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Biology

액체 상 전자 현미경 검사를 위한 화학적으로 고정된 포유류 세포의 그래핀 인클로저

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

여기에 제출된 포유류 세포에 있는 막 단백질을 표지하고 액체 상 스캐닝 전송 전자 현미경을 위한 그래 핀으로 견본을 코팅하기 위한 프로토콜입니다. 방사선에 의한 손상에 대하여 견본의 안정성은 또한 이 프로토콜로 공부할 수 있습니다.

Abstract

프로토콜은 스캐닝 전송 전자 현미경 검사(STEM)를 사용하여 유방암 세포의 손상되지 않은 혈장 막에서 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)를 조사하기 위해 설명된다. 포유류 유방암 세포주 SKBR3의 세포는 실리콘 진타(SiN) 창이 있는 실리콘 마이크로칩에서 재배되었다. 세포는 화학적으로 고정되었고, HER2 단백질은 2단계 비오틴-스트렙타비딘 결합 프로토콜을 사용하여 양자점 나노입자(QDs)로 표지되었다. 세포는 수화 상태를 유지하고 STEM 중 전자 빔 손상으로부터 보호하기 위해 다층 그래핀으로 코팅되었습니다. 전자 빔 조사 하에 샘플의 안정성을 검사하기 위해, 투여 량 시리즈 실험이 수행되었다. 그래핀 코팅 및 비 코팅 샘플을 비교하였다. 빔 유도 손상, 밝은 유물의 형태로, 증가 전자 용량 D에서일부 비 코팅 샘플에 등장, 코팅 된 샘플에 어떤 유물이 나타나지 않는 동안.

Introduction

막 단백질 기능의 분석은 세포 생물학 연구 및 약물 개발에 필수적입니다. 중요한 실험의 클래스는 세포에 있는 막 단백질 위치의 검사를 관련시킵니다. 이 정보는 동적 조립 및 분해를 통해 다양한 세포 기능을 구동하는 단백질 복합체 및 플라즈마 막의 특정 위치에 있는 단백질 의 조립에 대한 결론을 추론하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 기술 중, 가벼운 현미경 검사법 (LM) 및 전자 현미경 검사법 (EM) 세포에서 단백질 기능을 공부하기 위해 사용 됩니다. LM은 액체에 있는 전체 세포의 분석을 허용합니다; 그러나, 해상도는 실용조건1,2하에서 초분해능 형광 현미경검사용 종래의 경우 200-300nm, 최대 20nm로 제한된다.,2 EM은 약 1Å 해상도3을제공하지만, 종래의 시료 제제는 탈수, 금속 염색을 필요로 하며, 수지와 같은 마운팅 물질에 포함시켜 전염 전자 현미경(TEM)4. 보다 원소적인 환경에서 생물학적 샘플을 보존하기 위해 cryo-EM 기술을5,,6로사용할 수 있다. 샘플은 비정질 얼음으로 빠르게 고정되고 필요한 경우 단면이 지정됩니다. 또 다른 옵션은 동결 골절 EM7입니다.

그들의 네이티브, 액체 상태에서 온전한 세포 내의 막 단백질을 연구하기 위한 EM 기술은 지난 10년 동안8,,9,,10,,11에서나타났다. 2nm의 공간 분해능은 SiN 멤브레인에서 재배되고 그래핀9층으로동봉된 전체 세포에서 양자점(QD) 표지막 단백질에 대해 달성되었다.

여기서, 단백질 라벨링 및 그래핀 코팅을 위한 프로토콜의 세부 사항은9,,12가 설명된다. 이 프로토콜의 목표는 수화 상태에서 세포를 보존하면서 전체 고정 세포의 막에서 HER2의 공간 분포를 분석하는 것입니다. 그래핀코팅은 진공 상태에서 세포의 건조를 방지하고, 또한 방사선손상(13)을감소시킨다. 이 방법은 손상되지 않은 혈장 막 내의 표지된 막 단백질에 대한 정보를 제공하지만, 이 방법은 일반적으로 EM과 같이 세포 초구조를 연구하는 데 유용하지 않다.

그래핀은 알려진 가장 얇은 나노 물질이며, 벌집격자(14)에배치된 단일 탄소 원자 두꺼운 결정시트로 구성된다. 높은 유연성과 기계적 강도를 포함한 독특한 특성을 가지고 있습니다. 최근 연구에 따르면 결함이 없는 그래핀은 가스및 액체에 침투할 수 없지만 결함으로 수소투과(15)를허용합니다. 이 누설은 여기에서 사용되는 다층 그래핀을 사용하여 줄일 수 있습니다. 이중층 그래핀은 최근 저온-EM 샘플에 대한 지원으로서 유용함을 나타내며, 균일하지 않은 층만 형성될 수 있는 그래핀 옥사이드에 비해 얇은 얼음층의 균질성을 향상시키는 것으로나타났다. 그래핀은 또한 액체상 투과 전자 현미경 검사법13,,17동안 생물학적 시료의 빔 손상을 감소시키는 것으로 나타났다. 예시적인 실험으로서, 포유류 유방암 세포주 SKBR3에서 발현된 HER2는 STEM을 사용하여 기록된 QDs18 및 공간 분포로 표지되었다. 세포는 전자 투명 SiN멤브레인(19)을가진 Si 마이크로칩에 시드되었다. 마이크로칩은 LM 및 EM과 견고하고 호환되며 전체 라벨링 프로시저가마이크로칩(19)에서직접 수행될 수 있기 때문에 지원으로 선택되었다. 셀 부착 후 HER2는 2단계 라벨링프로토콜(20)으로레이블을 지정했습니다. 먼저, 생체화 된 항 HER2 항체 미메틱화합물(21)이 HER2에 부착되었다. 세포는 그 때 표지 유도 수용체 군집을 방지하기 위하여 화학적으로 고정되고, 세포 초구조의 안정성을 증가시키기 위하여. 연쇄상 비딘 코팅 QDs는 이후 HER2 항체 모방 복합체에 연결되었다. 밝은 형광 신호와 QD의 전자 조밀 코어는 상관 접대 형광 및 전자 현미경 검사법 (CLEM)20을허용했다. CLEM은 STEM 분석에 대한 관심있는 세포 영역이 세포상에서 HER2의 국소화를 강조하는 개요 형광 현미경 이미지로부터 선택할 수 있기 때문에 특히 유용합니다. 세포는 높은 HER2 수준을 가진 세포 영역을 확인하기 위하여 형광 현미경 검사법에 의해 분석되었습니다. 그 후, 3-5층 두께의 그래핀 시트를코팅9,,22용세포로 이송하였다. 이어서, 시료는 EM 시편 홀더에 장착되었다. STEM 데이터는 환상 암장(ADF) 검출기를 사용하여 획득되었으며, 세포 표면 위치에 비해 전지 표면에 HER2의 공간 분포에 대한 정보를 제공하지만 셀의 초구조에 대한 정보는 제공하지 않았다. 전자빔 조사 하에서 시료의 안정성을 결정하기 위해, 시료는 이미지D시리즈에서 증가용량(D)에서 검사되었다. 그래핀 코팅 및 비 코팅 샘플의 차이를 조사하였다. 여러 종류의 방사선 손상을 평가하였다.

