장에 따라 전체 혼합 단계 인구로 성장하는 데 10 - 20 일 사이에 걸렸습니다. 균주를 가로지르는 평균 성장 시간은 12.2일이었다. LSCP 샘플 크기는 각 스트레인에 대해 표시됩니다. 각 오류 표시줄은 평균에서 1개의 표준 편차를 사용하여 생성되었습니다. 동일한 문자로 연결되지 않은 수준은 크게 다릅니다. Tukey의 HSD 테스트를 사용하여 모든 쌍에 대한 비교. C. elegans 균주 (F (14,108) = 8.8, p < 0.0001 *)에 걸쳐 필요한 LSCP의 성장 시간 에서 상당한 차이가 발견되었습니다. 색상 막대는 각각의 C. elegans 변형 표현에 대한 표준 색상 디스플레이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 야생형 기준 균주 PD1074의 혼합 인구 및 성장 측정. 야생형 기준 균주의 LSCP 성장 1개, 원래 N2 Bristol 스트레인의 변형(PD1074)의 대표적인 LPFC 분포는 혼합단계 모집단의 크기 분포 및 이벤트 수를 문서화합니다. x축은 정렬된 웜의 길이(비행 시간, TOF)를 표시합니다. y축은 정렬된 웜의 광학 밀도(광학 소멸, EXT)를 표시합니다. 각 데이터 포인트는 샘플에 문서화된 웜입니다. 이미지 분석에 사용된 각 TOF 영역은 다른 색상으로 표시됩니다. 20TOF 지역은 50~2050년 TOF에 이르는 20개의 TOF 영역(R2 – R21)을 만들었습니다. 각 TOF 지역에 대한 자세한 내용은 보충 표 1에서 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: R2 – R12에 이르는 TOF 영역에서 정렬된 웜 이미지는 PD1074 LPFC 분포를 보여 준다. 지역 R2에서, L1 벌레는 확인될 수 있고 지역에서 R9는 주로 중력 성인이 확인됩니다, 우리에게 분포에서 단계가 예상되는 곳의 흐름 세포계 분포 내의 대략적인 지역을 주는 두 개의 발달 애벌레 극단에 걸쳐. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 대표적인 이미지는 도 5에표시된 LPFC 배포판에서 촬영되었으며, 컬러 박스는 그림 5의영역에 해당한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 야생형 기준 균주 PD1074의 비행 시간(TOF) 영역에 걸친 인구 분포입니다. 웜이 발견된 지역을 보여주는 TOF 전체 지역에 웜을 분포합니다. 각 PD1074 LSCP는 개별 색상으로 표시됩니다. (A)x축은 LSCP에 대해 관찰및 계산된 20개의 TOF 영역(R2 – R21)을 나타내며, 전체 크기 분포를 나타낸다. y축은 주어진 TOF 영역으로 떨어졌던 몸 크기가 있는 주어진 LSCP의 웜 의 백분율을 보여줍니다. (B)벌레 인구의 작은 분수가 R7-R21 영역 사이에 떨어짐에 따라 각 지역 내에 떨어진 웜의 백분율로 로그를 가져와 인구 분포를 표시하였다. x축은 R7-R21 TOF 영역을 표시합니다. y축은 지정된 TOF 영역에 빠진 바디 크기를 가진 지정된 LSCP의 웜 퍼센트 로그를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: LSCP가 재배되고 처리된 성장 조건의 평균 일일 온도(°C). 제어 온도(CT) 방의 보고된 온도는 6개월 동안 샘플 성장 및 수집을 통해 문서화및 수집되었습니다. 평균 일일 기온은 여기에 보고됩니다. LCSP가 프로젝트 기간 동안 증가한 온도(F(5,24) = 2.59, p = 0.0524 사이에는 큰 차이가 관찰되지 않았다. 전체 온도 차이는 샘플 성장 및 생성의 6 개월 기간 동안 0.003 °C 이하의 경연성이었다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: TOF 문이 있는 영역은 웜을 이미징을 위해 384웰 플레이트로 분류하는 데 사용됩니다. Binned 지역은 2050년까지 전체 TOF 분포에서 100T의 TOF에 걸쳐 만들어졌습니다. 게이트 된 영역을 변경하고 필요에 맞게 최적화 할 수 있습니다. 이미지 분석에 사용된 각 TOF 영역은 다른 색상으로 표시됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: TOF 영역의 384웰 플레이트 템플릿 및 복제 레이아웃. 모든 샘플은 이미징을 위해 384웰 플레이트로 분류되었습니다. 정렬을 위해 선택한 각 영역에 대해 4개의 복제가 만들어졌습니다. 게이트 된 영역을 변경하고 필요에 맞게 최적화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성되고 사용되는 특정 게이트 영역에 대한 보충 표 1을 참조하십시오. 이미지 분석에 사용된 각 TOF 영역은 다른 색상으로 표시됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 3: 이 프로토콜에 사용되는 C. elegans 균주는 CGC 및 CeNDR 균주의 혼합물을 포함합니다. 변형, 유전자형, 변형 소스 및 세부 사항은 이 표에 설명되어 있습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

