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Biology

तरल चरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए रासायनिक रूप से फिक्स्ड स्तनधारी कोशिकाओं के ग्राफीन बाड़े

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

यहां प्रस्तुत स्तनधारी कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन लेबलिंग और तरल चरण स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ग्राफीन के साथ नमूना कोटिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है । विकिरण के कारण होने वाले नुकसान के खिलाफ नमूनों की स्थिरता का भी इस प्रोटोकॉल के साथ अध्ययन किया जा सकता है।

Abstract

स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) का उपयोग करके स्तन कैंसर कोशिकाओं की बरकरार प्लाज्मा झिल्ली में मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (HER2) की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। स्तनधारी स्तन कैंसर सेल लाइन SKBR3 की कोशिकाओं सिलिकॉन नाइट्राइड (SiN) खिड़कियों के साथ सिलिकॉन माइक्रोचिप्स पर उगाया गया । कोशिकाओं को रासायनिक रूप से तय किया गया था, और HER2 प्रोटीन क्वांटम डॉट नैनोकणों (QDs) के साथ लेबल थे, एक दो कदम बायोटिन-streptavidin बाध्यकारी प्रोटोकॉल का उपयोग कर । कोशिकाओं को एक हाइड्रेटेड राज्य बनाए रखने के लिए मल्टीलेयर ग्राफीन के साथ लेपित किया गया था, और स्टेम के दौरान इलेक्ट्रॉन बीम क्षति से बचाने के लिए । इलेक्ट्रॉन बीम विकिरण के तहत नमूनों की स्थिरता की जांच करने के लिए, एक खुराक श्रृंखला प्रयोग किया गया था। ग्राफीन-लेपित और गैर-लेपित नमूनों की तुलना की गई। बीम प्रेरित क्षति, उज्ज्वल कलाकृतियों के रूप में, बढ़ी हुई इलेक्ट्रॉन खुराक डीमें कुछ गैर-लेपित नमूनों के लिए दिखाई दी, जबकि लेपित नमूनों पर कोई कलाकृतियों दिखाई नहीं दी ।

Introduction

झिल्ली प्रोटीन समारोह का विश्लेषण सेल जैविक अनुसंधान के लिए, और दवा के विकास के लिए आवश्यक है। महत्वपूर्ण प्रयोगों के एक वर्ग कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन पदों की परीक्षा शामिल है। इस जानकारी का उपयोग प्रोटीन परिसरों में प्रोटीन की असेंबली और प्लाज्मा झिल्ली में उनके विशिष्ट स्थानों के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए किया जा सकता है, जो गतिशील असेंबली और अलग-अलग के माध्यम से, विभिन्न प्रकार के सेलुलर कार्यों को चलाता है। अन्य तकनीकों के अलावा, कोशिकाओं में प्रोटीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एलएम) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) का उपयोग किया जाता है। एलएम तरल में पूरी कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है; हालांकि, संकल्प पारंपरिक के लिए 200-300 एनएम तक ही सीमित है और व्यावहारिक परिस्थितियों1,2 के तहत सुपर रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए20एनएम तक . EM लगभग 1 Å संकल्प3प्रदान करता है, लेकिन पारंपरिक नमूना तैयारी के लिए निर्जलीकरण, छवि के विपरीत को बढ़ाने के लिए धातु धुंधला, और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)4के लिए राल जैसे बढ़ते पदार्थ में एम्बेडिंग की आवश्यकता होती है। अधिक देशी जैसे वातावरण में जैविक नमूनों को संरक्षित करने के लिए, क्रायो-ईएम तकनीकों का उपयोग5,,6किया जा सकता है। नमूने तेजी से असंगत बर्फ में जमे हुए हैं, और, यदि आवश्यक हो, तो अनुभागित । एक अन्य विकल्प फ्रीज-फ्रैक्चरिंगईएम 7है।

अपने मूल, तरल राज्य में अक्षुण्ण कोशिकाओं के भीतर झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए EM तकनीक पिछले एक दशक में8,,9,10, 11,11में उभरा है ।, क्वांटम डॉट (क्यूडी) पर 2 एनएम का स्थानिक संकल्प प्राप्त किया गया था , जिसमें सीएन झिल्ली पर उगाई जाने वाली पूरी कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन लेबल किया गया था और ग्राफीन9की एक परत से घिरा हुआ था।

यहां, प्रोटीन लेबलिंग और ग्राफीन कोटिंग9,,12 के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण वर्णित है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य हाइड्रेटेड राज्य में कोशिकाओं को संरक्षित करते हुए पूरे, निश्चित कोशिकाओं की झिल्ली में HER2 के स्थानिक वितरण का विश्लेषण करना है। ग्राफीन के साथ कोटिंग वैक्यूम में कोशिकाओं को सूखने से रोकता है, और विकिरण क्षति को भी कम करता है13। यह विधि बरकरार प्लाज्मा झिल्ली के भीतर लेबल झिल्ली प्रोटीन के बारे में जानकारी प्रदान करती है, लेकिन विधि सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन करने के लिए उपयोगी नहीं है जैसा कि आमतौर पर ईएम के साथ किया जाता है।

ग्राफीन सबसे पतला नैनोमटेरियल जाना जाता है, और एक कार्बन परमाणु मोटी क्रिस्टलीय शीट एक हनीकॉम्ब जाली14में व्यवस्थित होते हैं । इसमें उच्च लचीलापन और यांत्रिक शक्ति सहित अद्वितीय गुण हैं। हाल के शोध से पता चला है कि दोष मुक्त ग्राफीन गैसों और तरल पदार्थों के लिए अभेद्य है, लेकिन दोष हाइड्रोजन पारमेशन15की अनुमति देते हैं । यहां इस्तेमाल किए जाने वाले मल्टीलेयर ग्राफीन का इस्तेमाल कर इस लीकेज को कम किया जा सकता है। बाइलेयर ग्राफीन ने हाल ही में क्रायो-ईएम नमूनों के लिए एक समर्थन के रूप में उपयोगी दिखाया है, ग्राफीन ऑक्साइड की तुलना में पतली बर्फ की परत की एकरूपता में सुधार जहां केवल गैर-वर्दी परतों का गठन किया जा सकता है16। ग्राफीन को तरल चरण संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी13,17के दौरान जैविक नमूनों की बीम क्षति को कम करने के लिए भी दिखाया गया था । एक अनुकरणीय प्रयोग के रूप में, HER2 स्तनधारी स्तन कैंसर सेल लाइन SKBR3 में व्यक्त QDs18 और उसके स्थानिक वितरण स्टेम का उपयोग कर दर्ज के साथ लेबल किया गया था । कोशिकाओं को एक एसआई माइक्रोचिप पर वरीयता दी गई थी जिसमें इलेक्ट्रॉन पारदर्शी एसआईएन झिल्ली19थी । माइक्रोचिप्स को समर्थन के रूप में चुना गया था क्योंकि वे एलएम और ईएम के साथ मजबूत, संगत हैं, और पूरी लेबलिंग प्रक्रिया सीधे माइक्रोचिप19पर की जा सकती है। सेल अटैचमेंट के बाद, HER2 को दो-स्टेप लेबलिंग प्रोटोकॉल20के साथ लेबल किया गया था। सबसे पहले, एक बायोटिनाइलेटेड एंटी-HER2 एंटीबॉडी मिमेटिक कंपाउंड21 HER2 से जुड़ा हुआ था। तब कोशिकाओं को रासायनिक रूप से लेबल-प्रेरित रिसेप्टर क्लस्टरिंग को रोकने और सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर की स्थिरता बढ़ाने के लिए तय किया गया था। स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित क्यूडी को बाद में HER2-एंटीबॉडी मिमेटिक कॉम्प्लेक्स से जोड़ा गया। क्यूडीएस के उज्ज्वल फ्लोरेसेंस सिग्नल और इलेक्ट्रॉन-घने कोर ने सहसंबद्ध फ्लोरेसेंस-और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (CLEM)20की अनुमति दी । CLEM विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि स्टेम विश्लेषण के लिए ब्याज के सेलुलर क्षेत्रों अवलोकन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं पर HER2 के स्थानीयकरण पर प्रकाश डाला छवियों से चुना जा सकता है । कोशिकाओं को उच्च HER2 स्तरों के साथ सेलुलर क्षेत्रों की पहचान करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । इसके बाद, ग्राफीन की 3-5 परत मोटी चादर को9,,22कोटिंग के लिए कोशिकाओं पर स्थानांतरित कर दिया गया था। बाद में, नमूना एक EM नमूना धारक में मुहिम शुरू की गई थी। स्टेम डेटा वलयाकार डार्क फील्ड (ADF) डिटेक्टर का उपयोग कर प्राप्त किया गया था, सेल सतह स्थान के सापेक्ष सेल सतह पर HER2 के स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन सेल के अल्ट्रास्ट्रक्चर के बारे में कोई जानकारी नहीं दे रही है । इलेक्ट्रॉन बीम विकिरण के तहत नमूने की स्थिरता निर्धारित करने के लिए, नमूनों की जांच एक छवि श्रृंखला में खुराक(डी)बढ़ाने पर की गई थी। ग्राफीन-लेपित और गैर-लेपित नमूनों के बीच अंतर की जांच की गई। कई प्रकार के विकिरण क्षति का मूल्यांकन किया गया।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल HER2 23 को लक्षित करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्तनधारी स्तन कैंसर सेल लाइन SKBR3 का उपयोग करताहै। प्रोटोकॉल में एक ग्राफीन-लेपित नमूने की तैयारी, और एक समान नमूना शामिल है लेकिन तुलना के लिए ग्राफीन कोटिंग के बिना। प्रयोग डुप्लिकेट में तैयार किया जाता है क्योंकि एसआईएन विंडो हर बार एक बार टूट सकती है, और ज्यादातर मामलों में एक प्रयोगात्मक डुप्लिकेट प्राप्त करने के लिए। विधि की समग्र उपज उच्च अर्थ है कि ग्राफीन कवर कोशिकाओं के साथ माइक्रोचिप्स आमतौर पर एक असाधारण त्रुटि के साथ प्राप्त किए जाते हैं, भले ही पूरे एसआईएन विंडो को सभी मामलों में ग्राफीन के साथ कवर नहीं किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में डुप्लीकेट का वर्णन नहीं किया गया है।

