Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מארז גרפן של תאי יונקים קבועים כימית עבור מיקרוסקופאלקטרונים בשלב נוזלי

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לתיוג חלבוני קרום בתאים יונקים וציפוי המדגם עם גרפן למיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקה שלב נוזלי. היציבות של הדגימות נגד הנזק שנגרם על ידי קרינה יכול גם נחקר עם פרוטוקול זה.

Abstract

פרוטוקול מתואר לחקירת קולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי 2 (HER2) בממברנה פלזמה שלמה של תאים סרטניים השד באמצעות מיקרוסקופאלקטרונים שידור סריקה (STEM). תאים של קו תא סרטן השד יונק SKBR3 גדלו על שבבי סיליקון עם סיליקון nitride (SiN) חלונות. התאים תוקנו כימית, וחולי HER2 סומנו עם חלקיקי נקודה קוונטית (QDs), באמצעות פרוטוקול מחייב ביוטין-סטרפטאבידין דו-שלבי. התאים היו מצופים גרפן רב שכבתי כדי לשמור על מצב הידרציה, ולהגן עליהם מפני נזק קרן אלקטרונים במהלך STEM. כדי לבחון את היציבות של הדגימות תחת קרני קרן אלקטרונים, בוצע ניסוי סדרת מינונים. דגימות מצופה גרפן ולא מצופה הושוו. נזק שנגרם קרן, בצורה של חפצים בהירים, הופיע עבור כמה דגימות לא מצופה במינון אלקטרונים מוגבר D, בעוד שום חפצים הופיעו על דגימות מצופה.

Introduction

ניתוח של תפקוד חלבון ממברנה חיוני למחקר ביולוגי של תאים, ולצורך פיתוח תרופות. מחלקה של ניסויים חשובים כרוכה בבדיקה של תנוחות חלבון קרום בתאים. מידע זה יכול לשמש כדי להסיק מסקנות על הרכבת חלבונים במתחמי חלבון ומיקומם הספציפי בממברנה פלזמה, אשר, באמצעות הרכבה דינמית ופירוק, מניע מגוון רחב של פונקציות תאיות. בין שאר הטכניקות, מיקרוסקופ אור (LM) ומיקרוסקופאלקטרונים (EM) משמשים לחקר פונקציות חלבון בתאים. LM מאפשר ניתוח של תאים שלמים בנוזל; עם זאת, ההחלטה מוגבלת 200-300 צפון לm עבור קונבנציונלי ועד 20 צפון לערך עבור מיקרוסקופ פלורסנט רזולוציה סופר בתנאיםמעשיים 1,,2. EM מספק בסביבות 1 Åרזולוציות 3, אבל הכנה מדגם קונבנציונלי דורש התייבשות, כתמי מתכת כדי לשפר את ניגודיות התמונה, הטבעה בחומר הרכבה, כגון שרף, עבור מיקרוסקופאלקטרונים שידור (TEM)4. כדי לשמר דגימות ביולוגיות בסביבה מקומית יותר, ניתן להשתמש בטכניקות cryo-EM5,6. הדגימות מוקפאות במהירות לתוך קרח אמורפי, ובמידת הצורך, נותחות. אפשרות נוספת היא הקפאת שבירה EM7.

EM טכניקות לחקר חלבוני קרום בתוך תאים שלמים במצבם היליד, נוזליהופיעו בעשור האחרון 8,,9,,10,,11. רזולוציה מרחבית של 2 ננומטר הושגה על נקודה קוונטית (QD) שכותרתה חלבוני קרום בתאים שלמים גדל על קרום SiN ומוקף בשכבה של גרפן9.

כאן, פרטים של פרוטוקול לסימון חלבון וציפוי גרפן9,12 מתוארים. מטרת פרוטוקול זה היא לנתח את ההתפלגות המרחבית של HER2 בממברנה של תאים שלמים, קבועים, תוך שמירה על התאים במצב הידרציה. ציפוי עם גרפן מונע ייבוש של התאים בריק, וגם מפחית נזקי קרינה13. שיטה זו מספקת מידע על חלבוני קרום מתויג בתוך קרום פלזמה שלם, אבל השיטה אינה שימושית לחקר ultrastructure התא כפי שנעשה בדרך כלל עם EM.

גרפן הוא הננו-חומר הדק ביותר הידוע, ומורכב מסדין גבישי עבה של אטום פחמן יחיד המסודר בסריג חלת דבש14. יש לו מאפיינים ייחודיים כולל גמישות גבוהה וכוח מכני. מחקרים אחרונים הראו כי גרפן ללא פגמים הוא בלתי חדיר לגזים ונוזלים, אבל פגמים מאפשרים חריץ מימן15. דליפה זו ניתן להפחית באמצעות גרפן רב שכבתי כפי שנעשה כאן. גרפן Bilayer לאחרונה הראה להיות שימושי כתמיכה עבור דגימות cryo-EM, שיפור ההומוגניות של שכבת הקרח דק לעומת תחמוצת גרפן שבו רק שכבות שאינן דו-מדם ניתןלגבש 16. גרפן גם הוצג כדי להפחית את נזקי קרן של דגימות ביולוגיות במהלך מיקרוסקופאלקטרוןשידור שלב נוזלי 13,17. כונס למופת, HER2 בא לידי ביטוי בקו תא סרטן השד היונק SKBR3 סומן עם QDs18 וההפצה המרחבית שלה נרשם באמצעות STEM. תאים נזרעו על שבב Si עם ממברנה SiN שקוף אלקטרונים19. השבבים נבחרו כתמיכה כפי שהם חזקים, תואם LM ו EM, ואת כל הליך התיוג ניתן לבצע ישירות על שבב19. לאחר קובץ מצורף לתא, HER2 סומן עם פרוטוקול תיוג דו-שלים20. ראשית, תרכובת נוגדן נגד HER2 ביוטינילציה21 היה מחובר HER2. התאים תוקנו אז מבחינה כימית כדי למנוע קיבוץ קולטן המושרה על ידי תווית, ולהגביר את היציבות של ultrastructure התא. QDs מצופה סטרפטוודין היו קשורים לאחר מכן לתסביך פנטון HER2. אות הפלואורסץ הבהיר והליבה הצפופה באלקטרונים של ה-QD אפשרו מיקרוסקופית קורלציה ואלקטרונים (CLEM)20. CLEM שימושי במיוחד מכיוון שניתן לבחור אזורים סלולריים בעלי עניין בניתוח STEM מתוך תמונות המיקרוסקופיות של הפלואורסקציה המבטחת את ההתמקה יתורליזציה של HER2 בתאים. תאים נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסץ כדי לזהות אזורים תאיים עם רמות HER2 גבוהות. לאחר מכן, 3-5 שכבה עבה גיליון של גרפן הועבר על התאיםלציפוי 9,22. לאחר מכן, הדגימה הורכבה במחזיק דגימה EM. נתוני STEM נרכשו באמצעות גלאי השדה האפל (ADF) טבעתי, מתן מידע על ההפצה המרחבית של HER2 על פני השטח של התא יחסית למיקום פני השטח של התא, אך לא מספק מידע על מבנה האולטרה של התא. כדי לקבוע את יציבות הדגימה תחת קרני קרן אלקטרונים, הדגימות נבדקו במינון הולך וגדל(D)בסדרת תמונות. ההבדל בין דגימות מצופה גרפן לדגימות לא מצופה נחקר. מספר סוגים של נזקי קרינה הוערכו.