여기서 설명한 프로토콜은 HER2 과발현 포유류 유방암 세포주 SKBR3를 HER223을표적으로 하는 모델 시스템으로 사용한다. 프로토콜은 하나의 그래 핀 코팅 샘플의 준비를 포함, 하나의 유사한 샘플하지만 비교를위한 그래 핀 코팅없이. 실험은 SiN 창이 매번 끊어질 수 있고 대부분의 경우에 실험 복제본을 얻을 수 있기 때문에 중복으로 제조된다. 이 방법의 전체 수율은 그래핀 으로 덮인 세포를 가진 마이크로칩이 모든 경우에 전체 SiN 창이 그래핀으로 덮여 있을 수 있더라도 일반적으로 예외적인 오류로 얻어진다는 것을 의미합니다. 중복 복제는 프로토콜에 설명되지 않습니다.

라벨링 프로토콜(steps 1-5)은이전에발표된 COS7 섬유아세포 세포에서 표피 성장 인자 수용체의 라벨링 프로토콜과 비교된다. 해당 용지의 세부 사항은 마이크로칩의 취급 및 웰 플레이트의 사용에 대해 언급됩니다. 다음 프로토콜은 HER2, 그래핀 코팅9에라벨을 부착하고 시료의 방사선 내성을 검사하는 데 최적화되어 있습니다.

Protocol

1. 마이크로칩 청소 및 폴리 L-리신(PLL) 및 섬유네틴 단백질(FLP)으로 코팅

  1. 2개의 마이크로칩에 SiN 멤브레인(2.0 x 2.6 mm)을 50mL의 아세톤에 넣습니다. 평평한 면을 향하게 하여 마이크로칩을 조심스럽게 처리합니다. 평평한 부리 핀셋을 사용하여 가장자리를 깨는 것을 피하십시오. SiN 창의 파손을 방지하기 위해 핀셋으로 처리 할 때 마이크로 칩의 상단 표면을 만지지 마십시오.
    참고: 또한 폴리테트라플루오로틸렌 코팅 또는 카본 팁 핀셋을 사용하여 마이크로칩의 손상을 방지할 수도 있습니다.
  2. 비커를 조심스럽게 흔들어 서 2 분 동안 칩을 씻어 마이크로 칩이 뒤집히지 않는 것을 보고.
  3. 마이크로칩을 50mL의 에탄올로 옮기고 비커를 조심스럽게 흔들어 2분 동안 씻습니다. 여분의 아세톤이 건조하지 않도록 전송이 빠르다는 것을 확인하십시오.
  4. 마이크로칩을 50mL의 물로 10분 동안 씻으세요.
  5. 20mL의 에탄올을 새로 준비한 비커에 마이크로칩을 담급드세요.
  6. 마이크로칩을 클린룸 조직에 배치하여 건조시 좋습니다.
  7. 플라즈마는 마이크로칩을 70mTorr에서 11.5sccm O2 및 35 sccm Ar로 청소하고 무선 주파수(RF)-타겟은 5분 동안 50W입니다.
  8. 멸균 세포 작업을 위해 라미나르 플로우 후드에 마이크로칩을 놓습니다.
  9. 물 속에서 0.01% PLL의 솔루션을 준비하십시오. 인산완충식식염수(PBS)에서 15 μg/mL FLP의 용액을 준비한다.
  10. 라미나르 플로우 후드 아래 24웰 플레이트를 준비하고 5개의 웰을 각각 1mL의 솔루션으로 개별적으로 채웁니다: 잘 1 – PLL; 잘 2 – 물; 잘 3 – 물; 잘 4 – FLP; 웰 5 – PBS와 잘 6 – PBS.
    참고: 핀셋을 사용하여 몇 초 동안 마이크로칩을 표시된 24 또는 96에 잘 찍어 세척 단계를 수행합니다. 표시된 시간과 온도에 대해 표시된 솔루션에서 24 또는 96에서 마이크로칩을 잘 배양하여 인큐베이션 단계를 수행합니다. 마이크로칩을 몇 초 이내에 다른 우물로 옮기세요.
  11. 5 분 동안 PLL 솔루션에 마이크로 칩을 인큐베이션합니다. 그런 다음 마이크로칩을 물에 두 번 씻으세요.
  12. 5 분 동안 FLP에서 마이크로 칩을 배양. 그런 다음 PBS에서 마이크로칩을 두 번 세척합니다.
  13. 두 마이크로칩을 새로운 96개의 웰 플레이트에 셀 파종용 혈청 프리 배지 50μL로 미리 채운 웰(각 마이크로칩에 대해 하나씩)으로 옮기습니다.
  14. 마이크로칩을 세포 현탁액이 준비될 때까지 37°C 및 5%CO2로 배양한다.

2. SiN 멤브레인 마이크로 칩에 세포를 파종

  1. 모든 소모품과 장비를 라미나르 플로우 후드에 설치하여 멸균 작업을 보장합니다.
  2. 유방암 세포주, SKBR3를 한 번 성장 배지로 세포 배양물로 씻는다. Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 사용 하 여 10% 태아 송아지 혈 청 (FCS), 그리고 1% 비 필수 아미노산 (NEAA) 성장 매체로.
  3. 세포가 플라스크에서 분리될 때까지 세포 분리 용액의 1mL로 세포를 배양한다.
  4. 플라스크의 분리된 세포에 5mL의 성장 배지를 추가합니다. 이 서스펜션을 원심분리기로 옮기.
  5. 세포 현탁액의 파이펫 20 μL이 혈류계로 들어가 세포 농도를 얻는다. 다음 수식을 사용합니다.
    Equation 1.
  6. 2.5 x 105 셀/mL의 분산 셀 서스펜션을 준비합니다. 준비된 셀 서스펜션의 필요한 양을 다음으로 계산합니다.
    Equation 2
    원하는 볼륨에 성장 매체로 채웁니다.
  7. SiN 멤브레인이 위쪽을 향하고 있으며 각각 25,000개의 세포를 포함하도록 혈청이 없는 배지의 50 μL을 향하도록 PLL 및 FLP 코팅 마이크로칩을 포함하는 96개의 웰 플레이트의 두 웰에 셀 서스펜션의 100 μL을 추가합니다.
  8. 37°C및 5%CO2에서 플레이트를 배양하여 5분 동안 소칩에 부착할 수 있는 세포를 기다립니다.
    참고: 이 시점에서 세포는 아직 부착되지 않았기 때문에 마이크로칩에서 분리될 수 있습니다.
  9. 반전 된 현미경으로 마이크로 칩에 세포의 밀도를 확인합니다. 셀이 평평하게 하고 부착하기에 충분한 공간으로 창을 덮는지 확인합니다(그림 1A참조).
    참고: 필요한 경우 이 시점에서 더 많은 셀을 추가할 수 있습니다.
  10. 마이크로칩을 200μL의 성장 배지를 포함하는 새로운 우물로 옮기고 하룻밤 사이에 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.
  11. 다음 날 오후에, 세포가 평평해지고 육안으로 검사된 인플루엔자(즉, 세포로 덮인 창 영역의 분수)를 약 2/3(그림 1B참조)로 분리한 경우 두 마이크로칩을 혈청이 없는 배지(혈청 기아 배지)로 옮기는 경우. 다른실험(25)을비교하기 위해 필요에 따라 정의된 시작 상태로 세포를 가져오기 위해 필요에 따라 혈청 없는 배지로 변경한다.
  12. 하룻밤 사이에 37 °C 및 5 % CO2에서 배양하십시오.
    참고: 세포 양은 다른 세포주에 대한 성장 속도 및 세포 형태에 따라 다를 수 있음을 유의하십시오.