다양한 선박을 LSCP로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 표준 유리 베이킹 접시가 사용되었습니다. 사용 중 LSPC는 35.56 x 20.32cm의 외부 치수를 가지고 있었고, 내부 치수는 27.94 x 17.78cm, 깊이는 약 4.45cm이며 장착 된 뚜껑이 함께 있었습니다. 따라서, 여기서 사용되는 박테리아의 양은 상기 차원을 가진 LSCP에 최적화되어 혼합단계 벌레의 큰 집단을 산출한다. 세균의 부피 및 농도는 실험적 요구에 맞게 조절될 수 있다.

곰팡이, 곰팡이 또는 기타 세균성 소스에 의한 오염은 LSCP 방법의 모든 단계에서 발생할 수 있으므로 주의해서 샘플을 처리하십시오. 프로토콜의 단계를 시작하기 전에 작업 공간이 70 % 에탄올과 10 %의 표백제로 청소되었는지 확인하십시오. 사용 가능한 경우, 30분 동안 UV 광이 있는 중고 지역을 치료하고 각 단계를 시작하기 전에 30분 전에 HEPA 공기 필터를 켭니다.

제어된설정(즉,20°C로 설정된 CT 룸)에서 LSCP를 성장시킴으로써, 사용자는 시료의 성장을 보다 쉽게 추적하고 잠재적오염을 문서화할 수 있다. LSCP의 표면이 오염되면 가능한 경우 오염을 잘라내고 오염을 제어할 수 없는 경우 시료가 계속 성장하거나 폐기하도록 합니다. 원치 않는 성장을 줄이고 자원을 위해 웜을 능가하지 않도록 신속하게 오염을 해결하는 것이 필수적입니다.

이 방법은 C. elegans의대규모 집단 집단 문화를 성장시키고자하는 사람들을위한 것입니다. LSCP에서 의 경우와 같이 상업적으로 사용 가능한 페트리 접시와 액체 문화에서 와 같이 동기화된 웜 개체수를 늘릴 수 있지만 저자는 이 옵션을 테스트하지 않았습니다. 또한 사용자가 지정된 샘플에서 평균 약 240만 개 이상의 웜을 성장시키고자 하는 경우 다른 방법을 권장합니다4. 성장 성공은 파이프라인에서 처리되는 변형에 따라 달라집니다. 저자는 성공적으로 15 C. elegans 긴장의 적어도 5개의 생물학 복제에 있는 대략 2.4 백만 벌레의 인구를 증가할 수 있었습니다, 방법이 견고하다는 것을 나타내는.

실험을 시작하기 전에 주어진 웜의 나이와 건강은 fecundity 및 후속 인구 증가 시간에 영향을 미칠 수 있음을 주의합니다. 이 파이프라인에 사용되기 전에 최소한의 스트레스로 웜을 건강한 조건에서 유지관리합니다. 재고 샘플이 생성, 동결 및 시간이 지남에 따라 유전 드리프트를 줄이기 위해 -80 °C에서 보관된 것으로 가정됩니다.

주어진 실험의 필요에 따라 LSCP에서 중력 성인을 시작하는 횟수를 변경할 수 있습니다. LSCP에서 시작 중력 성인의 수를 변경하면 성장률이 변경되므로 수확 할 시간이 변경됩니다. 5명의 중력 성인은 다음과 같은 이유로 각 LSCP를 시드하는 데 사용됩니다: (1) 한 번에 많은 C. elegans 균주를 LSCP에 종자하는 간단하고 빠르며 효율적인 방법이 필요했으며 (2) 성장 이질성으로 이어질 수 있는 그레이드 성인들 사이의 나이 차이를 줄이기 위해 필요하였다.

이 방법을 사용하면 모든 수명 주기 단계가 있는 많은 웜 군수를 수확할 수 있습니다. 현재 방법을 사용할 수 있는 C. elegans의 대규모 샘플을 수집하려면 다운스트림 작업에 원하는 웜 수를 얻기 위해 표백제 동기화가 필요합니다. 이러한 접근법을 감안할 때, 이제 표백제 동기화 및 다중 처리 단계와 관련된 어려움 없이 발효기 또는 대규모 액체 배양에서 가능한 한 많은 벌레를 자랄 수 있습니다. 당사의 프로토콜을 사용하면 관심 있는 균주를 효율적으로 타겟팅하고, 샘플 자체를 성장하는 데 최소한의 처리 시간을 사용하고, 다운스트림 파이프라인에서 필요에 따라 웜 또는 인구의 단계를 격리할 수 있습니다.