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש HER2 overexpressing קו תא סרטן השד יונק SKBR3 כמערכת מודל עבור מיקוד HER223. הפרוטוקול כולל הכנת דגימה אחת מצופה גרפן, ודגימה אחת דומה אך ללא ציפוי גרפן להשוואה. הניסוי מוכן בכפילות מאז חלון SiN עשוי לשבור מדי פעם, ולקבל עותק ניסיוני ברוב המקרים. התשואה הכוללת של השיטה היא משמעות גבוהה כי שבבים עם תאים מכוסים גרפן מתקבלים בדרך כלל עם שגיאה יוצאת דופן למרות לא כל חלון SiN עשוי להיות מכוסה גרפן בכל המקרים. כפילויות אינן מתוארות בפרוטוקול.

פרוטוקול תיוג (שלבים 1-5) דומה לפרוטוקול של תיוג קולטן גורם גדילה אפידרמי בתאי פיברובלסט COS7 שפורסמו בעבר24; פרטים בנייר זה מופנים לגבי הטיפול בשבים, והשימוש של צלחות באר. הפרוטוקול הבא ממוטב לסימון HER2, ציפוי גרפן9, ובדיקת עמידות הקרינה של המדגם.

Protocol

1. ניקוי שבבים וציפוי עם פולי-L-לינזין (PLL) וחלבון כמו פיברונקטין (FLP)

  1. מניחים שני שבבים עם קרום SiN (2.0 x 2.6 מ"מ) ב-50 מ"ל של אצטון. טפלו היטב בחיידקים כשהצד השטוח פונה כלפי פנים כלפי פנים. הימנע מלשבור את הקצוות באמצעות פינצטה עם מקור שטוח. הימנע מלגעת במשטח העליון של השבבים בעת טיפול פינצטה כדי למנוע שבירה של חלון SiN.
    הערה: אחד יכול גם להשתמש פוליאטטרפלואורואתילן מצופה או פינצטה קצה פחמן כדי למנוע נזק של השבבים.
  2. שוטפים את השבבים במשך 2 דקות על ידי ניעור קפדני של הבקת, וצפייה בשבבים לא מתהפכות.
  3. מעבירים את השבבים ל-50 מ"ל אתנול ושטפו במשך 2 דקות על ידי ניעור קפדני של הבקת. ודא שההעברה מהירה כך שהאצטון העודף לא יתייבש.
  4. שוטפים את השבבים ב-50 מ"ל מים למשך 10 דקות.
  5. טובלים את השבבים בבקת טרייה של 20 מ"ל אתנול.
  6. מניחים שבבים על רקמת חדר נקי לייבוש.
  7. פלזמה לנקות את השבבים עם 11.5 sccm O2 ו 35 sccm Ar ב 70 mTorr ותדר רדיו (RF)-יעד של 50 W במשך 5 דקות.
  8. מניחים את השבבים בכסה המנוע של זרימת למינאר לעבודת תאים סטריליים.
  9. הכן פתרון של 0.01% PLL במים. הכן פתרון של 15 μg/mL FLP בתמיסת מלח המאגר פוספט (PBS).
  10. להכין צלחת 24 היטב מתחת למכסה המנוע זרימה למינאר ולמלא 5 בארות בנפרד עם 1 מ"ל של הפתרונות בסדר הבא: גם 1 – PLL; באר 2 – מים; גם 3 – מים; גם 4 – FLP; גם 5 – PBS וגם 6 – PBS.
    הערה: בצע שלבי כביסה על-ידי טבילה של שבב לתוך 24 או 96 המצוין היטב למשך מספר שניות באמצעות פינצטה. בצע שלבי דגירה על-ידי דגירה השבבים ב 24 או 96 גם בתמיסה שצוין עבור זמן וטמפרטורה שצוינו. מעבירים את השבבים לבאר אחרת תוך מספר שניות.
  11. דגירה שבבים בתמיסת PLL במשך 5 דקות. ואז לשטוף את השבבים במים פעמיים.
  12. דגירה שבבים בFLP במשך 5 דקות. ואז לשטוף את השבבים בPBS פעמיים.
  13. להעביר את שני השבבים לבארות (אחד עבור כל שבב) של צלחת חדשה 96 גם ממולא מראש עם 50 μL של בינוני סרום ללא סרום עבור זריעת תאים.
  14. דגירה שבבים ב 37 ° C ו 5% CO2 עד מתלי התא מוכן.

2. זריעת תאים על שבבי קרום SiN

  1. הגדר את כל האספקה והציוד במכסה מנוע זרימה למינאר כדי להבטיח עבודה סטרילית.
  2. לשטוף את קו התא סרטן השד, SKBR3, בקבוקון תרבות תא עם גדילה בינונית פעם אחת. השתמש במדיום הנשר (DMEM) המותאם של Dulbecco המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS), ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAAs) כמדיום צמיחה.
  3. לדבוק את התאים עם 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התא עד התאים מנותקים מהבקבוקון.
  4. להוסיף 5 מ"ל של גדילה בינונית לתאים מנותקים הבקבוקון. העבר את המתלים לצינור צנטריפוגה.
  5. פיפט 20 μL של מתלה התא לתוך hemocytometer כדי להשיג את ריכוז התא. השתמש בנוסחה הבאה.
    Equation 1.
  6. הכן מתלה תא מפוזר של 2.5 x 105 תאים/מ"ל. חשב את הכמות הדרושה של מתלה התא המוכן על-ידי:
    Equation 2
    ולמלא עם צמיחה בינונית לנפח הרצוי.
  7. להוסיף 100 μL של מתלה התא לשתי בארות של צלחת 96 גם המכיל את שבבי PLL ו FLP מצופה עם קרום SiN פונה כלפי פנים ו 50 μL של בינוני סרום ללא סרום, כך שכל באר מכילה 25,000 תאים.
  8. דגירה את הצלחת ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 5 דקות לחכות לתאים לצרף שבב.
    הערה: בשלב זה, תאים יכולים לנתק מהמיקרו שבב כי הם לא דבקו עדיין.
  9. בדוק את צפיפות התאים על השבב עם מיקרוסקופ הפוך. ודא שהתאים מכסים את החלון עם די שטח לשטח ולדבוק בה (ראה איור 1A).
    הערה: ניתן להוסיף תאים נוספים בשלב זה במידת הצורך.
  10. להעביר את השבבים לתוך בארות חדשות המכילות 200 μL של צמיחה בינונית דגירה ב 37 ° C ו 5% CO2 לילה.
  11. בשעות אחר הצהריים של היום שלמחרת, להעביר את שני השבבים למדיום ללא סרום (סרום רעב בינוני) אם התאים השתטחו ודבקו confluency נבדק חזותית (כלומר, השבר של אזור החלון מכוסה תאים) של כ 2/3 (ראה איור 1B). עבור למדיום ללא סרום לפי הצורך כדי להביא את התאים במצב התחלתי מוגדר לפי הצורך להשוואה בין ניסויים שונים25.
  12. דגירה ב 37 °C ו 5% CO2 לילה.
    הערה: שים לב כי כמויות התא עשוי להיות שונה בהתאם שיעורי צמיחה מורפולוגיה תא עבור קווי תא אחרים.