3. HER2 라벨링 및 고정

  1. 보충 표 1에 설명된 대로 솔루션을 준비합니다.
    1. 라미나르 플로우 후드 아래에서 작동하여 멸균 작업을 보장합니다. 라벨링 플레이트 I라고 하는 96개의 웰 플레이트를 사용하고, 라벨링 플레이트 I 용액의 200 μL로 마이크로칩당 6개의 웰을 채우고 있습니다: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, 항체 마임제, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. 마이크로칩당 웰 플레이트의 행 당 행(예: A1에서 A6까지)을 사용합니다. 라벨링 플레이트를 37°C로 데우도록 데우습니다.
    2. 연기 후드 에서 고정 플레이트라고 불리는 24 개의 웰 플레이트를 준비하고 고정 플레이트 솔루션의 500 μL로 마이크로 칩 당 8 개의 우물을 채웁니다 : CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS / 글리신, PBS / 글리신, PBS / BSA.
      주의: CB는 흡입 또는 구강 섭취에 의해 심각하게 독성이 있으며 물에 유해합니다. 적절한 보호와 연기 후드에서 작업하고 안전 데이터 시트 (SDS)에 따라 CB를 폐기합니다. FA는 부식성이며 피부와 건강에 해롭습니다. 연기 후드 아래에서 작업하고 취급 및 폐기에 대한 자세한 내용은 SDS를 참조하십시오.
    3. 라벨링 플레이트 II라고 하는 96개의 웰 플레이트를 준비하고 마이크로칩당 4개의 웰을 라벨링 플레이트 II 솔루션의 200μL로 채웁니다: QDs, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA.
      참고 : 여기에, 24 우물 플레이트는 더 나은 우물에서 마이크로 칩을 볼 하는 데 사용 됩니다. 항체 모방(3.2단계) 및 QD(단계 3.4)를 적게 사용하려면 이러한 단계에 96개의 웰 플레이트를 사용하십시오.
  2. 셀에 HER2에 레이블을 지정합니다.
    1. 이러한 플레이트가 준비되면 마이크로칩을 라벨링 플레이트 1의 첫 번째 행의 우물에 배치하여 라벨링을 시작합니다.
    2. 라벨 플레이트 I로 표시된 96 웰 플레이트에서 PBS/BSA로 마이크로칩을 세척합니다.
    3. PBS/BSA/GS로 37°C 및 5%CO2로5분 동안 배양함으로써 항체 모방의 특이하지 않은 결합을 방지하기 위해 특이하지 않은 부위를 차단한다.
    4. 37°C에서 10분 동안 200nM 항체 모방을 배양하고 5%CO2를증분한다.
    5. PBS/BSA에서 마이크로칩을 세 번 세척합니다.
  3. 셀을 수정합니다.
    1. 마이크로칩을 연기 후드의 24웰 고정 플레이트로 옮기.
      참고: 여기에서멸균 작업이 필요하지 않습니다.
    2. CB로 몇 초 동안 한 번 씻으시다.
    3. 10 분 동안 3 % FA로 셀을 수정합니다.
    4. CB로 한 번, PBS로 세 번 씻으시면 됩니다.
    5. PBS-글리신을 2분 동안 배양하여 FA의 무료 알데히드 그룹을 차단합니다.
    6. PBS-BSA로 마이크로칩을 한 번 세척합니다.
  4. QD를 연결합니다.
    1. 마이크로칩을 96개의 잘 라벨링 플레이트 II로 이동합니다.
    2. 12 분 동안 20 nM QD와 인큐베이션.
    3. PBS/BSA로 마이크로칩을 두 번 세척합니다.
    4. 마이크로칩을 PBS/BSA가 잘 들어 있는 웰에 보관합니다.

4. 고정 된 세포의 가벼운 현미경 검사

  1. PBS/BSA 용액 2mL로 3.5cm 직경의 유리 바닥 접시를 준비합니다.
  2. 첫 번째 마이크로칩을 가져 와서 거꾸로 (아래로 향하는 세포)를 유리 바닥 접시에 넣고 형광 현미경에 접시를 놓습니다. 마이크로칩을 액체로 천천히 낮추어 세포의 손상을 방지합니다.
  3. 40배 목표와 적절한 형광 채널을 통해 모든 마이크로칩의 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 및 형광 이미지를 획득합니다.
    참고: 여기서, 540-580 nm의 포원 파장과 607-683 nm의 방출 파장을 QD655를 검출하는 데 사용된다.
  4. 두 번째 마이크로칩에 대한 절차를 반복합니다.