लेबलिंग प्रोटोकॉल (चरण 1-5) पहले24प्रकाशित COS7 फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर के लेबलिंग के प्रोटोकॉल के बराबर है; उस कागज में विवरण माइक्रोचिप्स की हैंडलिंग, और अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग के बारे में संदर्भित कर रहे हैं । निम्नलिखित प्रोटोकॉल को HER2 लेबलिंग, ग्राफीन कोटिंग9,और नमूने की विकिरण सहिष्णुता की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया है।

Protocol

1. माइक्रोचिप्स की सफाई और पॉली-एल-लिसिन (पीएलएल) और फाइब्रोनेक्टिन जैसे प्रोटीन (FLP) के साथ कोटिंग

  1. एसीटोन के 50 एमएल में सीएन झिल्ली (2.0 x 2.6 मिमी) के साथ दो माइक्रोचिप्स रखें। ऊपर का सामना करना पड़ फ्लैट पक्ष के साथ ध्यान से माइक्रोचिप्स संभाल। फ्लैट चोंच चिमटी का उपयोग करके किनारों को तोड़ने से बचें। सीएन विंडो के टूटने को रोकने के लिए चिमटी से निपटने के दौरान माइक्रोचिप्स की शीर्ष सतह को छूने से बचें।
    नोट: माइक्रोचिप्स के नुकसान को रोकने के लिए पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन कोटेड या कार्बन टिप चिमटी का भी उपयोग कर सकते हैं।
  2. चिप्स को ध्यान से बीकर मिलाते हुए 2 मिनट के लिए धोएं, माइक्रोचिप्स देखना ओवर फ्लिप न करें।
  3. माइक्रोचिप्स को इथेनॉल के 50 मिलीलन में स्थानांतरित करें और बीकर को ध्यान से हिलाकर 2 मिनट के लिए धोएं। सुनिश्चित करें कि स्थानांतरण जल्दी हो ताकि अतिरिक्त एसीटोन सूख न जाए।
  4. माइक्रोचिप्स को 10 मिनट तक 50 एमएल पानी से धोएं।
  5. माइक्रोचिप्स को इथेनॉल के 20 एमएल के हौसले से तैयार बीकर में डुबो दें।
  6. सुखाने के लिए एक क्लीनरूम ऊतक पर माइक्रोचिप्स रखें।
  7. प्लाज्मा 11.5 एससीएम ओ2 और 35 एससीएम एआर के साथ 70 मीटर और रेडियो फ्रीक्वेंसी (आरएफ) पर माइक्रोचिप्स को साफ करता है- 5 मिनट के लिए 50 डब्ल्यू का लक्ष्य।
  8. बाँझ सेल काम के लिए एक लेमिनार प्रवाह हुड में माइक्रोचिप्स रखें।
  9. पानी में 0.01% पीएलएल का समाधान तैयार करें। फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 15 माइक्रोन/एमएल एफएलपी का घोल तैयार करें।
  10. लैमिनार फ्लो हुड के नीचे 24 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें और निम्नलिखित क्रम में समाधानों के 1 एमएल के साथ व्यक्तिगत रूप से 5 कुओं को भरें: अच्छी तरह से 1 - पीएलएल; अच्छी तरह से 2 - पानी; अच्छी तरह से 3 - पानी; अच्छी तरह से 4 - FLP; अच्छी तरह से 5 - पीबीएस और अच्छी तरह से 6 - पीबीएस।
    नोट: चिमटी का उपयोग कर कुछ सेकंड के लिए संकेत 24 या ९६ अच्छी तरह से एक माइक्रोचिप सूई द्वारा धोने के कदम आचरण । संकेतित समय और तापमान के लिए संकेतित समाधान में 24 या 96 अच्छी तरह से माइक्रोचिप्स में इनक्यूबेटिंग करके इनक्यूबेशन चरणों को करें। माइक्रोचिप्स को कुछ सेकंड के भीतर दूसरे कुएं में स्थानांतरित करें।
  11. 5 मिनट के लिए पीएलएल समाधान में माइक्रोचिप्स को इनक्यूबेट करें। इसके बाद माइक्रोचिप्स को दो बार पानी में धो लें।
  12. 5 मिनट के लिए एफएलपी में माइक्रोचिप्स इनक्यूबेट। इसके बाद पीबीएस में माइक्रोचिप्स को दो बार धोएं।
  13. सेल सीडिंग के लिए सीरम-मुक्त माध्यम के 50 माइक्रोल के साथ पूर्व से भरे एक नए 96 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं (प्रत्येक माइक्रोचिप के लिए एक) में दोनों माइक्रोचिप्स स्थानांतरित करें।
  14. माइक्रोचिप्स को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि सेल सस्पेंशन तैयार न हो जाए।

2. सीएन झिल्ली माइक्रोचिप्स पर सीडिंग कोशिकाएं

  1. बाँझ काम सुनिश्चित करने के लिए एक लेमिनार प्रवाह हुड में सभी आपूर्ति और उपकरण स्थापित करें।
  2. एक बार विकास माध्यम के साथ एक सेल संस्कृति फ्लास्क में स्तन कैंसर सेल लाइन, SKBR3 धोएं। 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) युक्त दुलबेक्को के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) और विकास माध्यम के रूप में 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईए) का उपयोग करें।
  3. कोशिका टुकड़ी समाधान के 1 मिलील के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाओं को फ्लास्क से अलग न कर दिया।
  4. फ्लास्क में अलग कोशिकाओं में विकास माध्यम के 5 एमएल जोड़ें। इस निलंबन को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कोशिका एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर में सेल निलंबन के पिपेट 20 माइक्रोन। निम्नलिखित सूत्र का प्रयोग करें।
    Equation 1.
  6. 2.5 x 105 कोशिकाओं/एमएल का एक फैलाया हुआ सेल निलंबन तैयार करें। द्वारा तैयार सेल निलंबन की आवश्यक राशि की गणना करें:
    Equation 2
    और वांछित मात्रा के लिए विकास माध्यम के साथ भरें।
  7. एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के दो कुओं में सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें जिसमें पीएलएल और एफएलपी कोटेड माइक्रोचिप्स होते हैं जिसमें सीएन झिल्ली का सामना करना पड़ता है और सीरम-मुक्त माध्यम के 50 माइक्रोन इतना है कि प्रत्येक अच्छी तरह से 25,000 कोशिकाएं होती हैं।
  8. 5 मिनट के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें ताकि कोशिकाओं को माइक्रोचिप से अटैच करने का इंतजार किया जा सके।
    नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं माइक्रोचिप से अलग कर सकते है क्योंकि वे अभी तक पालन नहीं किया है ।
  9. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ माइक्रोचिप पर कोशिकाओं के घनत्व की जांच करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं खिड़की को पर्याप्त स्थान के साथ कवर करती हैं ताकि बाहर निकल सके और पालन किया जा सके (चित्रा 1Aदेखें)।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो इस बिंदु पर अधिक कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है।
  10. माइक्रोचिप्स को नए कुओं में स्थानांतरित करें जिसमें 200 माइक्रोन विकास माध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 रातोंरात2 पर इनक्यूबेट होता है।
  11. अगले दिन की दोपहर में, दोनों माइक्रोचिप्स को सीरम-मुक्त माध्यम (सीरम भुखमरी माध्यम) में स्थानांतरित करें यदि कोशिकाओं ने चपटा किया है और एक नेत्रहीन निरीक्षण की गई उदारता (यानी, कोशिकाओं के साथ कवर किए गए खिड़की क्षेत्र का अंश) लगभग 2/3 (चित्रा 1Bदेखें) का पालन किया है। विभिन्न प्रयोगों के बीच तुलना के लिए आवश्यक कोशिकाओं को एक परिभाषित प्रारंभिक स्थिति में लाने के लिए आवश्यक सीरम-मुक्त माध्यम में बदलें25।
  12. रात 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट।
    नोट: ध्यान रखें कि सेल की मात्रा अन्य सेल लाइनों के लिए विकास दर और सेल आकृति विज्ञान के अनुसार भिन्न हो सकती है।