3. תיוג וקבעון HER2

  1. הכן את הפתרונות כמתואר בטבלה משלימה 1.
    1. עבוד מתחת למכסה המנוע של זרימת למינאר כדי להבטיח עבודה סטרילית. השתמש צלחת 96 גם המכונה צלחת תיוג I, ולמלא 6 בארות לכל שבב עם 200 μL של צלחת תיוג אני פתרונות: PBS / BSA, PBS / BSA / GS, נוגדן mimetic, PBS / BSA, PBS / BSA, PBS / BSA. השתמש בשורה אחת (אות אחת בכל שורה, לדוגמה, A1 עד A6) של לוחית הבאר לכל שבב. מחממים את צלחת התיוג ל-37°C.
    2. מתחת למכסה מנוע אדים, להכין צלחת 24 גם המכונה צלחת קיבעון, ולמלא 8 בארות לכל שבב עם 500 μL של פתרונות לוח קיבעון: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS / גליצין, PBS / BSA.
      התראה: CB רעיל באופן חמור על ידי שאיפה או בליע אוראלי והוא מסוכן למים. עבוד מתחת למכסה המנוע של האדים עם הגנה מתאימה והשלך CB בהתאם לדף נתוני הבטיחות (SDS). FA הוא מאכל ומזיק לעור ובריאות. עבוד מתחת למכסה המנוע של האדים ועיין ב-SDS לקבלת מידע על טיפול וסילוק.
    3. הכן צלחת 96 היטב המכונה צלחת תיוג II ולמלא 4 בארות לכל שבב עם 200 μL של פתרונות צלחת תיוג II: QDs, PBS / BSA, PBS / BSA, PBS / BSA.
      הערה: כאן, צלחת 24 באר משמש כדי לראות טוב יותר את השבבים בארות. כדי להשתמש בפחות פנטומימטיקה נוגדנית (שלב 3.2) ו- QDs (שלב 3.4), השתמש ב- 96 לוחות באר עבור שלבים אלה.
  2. תייג את HER2 בתאים.
    1. ברגע שלוחות אלה מוכנים, התחל לתייג על ידי הצבת השבבים לתוך הבארים של השורה הראשונה של צלחת תיוג 1.
    2. לשטוף את השבבים עם PBS / BSA בצלחת 96 גם מסומן כמו צלחת תיוג I.
    3. חסום אתרים לא ספציפיים כדי למנוע איגוד לא ספציפי של הנוגדן mimetic על ידי דגירה עם PBS / BSA / GS במשך 5 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2.
    4. דגירה עם 200 nM נוגדן פנטומימטה במשך 10 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2.
    5. לשטוף שבב שלוש פעמים PBS / BSA.
  3. תקן את התאים.
    1. מעבירים את השבבים לצלחת קיבעון 24 באר ב מכסה המנוע אדים.
      הערה: אין צורך בעבודה סטרילית מכאן.
    2. לשטוף פעם אחת עם CB לכמה שניות.
    3. תקן תאים עם 3% FA למשך 10 דקות.
    4. לשטוף פעם אחת עם CB ושלוש פעמים עם PBS.
    5. לחסום קבוצות אלדהיד חינם של FA על ידי דגירה עם PBS-גליצין במשך 2 דקות.
    6. לשטוף שבבים עם PBS-BSA פעם אחת.
  4. חבר את ה-QDs.
    1. להעביר את השבבים לצלחת תיוג 96 גם II.
    2. דגירה עם QDs 20 נה"מ במשך 12 דקות.
    3. לשטוף את השבבים עם PBS / BSA פעמיים.
    4. אחסן את השבבים בבאר המכילה PBS/BSA.

4. מיקרוסקופ אור של התאים הקבועים

  1. הכן צלחת תחתית זכוכית בקוטר 3.5 ס"מ עם 2 מ"ל של פתרון PBS/BSA.
  2. קח את השבבים הראשונים, מניחים אותו הפוך (תאים עם הפנים כלפי מטה) לתוך צלחת תחתית הזכוכית ולמקם את המנה במיקרוסקופ פלואורסצנה. מנמיך את השבב לאט לתוך הנוזל כדי למנוע נזק על התאים.
  3. רכוש ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) ותמונות פלואורסצנטיות של כל שבב עם מטרה של פי 40 וערוץ הפלואורסצנטי המתאים.
    הערה: כאן, אורך גל של 540-580 00 00 00 00 00:00:00,000 --& 00:00:00,000 00:00,000 00:00,000 --&00:00,000 00:00,000 --&00:00,000 00:00,000 --&00:00,00
  4. חזור על ההליך עבור השבב השני.