5. 수정 후

  1. 연기 후드 아래의 모든 단계를 수행합니다.
  2. 96개의 웰 플레이트의 마이크로칩당 6개의 우물을 채우고 수정 후 솔루션의 200μL을 입력합니다.
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    주의: GA는 피부에 유해하며 피부, 호흡기 및 눈에 유해합니다. 연기 후드 아래에서 작업하고 취급 및 폐기에 대한 자세한 내용은 SDS를 참조하십시오.
  3. 두 마이크로칩을 각각 의 우물에 놓고 세포가 위를 향합니다.
  4. CB로 한 번 씻으시면 됩니다.
  5. 10 분 동안 2 % GA로 셀을 수정합니다.
  6. CB로 한 번 씻으시면 됩니다.
  7. PBS/BSA로 세 번 씻으셔도 됩니다.
    참고: FA를 사용한 첫 번째 고정 단계는 이미 생물학적 구조를 수정하지만 막 단백질 확산의 감소된 수준은 여전히 발생할 수 있으며, QD당 다중 스트렙타비딘의 존재로 인해 라벨 유도 클러스터링으로 이어질 수 있습니다. 따라서 FA 고정에서 GA로의 실험 단계의 시간을 유지하여 멤브레인의 단백질 확산을 최소화하기 위해 가능한 한 짧게 하십시오.
  8. PBS/BSA에 저장하여 삼투성 충격을 방지하고 0.02% 나트륨 아지드(NaN3)를저장하여 새로운 웰 플레이트에 그래핀 코팅까지 4°C에서 세균 성장을 방지합니다. 건조를 방지하기 위해 파라핀 필름으로 잘 플레이트를 밀봉하십시오. 마이크로칩과 세포는 4°C에 보관할 때 최대 2주까지 안정적입니다.
    주의: NaN3은 물과 급성 독성을 구강 섭취, 피부 및 호흡기용으로 유해합니다. 연기 후드 아래에서 작업하고 취급 및 폐기에 대한 자세한 내용은 SDS를 참조하십시오.

6. 그래 핀을 소금 결정으로 청소하고 전달합니다.

  1. PMMA-그래핀 온 폴리머(도2A)로부터폴리(메틸 메타크릴레이트)-그래핀을 제거한다.
    1. PMMA 그래핀 주위의 폴리머에 몇 방울의 물방울을 피펫.
      참고: PMMA 그래핀이 수면에 떠 있는 지지 폴리머에서 쉽게 벗겨지도록 하십시오.
    2. PMMA 그래핀 온 폴리머를 30-45°의 각도로 물에 담그면 PMMA-graphene을 방출합니다.
      참고: 폴리머는 약간만 젖어야 합니다. 폴리머에 너무 많은 물을 파이프하면 PMMA 그래핀을 들어 올리고 접을 수 있습니다.
  2. 나트륨 퍼설페이트 용액을 이용한 에칭 구리 계 오염물질(도2B).
    참고 : 구리 호일에 재배 된 상업용 그래핀에는 종종 구리 에티트 용액(22)으로제거 할 수있는 하위 마이크로 미터 구리 잔류물이 포함되어 있습니다.
    1. 물 속에서 0.42 M 나트륨 의 50 mL 용액을 준비합니다.
    2. 표준 유리 슬라이드를 사용하여 PMMA-그래핀을 나트륨 퍼설페이트 용액으로 옮기십시오. PMMA 그래핀은 용액 위에 떠 있습니다.
    3. 심야 나트륨 persulfate 용액에 PMMA 그래핀을 둡니다.
    4. 나트륨 persulfate 용액에서 PMMA 그래 핀을 제거하고 유리 슬라이드를 사용하여 깨끗한 물 위에 놓습니다. 반 시간 동안 물에 떠 보자.
    5. PMMA-그래핀으로부터 모든 멸산나트륨 잔류물을 제거하기 위해 이전 단계를 총 3회 반복한다.
  3. PMMA 그래핀을 염화나트륨(NaCl) 결정으로 옮기다.
    1. 페트리 접시에 물에 NaCl의 포화 솔루션을 준비합니다.
    2. 유리 슬라이드를 사용하여 그래핀 측면을 아래로 사용하여 NaCl 용액 위에 PMMA 그래핀을 전달합니다.
    3. 핀셋으로 NaCl 크리스탈을 잡고 떠다니는 PMMA 그래핀을 집어들세요.
      참고: NaCl 결정의 크기는 소금 의 가장자리에 돌출 된 그래 핀을 접거나 핀셋으로 그래 핀에 접촉하지 않도록 PMMA 그래 핀의 크기보다 약간 커야합니다. 이러한 실험에서 NaCl 크리스탈12mm x 12mm x 0.5 mm는 10mm x 10mm 그래핀 시트를 집어 들고 나중에 지원하는 데 사용됩니다.
    4. PMMA-그래핀 온 소금을 2분 동안 수직으로 잡고 여분의 물이 흘러나올 수 있도록 합니다.
    5. PMMA-그래핀 온-소금을 실온에서 30분 동안 건조시키고 100°C의 오븐에서 20분간 구워 물을 완전히 제거합니다.
  4. 아세톤워시(그림 2C)를사용하여 PMMA를 제거합니다.
    1. 유리 페트리 접시에 아세톤을 연기 후드의 핫플레이트에 ~50°C로 예열합니다. 불을 피하기 위해 조심스럽게 온도를 지켜보십시오.
    2. PMMA 그래핀 온 소금을 아세톤으로 채워진 페트리 접시에 담그고 30분 동안 PMMA를 녹입니다.
    3. 새롭고 깨끗한 아세톤으로 이전 단계를 총 세 번 반복합니다.
    4. 샘플 준비를 위해 사용하기 전에 그래핀 온 소금 공기를 철저히 건조시키십시오.

7. 그래핀 코팅

참고: 그래 핀 코팅 절차는 그림 3A에괄호로 표시됩니다.

  1. 고정 된 세포로 제조 된 하나의 마이크로 칩을 씻고 충완에서 소금의 잔류물을 제거하기 위해 순수한 물에 HER2를 표시합니다. 마이크로칩을 필터 용지에 놓습니다. 세포는 다크스팟(그림 3B)으로볼 수 있습니다.
  2. NaCl 크리스탈의 다층 그래핀을 면도날을 사용하여 마이크로칩의 SiN 창에 맞는 조각으로 자른다.
  3. 순수한 물의 비커를 준비하고 수면에 대하여 약 45° 각도의 결정을 기울이고 물을 만져서 NaCl 크리스탈에서 그래 핀을 제거합니다. 그래 핀은 수면(그림 3C)에떠 있습니다.
  4. 수면의 금속 고리로 그래핀을 잡으세요. 그래 핀은 루프 아래의 액적 내에 떠 있습니다(그림 3D).
  5. 마이크로칩의 상부 표면을 하부 루프 표면으로 터치합니다. 마이크로칩은 금속 루프에 충실합니다. 그래 핀은 마이크로칩(도3E)의상부에서 볼 수 있다.
  6. 스테레오현미경으로 필터 용지를 사용하여 마이크로칩에서 남은 물을 제거하여 그래핀이 SiN 창의 모든 세포를 덮습니다.
    참고: 그래핀이 블랜트할 때 이동합니다. 필터 용지 가장자리만으로 마이크로칩을 터치하여 그래핀이 창 상단에 있는지 확인합니다.
  7. 핀셋을 사용하여 금속 루프에서 마이크로칩을 제거하고 필터 용지에 놓습니다. 그래 핀은 마이크로 칩(도 3F)에보라색 반짝이로 볼 수 있습니다.
  8. 마이크로칩을 종이에서 페트리 접시로 옮킵니다.
  9. 파이프는 물 방울을 자유 칸 중 하나에 넣고 뚜껑을 닫아 수분 포화 분위기를 제공합니다.
  10. 파라핀 필름으로 구획 접시를 밀봉하고 추가 측정을 위해 필요한 경우 4 °C의 냉장고에 보관하십시오.