3. HER2 लेबलिंग और निर्धारण

  1. अनुपूरक तालिका 1में वर्णित समाधान तैयार करें ।
    1. बाँझ काम सुनिश्चित करने के लिए लेमिनार प्रवाह हुड के तहत काम करें। एक ९६ अच्छी तरह से लेबलिंग प्लेट मैं के रूप में संदर्भित प्लेट का उपयोग करें, और लेबलिंग प्लेट मैं समाधान के २०० μL के साथ माइक्रोचिप प्रति 6 कुओं को भरने: PBS/BSA, PBS/BSA/जीएस, एंटीबॉडी नकल, PBS/BSA, PBS/BSA । माइक्रोचिप प्रति अच्छी प्लेट की एक पंक्ति (प्रति पंक्ति एक अक्षर, उदाहरण के लिए, A1 से A6) का उपयोग करें। लेबलिंग प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. एक धूम हुड के तहत, फिक्सेशन प्लेट के रूप में संदर्भित एक 24 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें, और फिक्सेशन प्लेट समाधानों के 500 माइक्रोल के साथ प्रति माइक्रोचिप 8 कुओं को भरें: सीबी, एफए, सीबी, पीबीएस, पीबीएस, पीबीएस, पीबीएस, पीबीएस/
      सावधानी: सीबी साँस लेना या मौखिक घूस से तीव्रता से विषाक्त है और पानी के लिए खतरनाक है । उचित सुरक्षा के साथ धुएं हुड के तहत काम करें और सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) के अनुसार सीबी को निपटाएं। एफए संक्षारक और त्वचा और स्वास्थ्य के लिए हानिकारक है। धूम हुड के तहत काम करें और हैंडलिंग और निपटान के बारे में जानकारी के लिए एसडीएस को देखें।
    3. एक ९६ अच्छी तरह से लेबलिंग प्लेट द्वितीय के रूप में संदर्भित प्लेट तैयार करें और लेबलिंग प्लेट II समाधानों के २०० μL के साथ प्रति माइक्रोचिप 4 कुओं को भरें: QDs, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA ।
      नोट: यहां, एक 24 अच्छी तरह से थाली बेहतर कुओं में माइक्रोचिप्स देखने के लिए प्रयोग किया जाता है । कम एंटीबॉडी मिमेटिक (चरण 3.2) और क्यूडी (चरण 3.4) का उपयोग करने के लिए, इन चरणों के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करें।
  2. कोशिकाओं में HER2 लेबल।
    1. एक बार जब ये प्लेटें तैयार हो जाएं, तो माइक्रोचिप्स को लेबलिंग प्लेट 1 की पहली पंक्ति के कुओं में रखकर लेबलिंग शुरू करें।
    2. लेबलिंग प्लेट I के रूप में चिह्नित ९६ अच्छी तरह से थाली में PBS/बीएसए के साथ माइक्रोचिप्स धोएं ।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 5 मिनट के लिए पीबीएस/बीएसए/जीएस के साथ इनक्यूबेटिंग करके एंटीबॉडी मिमेटिक के अविशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए अविशिष्ट साइटों को ब्लॉक करें ।
    4. 200 एनएम एंटीबॉडी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 10 मिनट के लिए एंटीबॉडी नकल के साथ इनक्यूबेट।
    5. पीबीएस/बीएसए में तीन बार माइक्रोचिप धोएं।
  3. कोशिकाओं को ठीक करें।
    1. माइक्रोचिप्स को धूम हुड में 24 अच्छी तरह से फिक्सेशन प्लेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: यहां से किसी बाँझ काम की जरूरत नहीं है ।
    2. कुछ सेकंड के लिए सीबी के साथ एक बार धो लें।
    3. 10 मिनट के लिए 3% एफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
    4. सीबी के साथ एक बार और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    5. 2 मिनट के लिए पीबीएस-ग्लाइसिन के साथ इनक्यूबेटिंग करके एफए के मुक्त एल्डिहाइड समूहों को ब्लॉक करें।
    6. एक बार पीबीएस-बीएसए के साथ माइक्रोचिप्स धोएं।
  4. क्यूडी संलग्न करें।
    1. माइक्रोचिप्स को 96 वेल लेबलिंग प्लेट II पर ले जाएं।
    2. 12 मिनट के लिए 20 एनएम क्यूडीएस के साथ इनक्यूबेट।
    3. माइक्रोचिप्स को पीबीएस/बीएसए के साथ दो बार धोएं।
    4. माइक्रोचिप्स को पीबीएस/बीएसए युक्त कुएं में स्टोर करें।

4. तय कोशिकाओं की हल्की माइक्रोस्कोपी

  1. पीबीएस/बीएसए सॉल्यूशन के 2 एमएल के साथ 3.5 सेमी व्यास ग्लास बॉटम डिश तैयार करें।
  2. पहले माइक्रोचिप्स लें, इसे उल्टा (नीचे की ओर आ रही कोशिकाएं) ग्लास बॉटम डिश में रखें और डिश को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप में रखें । कोशिकाओं पर नुकसान को रोकने के लिए माइक्रोचिप को धीरे-धीरे तरल में कम करें।
  3. 40x उद्देश्य और उपयुक्त फ्लोरेसेंस चैनल के साथ हर माइक्रोचिप की अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: यहां, 540-580 एनएम की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और QD655 का पता लगाने के लिए 607-683 एनएम की एक उत्सर्जक तरंगदैर्ध्य का उपयोग किया जाता है।
  4. दूसरी माइक्रोचिप के लिए प्रक्रिया दोहराएं।

5. निर्धारण के बाद

  1. धूम हुड के तहत सभी चरणों का प्रदर्शन करें।
  2. निर्धारण के बाद के समाधान के 200 माइक्रोल के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेट के माइक्रोचिप प्रति 6 कुओं को भरें:
    सीबी, जीए, सीबी, पीबीएस, पीबीएस, पीबीएस।
    सावधानी: GA पानी के लिए खतरनाक है, त्वचा, श्वसन प्रणाली, और आंखों के लिए हानिकारक है । धूम हुड के तहत काम करें और हैंडलिंग और निपटान के बारे में जानकारी के लिए एसडीएस को देखें।
  3. दोनों माइक्रोचिप्स को अपने-अपने कुओं में कोशिकाओं का सामना करना पड़ रहा है।
  4. सीबी के साथ एक बार धो लें।
  5. 10 मिनट के लिए 2% GA के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  6. सीबी के साथ एक बार धो लें।
  7. पीबीएस/बीएसए के साथ तीन बार धोएं।
    नोट: एफए के साथ पहला निर्धारण कदम पहले से ही जैविक संरचना को ठीक करता है लेकिन झिल्ली प्रोटीन प्रसार का एक कम स्तर अभी भी हो सकता है, संभवतः QD प्रति कई स्ट्रेप्टाविडिन की उपस्थिति के कारण प्रेरित क्लस्टरिंग लेबल के लिए अग्रणी । एफए निर्धारण से GA तक प्रयोगात्मक चरणों का समय रखें, इसलिए, झिल्ली में प्रोटीन के प्रसार को कम करने के लिए जितना संभव हो उतना कम करें।
  8. एक नई अच्छी थाली में ग्राफीन कोटिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल वृद्धि को रोकने के लिए ऑस्मोटिक झटके और 0.02% सोडियम एजाइड(एनएएन 3)को रोकने के लिए पीबीएस/बीएसए में स्टोर करें। सुखाने को रोकने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ अच्छी तरह से प्लेट सील करें। माइक्रोचिप्स और कोशिकाएं 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर 2 सप्ताह तक स्थिर होती हैं।
    सावधानी: NaN 3 पानी के लिए खतरनाक है और त्वचा औरश्वसन प्रणाली के लिए मौखिक घूस से तीव्रता से विषाक्त है । धूम हुड के तहत काम करें और हैंडलिंग और निपटान के बारे में जानकारी के लिए एसडीएस को देखें।