5. לאחר קיבעון

  1. בצע את כל השלבים מתחת למכסה המנוע של האדים.
  2. מלא 6 בארות לכל שבב של צלחת 96 באר עם 200 μL של פתרונות לאחר קיבעון:
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    התראה: GA מסוכן למים, מזיק לעור, מערכת הנשימה, ועיניים. עבוד מתחת למכסה המנוע של האדים ועיין ב-SDS לקבלת מידע על טיפול וסילוק.
  3. מקם את שני השבבים בארות שלהם בהתאמה עם התאים פונים כלפי פנים.
  4. לשטוף פעם אחת עם CB.
  5. תקן תאים עם 2% GA למשך 10 דקות.
  6. לשטוף פעם אחת עם CB.
  7. לשטוף שלוש פעמים עם PBS / BSA.
    הערה: שלב קיבעון הראשון עם FA כבר מתקן את המבנה הביולוגי, אבל רמה מופחתת של דיפוזיה חלבון קרום עדיין עלולה להתרחש, אולי מוביל תווית המושרה קיבוץ באשכולות בשל הנוכחות של סטרפטווידינים מרובים לכל QD. לשמור את הזמן של השלבים הניסיוניים קיבעון FA כדי GA, לכן, קצר ככל האפשר כדי למזער את דיפוזיה של החלבונים בממברנה.
  8. לאחסן PBS / BSA כדי למנוע זעזועים אוסמוטיים 0.02% נתרן אזיד (NaN3)כדי למנוע צמיחה חיידקים ב 4 ° C עד ציפוי גרפן בצלחת באר חדשה. לאטום צלחת היטב עם סרט פרפין כדי למנוע ייבוש. השבבים והתאים יציבים עד שבועיים כאשר הם מאוחסנים ב- 4 °C.
    התראה: NaN3 מסוכן למים ורעיל באופן חמור על ידי בליע אוראלי, עבור העור ומערכת הנשימה. עבוד מתחת למכסה המנוע של האדים ועיין ב-SDS לקבלת מידע על טיפול וסילוק.

6. ניקוי והעברת גרפן על גבישי מלח

  1. הסר פולי(מתיל מתקרילייט) (PMMA)-גרפן מ PMMA-גרפן על פולימר(איור 2A).
    1. פיפטה כמה טיפות מים על הפולימר סביב PMMA-גרפן.
      הערה: ודא כי PMMA-גרפן בקלות יורד פולימר תומך כפי שהוא צף על פני המים.
    2. לטבול PMMA-גרפן על פולימר לתוך מים עם זווית של 30-45 ° כדי לשחרר את PMMA-גרפן.
      הערה: הפולימר צריך להיות רטוב במקצת בלבד. התפתלת יותר מדי מים על הפולימר תרים ואולי תקפל את PMMA-גרפן.
  2. Etch מזהמים מבוססי נחושת באמצעות תמיסת נתרן שכנוע(איור 2B).
    הערה: גרפן מסחרי גדל על רדיד נחושת לעתים קרובות מכיל שאריות נחושת תת מיקרומטר, אשר ניתן להסיר עם תמיסת נחושת etchant22.
    1. הכן תמיסה 50 מ"ל של 0.42 M נתרן שכנוע במים.
    2. העבר PMMA-גרפן לתוך תמיסת נתרן להריץ עם הצד גרפן כלפי מטה באמצעות מגלשת זכוכית סטנדרטית. PMMA-גרפן יצוף על גבי הפתרון.
    3. השאר את PMMA-גרפן בתמיסת נתרן שכנוע בן לילה.
    4. הסר את PMMA-גרפן מתמיסת נתרן שכנוע והניחו אותו על גבי מים נקיים באמצעות מגלשת זכוכית. תן לו לצוף על המים במשך חצי שעה.
    5. חזור על השלב הקודם בסך הכל שלוש פעמים כדי להסיר את כל שאריות נתרן שכנוע מ PMMA-גרפן.
  3. מעבירים את ה-PMMA-גרפן על גבי קריסטל נתרן כלורי (NaCl).
    1. הכן תמיסה רוויה של NaCl במים בצלחת פטרי.
    2. העבר את PMMA-גרפן מעל פתרון NaCl עם הצד גרפן כלפי מטה באמצעות מגלשת זכוכית.
    3. החזק גביש NaCl עם פינצטה ולהרים את PMMA-גרפן צף.
      הערה: הגודל של גביש NaCl צריך להיות מעט גדול יותר מגודל PMMA-גרפן כדי למנוע קיפול גרפן בולט בקצה המלח או יצירת קשר עם גרפן עם פינצטה. בניסויים אלה גביש NaCl של 12 מ"מ x 12 מ"מ x 0.5 מ"מ משמש להרים גיליון גרפן 10 מ"מ x 10 מ"מ ולתמיכה בו לאחר מכן.
    4. החזק את PMMA-גרפן על מלח אנכית במשך 2 דקות כדי לאפשר למים עודפים לזרום החוצה.
    5. נותנים ל-PMMA-גרפן על מלח להתייבש בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ולאפות אותו בתנור ב-100 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להסיר לחלוטין את המים.
  4. הסר PMMA באמצעות שטיפה אצטון (איור 2C).
    1. מחממים אצטון בצלחת פטרי מזכוכית ל-50 מעלות צלזיוס על פלטה בצלחת האדים. שימו לב לטמפרטורה בזהירות כדי להימנע מאש.
    2. לטבול את PMMA-גרפן על מלח לתוך צלחת פטרי מלא אצטון ולהשאיר אותו כדי להמיס את PMMA במשך 30 דקות.
    3. חזור על השלב הקודם בסך הכל שלוש פעמים עם אצטון חדש ונקי.
    4. נותנים לגרפן על המלח להתייבש ביסודיות לפני השימוש בו להכנת מדגם.

7. ציפוי גרפן

הערה: הליך ציפוי גרפן מוצג באופן סכמטי באות 3A.

  1. לשטוף שבב אחד מוכן עם תאים קבועים ותיוג HER2 במים טהורים כדי להסיר את כל שאריות של מלח מהמאגר. מניחים את השבב על נייר סינון. התאים גלויים ככתמים כהים (איור 3B).
  2. חותכים את הגרפן הרב שכבתי על גביסטל NaCl לחתיכה שמתאימה לחלון SiN של שבב באמצעות סכין גילוח.
  3. הכן גם מים טהורים והסר את הגרפן מקריסטל ה-NaCl על-ידי הטיית הקריסטל בזווית של כ-45 מעלות ביחס לפני המים ונגיעה במים. הגרפן יצוף על פני המים(איור 3C).
  4. לתפוס את הגרפן עם לולאת מתכת מפני השטח של המים. גרפן יצוף בתוך הטיפה מתחת ללולאה(איור 3D).
  5. גע במשטח העליון של השבב עם משטח הלולאה התחתונה. השבב ייצמד ללולאה המתכתית. גרפן ניתן לראות על גבי השבב (איור 3E).
  6. תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש בנייר סינון כדי להסיר את המים הנותרים מהמיקרו-שבב, כך שהגרפן מכסה את כל התאים בחלון SiN.
    הערה: הגרפן יזוז כאשר כתמים. ודא גרפן נשאר בחלק העליון של החלון על ידי נגיעה שבב רק עם קצה נייר המסנן.
  7. השתמש פינצטה כדי להסיר את השבב מלולאת המתכת ולמקם אותו על נייר מסנן. הגרפן נראה כנצנוץ סגול על השבב ( איור3F).
  8. מעבירים את השבב מהנייר לצלחת פטרי בתא.
  9. פיפטה טיפת מים לתוך אחד התאים חינם ולסגור את המכסה כדי לספק אווירה רוויה במים.
  10. אטמו את צלחת התא עם סרט פרפין וחסנו במקרר ב-4 מעלות צלזיוס אם יידרשו למדידות נוספות.