8. 줄기

  1. 콘덴서 렌즈, 프로브 전류 I = 180 pA(5% 정확도 이내제조업체에 의해 제공되는 상이한 현미경 설정에 대한 프로브 전류에 대한 정보) 및 13.2mrad의 빔 수렴 반각도를 삽입하여 서적어도 0.2nm의 프로브 크기에 대한 정렬/테스트 샘플을 사용하여 200 kV 빔 에너지에서 STEM을 조정한다. 프로젝터 렌즈 설정을 조정하여 ADF STEM 검출기를 세미 앵글 범위(내부 및 외부)를 68-280 mrad로 설정합니다. STEM 이미지 크기를 2048 x 2048 픽셀로 설정하고 픽셀은 시간 t = 6 μs에 거주합니다.
  2. 세포가 향하고 있는 방식으로 TEM에 대한 표준 표본 홀더에 그래핀 코팅 된 세포로 마이크로 칩을 적재합니다.
  3. 홀더를 전자 현미경에 적재합니다.
  4. 8.1 단계의 설정을 사용하여배율(M)= 800x(도4)에서개요 그림을 획득한다.
  5. 셀에서 관심 영역을 식별합니다.
  6. M = 80,000x에서 ADF 검출기가 있는 QD를 픽셀 크기 d = 1.3nm(그림4)에서8.1단계의 설정을 사용하여 이미지합니다.
  7. 노출영역(도 4)을나타내기 위해 노출 후 영역의 이미지를 낮은 배율(여기, M = 50,000x)으로 획득한다.
  8. 전자 용량 계산
    Equation 3
    e는 기본 요금입니다. 위의 설정과 함께,
    Equation 4
    5%의 오차가 있습니다.
  9. 동일한 설정으로 용량 시리즈에 대해 20 개의 이미지를 획득하지만 t = 60 μs로 누적 된 용량의 결과
    Equation 20.
  10. 그래 핀의 존재를 확인하려면 현미경을 M = 1,200x에서 TEM으로 전환하고 셀 근처의 영역을 선택하고 회절 모드로 전환합니다. 노출 시 0.5초, 2048 x 2048 x 3픽셀, 50 μm(도4)의선택된 영역 조리개에 회절 패턴을 기록합니다.
  11. 세션의 끝에서, 현미경에서 샘플을 제거하고, 마이크로 칩을 구획 접시에 다시 넣고, 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고, 추가 측정을 위해 필요한 경우 4 °C의 냉장고에 보관하십시오.
  12. 제1 마이크로칩과 동일한 방식으로 제조되었지만 그래핀 코팅없이 제조된 두 번째 마이크로칩을 선택합니다.
  13. 8.2-8.11 단계를 반복하지만 이제이 샘플에 대해 반복하십시오. 비교(그림 4)와같이 위와 동일한 설정으로 회절 패턴을 기록합니다.

9. 분석

참고: STEM 이미지에서 QD 위치를 자동으로 감지하기 위해 분석은다른곳에서 설명한 대로 ImageJ(NIH)에 대한 로컬 디자인 플러그인을 사용합니다. 플러그인은 요청 시 사용할 수 있습니다.

  1. 이 소프트웨어는 STEM 이미지에서 입자를 감지하기 위해 다음 단계를 자동으로 적용합니다.
    1. 픽셀 노이즈를 줄이기 위해 가우시안 필터를 적용합니다.
    2. 빠른 포리에 변환 (FFT) 밴드 패스 필터를 적용하여 나노 입자만 가져옵니다.
    3. 이미지를 비나이즈하기 위해 임계값을 설정합니다.
    4. 입자 감지를 위해 공차 계수가 2인 10nm의 입자 직경을 사용합니다.
    5. 파티클 위치를 감지합니다.
  2. 시리즈당 10쌍의 QD 사이의 중심간 거리를 측정합니다. 여기서, 다양한 크기의 10 개의 거리가 시리즈당 측정되었습니다.
  3. 다음을 사용하여 각 파티클 거리를 첫 번째 이미지의 거리와 비교하여 파티클 거리의 상대적 변화를 계산합니다.
    Equation 5.

Representative Results

도 1A는 창이 덮여 있는 방식으로 시드된 세포를 나타내지만, 이를 평평하게 하고 부착할 수 있는 충분한 공간이 있어 약2/3rd(그림 1B)의합류로 이어진다. 마이크로칩(도1C)에너무 많은 세포가 시드되는 경우, 모든 세포가 마이크로칩을 부착할 공간이 부족하다. 도 1D는 24h 이후와 동일한 마이크로칩을 나타낸다. 세포의 절반 이상이 평평해지지 않았습니다. 한편, 셀이 너무 적으면(도 1E),SiN 창은 도 1F에서볼 수 있듯이 24h 후 큰 빈 공간으로 끝납니다. 도 1G는 도 1A 및 도 1B에서세포의 DIC 이미지를 나타낸다. 도 1H는 HER2의 성공적인 라벨링을 나타내는 노란색으로 표시된 해당 형광 이미지 의 거짓을 나타낸다.

대표적인 STEM 데이터는 도 4에도시되어 있다. 그래핀 코팅(왼쪽 컬럼) 및 비코팅(오른쪽 컬럼) SKBR3 세포를 조사하였다. 도 4A,B는 창에 있는 셀의 M = 800x 개요 이미지를 표시합니다. 인셋으로 표시된 영역은 용량 시리즈 동안 M = 80,000x에서 이미지화되었으며 그림 4C,D를참조하십시오. QD는 밝은 반점으로 보입니다. 도 4E 및 도 4F는 도 4C의직사각형 위치에서 획득한 M = 50,000x 확대 된 이미지를 보여 주며,D. 두 이미지는 D = (7.8 ±0.4) x 103 e-/Å2와함께 투여 시리즈를 수집 한 후 기록되었다. 투여량 계열은 M = 80,000x에서 기록되었다. 노출된 영역은 직사각형으로 인식될 수 있으며, 이에 따라 비코팅 된샘플(도 4F)에대해 사각형이 명확하게 보였다.

그래 핀의 존재를 확인하기 위해 세포가없는 영역의 회절 패턴을 확인하지만 SiN 창에 그래 핀이 있거나없는 것을 획득했습니다. 그래핀의 육각형 구조는 그래핀 코팅샘플(도 4G)의회절 패턴에서 관찰되었으며, 비코팅 시료(도4H)에대해 결석하였다. 단일 결정 그래 핀의 회절 패턴은 그래 핀의 고도로 정렬 된 육각 형 구조로 인해 6 배 대칭을 가질 것입니다. 따라서 육각형 구조는 샘플에 그래 핀의 존재를 나타냅니다.