LPFC는 지정된 LSCP에서 인구 분포와 크기를 문서화하는 도구로 활용되었습니다. 사용되는 LPFC는 크기(TOF) 및 광학 밀도를 기반으로 웜을 분석, 정렬 및 분배하는 연속 유량 시스템입니다. 주어진 웜이 유동 셀을 통과할 때, 축 광 손실 검출기는 벌레가 통과하는 데 걸리는 시간 동안 488 nm-솔리드 상태 레이저에 의해 차단된 신호광의 양을 포착하여 사용자에게 웜의 TOF 및 광학 밀도를 제공합니다. 형광 수집 광학 및 검출기는 각 샘플의 형광 감도 및 수집을 극대화하기 위해 활용 될 수 있습니다. LPFC 컬렉션 매개 변수는 계측기에 따라 다릅니다. 사용자는 웜 크기를 캡처하기 위해 다양한 플랫폼을 사용할 수 있으며 LPFC를 사용할 수 없는 경우 이 프로토콜을 사용하는 데 국한되지 않습니다.

저자는 액체 염색체를 통해 C. elegans의 각종 긴장에서 알려지지 않은 대사산물을 확인하기 위하여 여기에서 기술된 방법에서 성장한 견본을 이용하고 있습니다 - 질량 분광법, NMR 분광법 및 RNA 순서. 저자는 이 파이프라인을 사용하여 새로운 관심 있는 균주를 쉽게 처리할 수 있기 때문에 다양한 C. elegans 균주를 사용하여 이 파이프라인의 샘플 성장을 위해 이 방법을 계속 사용할 계획입니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는이 원고에 대한 유용한 토론과 피드백에 대한 Edison Lab의 회원들에게 감사드립니다. 특히, B.M. 일부 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC와 NSF 생활 컬렉션 CSBR 1930382 의해 투자되는 CeNDR에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH (U2CES030167)의 보조금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Sterile Serological Pipettes VWR 89130-898
10 ul pipette tips VWR 89079-438
100 ul pipette tips VWR 89079-442
1000 mL Graduated Cylinder VWR 10124-380
1000 ul pipette tips VWR 89079-488
15 mL conical tubes VWR 89039-668
190 Proof Ethanol VWR 89125-166
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask VWR 75804-654
50 mL conical tubes VWR 75874-294
Agar Sigma 05040-100G
Agarose Sigma A9539-500G
BVC Control G Fluid Aspiration System Vacuubrand
Calcium Chloride Sigma 449709-10G
Cholesterol Sigma C3045-25G
Clorox Bleach VWR 89414-502
Conviron Control Temperature Room Conviron https://www.conviron.com/environmental-rooms
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate VWR 89089-866
Fisher Scientific Accuspin 3R Fisher
Flat-Bottom 24-Well Plate VWR 29443-952
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. Home Depot 204390560
HT115 E. coli (DE3) CGC HT115(DE3) https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)
Kimwipes VWR 470224-038
Large Scale Culture Plate (LSCP) Pyrex 1090948 Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid
Magnesium Sulfate Sigma C86677-25G
MgSO4 VWR 97062-998
Microscope Plain Slides VWR 16004-422
Millipore Filter Millipore 1.11727.2500
Molecular Devices ImageXpress Molecular Devices Model Number:IXMConfocal https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532
Nystatin (10mg/mL) Sigma N6261-25MU
Peptone Sigma P7750-100G
Petri Dishes (6 cm) VWR 25384-092
Pipette Controller VWR 613-4180
Potassium Chloride Fisher P217-3
Potassium Phosphate Monobasic VWR 0781-500G
Potasssium Hydroxide Fisher P250-500
Red Fluroscent Microspheres Polysciences 19507-5
Sodium Chloride Sigma 746398-500G
Sodium Hydroxide Fisher 111357
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher BP332-500
Standard Gilson Pipette Set Gilson FA10002M, FA10004M, FA10006M
Streptomycin (100mg/mL) Sigma S6501-25G
Union Biometrica COPAS BioSorter Union Biometrica https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.

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References

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  4. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).
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대규모 혼합 단계 <em>Caenorhabditis 예인단</em> 인구의 문화와 분석
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Shaver, A. O., Gouveia, G. J., Kirby, P. S., Andersen, E. C., Edison, A. S. Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations. J. Vis. Exp. (171), e61453, doi:10.3791/61453 (2021).More

Shaver, A. O., Gouveia, G. J., Kirby, P. S., Andersen, E. C., Edison, A. S. Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations. J. Vis. Exp. (171), e61453, doi:10.3791/61453 (2021).

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