8. גזע

  1. כוונן את STEM באנרגיית קרן 200 kV באמצעות מדגם יישור/בדיקה עבור גודל בדיקה של לפחות 0.2 צפון-מז' על-ידי התאמת עדשות העיב, זרם בדיקה I = 180 pA (מידע על זרם הגשוש להגדרות מיקרוסקופ שונות מסופק על-ידי היצרן בתוך 5% דיוק) וזווית למחצה של התכנסות קרן של 13.2 mrad על-ידי הכנסת צמצם. הגדר את גלאי ה- ADF STEM הפותח טווח חצי זווית (פנימי והחוצה) ל- 68-280 mrad על-ידי כוונון הגדרות עדשת המקרן. הגדר את גודל תמונת STEM ל- 2048 x 2048 פיקסלים, ואת זמן הזמן להתעכב פיקסל = 6 μs.
  2. טען את השבב עם תאים מצופים גרפן במחזיק דגימה סטנדרטי עבור TEM באופן כזה שהתאים פונים כלפי פנים כלפי פנים.
  3. טען את המחזיק למיקרוסקופ האלקטרונים.
  4. רכוש תמונת מבט כוללת על הגדלה (M) = 800x (איור 4) באמצעות ההגדרות בשלב 8.1.
  5. זהה אזור מעניין בתא.
  6. תמונה QDs עם גלאי ADF ב M = 80,000x בגודל פיקסל d = 1.3 נה"מ ( איור4) באמצעות ההגדרות בשלב 8.1.
  7. לרכוש תמונה של האזור לאחר חשיפה עם הגדלה נמוכה יותר (כאן, M = 50,000x) כדי להראות את האזור החשוף(איור 4).
  8. חשב את מינון האלקטרונים
    Equation 3
    איפה e הוא תשלום יסודי. עם ההגדרות שניתנו לעיל,
    Equation 4
    ושגיאה של 5%.
  9. לרכוש 20 תמונות עבור סדרת מינון עם אותן הגדרות, אבל עם t = 60 μs וכתוצאה מכך מנה מצטברת של
    Equation 20.
  10. כדי לאשר את הנוכחות של גרפן, העבר את המיקרוסקופ ל- TEM ב- M = 1,200x, בחר אזור ליד תא ולעבור למצב iffraction. הקלטת תבנית מפזר בזמן חשיפה של 0.5 שניות, 2048 x 2048 x 3 פיקסלים, ומצמצם שטח נבחר של 50 μm(איור 4).
  11. בסוף המפגש, מוציאים את הדגימה מהמיקרוסקופ, מניחים את השבב בחזרה לצלחת התא, אוטמים את המנה בפילם פרפין ומאחסנים אותה במקרר ב-4 מעלות צלזיוס אם יש צורך במדידות נוספות.
  12. בחר את השבב השני שהוכן באותו אופן כמו השבב הראשון אך ללא ציפוי גרפן.
  13. חזור על שלבים 8.2-8.11 אך כעת עבור מדגם זה. הקלט תבנית מפזר עם הגדרות זהות לזה שלעיל, בהשוואה (איור 4).

9. ניתוח

הערה: לזיהוי אוטומטי של מיקומי QD בתדמית STEM, הניתוח משתמש בתוסף של עיצוב מקומי עבור ImageJ (NIH), כמתואר במקוםאחר 20. התוסף זמין על פי בקשה.

  1. התוכנה מחילה באופן אוטומטי את השלבים הבאים כדי לזהות חלקיקים בתדמית STEM:
    1. החל מסנן גאוסיאני כדי להפחית את רעש הפיקסלים.
    2. החלת מסנן פסים מהיר פורייה (FFT) כדי להשיג חלקיקים בלבד.
    3. הגדר סף לתיעון בינאריזציה של התמונה.
    4. השתמש בקוטר חלקיקים של 10 נה"מ עם גורם סובלנות של 2 לזיהוי חלקיקים.
    5. תבחין בעמדות חלקיקים.
  2. מדוד את המרחק ממרכז למרכז בין עשרה זוגות QDs לכל סידרה. כאן נמדדו 10 מרחקים בגדלים שונים לכל סידרה.
  3. חשב את השינוי היחסי במרחק החלקיקים על-ידי השוואת כל מרחק חלקיק למרחק בתמונה הראשונה באמצעות:
    Equation 5.

Representative Results

איור 1א מראה תאים שנזרעו באופן כזה שהחלון מכוסה אך עם מספיק מקום כדי לאפשר להם לשטח ולדבוק, מה שמוביל להתאגידות של כ-2/3rd (איור 1B). במקרה תאים רבים מדי נזרעים על שבב(איור 1C),אין מספיק מקום עבור כל התאים לדבוק שבב. איור 1D מציג את אותו שבב לאחר 24 שעות. יותר ממחצית התאים לא השתטחו. מצד שני, אם מעט מדי תאים נזרעים(איור 1E),חלון SiN יהיה בסופו של דבר עם שטח ריק גדול לאחר 24 שעות כפי שניתן לראות איור 1F. איור 1G מציג את תמונת ה- DIC של התאים בא איור 1A ואיור 1B. איור 1H מציג את תמונת הפלואורסץ המתאימה בצבע כוזב בצהוב המציין תיוג מוצלח של HER2.

נתוני STEM מייצגים מוצגים באיון 4. תאי SKBR3 מצופים גרפן (עמודה שמאלית) ותאי SKBR3 שאינם מצופים (עמודה ימנית). איור 4א,B הצג M = תמונות מבט כולל של 800x של התאים בחלון. האזורים המוצגים כמו insets נתו ב M = 80,000x במהלך סדרת המינון, ראה איור 4C,D. ה-QDs נראים כנקודות בהירות כאן. איור 4E ואיור 4F מציגים M = 50,000 תמונות מוגדלות שנרכשו במיקומים של מלבנים באיור 4C,D. שתי התמונות נרשמו לאחר רכישת סדרת מינונים עם D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/Å2. סדרת המינונים הוקלטה ב- M = 80,000x. ניתן לזהות את האזורים החשופים כמלבנים, לפיהם המלבן היה גלוי בבירור עבור המדגם שאינו מצופה(איור 4F).

כדי לאמת את הנוכחות של גרפן, דפוסי iffraction של אזורים ללא תאים, אבל עם או בלי גרפן על חלון SiN נרכשו. המבנה המשושה של הגרפן נצפה בתבנית ההתפלה של המדגם מצופה גרפן(איור 4G),בזמן שהוא נעדר עבור המדגם שאינומצופה (איור 4H). דפוס ההתפלה של גרפן גביש יחיד יהיה סימטריה פי שישה בשל מבנה משושה מסודר מאוד של גרפן. אז, המבנה המשושה מצביע על נוכחות גרפן על הדגימות.