샘플에 전자 빔 조명의 효과를 조사하기 위해 STEM 이미지는 축적 된 전자 용량의 이미지 시리즈에서 획득되었습니다. 코팅되지 않은 및 그래핀 코팅 된 샘플에 대한 대표적인 결과는 각각 도 5A-D 및 도 5E-G에표시됩니다. 모든 데이터는 셀의 가장자리에서 습득되었으며, 여기서 셀은 평평한, 관찰된 구조는 따라서 SiN 멤브레인에 가장 가깝다. 코팅되지 않은 시료의 노출은 D=(1.9±0.1) x 103 e-/Å D 2(도 5B)에서세포 표면에 나타나는 밝은 구조로 이어졌다. 이러한 구조는 더 높은 용량으로 더 커졌기 때문에 D =(7.8± 0.4) x 103 e-/Å2 (도 5C, D)에서시리즈의 마지막 이미지에서 명확하게 볼 수 있었습니다. 이러한 반점은 그래 핀 코팅 샘플(도 5Figure 5E-G)에나타나지 않았다.

상기에 기재된 프로토콜을 사용하여 추가 마이크로칩을 제조및 검사하였다. 6개의 코팅및 7개의 비코팅 견본은 총으로 조사되었습니다. 코팅되지 않은 7개의 샘플 중 2개는 이러한 유물을 보여주었습니다. 코팅된 샘플 중 어느 것도 추가적인 밝은 반점을 보여주지 못했습니다.

방사선 손상의 또 다른 척도로, QDs 사이의 거리를 검사했다. 구조적 손상이 발생하면 QD 사이의 거리가 변경될 것으로 예상됩니다. 거리의 변화는 다양한 쌍 거리에 대해 D를 축적하는 다양한 QD 쌍에 대해 측정되었습니다. 도 5H는 코팅되지 않은 시료의 입자의 상대적 변화가 평균 1.3% 미만으로 유지된 반면, 코팅된 시료의 평균 상대 거리는 0.8% 미만으로 유지되었다는 것을 보여줍니다. 따라서 그래핀 코팅이 시료를 안정화시켰지만 그래핀 코팅이 없는 건조시도 현저하게 안정적이었다는 결론을 내릴 수 있다.

Figure 1
그림 1: 실리콘 마이크로칩의 SiN 창에 세포 파종 및 HER2 라벨. (A)마이크로칩에 시드후 5분 동안 SKBR3 세포를 가진 SiN 창 영역의 예시적인 영상. (B)동일한 세포가 24시간 후 동일한 SiN 창에 퍼진다.(C)SKBR3 세포는 시드 후 5분 동안 시 마이크로칩에 있다. (D)24시간 후 (C)와 동일한 세포. 파종 시 칩에 세포가 너무 많기 때문에 세포가 제대로 평평해지지 않았습니다. (E)종자 후 5 분 마이크로 칩에 세포. (F)마이크로칩에 너무 적은 세포가 시드되었기 때문에 창에서 셀이 거의 보이지 않았다. (G)HER2의 QD 라벨링 후 동일한 SKBR3 세포의 DIC 이미지. (H)ED2-QD655(노란색으로 거짓 색)를 가진 SKBR3 세포의 DIC 및 해당 형광 이미지의 오버레이 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 그래핀을 NaCl 크리스탈로 청소하고 전달합니다. (A)PMMA-그래핀 온 폴리머는 PMMA 그래핀을 방출하기 위해 순수한 물에 침지된다. PMMA 그래핀은 유리 슬라이드로 잡을 수 있습니다. (B)구리계 오염은 파황페이트 나트륨 용액을 사용하여 에칭하였다. 그래 핀을 청소하기 위해, 그것은 탈이온 된 물을 포함하는 비커로 전송되었다. 이 단계는 3번 반복되었습니다. PMMA 그래핀은 순수한 물에 NaCl의 포화 용액으로 옮겨졌습니다. NaCl 결정은 염액에서 그래 핀을 집어 들기 위해 사용되었습니다. (C)NaCl 크리스탈의 PMMA 그래핀은 실온에서 30분 동안 건조되었습니다. PMMA는 30 분 동안 아세톤에서 블록을 인큐베이팅하여 제거되었습니다.

Figure 3
그림 3: Si 마이크로칩에 시드된 세포의 그래핀 코팅. (A)그래 핀 코팅의 절차. NaCl 크리스탈의 그래핀이 수면위로 방출됩니다. 그래핀 조각은 금속 루프로 잡히고 Si 마이크로칩으로 전달됩니다. (B)마이크로칩(2.0 x 2.6mm)은 그래핀 없이 400 x 160 μm의 SiN 윈도우를 갖는다. SKBR3 세포는 어두운 반점으로 보였다. (C)물로 채워진 비커의 표면에 떠있는 그래 핀 (빨간 원). (D)금속 루프로 잡힌 그래핀. (E)그래핀이 SiN 창 위에 있도록 물방울에 부착된 마이크로칩. (F)그래 핀 코팅 후 마이크로 칩. 그래핀은 보라색 반짝이로 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: SiN 창에 그래 핀 코팅 및 비 코팅 된 SKBR3 세포의 STEM. (A)M=800x에서 획득한 그래핀 코팅 시료의 STEM M 이미지(B) M=800x.(C) B M= C80,000x 이미지에서 획득한 노단형 시료의 줄기 이미지는 A. 옐로우 라인의 파란색 사각형의 위치에 기록된 80,000x 영상을 나타내고 입자 내에서 측정된 예를 나타낸다. (D) M = 80,000x 이미지는 B. 노란색 선에서 파란색 사각형의 위치에 기록된 입자 내에서 측정된 예를 나타낸다. (E) M = D =(7.8±0.4) x 103 e-/Å2에노출된 C와 동일한 영역의 50,000x 이미지. (F) M = D와 동일한 영역의 50,000x 이미지 및 D =(7.8±0.4) x 103 e-/Å2에노출된다. 노출된 지역은 분명하게 보였다. (G)세포가 없는 부위로부터 그래핀 코팅 된 샘플의 회절 패턴. 그래 핀의 6 배 대칭은 밝은 반점으로 볼 수 있습니다. (H)그래 핀이 없는 시료의 회절 패턴이 6배의 밝은 반점을 나타내지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 그래핀 코팅없이 샘플에서 발생하는 유물. (A) M = 80,000x에서 획득하고 D =(0.39± 0.02) x 102 e-/Å2에 노출된 그래 핀 코팅이 없는 시료에 대한 영역의 첫 번째 이미지.2 (B) D =(1.94± 0.1) x 103 e-/Å2(노란색 화살표)에서 발생하는 첫 번째 아티팩트가 있는 이미지. (C, D) D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ Å2로획득 한 시리즈의 마지막 이미지. 유물은 밝은 반점으로 보였다. (E-G) 그래 핀 은 발생 유물없이 샘플을 코팅. (E) D = (0.39 ± 0.02) x 102 e-/Å2 (F)x 103 e-/Å2 (G) D = (7.8 ±.4) x 103 e-/Å2. D (H)그래 핀 코팅 및 비 코팅 된 샘플에 대한 입자 거리의 상대적 변화. 유물을 보여주는 비코팅 샘플 중 2개는(A-C)에 나타난 샘플 중 하나와 D의 두 번째 샘플의 마지막 이미지와 3개의 코팅된 샘플을 분석하였다(하나는 E-G로 도시됨). 총 10개의 QD 쌍이 250nm에서 3 μm 사이의 거리를 가진 샘플당 검사되었습니다. 상대적 변화는 한 그룹의 모든 측정평균을 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보조 표 1: 솔루션 및 버퍼용 레시피입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