6. सफाई और नमक क्रिस्टल पर ग्राफीन स्थानांतरित

  1. पीएमएमए-ग्राफीन-ऑन-पॉलीमर(चित्रा 2 ए)से पॉली (मिथाइल मेथाक्रिलेट) (पीएमएमए) -ग्राफीन को हटा दें।
    1. पिपेट पीएमएमए-ग्राफीन के चारों ओर पॉलीमर पर पानी की कुछ बूंदें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि पीएमएमए-ग्राफीन आसानी से सहायक बहुलक से आता है क्योंकि यह पानी की सतह पर तैरता है।
    2. पीएमएमए-ग्राफीन को छोड़ने के लिए पीएमएमए-ग्राफीन-ऑन-पॉलीमर को 30-45 डिग्री के कोण के साथ पानी में विसर्जित करें।
      नोट: बहुलक केवल थोड़ा गीला होना चाहिए। बहुलक पर बहुत अधिक पानी पाइपिंग ऊपर उठा और संभवतः पीएमएमए-ग्राफीन गुना होगा ।
  2. सोडियम पर्सोल्फेट समाधान(चित्रा 2B)का उपयोग करके नक़्क़ा तांबा आधारित संदूषक।
    नोट: तांबे की पन्नी पर उगाए जाने वाले वाणिज्यिक ग्राफीन में अक्सर उप-माइक्रोमीटर तांबे के अवशेष होते हैं, जिन्हें तांबे के ओथांट समाधान22के साथ हटाया जा सकता है।
    1. पानी में 0.42 मीटर सोडियम पर्सल्फेट का 50 एमएल घोल तैयार करें।
    2. एक मानक ग्लास स्लाइड का उपयोग करके ग्राफीन साइड डाउन के साथ सोडियम पर्सल्फेट समाधान में पीएमएमए-ग्राफीन को स्थानांतरित करें। पीएमएमए-ग्राफीन समाधान के शीर्ष पर तैरेगा।
    3. सोडियम पर्सोल्फेट सॉल्यूशन में पीएमएमए-ग्राफीन को रात भर छोड़ दें।
    4. सोडियम पर्सोल्फेट समाधान से पीएमएमए-ग्राफीन निकालें और इसे ग्लास स्लाइड का उपयोग करके साफ पानी के शीर्ष पर रखें। इसे आधे घंटे तक पानी पर तैरने दें।
    5. पीएमएमए-ग्राफीन से सभी सोडियम अनुनाद अवशेषों को हटाने के लिए पिछले चरण को कुल तीन बार दोहराएं।
  3. पीएमएमए-ग्राफीन को सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) क्रिस्टल पर स्थानांतरित करें।
    1. पेट्री डिश में पानी में एनएसीएल का सैचुरेटेड घोल तैयार करें।
    2. एक ग्लास स्लाइड का उपयोग करके ग्राफीन साइड के साथ एनएसीएल समाधान के शीर्ष पर पीएमएमए-ग्राफीन स्थानांतरित करें।
    3. चिमटी के साथ एक एनएसीएल क्रिस्टल पकड़ो और फ्लोटिंग पीएमएमए-ग्राफीन उठाओ।
      नोट: एनएसीएल क्रिस्टल का आकार पीएमएमए-ग्राफीन के आकार से थोड़ा बड़ा होना चाहिए ताकि नमक के किनारे पर फैला हुआ ग्राफीन को तह करने या चिमटी के साथ ग्राफीन से संपर्क करने से बचा जा सके। इन प्रयोगों में 12 मिमी x 12 मिमी x 0.5 मिमी के एनएसीएल क्रिस्टल का उपयोग 10 मिमी x 10 मिमी ग्राफीन शीट को चुनने और बाद में इसे समर्थन देने के लिए किया जाता है।
    4. अतिरिक्त पानी को बाहर बहने देने के लिए पीएमएमए-ग्राफीन-ऑन-नमक को 2 मिनट के लिए खड़ी रखें।
    5. पीएमएमए-ग्राफीन-ऑन-नमक को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें और इसे पानी को पूरी तरह से हटाने के लिए 20 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बेक करें।
  4. एक एसीटोन वॉश(चित्रा 2C)का उपयोग करके पीएमएमए निकालें।
    1. एक ग्लास पेट्री डिश में पहले से गरम एसीटोन को धुएं के हुड में हॉटप्लेट पर ~50 डिग्री सेल्सियस तक। आग से बचने के लिए तापमान को ध्यान से देखें।
    2. पीएमएमए-ग्राफीन-ऑन-नमक को एसीटोन से भरे पेट्री डिश में विसर्जित करें और इसे 30 मिनट के लिए पीएमएमए को भंग करने के लिए छोड़ दें ।
    3. पिछले चरण को नए, स्वच्छ एसीटोन के साथ कुल तीन बार दोहराएं।
    4. नमूना तैयार करने के लिए इसका उपयोग करने से पहले ग्राफीन-ऑन-सॉल्ट हवा-सूखी को अच्छी तरह से सूखने दें।

7. ग्राफीन कोटिंग

नोट: ग्राफीन कोटिंग प्रक्रिया को चित्रा 3 एमें योजनाबद्ध ढंग से दिखाया गया है ।

  1. फिक्स्ड कोशिकाओं के साथ तैयार एक माइक्रोचिप धोएं और बफर से नमक के किसी भी अवशेष को हटाने के लिए शुद्ध पानी में HER2 लेबल करें। माइक्रोचिप को फिल्टर पेपर पर रखें। कोशिकाएं डार्क स्पॉट(चित्रा 3B)के रूप में दिखाई देती हैं।
  2. एनएसीएल क्रिस्टल पर मल्टीलेयर ग्राफीन को एक टुकड़े में काटें जो रेजर ब्लेड का उपयोग करके माइक्रोचिप की एसआईएन खिड़की को फिट बैठता है।
  3. शुद्ध पानी की एक बीकर तैयार करें और पानी की सतह के संबंध में क्रिस्टल को लगभग 45 डिग्री कोण झुकाकर एनएसीएल क्रिस्टल से ग्राफीन को हटा दें और पानी को छूएं। ग्राफीन पानी की सतह(चित्रा 3C)पर तैरेगा।
  4. पानी की सतह से एक धातु पाश के साथ ग्राफीन पकड़ो। ग्राफीन लूप(चित्रा 3 डी)के नीचे बूंद के भीतर तैरेगा।
  5. माइक्रोचिप की ऊपरी सतह को निचले लूप सतह से स्पर्श करें। माइक्रोचिप मेटल लूप से चिपक जाएगी। ग्राफीन माइक्रोचिप(चित्रा 3E)के शीर्ष पर देखा जा सकता है ।
  6. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, माइक्रोचिप से बचे हुए पानी को हटाने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें, ताकि ग्राफीन एसआईएन विंडो पर सभी कोशिकाओं को कवर करे।
    नोट: ग्राफीन जब दागदार कदम होगा। सुनिश्चित करें कि ग्राफीन फिल्टर पेपर के किनारे के साथ माइक्रोचिप को छूकर खिड़की के शीर्ष पर रहता है।
  7. धातु लूप से माइक्रोचिप को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें और इसे एक फिल्टर पेपर पर रखें। ग्राफीन माइक्रोचिप(चित्रा 3F)पर एक बैंगनी झिलमिलाहट के रूप में दिखाई देता है।
  8. माइक्रोचिप को कागज से कंपार्टमेंट पेट्री डिश में ट्रांसफर करें।
  9. एक मुक्त डिब्बों में पानी की एक बूंद पिपेट करें और पानी-संतृप्त वातावरण प्रदान करने के लिए ढक्कन बंद करें।
  10. पैराफिन फिल्म के साथ डिब्बे पकवान सील और आगे माप के लिए आवश्यक होने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में स्टोर करें।