כדי לחקור את ההשפעה של תאורת קרן אלקטרונים על המדגם, תמונות STEM נרכשו בסדרת תמונות עם מינון אלקטרונים מצטבר. תוצאות מייצגות עבור דגימות שאינן מצופים וגרפן מוצגות באיור 5A-D וב- איור 5E-G, בהתאמה. כל הנתונים נרכשו בקצה התא, שבו התא הוא השטוח ביותר, והמבנה שנצפה הוא לפיכך הקרוב ביותר לממברנה SiN. החשיפה של דגימות שאינן מצופים הובילה למבנים בהירים המופיעים על משטחי התא ב- D = (1.9 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (איור 5B). מבנים אלה הפכו גדולים יותר עם מינונים גבוהים יותר, כך שהם היו גלויים בבירור בתמונה האחרונה של הסדרה ב D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ Å2 (איור 5C, D). נקודות אלה לא הופיעו באף אחת מהדגימות מצופה גרפן(איור 5E-G).

שבבים נוספים הוכנו ונבדקו באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. בסך הכל נחקרו שש דגימות מצופים ושבע דגימות לא מצופים. שתיים מתוך שבע דגימות לא מצופה הראו את החפצים האלה. אף אחת מהדגימות המצופה לא הראתה נקודות בהירות נוספות.

כמדד נוסף של נזקי קרינה, המרחק בין QDs נבדק. אם נגרם נזק מבני, אפשר היה לצפות שמרחקים בין QDs ישתנו. שינויים במרחקים נמדדו עבור זוגות שונים של QDs עם צבירת D עבור טווח של מרחקים זוג. איור 5H מראה כי השינוי היחסי של החלקיקים עבור דגימות שאינן מצופים נשאר מתחת 1.3% בממוצע, בעוד המרחק היחסי הממוצע נשאר מתחת 0.8% עבור הדגימות מצופה. אפשר, לכן, להסיק כי ציפוי גרפן ייצב את המדגם אבל דגימות מיובשות ללא ציפוי גרפן היה גם יציב להפליא.

Figure 1
איור 1: זריעת תאים על חלון SiN של שבב סיליקון ו- HER2 מסומן. (A) תמונה למופת של אזור חלון SiN עם תאי SKBR3 5 דקות לאחר זריעת שבב. (ב)אותם תאים התפשטו על אותו חלון SiN לאחר 24 שעות (C)תאי SKBR3 על שבב Si 5 דקות לאחר זריעה. (D)אותם תאים כמו ב- (C) לאחר 24 שעות. התאים לא לשטח כראוי כמו שהיו יותר מדי תאים על השבבים על זריעה. (ה)תאים על שבב 5 דקות לאחר זריעה. (F)רק תאים מעטים נראו על החלון כי מעט מדי תאים נזרעו על השבב. (G) תמונת DIC של אותם תאי SKBR3 לאחר תיוג QD של HER2. (H) שכבת-על של תמונת DIC ותדמית פלואורסקצנה מתאימה של תאי SKBR3 עם תאי SKBR3 עם HER2-QD655 (בצבע כוזב בצהוב). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניקוי והעברה של גרפן על גבישי NaCl. (A) PMMA-גרפן על פולימר שקוע במים טהורים כדי לשחרר גרפן PMMA. PMMA-גרפן יכול להיתפס עם מגלשת זכוכית. (ב)זיהום על בסיס נחושת נחרטו באמצעות תמיסת נתרן שכנוע. כדי לנקות את הגרפן, הוא הועבר לבקת המכילה מים שהם מנוקים. שלבים אלה חזרו על עצמם 3 פעמים. ה-PMMA-גרפן הועבר לאחר מכן לתמיסה רוויה של NaCl במים טהורים. גביש NaCl שימש כדי לאסוף את הגרפן מתמיסת המלח. (ג)PMMA-גרפן על גביש NaCl היה מיובש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. PMMA הוסר על ידי דגירה בלוק באצטון במשך 30 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 3
איור 3: ציפוי גרפן של תאים שנזרעו על שבב Si. (א)הליך של ציפוי גרפן. גרפן על גבישי NaCl משתחרר על פני המים. פיסת גרפן לאחר מכן נתפס עם לולאת מתכת ומועבר על שבב Si. (ב)שבב (2.0 x 2.6 מ"מ) עם חלון SiN של ממדים 400 x 160 μm ללא גרפן. תאי SKBR3 נראו ככתמים כהים. גרפן(עיגול אדום) צף על פני השטח של גם עם מים. גרפןנתפס עם לולאת מתכת. (ה)השבב המחובר לטיפות המים כך הגרפן היה על גבי חלון SiN. שבבFזעיר לאחר ציפוי גרפן. הגרפן היה נראה כנצנוץ סגול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: גזע של תאי SKBR3 מצופים גרפן ולא מצופה בחלון SiN. (A)תמונת STEM של מדגם מצופה גרפן שנרכשה ב- M = 800x. (B) תמונת STEM של מדגם לא מצופה שנרכשה ב- M = 800x. (C) M = תמונה של 80,000x שנרשמה במיקום המלבן הכחול בשורות צהובות A. מייצגת מרחקים דוגמאות הנמדדים בתוך חלקיק. (D) M = תמונה של 80,000x שתועדה במיקום המלבן הכחול ב- B. קו צהוב מייצג דוגמאות למרחקים הנמדדים בתוך חלקיקים. (E) M = תמונה של 50,000x באותו אזור שבו C נחשף ל- D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2. (F) M = תמונה של 50,000x באותו אזור כמו D ונחשפה ל- D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2. האזור החשוף נראה בבירור. (ז)תבנית מפזר של דגימה מצופה גרפן מאיזור ללא תאים. הסימטריה פי שישה של הגרפן נראית כנקודות בהירות. (H)תבנית מפזר של מדגם ללא גרפן מראה אין כתמים בהירים פי 6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: חפצים הנובעים מדגימות ללא ציפוי גרפן. (א)תמונות ראשוניות של אזורים בדגימות ללא ציפוי גרפן שנרכשו ב- M = 80,000x, ונחשפו ל- D = (0.39 ± 0.02) x 102 e-/Å2. (ב)תמונות עם החפצים הראשונים הנובעים D = (1.94 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (חצים צהובים). (ג, ד) מה אתה עושה? התמונה האחרונה של הסדרה שנרכשה עם D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/Å2. חפצים נראו כנקודות בהירות. אנילא יודע מה לעשות. דגימות מצופה גרפן ללא חפצים הנובעים. (E) D = (0.39 ± 0.02) x 10e -/Å2 (F) D = (1.94 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/Å2. (H)שינוי יחסי במרחקי חלקיקים עבור דגימות מצופה גרפן ולא מצופה. שתיים מהדגימות שאינן מצופים המציגות פריטים, אחד מהם מוצג ב- (A-C) והתמונה האחרונה של הדגימה השנייה ב- D, כמו גם שלוש דגימות מצופה נותחו (אחת מוצגת ב- E-G). בסך הכל נבחנו עשרה זוגות QD לכל מדגם עם מרחקים הנעים בין 250 טנ"מ ל-3 μm. השינוי היחסי משקף את הממוצע של כל המדידות בקבוצה אחת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה 1: מתכונים לפתרונות ומאגרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