단백질 기능을 더 잘 이해하려면 그대로 세포의 혈장 막에서 단백질 위치에 대한 정보를 얻는 것이 중요합니다. 이 정보를 얻기 위한 방법은 초해상도 형광 현미경 검사법1,,2를포함한다. 초해상도 현미경 검사는 지난 몇 년 동안 더 개발되었지만, 그것의 해상도는 여전히 세포 실험의 실제적인 조건에 대 한 약 20 nm에 국한, 전형적인 수용 체 단백질의 범위에 크기 는 1-10 nm. 단백질을 시각화하기에 충분한 해상도를 가진 단 하나 세포 및 단 하나 분자 수준에 단백질의 화상 진찰은 EM을 통해 가능합니다. 그러나 절개로 인해, 종래의 EM 방법은 전형적으로 세포를그대로두지 않으며, 이는 플라즈마 멤브레인에서 단백질의 문맥과 공간 분포에 대한 중요한 정보의 손실로 이어집니다. 저온-TEM을 갖는 전체 세포에 대한 방법은6,단백질 라벨링을 저온-EM(27)과 결합하는 것이 가능하며, 또한 저온-STEM이28개입증되었다.27 그러나, 극저온-EM 워크플로우는 세포 초구조 및 단백질 구조를 연구하는 데 최적화되며 멤브레인 단백질 공간 분포를 분석하는 데 는 그리 많지 않습니다. 임계점 건조는 또 다른 전체 세포 준비 방법이지만 샘플은 여러 건조 단계를 거치며, 기술은 매우 시간이 많이 소요되는29. 막 단백질은 또한 동결 골절7을통해 검사되었습니다. 이 방법에서는 세포가 고정, 동결 및 골절됩니다. 골절된 부품은 탄소 및 백금 층에 의해 복제되고 생물학적 시료가 제거됩니다. 그런 다음 복제본을 EM30으로분석할 수 있습니다. 전체 세포 분석은 전체 세포의 문맥 내의 막에 단백질의 분포에 대한 정보가 손실되어 동결 분획으로 불가능합니다.

여기에 제시된 방법은견본9,,31를얇게 슬라이스할 필요 없이 세포막을 연구할 수 있게 한다. 세포는 막 단백질의 국소화가 EM 심상과 상관되는 형광 심상에서 볼 수 있도록 그대로 유지됩니다. 수화 상태의 그대로 세포 내의 단일 세포 및 단일 분자 수준에서 단백질을 연구하는 것은 이 그래핀 인클로저 방법을 사용하여 QD 표지 단백질의 STEM을 사용하여 2nm의 해상도로 가능하다는 것을 보여주었다9. 그들의 네이티브 상태에 있는 세포를 지키는 것은 단백질 기능을 이해하는 데 중요한 단 하나 세포 및 단 하나 분자 수준에서 분석이 가능하다는 것을 막 단백질의 공간 분포를 보존하고, 치료 접근을 위한 새로운 약을 개발하는 것을 중요합니다.

EM을 가진 화상 진찰 생물학 견본의 또 다른 중요한 양상은 전자 광선에 기인한 견본의 방사선 손상입니다. 용액은 종종 탄소32의얇은 층 사이의 시편을 캡슐화하는 것과 같은 가능한 한 전자 용량또는 다양한 코팅 방법의 감소를 포함한다. 우리의 방법은 그래핀 코팅이 비 코팅 된 샘플을 위해 세포 표면에 나타나는 빔 유도 아티팩트를 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 화학적으로 고정된 그래핀 코팅 된 생물학적 샘플의 검사는 200 케브 빔 에너지에서 D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2에서 전자 빔 조사하에서 가능한 밝은 반점과 같은 방사선 손상없이 샘플에 나타나는. 정교한 시료 제제, 예를 들어 염색, 임베딩, (극저온)단면, 골절 등을 포함하는 다른 EM 방법에 비해, 여기에 설명된 방법은 시간이 덜 소요된다. 단백질의 라벨링은 몇 시간 이내에 수행되며 그래 핀 코팅은 숙련 된 연구자에게 약 15 분밖에 필요하지 않습니다. 샘플 준비는 형광 현미경 검사법에 필요한 절차와 유사합니다.

프로토콜은 일부 단계에서 수정할 수 있습니다. 마이크로칩의 그래핀은 필터 용지로 블랜트할 때 그래핀이 움직이지 않도록 공기 건조될 수도 있습니다. 그래핀이 소금으로 오염되면 소금을 녹여 오염을 최소화하기 위해 약 1 시간 동안 수면에 떠있는 것이 가능합니다. 그래핀상 구리 또는 PMMA 오염발생은 프로토콜의 해당 에칭 단계를 확장함으로써 감소될 수 있다. 다른 그래핀 코팅 방법은 예를 들어, 그래핀-PMMA가 세포에 직접 증착되고, PMMA는 그 후3333아세톤에서 세척하여 제거된 곳을 설명하였다. 우리의 방법에서, PMMA는 추가 아세톤 세척 단계로 인한 세포에 가능한 손상을 방지하기 위해 코팅하기 전에 제거되었다. NaCl은 평평한 기판으로 선택되었기 때문에 그래 핀을 주름시키지 않고 물에 용해하여 그래핀9를방출한다. 게다가, 원하는 크기로 절단 할 수 있으며 기판 잔류물은 그래 핀에 남아 있지 않습니다. 그러나 이러한 기준을 고려하여 염화칼륨과 같은 다른 기질도 사용할 수 있습니다.