8. स्टेम

  1. कंडेनसर लेंस को समायोजित करके कम से कम 0.2 एनएम के जांच आकार के लिए एक संरेखण/परीक्षण नमूने का उपयोग करके 200 केवी बीम ऊर्जा पर स्टेम को समायोजित करें, एक जांच वर्तमान I = 180 पीए (विभिन्न माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के लिए जांच वर्तमान के बारे में जानकारी निर्माता द्वारा 5% सटीकता के भीतर प्रदान की जाती है) और एक बीम अभिसरण अर्ध-कोण 13.2 एमआरएडी का एपर्चर डालकर। प्रोजेक्टर लेंस सेटिंग्स को समायोजित करके एडीएफ स्टेम डिटेक्टर खोलने सेमी-एंगल रेंज (इनर और आउटर) को 68-280 एमआरएडी में सेट करें। स्टेम छवि आकार 2048 x 2048 पिक्सल के लिए सेट करें, और पिक्सेल समय t = 6 μs निवास करते हैं।
  2. TEM के लिए एक मानक नमूना धारक में ग्राफीन-लेपित कोशिकाओं के साथ माइक्रोचिप लोड इस तरह से है कि कोशिकाओं को सामना कर रहे हैं ।
  3. धारक को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में लोड करें।
  4. चरण 8.1 में सेटिंग्स का उपयोग करके आवर्धन(एम)= 800x(चित्रा 4)पर एक अवलोकन चित्र प्राप्त करें।
  5. एक सेल पर ब्याज के क्षेत्र की पहचान करें।
  6. चरण 8.1 में सेटिंग्स का उपयोग करके पिक्सेल आकार डी = 1.3 एनएम(चित्रा 4)पर एम = 80,000x पर एडीएफ डिटेक्टर के साथ क्यूडी छवि।
  7. उजागर क्षेत्र(चित्रा 4)दिखाने के लिए कम आवर्धन (यहां, एम = 50,000x) के साथ एक्सपोजर के बाद क्षेत्र की एक छवि प्राप्त करें।
  8. इलेक्ट्रॉन खुराक की गणना करें
    Equation 3
    जहां ई प्राथमिक प्रभार है। उपरोक्त में दी गई सेटिंग्स के साथ,
    Equation 4
    और 5% की त्रुटि।
  9. एक ही सेटिंग्स के साथ एक खुराक श्रृंखला के लिए 20 छवियों का अधिग्रहण, लेकिन टी के साथ = 60 μs जिसके परिणामस्वरूप एक संचित खुराक में जिसके परिणामस्वरूप
    Equation 20.
  10. ग्राफीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, माइक्रोस्कोप को एम = 1,200x पर टेम में स्विच करें, एक सेल के पास एक क्षेत्र का चयन करें, और विवर्तन मोड पर स्विच करें। 0.5 एस, 2048 x 2048 x 3 पिक्सल के एक्सपोजर समय पर एक विवर्तन पैटर्न रिकॉर्ड करें, और 50 माइक्रोन(चित्रा 4)का एक चयनित क्षेत्र अपर्चर।
  11. सत्र के अंत में, माइक्रोस्कोप से नमूना निकालें, माइक्रोचिप को डिब्बे के पकवान में वापस रखें, डिश को पैराफिन फिल्म के साथ सील करें, और आगे माप के लिए आवश्यक होने पर इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में स्टोर करें।
  12. पहले माइक्रोचिप की तरह ही तैयार दूसरी माइक्रोचिप का चयन करें लेकिन ग्राफीन कोटिंग के बिना।
  13. दोहराएं कदम 8.2-8.11 लेकिन अब इस नमूने के लिए। तुलना(चित्रा 4)के रूप में, उपरोक्त में समान सेटिंग्स के साथ एक विवर्तन पैटर्न रिकॉर्ड करें।

9. विश्लेषण

नोट: एक स्टेम छवि में QD पदों का स्वचालित पता लगाने के लिए, विश्लेषण ImageJ (NIH) के लिए स्थानीय डिजाइन के एक प्लगइन का उपयोग करता है, के रूप में कहीं और20वर्णित है । प्लगइन अनुरोध पर उपलब्ध है।

  1. सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से स्टेम छवि में कणों का पता लगाने के लिए निम्नलिखित चरणों को लागू करता है:
    1. पिक्सेल शोर को कम करने के लिए गॉसियन फ़िल्टर लगाएं।
    2. केवल नैनोकणों को प्राप्त करने के लिए फास्ट फोरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) बैंडपास फिल्टर लागू करें।
    3. छवि को बाइनरी करने के लिए एक सीमा निर्धारित करें।
    4. कण का पता लगाने के लिए 2 के सहिष्णुता कारक के साथ 10 एनएम के कण व्यास का उपयोग करें।
    5. कण की स्थिति का पता लगाएं।
  2. श्रृंखला प्रति QDs के दस जोड़े के बीच केंद्र से केंद्र की दूरी को मापने । यहां, अलग-अलग आकार के साथ 10 दूरी प्रति श्रृंखला मापी गई थी।
  3. पहली छवि में दूरी के लिए प्रत्येक कण दूरी की तुलना करके कण दूरी में सापेक्ष परिवर्तन की गणना:
    Equation 5.

Representative Results

चित्रा 1A कोशिकाओं को इस तरह से वरीयता प्राप्त दिखाता है कि खिड़की को कवर किया जाता है लेकिन पर्याप्त जगह के साथ उन्हें समतल करने और पालन करने की अनुमति देने के लिए, जिससे लगभग 2/3rd (चित्रा 1B)की मजबूती होती है । यदि बहुत सी कोशिकाओं को माइक्रोचिप(चित्रा 1 सी)पर वरीयता दी जाती है, तो सभी कोशिकाओं के लिए माइक्रोचिप का पालन करने के लिए अपर्याप्त जगह है। चित्रा 1D 24 घंटे के बाद एक ही माइक्रोचिप से पता चलता है । कोशिकाओं के आधे से अधिक समतल नहीं किया । दूसरी ओर, यदि बहुत कम कोशिकाओं को वरीयता दी जाती है(चित्रा 1E),तो एसआईएन विंडो 24 घंटे के बाद एक बड़ी खाली जगह के साथ समाप्त हो जाएगी जैसा कि चित्रा 1Fमें देखा गया है। चित्रा 1G चित्रा 1A और चित्रा 1B में कोशिकाओं की डीआईसी छवि से पता चलताहै । चित्रा 1H HER2 के सफल लेबलिंग का संकेत पीले रंग में इसी फ्लोरेसेंस छवि झूठी रंग से पता चलता है ।

प्रतिनिधि स्टेम डेटा चित्रा 4में दिखाया गया है । ग्राफीन-लेपित (बाएं कॉलम) और गैर-लेपित (दाएं कॉलम) SKBR3 कोशिकाओं की जांच की गई । चित्रा 4A,बी शो एम = 800x अवलोकन खिड़की पर कोशिकाओं की छवियों। इनसेट के रूप में दिखाए गए क्षेत्रों को खुराक श्रृंखला के दौरान एम = 80,000x पर चित्रित किया गया था, चित्रा 4C,Dदेखें। क्यूडी यहां चमकीले धब्बे के रूप में दिखाई दे रहे हैं। चित्रा 4E और चित्रा 4F शो एम = 50,000x बढ़ाया चित्र चित्रा 4Cमें आयतों के स्थानों पर अधिग्रहीत,डी दोनों छवियों डी के साथ एक खुराक श्रृंखला के अधिग्रहण के बाद दर्ज की गई = (७.८ ± ०.४) x 103 ई-/Å2। खुराक श्रृंखला एम = 80,000x पर दर्ज की गई थी। उजागर क्षेत्रों को आयतों के रूप में पहचाना जा सकता है, जिससे आयत गैर-लेपितनमूने (चित्रा 4F)के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा था।

ग्राफीन की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए, कोशिकाओं के बिना क्षेत्रों के विवर्तन पैटर्न, लेकिन सीएन विंडो पर ग्राफीन के साथ या बिना प्राप्त किए गए थे। ग्राफीन की षट्कोणीय संरचना ग्राफीन-लेपित नमूने(चित्रा 4G)के विवर्तन पैटर्न में देखी गई थी, जबकि यह गैर-लेपितनमूने (चित्रा 4H)के लिए अनुपस्थित थी। ग्राफीन की अत्यधिक आदेशित षट्कोणीय संरचना के कारण एकल क्रिस्टल ग्राफीन के विवर्तन पैटर्न में छह गुना समरूपता होगी। इसलिए, षट्कोणीय संरचना नमूनों पर ग्राफीन की उपस्थिति को इंगित करती है।

नमूने पर इलेक्ट्रॉन बीम रोशनी के प्रभाव की जांच करने के लिए, स्टेम छवियों को एक जमते इलेक्ट्रॉन खुराक के साथ एक छवि श्रृंखला में प्राप्त किया गया था। गैर-लेपित और ग्राफीन-लेपित नमूनों के लिए प्रतिनिधि परिणाम क्रमशः चित्रा 5ए-डी और चित्रा 5ई-जीमें दिखाए जाते हैं। सभी डेटा सेल के किनारे पर प्राप्त किए गए थे, जहां सेल फ्लैटटेस्ट है, और अवलोकन संरचना इस प्रकार एसआईएन झिल्ली के निकटतम है। एक गैर-लेपित नमूनों के जोखिम के कारण डी = (1.9 ± 0.1) x 103 ई-/ Å2 (चित्रा 5B)पर कोशिका सतहों पर दिखाई देने वाली उज्ज्वल संरचनाएं हुईं। ये संरचनाएं उच्च खुराक के साथ बड़ी हो गईं, इसलिए वे डी = (7.8 ± 0.4) x 103 ई-/ Å2 (चित्रा 5सी, डी)में श्रृंखला की अंतिम छवि में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे। ये स्पॉट ग्राफीन-कोटेड नमूनों में से किसी पर दिखाई नहीं दिया(चित्रा 5ई-जी)।

उपरोक्त में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अतिरिक्त माइक्रोचिप्स तैयार किए गए थे और उनकी जांच की गई थी। कुल छह लेपित और सात गैर-लेपित नमूनों की जांच की गई । सात में से दो बिना कोटेड नमूनों में इन कलाकृतियों को दिखाया गया। लेपित नमूनों में से कोई भी अतिरिक्त उज्ज्वल धब्बे नहीं दिखाया ।

विकिरण क्षति के एक अन्य उपाय के रूप में, क्यूडी के बीच की दूरी की जांच की गई थी। यदि संरचनात्मक क्षति होती है, तो कोई भी QDs के बीच दूरी बदलने की उम्मीद करेगा। दूरी में परिवर्तन जोड़ी दूरी की एक श्रृंखला के लिए डी जमते के साथ QDs के विभिन्न जोड़े के लिए मापा गया। चित्रा 5H से पता चलता है कि गैर लेपित नमूनों के लिए कणों के सापेक्ष परिवर्तन औसतन १.३% से नीचे रहे, जबकि औसत सापेक्ष दूरी लेपित नमूनों के लिए ०.८% से नीचे रहे । इसलिए, कोई भी निष्कर्ष निकाल सकता है कि ग्राफीन कोटिंग ने नमूने को स्थिर कर दिया लेकिन ग्राफीन कोटिंग के बिना सूखे नमूने भी उल्लेखनीय रूप से स्थिर थे।

Figure 1
चित्रा 1: सिलिकॉन माइक्रोचिप और HER2 लेबल की एक सीएन खिड़की पर सेल सीडिंग। (क)माइक्रोचिप पर सीडिंग के बाद एसकेबीआर3 कोशिकाओं के साथ एसआईएन विंडो क्षेत्र की अनुकरणीय छवि 5 मिनट । (ख)एक ही कोशिकाएं सीडिंग के बाद 24 घंटे(सी)एसकेबीआर3 कोशिकाओं पर सी माइक्रोचिप 5 मिनट के बाद एक ही एसआईएन विंडो पर फैलती हैं । (घ)24 घंटे के बाद (सी) के रूप में एक ही कोशिकाओं । कोशिकाओं को ठीक से समतल नहीं किया के रूप में वहां बोने पर चिप्स पर भी कई कोशिकाओं थे । (ई)सीडिंग के बाद माइक्रोचिप पर 5 मिनट की कोशिकाएं । (एफ)खिड़की पर केवल कुछ कोशिकाएं दिखाई दे रही थीं क्योंकि माइक्रोचिप पर बहुत कम कोशिकाएं वरीयता प्राप्त थीं । (जी)HER2 के QD लेबलिंग के बाद एक ही SKBR3 कोशिकाओं की डीआईसी छवि । (ज)डीआईसी की ओवरले छवि और लेबल की इसी फ्लोरेसेंस छवि SKBR3 कोशिकाओं के साथ HER2-QD655 (पीले रंग में झूठा रंग) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नैसीएल क्रिस्टल पर ग्राफीन की सफाई और स्थानांतरण। 1)पीएमएमए-ग्राफीन ऑन-पॉलीमर पीएमएमए ग्राफीन को छोड़ने के लिए शुद्ध पानी में डूब जाता है। पीएमएमए-ग्राफीन को ग्लास स्लाइड के साथ पकड़ा जा सकता है। (ख)सोडियम पर्सोल्फेट समाधान का उपयोग करके तांबा आधारित संदूषण को नक़्क़ाशीद किया गया था । ग्राफीन को साफ करने के लिए, इसे एक बीकर में स्थानांतरित कर दिया गया था जिसमें डिएकोनाइज्ड पानी था। ये कदम 3 बार दोहराया गया। इसके बाद पीएमएमए-ग्राफीन को शुद्ध पानी में एनएसीएल के संतृप्त समाधान में स्थानांतरित कर दिया गया । नमक के घोल से ग्राफीन लेने के लिए एनएसीएल क्रिस्टल का इस्तेमाल किया गया। (ग)नैक क्रिस्टल पर पीएमएमए-ग्राफीन को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सुखाया गया था । पीएमएमए को 30 मिनट के लिए एसीटोन में ब्लॉक इनक्यूबेटिंग करके हटा दिया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सी माइक्रोचिप पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की ग्राफीन कोटिंग। }Aग्राफीन कोटिंग की प्रक्रिया। एनएसीएल क्रिस्टल पर ग्राफीन पानी की सतह पर जारी किया जाता है। ग्राफीन टुकड़ा तो एक धातु पाश के साथ पकड़ा और एसआई माइक्रोचिप पर स्थानांतरित कर दिया है । (B)माइक्रोचिप (2.0 x 2.6 मिमी) आयामों की एक सीएन खिड़की के साथ 400 x 160 माइक्रोन ग्राफीन के बिना। SKBR3 कोशिकाओं को काले धब्बे के रूप में दिखाई दे रहे थे । (ग)पानी से भरी बीकर की सतह पर तैरती ग्राफीन (लाल वृत्त) । (घ)ग्राफीन को मेटल लूप के साथ पकड़ा गया । (ई)पानी की बूंद से जुड़ी माइक्रोचिप ताकि ग्राफीन सीएन विंडो के ऊपर हो। (एफ)ग्राफीन कोटिंग के बाद माइक्रोचिप। ग्राफीन एक बैंगनी झिलमिलाहट के रूप में दिखाई दे रहा था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सीएन विंडो पर ग्राफीन लेपित और गैर-लेपित SKBR3 कोशिकाओं का स्टेम। (A) एम = 800x पर अधिग्रहीत ग्राफीन कोटेड नमूने की स्टेम छवि।(B) एम = 800x पर अधिग्रहीत गैर-लेपित नमूने की स्टेम छवि ।(C) M= 80,000x छवि ए में नीले आयत की स्थिति में दर्ज की गई पीली रेखाएं कण के भीतर मापा उदाहरण दूरी का प्रतिनिधित्व करता है । (घ) एम = 80,000x छवि बी में नीले आयत की स्थिति में दर्ज की गई पीली रेखा कणों के भीतर मापा उदाहरण दूरी का प्रतिनिधित्व करता है । (ई) एम = सी के रूप में एक ही क्षेत्र की 50,000x छवि डी = (7.8 ± 0.4) x 103 ई-/2 (एफ) एम = डी के रूप में एक ही क्षेत्र की 50,000x छवि और डी = (7.8 ± 0.4) x 103 ई-/Å2के संपर्क में । उजागर क्षेत्र में साफ तौर पर देखा गया। (जी)कोशिकाओं के बिना एक क्षेत्र से एक ग्राफीन लेपित नमूने का विवर्तन पैटर्न । ग्राफीन की छह गुना समरूपता उज्ज्वल धब्बे के रूप में दिखाई देती है। (ज)ग्राफीन के बिना एक नमूने का विवर्तन पैटर्न कोई 6 गुना उज्ज्वल धब्बे दिखा रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: ग्राफीन कोटिंग के बिना नमूनों पर उत्पन्न होने वाली कलाकृतियों। (ए) ग्राफीन कोटिंग के बिना नमूनों पर क्षेत्रों की पहली छवियां एम = 80,000x पर अधिग्रहीत, और डी = (0.39 ± 0.02) x 102 ई2-/ (ख) डी = (1.94 ± 0.1) x 103 ई-/ Å2 (पीले तीर) पर उत्पन्न होने वाली पहली कलाकृतियों के साथ छवियां। (C, D) डी = (7.8 ± 0.4) x 103 ई-/ Å2के साथ अधिग्रहीत श्रृंखला की अंतिम छवि। कलाकृतियों को चमकीले धब्बे के रूप में दिखाई दे रहे थे । (ई-जी) ग्राफीन ने कलाकृतियों को उत्पन्न किए बिना नमूने लेपित किए। (ई) डी = (0.39 ± 0.02) x 102 ई-/Å 2 (एफ) डी = (1.94 ± 0.1) x 103 ई-/Å 2 2(जी) डी = (7.8 ± 0.4) x 103 ई-/ (ज)ग्राफीन लेपित और गैर-लेपित नमूनों के लिए कण दूरी में सापेक्ष परिवर्तन। कलाकृतियों को दिखाने वाले गैर-लेपित नमूनों में से दो, जिनमें से एक (ए-सी) में दिखाया गया है, और डी में दूसरे नमूने की अंतिम छवि, साथ ही तीन लेपित नमूनों का विश्लेषण किया गया (एक ई-जी में दिखाया गया है)। कुल मिलाकर, २५० एनएम और 3 माइक्रोन के बीच की दूरी के साथ प्रति नमूना दस QD जोड़े की जांच की गई । सापेक्ष परिवर्तन एक समूह में सभी मापों के औसत को दर्शाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: समाधान और बफ़र्स के लिए व्यंजनों। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटीन फ़ंक्शन को बेहतर ढंग से समझने के लिए, बरकरार कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन स्थानों के बारे में जानकारी प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। इस जानकारी को प्राप्त करने के तरीकों में सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी1,2शामिल हैं। हालांकि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी आगे पिछले वर्षों में विकसित किया गया है, इसका संकल्प अभी भी सेल प्रयोगों की व्यावहारिक स्थितियों के लिए लगभग 20 एनएम तक ही सीमित है, जबकि ठेठ रिसेप्टर प्रोटीन 1-10 एनएम की सीमा में आकार है । प्रोटीन की कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प के साथ एकल कोशिका और एकल अणु स्तर पर प्रोटीन की इमेजिंग ईएम के साथ संभव है। लेकिन खंड के कारण, पारंपरिक ईएम विधियां आमतौर पर कोशिका को बरकरार नहीं छोड़ती हैं26,जो प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन के संदर्भ और स्थानिक वितरण के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के नुकसान की ओर ले जाती है। क्रायो-टेम के साथ पूरी कोशिकाओं के लिए विधियां विकसित की गई हैं6,क्रायो-ईएम27के साथ प्रोटीन लेबलिंग को जोड़ना संभव है, क्रायो-स्टेम का प्रदर्शनभी 28को किया गया है। हालांकि, क्रायो-ईएम वर्कफ्लो को सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर और प्रोटीन संरचना का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जाता है, और झिल्ली प्रोटीन स्थानिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए इतना नहीं। महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने एक और पूरी सेल तैयार करने की विधि है, लेकिन नमूने कई सुखाने कदम के अधीन हैं, और तकनीक अत्यधिक समय लेने वाली29है । फ्रीज फ्रैक्चर7के माध्यम से झिल्ली प्रोटीन की भी जांच की गई है । इस विधि में, कोशिकाओं को ठीक किया जाता है, जमे हुए और खंडित किया जाता है। खंडित भागों कार्बन और प्लेटिनम परतों द्वारा दोहराया जाता है, और जैविक नमूना हटा दिया जाता है । इसके बाद ईएम30के साथ प्रतिकृतियों का विश्लेषण किया जा सकता है । फ्रीज अंश के साथ पूरे सेल विश्लेषण असंभव है क्योंकि पूरे सेल के संदर्भ में झिल्ली में प्रोटीन के वितरण के बारे में जानकारी खो जाती है।

यहां प्रस्तुत विधि कोशिका झिल्ली को नमूने9,,31को पतला करने की आवश्यकता के बिना अध्ययन करने की अनुमति देती है। कोशिकाओं को बरकरार रखा जाता है ताकि झिल्ली प्रोटीन का स्थानीयकरण फ्लोरेसेंस छवियों से दिखाई दे, जो ईएम छवियों के साथ सहसंबद्ध हैं। हाइड्रेटेड अवस्था में अक्षुण्ण कोशिकाओं के भीतर एकल कोशिका और एकल अणु स्तर पर प्रोटीन का अध्ययन करना इस ग्राफीन बाड़े विधि9का उपयोग करके क्यूडी लेबल वाले प्रोटीन के स्टेम का उपयोग करके 2 एनएम के संकल्प के साथ संभव हो पाया है । कोशिकाओं को उनके मूल राज्य में रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह झिल्ली प्रोटीन के स्थानिक वितरण को बरकरार रखता है जैसे कि एकल कोशिका और एकल अणु स्तर पर विश्लेषण संभव है, जो प्रोटीन कार्यों को समझने और चिकित्सा दृष्टिकोण के लिए नई दवाओं का विकास करने के लिए महत्वपूर्ण है।

EM के साथ इमेजिंग जैविक नमूनों का एक और महत्वपूर्ण पहलू इलेक्ट्रॉन बीम की वजह से नमूनों के विकिरण क्षति है। समाधानों में अक्सर इलेक्ट्रॉन की खुराक में कमी या विभिन्न कोटिंग विधियों को शामिल किया जाता है, जैसे कि कार्बन32की पतली परतों के बीच नमूने को संलग्न करना। हमारी विधि से पता चलता है कि ग्राफीन कोटिंग बीम-प्रेरित कलाकृतियों को कम करती है जो गैर-लेपित नमूनों के लिए कोशिका की सतह पर निकलती हैं। रासायनिक रूप से तय की गई जांच, और ग्राफीन लेपित जैविक नमूनों की जांच 200 केवी बीम ऊर्जा पर इलेक्ट्रॉन बीम विकिरण के तहत डी = (7.8 ± 0.4) x 103 ई-/Å 2 विकिरण क्षति के बिना संभव है, जैसे उज्ज्वल धब्बे, नमूने पर दिखाई दे रहा है। अन्य ईएम विधियों की तुलना में, जिसमें विस्तृत नमूना तैयारी शामिल है, उदाहरण के लिए, धुंधला, एम्बेडिंग, (क्रायो-) सेक्शनिंग, फ्रैक्चरिंग, आदि, यहां वर्णित विधि कम समय लेने वाली है। प्रोटीन की लेबलिंग कुछ ही घंटों के भीतर की जाती है, और ग्राफीन कोटिंग के लिए प्रशिक्षित शोधकर्ताओं के लिए केवल लगभग 15 मिनट की आवश्यकता होती है। नमूना तैयारी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं के साथ तुलनीय है।

प्रोटोकॉल को कुछ चरणों में संशोधित किया जा सकता है। माइक्रोचिप पर ग्राफीन को हवा में सुखाने के लिए भी हवा में सुखाने के लिए सुनिश्चित करें कि ग्राफीन एक फिल्टर पेपर के साथ दाग होने पर आगे नहीं बढ़ता है। यदि ग्राफीन नमक से दूषित है, तो नमक को भंग करने के लिए इसे लगभग एक घंटे तक पानी की सतह पर तैरने देना संभव है और इस प्रकार संदूषण को कम करना संभव है। ग्राफीन पर होने वाले तांबा या पीएमएमए संदूषण को प्रोटोकॉल में संबंधित नक़्क़ाशी चरणों का विस्तार करके कम किया जा सकता है। अन्य ग्राफीन कोटिंग विधियों का वर्णन किया गया है जहां, उदाहरण के लिए, ग्राफीन-पीएमएमए सीधे कोशिकाओं पर जमा किया गया था, और पीएमएमए को बाद में33एसीटोन में धोने से हटा दिया गया था। हमारी विधि में, अतिरिक्त एसीटोन धोने के चरणों के कारण कोशिकाओं को किसी भी संभावित नुकसान से बचने के लिए कोटिंग से पहले पीएमएमए को हटा दिया गया था। NaCl यहां एक सब्सट्रेट के रूप में चुना गया था क्योंकि यह सपाट है, इसलिए यह ग्राफीन को शिकन नहीं देता है, और यह ग्राफीन 9 को छोड़ने के लिए पानी में घुलजाताहै। इसके अलावा, इसे वांछित आकार में काटा जा सकता है और ग्राफीन पर कोई सब्सट्रेट अवशेष नहीं बचे हैं। लेकिन उन मानदंडों को ध्यान में रखते हुए, पोटेशियम क्लोराइड जैसे अन्य सब्सट्रेट्स संभवतः भी इस्तेमाल किए जा सकते हैं।

संभावित लेबल-प्रेरित क्लस्टरिंग की संभावना को कम करने के लिए, एफए निर्धारण के बाद जीए निर्धारण चरण को सीधे लागू किया जा सकता है, जिसके बाद सभी झिल्ली प्रोटीन स्थिर होते हैं। एफए के साथ पहला निर्धारण कदम पहले से ही जैविक संरचना को ठीक करता है लेकिन झिल्ली प्रोटीन प्रसार का एक कम स्तर अभी भी34हो सकता है, संभवतः प्रति क्यूडी कई स्ट्रेप्टाविडिन की उपस्थिति के कारण लेबल प्रेरित क्लस्टरिंग के लिए अग्रणी है। GA के साथ निर्धारण एलएम के दौरान एक ऑटोफ्लोरेसेंस संकेत का कारण बन सकता है, और इसलिए, वर्णित प्रोटोकॉल में एलएम के बाद किया जाता है, लेकिन कहीं और वर्णित34के रूप में कम किया जा सकता है। Cacodylate बफर काफी विषाक्त है, और अन्य फिक्सेटिव्स का उपयोग भी किया जा सकता है, लेकिन यहां कैकोडिलेट का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह ईएम प्रोटोकॉल के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला बफर है, उपजी से बचाता है, बैक्टीरियल और कवक के विकास को रोकता है, और कैल्शियम आयनों के साथ संगत है जो लिपिड झिल्ली35की अल्ट्रास्ट्रक्चरल अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। यदि आवश्यक हो, तो लिपिड को स्थिर करने के लिए ऑस्मिम टेट्रोक्साइड का उपयोग अतिरिक्त निर्धारण के रूप में किया जा सकता है। यह सेल संरचना के विपरीत को बढ़ाने में मदद करेगा, लेकिन सिस्टम में एक और धातु भी जोड़ेगा और क्यूडी पर प्राप्त कंट्रास्ट को कम करेगा।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में कई कदम हैं जिन्हें अच्छे निर्देश की आवश्यकता होती है। माइक्रोचिप्स की एसआईएन सतह को खरोंचने से बचने और टूटने से रोकने के लिए माइक्रोचिप्स को संभालने से पहले कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, डुप्लिकेट में माइक्रोचिप्स तैयार करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि एसआईएन विंडो समय-समय पर टूट सकती है। माइक्रोचिप पर कोशिकाओं की आवश्यक संख्या प्राप्त करने के लिए भी कुछ अनुभव की आवश्यकता है। ग्राफीन के साथ कोशिकाओं को कोटिंग कुछ प्रशिक्षण की जरूरत है क्योंकि पानी पर ग्राफीन तैरने के लिए सही झुकाव कोण खोजना मुश्किल हो सकता है। पानी से ग्राफीन को पकड़ने पर पतले ग्राफीन को देखना भी मुश्किल हो सकता है। जैसे ही ग्राफीन माइक्रोचिप पर होता है, अतिरिक्त पानी को फिल्टर पेपर के साथ बंद करने की आवश्यकता होती है। यह केवल एक फिल्टर पेपर की नोक के साथ किया जाना चाहिए जैसे माइक्रोचिप से ग्राफीन को हटाने से बचने के लिए।

ग्राफीन कोटिंग ने कलाकृतियों को नमूने पर प्रदर्शित होने से रोका। लेकिन डी & 4 x 102 ईके लिए-/Å2 भी गैर-लेपित नमूने के लिए कोई कलाकृतियों उभरा, और कलाकृतियों केवल 2 गैर लेपित नमूनों के लिए दिखाई दिया । इस प्रकार, गैर-लेपित कोशिकाओं की परीक्षाएं भी संभव लगती हैं, हालांकि ग्राफीन का उपयोग करना और विरूपण साक्ष्य गठन के जोखिम से बचना बेहतर होगा। उन कलाकृतियों की संरचना का भविष्य में विश्लेषण किया जा सकता है ताकि उनके गठन को रोकने के बारे में संकेत दिया जा सके। कोशिकाओं की संरचनात्मक स्थिरता के बारे में केवल ग्राफीन कोटिंग का मामूली सुधार देखा गया था। निश्चित कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से जांचे गए पतले क्षेत्रों में स्थिर किया गया था, जहां उनकी संरचना एसआईएन झिल्ली के करीब निकटता में थी। हालांकि, हमने यहां जो जांच नहीं की, वह कलाकृतियों को सुखाने वाली थी जो वैक्यूम4के संपर्क में आने पर सेलुलर नमूनों के लिए होने के लिए जानी जाती हैं। कोशिकाओं के सूखने से कोशिकाओं का सिकुड़ना होगा ताकि क्यूडी की दूरियां भी परिणामस्वरूप बदल जाएं । यहां इस्तेमाल होने वाली इलेक्ट्रॉन डोज के लिए ग्राफीन-लेपित और नॉन-कोटेड नमूनों के क्यूडी की दूरी स्थिर रही। ईएम के लिए कोशिकाओं पर ग्राफीन कोटिंग के प्रभाव की जांच करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है।

इस विधि की एक सीमा यह है कि कोशिकाओं का रासायनिक निर्धारण आवश्यक है; इसलिए, कोई जीवित सेल प्रयोग नहीं किया जा सकता है। लेकिन यदि लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है और उच्च संरचनात्मक स्थिरता वाली कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए बैक्टीरिया, तो अनिर्धारित कोशिकाओं को ईएम36 के लिए ग्राफीन में संलग्न किया जा सकता है हालांकि एक अलग इलेक्ट्रॉन खुराक सहिष्णुता के साथ। इसके अलावा, प्रोटीन सीधे पता लगाने योग्य नहीं हैं, इसलिए प्रोटीन की कल्पना करने के लिए क्यूडी की आवश्यकता होती है। विधि छोटे लेबल से लाभ होगा । चर्चा का एक मुद्दा यह है कि क्या यह अच्छा है या बुरा है कि अल्ट्रास्ट्रक्चर स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं दे रहा है । हमारी विधि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के समान है जहां केवल चयनित प्रोटीन ही दिखाई देते हैं37. अल्ट्रास्ट्रक्चर की दृश्यता बढ़ाने से छवि को और अधिक जानकारी भी मिलेगी, और फिर कुछ बिंदु पर व्यक्तिगत लेबल पदों का पता लगाने से रोका जा सकेगा। इसके अलावा, यहां वर्णित विधि एक प्रोटीन प्रजातियों के लिए है, और प्रोटोकॉल के अतिरिक्त कई प्रोटीन लेबल करने में सक्षम होने की जरूरत है । अंत में, विधि तब काम करती है जब एक छोटी उच्च आत्मीयता विशेष रूप से बाध्यकारी अणु जैसे एंटीबॉडी मिमेटिक21 या ना कोई नहीं38 उपलब्ध है। आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी बहुत बड़ा कर रहे हैं और ओलिगोमर में प्रोटीन उपइकाओं की कार्यात्मक स्थिति का पता लगाने को रोकने होगा।

हमारी विधि हाइड्रेटेड राज्य में कोशिकाओं को रखते हुए EM का उपयोग करते हुए पूरी कोशिकाओं पर प्रोटीन समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। कोशिकाओं की श्रृंखला की जांच करना आसानी से संभव है। अन्य प्रकार की कोशिकाओं और प्रोटीन का भी अध्ययन किया जा सकता है। यदि प्रोटीन लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है, तो प्रोटोकॉल के सबसेट का उपयोग विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों के ग्राफीन कोटिंग के लिए किया जा सकता है। आणविक स्तर पर झिल्ली प्रोटीन समारोह के सहसंबंधों को समझने के लिए पूरी कोशिकाओं का अध्ययन करने की क्षमता सेलुलर अनुसंधान में प्रासंगिक है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ मदद के लिए डी बी Peckys शुक्रिया अदा करते हैं, पांडुलिपि की समीक्षा के लिए एफ Weinberg, प्रयोगों और आंकड़ों के साथ मदद के लिए टी Trampert, आंकड़ों के साथ मदद के लिए एस Smolka, और ई. Arzt INM के माध्यम से अपने समर्थन के लिए । इस शोध को अन्यक्रांत क्रानर-फ्रेसेनियस-स्टिफतुंग द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

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