כדי להבין טוב יותר את תפקוד החלבון, חשוב להשיג מידע על מיקומי חלבון בממברנה פלזמה של תאים שלמים. שיטות לקבלת מידע זה כוללות מיקרוסקופית פלואורסץ ברזולוציהסופר 1,2. למרות מיקרוסקופית סופר ברזולוציה התפתחה עוד יותר בשנים האחרונות, הרזולוציה שלה עדיין מוגבלת כ 20 nm עבור תנאים מעשיים של ניסויים בתא, בעוד חלבוני קולטן טיפוסי יש גדלים בטווח של 1-10 נמיר. הדמיה של חלבונים על תא יחיד ברמת מולקולה אחת עם רזולוציה מספקת כדי לדמיין חלבונים אפשרי עם EM. אבל בשל מקטע, שיטות EM קונבנציונליות בדרך כלל לא להשאיר אתהתא ללא פגע 26, מה שמוביל לאובדן מידע חשוב על ההקשר ואת ההפצה המרחבית של חלבונים קרום פלזמה. שיטות עבור תאים שלמים עם cryo-TEM פותחו6, זה אפשרי לשלב תיוג חלבון עם cryo-EM27, גםcryo-STEM הוכח28. עם זאת, זרימות עבודה cryo-EM ממוטבות לחקר ultrastructure התא ומבנה החלבון, ולא כל כך הרבה לניתוח הפצות מרחביות חלבון קרום. ייבוש נקודה קריטית היא עוד שיטת הכנה תא שלמה אבל הדגימות כפופות מספר שלבי ייבוש, ואת הטכניקה היא זמן רבמאוד 29. חלבוני קרום נבדקו גם באמצעות שבר הקפאה7. בשיטה זו, התאים קבועים, קפואים ושברים. החלקים השברו משוכפלים על ידי שכבות פחמן ופלטינה, והדגימה הביולוגית מוסרת. לאחר מכן ניתן לנתח את העותקים המשוכפלים באמצעות EM30. ניתוח תא שלם הוא בלתי אפשרי עם השבר הקפאה כי מידע על התפלגות חלבונים בממברנה בהקשר של התא כולו הולך לאיבוד.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת את קרום התא להיחקר ללא צורך לחתוך דק את הדגימה9,31. התאים נשמרים ללא פגע כך ההתיקות של חלבוני קרום גלוי מתמונות פלואורסקצנציה, אשר מתואמים עם תמונות EM. לימוד חלבונים ברמת תא יחיד מולקולה אחת בתוך תאים שלמים במצב הידראולי הראו להיות אפשרי עם רזולוציה של 2 nm באמצעות STEM של QD מתויג חלבונים באמצעות שיטת מארז גרפןזה 9. שמירה על תאים במצבם הטבעי היא קריטית, כפי שהוא משמר את ההפצה המרחבית של חלבוני קרום כזה ניתוחים אפשריים ברמת תא יחיד מולקולה אחת, אשר חשוב להבנת פונקציות חלבון, ופיתוח תרופות חדשות עבור גישות טיפול.

היבט קריטי נוסף של הדמיית דגימות ביולוגיות עם EM הוא נזק הקרינה של הדגימות שנגרמו על ידי קרן האלקטרונים. הפתרונות כוללים לעתים קרובות את הפחתת מינון האלקטרונים ככל האפשר או שיטות ציפוי שונות, כגון אנקיפת הדגימה בין שכבות דקות שלפחמן 32. השיטה שלנו מראה שציפוי גרפן מפחית חפצים המושרה על ידי קרן שצצות על פני התא לדגימות שאינן מצופים. בדיקה של מבחינה כימית קבוע, ודגימות ביולוגיות מצופה גרפן אפשרי תחת קרן אלקטרונים קרינה ב 200 keV קרן אנרגיה עד D = (7.8±0.4) x 103 e-/ Å 2 ללא נזקלקרינה, כגון נקודות בהירות, להופיע על המדגם. בהשוואה לשיטות EM אחרות המערבות הכנת מדגם משוכלל, לדוגמה, הכתמה, הטבעה, (cryo-) מקטע, שבירה, וכו ', השיטה המתוארת כאן היא פחות זמן רב. תיוג החלבונים מתבצע תוך מספר שעות, וציפוי גרפן דורש רק כ-15 דקות לחוקרים מיומנים. הכנת המדגם דומה עם ההליכים הדרושים למיקרוסקופ פלואורסצטי.

ניתן לשנות את הפרוטוקול בשלבים מסוימים. הגרפן על השבב יכול גם להיות מיובש באוויר כדי לוודא כי גרפן לא זז כאשר נמחץ עם נייר מסנן. אם הגרפן מזוהם במלח, ניתן לתת לו לצוף על פני המים במשך כשעה כדי להמיס את המלח ובכך למזער את הזיהום. זיהום נחושת או PMMA המתרחשים בגרפן יכול להיות מופחת על ידי הרחבת שלבי החריט המתאימים בפרוטוקול. שיטות ציפוי גרפן אחרות תוארו שבו, לדוגמה, גרפן-PMMA הופקד ישירות על תאים, PMMA הוסר על ידי כביסה אצטון לאחרמכן 33. בשיטה שלנו, PMMA הוסר לפני ציפוי כדי למנוע כל נזק אפשרי לתאים שנגרמו על ידי שלבי כביסה אצטון נוספים. NaCl נבחר כמצע כאן כי הוא שטוח, כך שהוא לא לקמט את הגרפן, והוא מתמוסס במים כדי לשחרר את הגרפן9. חוץ מזה, זה יכול להיות חתוך לגודל הרצוי ולא שאריות הצוללת נשארות על גרפן. אבל אם לוקחים את הקריטריונים האלה בחשבון, מצעים אחרים כמו אשלגן כלורי יכול לשמש גם כן.