잠재적인 라벨 유도 클러스터링 가능성을 줄이기 위해 GA 고정 단계는 FA 고정 후 직접 구현될 수 있으며, 그 후 모든 멤브레인 단백질이 고정됩니다. FA를 사용한 첫 번째 고정 단계는 이미 생물학적 구조를 고치지만 멤브레인 단백질 확산의 감소된 수준은 여전히34개,QD당 다중 스트렙타비딘의 존재로 인해 라벨 유도 클러스터링으로 이어질 수 있다. GA를 사용하여 고정하면 LM 동안 자동 형광 신호로 이어질 수 있으며, 따라서, 설명된 프로토콜에서 LM 후에 수행되지만 다른 곳에서 설명된 바와 같이 감소될 수 있다34. 캐코디레이트 버퍼는 매우 독성이 있으며, 다른 고정제도 사용할 수 있지만, EM 프로토콜에 일반적으로 사용되는 버퍼이기 때문에 여기에 cacodylate가 사용되고, 침전을 방지하고, 세균및 곰팡이의 성장을 방지하며, 지질막(35)의초구조적 무결성을 보존하는 데 필요한 칼슘 이온과 호환된다. 필요한 경우, 오스뮴 테트옥사이드는 지질 안정화를 위한 추가 고정으로 사용될 수 있다. 이것은 세포 구조의 대비를 향상시키는 것을 도울 것입니다, 그러나 또한 시스템에 또 다른 금속을 추가하고 QD에 얻은 대비를 감소시키는 것을 도울 것입니다.

여기에 설명된 프로토콜에는 좋은 명령이 필요한 많은 단계가 포함되어 있습니다. 마이크로칩의 SiN 표면을 긁지 않도록 하고 파손을 방지하기 위해 마이크로칩을 취급하기 전에 일부 교육이 필요합니다. 앞서 언급했듯이 SiN 창이 때때로 끊어질 수 있으므로 마이크로칩을 중복으로 준비하는 것이 좋습니다. 마이크로칩에서 필요한 수의 세포를 얻으려면 약간의 경험이 필요합니다. 그래 핀으로 세포를 코팅하는 것은 물에 그래 핀을 부동 오른쪽 기울기 각도를 찾기 어려울 수 있기 때문에 약간의 훈련이 필요합니다. 물에서 그래 핀을 잡을 때, 얇은 그래 핀을 보기 어려울 수도 있습니다. 그래핀이 마이크로칩에 있는 즉시 필터 용지로 과도한 물을 제거해야 합니다. 이것은 마이크로 칩에서 그래 핀을 제거하지 않도록 필터 용지의 끝만 수행해야합니다.

그래핀 코팅은 샘플에 아티팩트가 나타나는 것을 방지했습니다. 그러나 D < 4 x 102 e-/Å2의 경우 코팅되지 않은 샘플에 대한 아티팩트가 나타나지 않았으며 2 개의 코팅되지 않은 샘플에 대해서만 아티팩트가 나타났습니다. 따라서, 코팅되지 않은 세포의 검사는 그래 핀을 사용하고 유물 형성의 위험을 피하는 것이 더 좋을지라도 가능한 것처럼 보입니다. 이러한 유물의 구성은 미래에 분석하여 형성을 방지하는 방법에 대한 힌트를 줄 수 있습니다. 세포의 구조적 안정성에 관해서는 그래 핀 코팅의 사소한 개선만 관찰되었다. 고정 된 세포는 분명히 그들의 구조가 SiN 막의 근접에 있던 검사 된 얇은 영역에서 안정화되었다. 그러나 여기서 검사하지 않은 것은 진공4에노출되었을 때 세포 시료에 발생하는 것으로 알려진 유물을 건조시키는 것입니다. 세포의 건조는 또한 QD 거리가 결과로 변경될 수 있도록 세포의 수축으로 이끌어 낼 것입니다. 여기에 사용되는 전자 용량의 경우 그래핀 코팅 및 비 코팅 시료의 QD의 거리는 안정적으로 유지되었습니다. EM용 세포에 대한 그래핀 코팅의 효과를 검사하기 위해 추가 연구가 필요합니다.

이 방법의 한 가지 제한은 세포의 화학적 고정이 필요하다는 것입니다. 따라서 라이브 셀 실험을 수행할 수 없습니다. 그러나 라벨링이 필요하지 않고 구조 안정성이 높은 세포가 사용되는 경우, 예를 들어 박테리아, 고정되지 않은 세포는 다른 전자 투여량 허용 오차이기는 하지만 EM36에 대한 그래핀에 동봉될 수 있다. 또한 단백질은 직접 감지할 수 없으므로 단백질을 시각화하려면 QD가 필요합니다. 이 메서드는 작은 레이블의 이점을 누릴 수 있습니다. 초구조가 명확하게 보이지 않는 것이 좋든 나쁘든 간에 토론의 포인트입니다. 우리의 방법은 선택된 단백질만 볼 수 있는 형광 현미경 검사법의 것과 유사합니다37. 울트라 구조의 가시성을 높이면 이미지에 훨씬 더 많은 정보가 추가되고 어떤 시점에서 개별 레이블 위치를 감지하지 못하게 됩니다. 더욱이, 여기서 설명된 방법은 하나의 단백질 종을 위한 것이며, 여러 단백질에 라벨을 붙일 수 있도록 프로토콜의 추가가 필요하다. 마지막으로, 항체모방(21) 또는nanobody(38)와 같은 작은 친화성이 특이히 결합분자가 가능할 때 작용한다. 일반적으로 사용되는 항체는 훨씬 더 크고 올리고머로 단백질 하위 단위의 기능적 상태의 검출을 방지할 수 있습니다.

우리의 방법은 수화 상태에서 세포를 유지하면서 EM을 사용하여 전체 세포에 단백질 기능을 연구하는 데 유용합니다. 일련의 세포를 검사하는 것이 쉽게 가능합니다. 세포와 단백질의 그밖 모형은 또한 공부할 수 있습니다. 단백질 라벨링이 필요하지 않은 경우, 프로토콜의 하위 집합은 다양한 생물학적 표본의 그래핀 코팅에 사용될 수 있다. 전체 세포를 연구하는 능력은 분자 수준에서 막 단백질 기능의 상관 관계를 이해하기 위한 세포 연구에서 관련이 있습니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 세포 배양 프로토콜에 도움을 D. B. Peckys, 원고를 검토 F. Weinberg, 실험및 수치에 도움을 준 T. Trampert, 수치에 도움을 준 S. S. Smolka, INM을 통해 그의 지원에 대한 E. Arzt에게 감사드립니다. 이 연구는 엘스 크뢰너-프레세니우스-스티프퉁에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

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References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. The Transmission Electron Microscope. , Springer. (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , Jones and Barlett Publishers. (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , Springer. (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

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생물학 문제 163 그래 핀 나노 입자 전세포 수화 스캐닝 전송 전자 현미경 STEM 막 단백질 방사선 손상
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Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

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