כדי להפחית את הסיכוי של קיבוץ באשכולות פוטנציאליים הנגרמת על-ידי תווית, ניתן ליישם את שלב קיבעון GA מיד לאחר קיבעון FA, שלאחריו כל חלבוני קרום משותקים. צעד קיבעון הראשון עם FA כבר מתקן את המבנה הביולוגי, אבל רמה מופחתת של דיפוזיה חלבון קרום עדייןעלולה להתרחש 34, אולי מוביל תווית המושרה אשכולות בשל הנוכחות של סטרפטאבידין מרובים לכל QD. קיבעון עם GA עלול להוביל לאות השפעה אוטומטית במהלך LM, ולכן, נעשה לאחר LM בפרוטוקול המתואר, אך ניתן להפחיתו כמתואר במקוםאחר 34. מאגר Cacodylate הוא רעיל למדי, קיבעון אחרים יכול לשמש גם כן, אבל cacodylate משמש כאן כפי שהוא חיץ נפוץ עבור פרוטוקולי EM, מונע משקעים, מונע את הצמיחה של חיידקים ופטריות, והוא תואם יוני סידן הדרושים כדי לשמר את שלמות ultrastructural של קרום שומנים35. במידת הצורך, tetroxide osmium יכול לשמש קיבעון נוסף לייצוב השימנים. זה יעזור לשפר את הניגודיות של מבנה התא, אבל גם להוסיף מתכת נוספת למערכת ולהפחית את הניגודיות שהושגה על QDs.

הפרוטוקול המתואר כאן מכיל שלבים רבים הדורשים הדרכה טובה. הכשרה מסוימת נדרשת לפני טיפול שבבים כדי למנוע גירוד פני השטח SiN של השבבים כדי למנוע שבירה. כפי שהוזכר קודם לכן, מומלץ להכין שבבים בכפילויות כמו חלון SiN יכול לשבור מפעם לפעם. השגת המספר הנדרש של תאים על שבב גם דורש קצת ניסיון. ציפוי התאים עם גרפן צריך קצת אימון כפי שזה יכול להיות קשה למצוא את זווית הטיה הימנית לצוף גרפן על המים. בעת תפיסת גרפן מהמים, זה גם יכול להיות קשה לראות את גרפן דק. ברגע הגרפן הוא על השבב, עודף מים צריך להיות מנופח עם נייר מסנן. זה צריך להיעשות רק עם קצה נייר מסנן כזה כדי למנוע את גרפן מהשבב.

ציפוי גרפן מנע מחפצים להופיע על הדגימה. אבל עבור D < 4 x 102 e-/Å2 גם לא צצו חפצים עבור הדגימה שאינה מצופה, וחפצים הופיעו עבור 2 דגימות שאינן מצופה בלבד. לכן, בדיקות של תאים שאינם מצופים גם נראה אפשרי, אם כי עדיף להשתמש גרפן ולהימנע מהסיכון של היווצרות חפץ. הרכב חפצים אלה ניתן לנתח בעתיד כדי לתת רמזים על איך למנוע את היווצרותם. לגבי היציבות המבנית של התאים נצפתה רק שיפור קל של ציפוי גרפן. התאים הקבועים התייצבו ככל הנראה באזורים הדקים שנבדקו, שם המבנה שלהם היה בסמיכות לממברנה SiN. מה שלא בדקנו כאן, עם זאת, היו ייבוש חפצים שידועים להתרחש עבור דגימות סלולריות כאשר נחשפו ואקום4. ייבוש התאים יוביל להתכווצות התאים כך שגם מרחקי ה-QD ישתנו כתוצאה מכך. עבור מינון האלקטרונים המשמש כאן, המרחק של QDs של דגימות מצופה גרפן ולא מצופה נשאר יציב. מחקרים נוספים נדרשים כדי לבחון את ההשפעה של ציפוי גרפן על התאים עבור EM.

מגבלה אחת של שיטה זו היא כי קיבעון כימי של התאים הוא הכרחי; לכן, לא ניתן לבצע ניסויים בתא חי. אבל במקרה התיוג אינו נחוץ ותאים עם יציבות מבנית גבוהה יותר משמשים, למשל חיידקים, אז תאים לא תוקנים יכול להיות מוקף גרפן עבור EM36 אם כי עם סובלנות מינון אלקטרונים שונה. כמו כן, החלבונים אינם ניתנים לזיהוי ישיר, כך QDs נדרשים כדי לדמיין את החלבונים. השיטה תרוויח מתוויות קטנות יותר. נקודת דיון היא אם זה טוב או רע כי ultrastructure אינו נראה בבירור. השיטה שלנו דומה לזו של מיקרוסקופ פלואורסטי שבו רק חלבונים נבחרים נראים37. הגדלת הנראות של מבנה האולטרה גם תוסיף מידע רב יותר לתמונה, ולאחר מכן בשלב מסוים תמנע זיהוי של מיקומי התוויות הבודדות. יתר על כן, השיטה המתוארת כאן היא עבור מין חלבון אחד, ותוספות של הפרוטוקול נדרשים להיות מסוגלים לתייג חלבונים מרובים. אחרון, השיטה פועלת כאשר מולקולה קטנה גבוהה מחייבת במיוחד כגון נוגדןפנטומימה 21 או nanobody38 זמין. נוגדנים נפוצים הם הרבה יותר גדולים וימנעו זיהוי של המצב הפונקציונלי של יחידות משנה חלבון לתוך אוליגומרים.

השיטה שלנו שימושית לחקר תפקוד חלבון על תאים שלמים באמצעות EM תוך שמירה על התאים במצב הידרציה. ניתן לבחון סדרה של תאים. סוג אחר של תאים וחלבונים ניתן ללמוד גם כן. אם אין צורך בתיוג חלבונים, ניתן להשתמש בתת-קבוצה של הפרוטוקול לציפוי גרפן של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות. היכולת לחקור תאים שלמים רלוונטית במחקר תאי להבנת מתאם של תפקוד חלבון ממברנה ברמה המולקולרית.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ל-D. B. Peckys על העזרה בפרוטוקול תרבות התא, פ. ויינברג על סקירת כתב היד, ט. טרמפרט לעזרה בניסויים ובדמויות, ס. סמולקה על העזרה עם הדמויות, ו-א. ארזט על תמיכתו באמצעות INM. מחקר זה ממומן על ידי אלסר קרונר-פרסניוס-שטיפטונג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. The Transmission Electron Microscope. , Springer. (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , Jones and Barlett Publishers. (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , Springer. (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 163 גרפן חלקיקים תא שלם הידרציה מיקרוסקופאלקטרונים סריקה STEM חלבוני קרום נזק לקרינה
מארז גרפן של תאי יונקים קבועים כימית עבור מיקרוסקופאלקטרונים בשלב נוזלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N.… More

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter