Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Grafeen behuizing van chemisch vaste zoogdiercellen voor vloeibare fase elektronenmicroscopie

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

Hier gepresenteerd is een protocol voor het labelen van membraaneiwitten in zoogdiercellen en het monster bedekt met grafeen voor vloeibare-fase scanning transmission electron microscopie. De stabiliteit van de monsters tegen de schade veroorzaakt door straling kan ook bestudeerd met dit protocol.

Abstract

Een protocol wordt beschreven voor het onderzoeken van de menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) in het intacte plasmamembraan van borstkankercellen met behulp van scanning transmissie elektronenmicroscopie (STEM). Cellen van de zoogdier borstkanker cel lijn SKBR3 werden gekweekt op silicium microchips met silicium nitride (SiN) ramen. Cellen werden chemisch gefixeerd, en HER2-eiwitten werden gelabeld met quantum dot nanodeeltjes (QD's), met behulp van een twee-staps biotine-streptavidin binding protocol. De cellen werden bekleed met meerlaags grafeen om een gehydrateerde toestand te behouden en te beschermen tegen schade aan elektronenbundels tijdens STEM. Om de stabiliteit van de monsters onder elektronenbundelbestraling te onderzoeken, werd een dosisreeksexperiment uitgevoerd. Grafeen-gecoate en niet-gecoate monsters werden vergeleken. Beam geïnduceerde schade, in de vorm van heldere artefacten, verscheen voor sommige niet-gecoate monsters bij verhoogde elektronendosis D, terwijl er geen artefacten verschenen op gecoate monsters.

Introduction

Analyse van membraaneiwitfunctie is essentieel voor celbiologisch onderzoek en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Een klasse van belangrijke experimenten omvat het onderzoek van membraan eiwitposities in cellen. Deze informatie kan worden gebruikt om conclusies af te leiden over de assemblage van eiwitten in eiwitcomplexen en hun specifieke locaties in het plasmamembraan, die, via dynamische assemblage en demontage, een breed scala aan cellulaire functies aandrijft. Onder andere technieken, lichtmicroscopie (LM) en elektronenmicroscopie (EM) worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitfuncties in cellen. LM maakt de analyse van hele cellen in vloeistof mogelijk; de resolutie is echter beperkt tot 200-300 nm voor conventionele en tot 20 nm voor superresolutie fluorescentiemicroscopie onder praktische omstandigheden1,2. EM biedt ongeveer 1 Å resoluties3,maar conventionele monster voorbereiding vereist uitdroging, metalen vlekken om het beeldcontrast te verbeteren, en inbedding in een montage stof, zoals hars, voor transmissie elektronen microscopie (TEM)4. Om biologische monsters in een meer native-achtige omgeving te bewaren, kunnen cryo-EM-technieken worden gebruikt5,6. De monsters worden snel ingevroren in amorf ijs, en, indien nodig, ge sectionteerd. Een andere optie is freeze-breken EM7.

EM-technieken voor het bestuderen van membraaneiwitten in intacte cellen in hun oorspronkelijke, vloeibare toestand zijn in het afgelopen decennium8,9,10,11ontstaan .9 Een ruimtelijke resolutie van 2 nm werd bereikt op quantum dot (QD) gelabelde membraaneiwitten in hele cellen gekweekt op een SiN-membraan en omsloten door een laag grafeen9.

Hier worden details beschreven van een protocol voor eiwitlabeling en grafeencoating9,12. Het doel van dit protocol is om de ruimtelijke verdeling van HER2 te analyseren in het membraan van hele, vaste cellen, met behoud van de cellen in een gehydrateerde toestand. Coating met grafeen voorkomt drogen van de cellen in vacuüm, en vermindert ook stralingsschade13. Deze methode biedt informatie over gelabelde membraaneiwitten in het intacte plasmamembraan, maar de methode is niet nuttig voor het bestuderen van de cellulaire ultrastructuur zoals gewoonlijk wordt gedaan met EM.

Grafeen is het dunste nanomateriaal bekend, en bestaat uit een enkel koolstofatoom dikke kristallijne plaat gerangschikt in een honingraat rooster14. Het heeft unieke eigenschappen, waaronder hoge flexibiliteit en mechanische sterkte. Recent onderzoek heeft aangetoond dat defectvrij grafeen ondoordringbaar is voor gassen en vloeistoffen, maar gebreken maken waterstofpermeatiemogelijk 15. Deze lekkage kan worden verminderd door het gebruik van meerlaags grafeen zoals hier gebruikt. Bilayer grafeen heeft onlangs aangetoond nuttig te zijn als een steun voor cryo-EM monsters, het verbeteren van de homogeniteit van de dunne ijslaag in vergelijking met grafeenoxide waar alleen niet-uniforme lagen kunnen worden gevormd16. Grafeen bleek ook de bundelschade van biologische monsters te verminderen tijdens de vloeibare fase transmissie elektronenmicroscopie13,17. Als voorbeeldig experiment werd HER2, uitgedrukt in de borstkankercellijn VAN ZOogdieren, AANGEDUID MET QDs18 en de ruimtelijke verdeling ervan geregistreerd met STEM. Cellen werden gezaaid op een Si microchip met een elektron transparante SiN membraan19. De microchips zijn gekozen als ondersteuning omdat ze robuust zijn, compatibel met LM en EM, en de gehele etiketteringsprocedure kan direct op de microchip19worden uitgevoerd. Na de celbevestiging werd HER2 gelabeld met een labelprotocol20in twee stappen. Eerst werd een biotinylated anti-HER2 antilichaam mimetische verbinding21 bevestigd aan HER2. De cellen werden vervolgens chemisch bevestigd om label-geïnduceerde receptorclustering te voorkomen en om de stabiliteit van de cellulaire ultrastructuur te verhogen. Streptavidin-gecoate QD's werden vervolgens gekoppeld aan het HER2-antilichaam mimetisch complex. Het heldere fluorescentiesignaal en de elektronendichte kern van de QDs maakten correlatieve fluorescentie- en elektronenmicroscopie (CLEM)20mogelijk . CLEM is vooral handig omdat cellulaire regio's die van belang zijn voor STEM-analyse kunnen worden geselecteerd uit het overzicht fluorescentiemicroscopie afbeeldingen die de lokalisatie van HER2 op de cellen benadrukken. Cellen werden geanalyseerd door fluorescentie microscopie om cellulaire regio's met hoge HER2-niveaus te identificeren. Daarna werd een 3-5 laag dikke plaat van grafeen overgebracht op de cellen voor coating9,22. Vervolgens werd het monster gemonteerd in een EM-specimenhouder. STEM-gegevens werden verkregen met behulp van de ringvormige donkere veld (ADF) detector, het verstrekken van informatie over de ruimtelijke verdeling van HER2 op het celoppervlak ten opzichte van het celoppervlak locatie, maar het geven van geen informatie over de ultrastructuur van de cel. Om de stabiliteit van het monster onder elektronenbundelbestraling te bepalen, werden de monsters onderzocht bij toenemende dosis(D)in een beeldreeks. Het verschil tussen grafeengecoate en niet-gecoate monsters werd onderzocht. Verschillende soorten stralingsschade werden geëvalueerd.

Het hier beschreven protocol maakt gebruik van de HER2 overexpressie zoogdier borstkanker cellijn SKBR3 als een model systeem voor het richten van HER223. Het protocol omvat de voorbereiding van een grafeen gecoate monster, en een soortgelijk monster, maar zonder grafeen coating voor vergelijking. Het experiment wordt in tweevoud voorbereid omdat het SiN-venster eens per keer kan breken en in de meeste gevallen een experimenteel duplicaat kan verkrijgen. De totale opbrengst van de methode is hoog, wat betekent dat microchips met met grafeen bedekte cellen meestal worden verkregen met een uitzonderlijke fout, hoewel niet het hele SiN-venster in alle gevallen met grafeen kan worden bedekt. Duplicaten worden niet beschreven in het protocol.

Het etiketteringsprotocol (stap 1-5) is vergelijkbaar met het protocol van de etikettering van de epidermale groeifactorreceptor in COS7 fibroblastcellen die eerder24zijn gepubliceerd; details in dat papier worden genoemd met betrekking tot de behandeling van de microchips, en het gebruik van de put platen. Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het labelen van HER2, grafeencoating9en het onderzoeken van de stralingstolerantie van het monster.

Protocol

1. Reiniging van microchips en coating met poly-L-lysine (PLL) en fibronectine-achtig eiwit (FLP)

  1. Plaats twee microchips met een SiN membraan (2,0 x 2,6 mm) in 50 mL aceton. Behandel de microchips voorzichtig met de vlakke kant naar boven. Vermijd het breken van de randen met behulp van platte snavel pincet. Raak het bovenste oppervlak van de microchips niet aan bij het hanteren met een pincet om breuk van het SiN-venster te voorkomen.
    OPMERKING: Men kan ook polytetrafluorethyleen gecoat of koolstof tip pincet gebruiken om schade van de microchips te voorkomen.
  2. Was de chips voor 2 min door zorgvuldig schudden van de beker, kijken naar de microchips niet omdraaien.
  3. Breng de microchips op 50 mL ethanol en was gedurende 2 minuten door het bekerglas voorzichtig te schudden. Zorg ervoor dat de overdracht snel is, zodat de overtollige aceton niet droogt in.
  4. Was de microchips met 50 mL water gedurende 10 minuten.
  5. Dompel de microchips in een vers bereid bekerglas van 20 mL ethanol.
  6. Plaats microchips op een cleanroom weefsel voor het drogen.
  7. Plasma reinigt de microchips met 11,5 sccm O2 en 35 sccm Ar bij 70 mTorr en radiofrequentie (RF)-doel van 50 W gedurende 5 minuten.
  8. Plaats de microchips in een laminaire stroomkap voor steriel celwerk.
  9. Bereid een oplossing van 0,01% PLL in water. Bereid een oplossing voor van 15 μg/mL FLP in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  10. Bereid een 24 put plaat onder de laminaire stroomkap en vul 5 putten individueel met 1 mL van de oplossingen in de volgende volgorde: goed 1 – PLL; goed 2 – water; goed 3 – water; goed 4 – FLP; goed 5 – PBS en goed 6 – PBS.
    OPMERKING: Voer wasstappen uit door een microchip gedurende een paar seconden in de aangegeven 24 of 96 goed te dompelen met behulp van een pincet. Voer incubatiestappen uit door de microchips in de 24 of 96 goed in de aangegeven oplossing voor aangegeven tijd en temperatuur uit te broeden. Breng de microchips binnen enkele seconden over naar een andere put.
  11. Incubeer de microchips in PLL-oplossing gedurende 5 minuten. Was vervolgens twee keer de microchips in water.
  12. Incubeer de microchips in FLP gedurende 5 min. Was vervolgens twee keer de microchips in PBS.
  13. Breng beide microchips over op putten (één voor elke microchip) van een nieuwe 96 putplaat voorgevuld met 50 μL serumvrij medium voor celzaaien.
  14. Broed de microchips bij 37 °C en 5% CO2 tot de celsuspensie is voorbereid.

2. Zaaicellen op SiN membraanmicrochips

  1. Zet alle benodigdheden en apparatuur in een laminaire stroomkap om steriele werking te garanderen.
  2. Was de borstkankercellijn SKBR3, in een celkweek met groeimedium. Gebruik dulbecco's gemodificeerde adelaar medium (DMEM) met 10% foetale kalf serum (FCS), en 1% niet-essentiële aminozuren (NEA's) als groeimedium.
  3. Incubeer de cellen met 1 mL van de cellosselementoplossing tot de cellen losgemaakt van de kolf.
  4. Voeg 5 mL groeimedium toe aan de losgemaakte cellen in de kolf. Breng deze ophanging over op een centrifugebuis.
  5. Pipette 20 μL van de celsuspensie in een hemocytometer om de celconcentratie te verkrijgen. Gebruik de volgende formule.
    Equation 1.
  6. Bereid een verspreide celsuspensie van 2,5 x 105 cellen/mL voor. Bereken de benodigde hoeveelheid van de voorbereide celsuspensie door:
    Equation 2
    en vul met groeimedium tot het gewenste volume.
  7. Voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan de twee putten van een 96 putplaat met de PLL- en FLP-gecoate microchips met het SiN-membraan naar boven gericht en 50 μL serumvrij medium, zodat elke put 25.000 cellen bevat.
  8. Broed de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 5 minuten om te wachten tot de cellen zich aan de microchip hechten.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen cellen loskomen van de microchip omdat ze nog niet zijn gehecht.
  9. Controleer de dichtheid van de cellen op de microchip met een omgekeerde microscoop. Zorg ervoor dat cellen het venster bedekken met voldoende ruimte om af te vlakken en te hechten (zie figuur 1A).
    LET OP: Meer cellen kunnen worden toegevoegd op dit punt indien nodig.
  10. Breng de microchips over in nieuwe putten met 200 μL groeimedium en incbaat bij 37 °C en 5% CO2 's nachts.
  11. Breng in de middag van de volgende dag beide microchips over naar serumvrij medium (serumverhongeringsmedium) als cellen zijn afgevlakt en zich hebben gehouden aan een visueel geïnspecteerde samenvloeiing (d.w.z. de fractie van het raamoppervlak bedekt met cellen) van ongeveer 2/3 (zie figuur 1B). Verandering in serumvrij medium indien nodig om de cellen in een gedefinieerde uitgangsconditie te brengen, indien nodig voor vergelijking tussen verschillende experimenten25.
  12. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 's nachts.
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat celhoeveelheden kunnen verschillen afhankelijk van de groeipercentages en de celmorfologie voor andere cellijnen.

3. HER2-etikettering en fixatie

  1. Bereid de oplossingen voor zoals beschreven in aanvullende tabel 1.
    1. Werk onder de laminaire stroomkap om steriele werking te garanderen. Gebruik een 96 putplaat aangeduid als labelplaat I en vul 6 putten per microchip met 200 μL van de labelplaat I-oplossingen: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, antilichaammimetisch, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Gebruik één rij (één letter per rij, bijvoorbeeld A1 tot A6) van de putplaat per microchip. Verwarm de etiketterende plaat tot 37 °C.
    2. Onder een rookkap, bereid een 24 put plaat aangeduid als fixatieplaat, en vul 8 putten per microchip met 500 μL van de fixatieplaat oplossingen: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS, PBS/ glycine, PBS/BSA.
      LET OP: CB is acuut giftig door inademing of orale inname en is gevaarlijk voor wateren. Werk onder de rookkap met de juiste bescherming en gooi CB volgens het veiligheidsinformatieblad (SDS). FA is corrosief en schadelijk voor de huid en de gezondheid. Werk onder de rookkap en raadpleeg de SDS voor informatie over handling en verwijdering.
    3. Bereid een 96 putplaat die aangeduid wordt als labelplaat II en vul 4 putten per microchip met 200 μL van de labelplaat II-oplossingen: QD's, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA.
      LET OP: Hier wordt een 24 putplaat gebruikt om de microchips in de putten beter te zien. Gebruik voor minder antilichaammimetisch (stap 3.2) en QD's (stap 3.4) 96 putplaten voor deze stappen.
  2. Label HER2 in de cellen.
    1. Zodra deze platen klaar zijn, beginnen met het labelen door het plaatsen van de microchips in de putten van de eerste rij van labelplaat 1.
    2. Was de microchips met PBS/BSA in de 96 putplaat gemarkeerd als labelplaat I.
    3. Blokkeer niet-specifieke plaatsen om niet-specifieke binding van het antilichaam mimetisch te voorkomen door te broeden met PBS/BSA/GS gedurende 5 min bij 37 °C en 5% CO2.
    4. Incubeer met 200 nM-antilichaam mimetisch gedurende 10 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
    5. Was microchip drie keer in PBS/BSA.
  3. Repareer de cellen.
    1. Breng de microchips over op de 24 put fixatieplaat in de rookkap.
      LET OP: Vanaf hier is er geen steriel werk nodig.
    2. Was een keer met CB voor een paar seconden.
    3. Fix cellen met 3% FA voor 10 min.
    4. Was één keer met CB en drie keer met PBS.
    5. Blokkeer gratis aldehyde groepen FA door uit te broeden met PBS-glycine gedurende 2 min.
    6. Was microchips één keer met PBS-BSA.
  4. Bevestig de QD's.
    1. Verplaats de microchips naar de 96 goed labelplaat II.
    2. Incubeer met 20 nM QDs voor 12 min.
    3. Was de microchips twee keer met PBS/BSA.
    4. Bewaar de microchips in een put met PBS/BSA.

4. Lichte microscopie van de vaste cellen

  1. Bereid een glazen bodemschotel met een diameter van 3,5 cm met een PBS/BSA-oplossing van 2 mL.
  2. Neem de eerste microchips, plaats het ondersteboven (cellen naar beneden gericht) in de glazen bodemschaal en plaats de schotel in de fluorescentiemicroscoop. Laat de microchip langzaam in de vloeistof zakken om schade aan de cellen te voorkomen.
  3. Verwerf differentiële interferentie contrast (DIC) en fluorescentie beelden van elke microchip met een 40x doelstelling en de juiste fluorescentie kanaal.
    OPMERKING: Hier wordt een excitatiegolflengte van 540-580 nm en een emitterende golflengte van 607-683 nm gebruikt om QD655 te detecteren.
  4. Herhaal de procedure voor de tweede microchip.

5. Nafixatie

  1. Voer alle stappen onder de rookkap uit.
  2. Vul 6 putten per microchip van een 96 putplaat met 200 μL van de post-fixatieoplossingen:
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    LET OP: GA is gevaarlijk voor wateren, schadelijk voor de huid, luchtwegen en ogen. Werk onder de rookkap en raadpleeg de SDS voor informatie over handling en verwijdering.
  3. Plaats beide microchips in hun respectieve putten met de cellen naar boven gericht.
  4. Was een keer met CB.
  5. Fix cellen met 2% GA voor 10 min.
  6. Was een keer met CB.
  7. Was drie keer met PBS/BSA.
    OPMERKING: De eerste fixatiestap met FA bevestigt al de biologische structuur, maar een verlaagd niveau van membraaneiwitdiffusie kan nog steeds optreden, wat mogelijk leidt tot label geïnduceerde clustering als gevolg van de aanwezigheid van meerdere streptavidins per QD. Houd de tijd van de experimentele stappen van FA fixatie naar GA, daarom zo kort mogelijk om de verspreiding van de eiwitten in het membraan te minimaliseren.
  8. Bewaar in PBS/BSA om osmotische schokken en 0,02% natriumazijn (NaN3)te voorkomen om bacteriële groei bij 4 °C te voorkomen tot grafeencoating in een nieuwe putplaat. Verzegel de putplaat met paraffinefolie om uitdroging te voorkomen. De microchips en cellen zijn stabiel tot 2 weken wanneer ze worden opgeslagen bij 4 °C.
    LET OP: NaN3 is gevaarlijk voor wateren en acuut giftig door orale inname, voor de huid en de luchtwegen. Werk onder de rookkap en raadpleeg de SDS voor informatie over handling en verwijdering.

6. Reiniging en overdracht van grafeen op zoutkristallen

  1. Verwijder poly(methylmethacrylaat) (PMMA)-grafeen uit PMMA-grafeen-op-polymeer (figuur 2A).
    1. Pipette een paar druppels water op het polymeer rond het PMMA-grafeen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het PMMA-grafeen gemakkelijk van het ondersteunende polymeer komt terwijl het op het wateroppervlak drijft.
    2. Dompel het PMMA-grafeen-op-polymeer onder in water met een hoek van 30-45° om het PMMA-grafeen vrij te geven.
      LET OP: Het polymeer mag slechts licht bevochtigd zijn. Pipetten te veel water op het polymeer zal tillen en eventueel vouwen de PMMA-grafeen.
  2. Verontreinigende stoffen op basis van koper met behulp van een natriumpersulfaatoplossing(figuur 2B).
    OPMERKING: Commercieel grafeen geteeld op koperfolie bevat vaak ondergrondse koperresten, die kunnen worden verwijderd met een koperen etchant-oplossing22.
    1. Bereid een 50 mL-oplossing van 0,42 M natriumpersulfaat in water.
    2. Breng PMMA-grafeen in de natriumpersulfaatoplossing met de grafeenzijde naar beneden met behulp van een standaard glazen schuif. PMMA-grafeen zal zweven op de top van de oplossing.
    3. Laat het PMMA-grafeen 's nachts in de natriumpersulfaatoplossing.
    4. Verwijder het PMMA-grafeen uit de natriumpersulfaatoplossing en plaats het met een glazen schuif op schoon water. Laat het een half uur op het water drijven.
    5. Herhaal de vorige stap in totaal drie keer om alle natriumpersulfaatresten uit het PMMA-grafeen te verwijderen.
  3. Breng het PMMA-grafeen over op een natriumchloride (NaCl) kristal.
    1. Bereid een verzadigde oplossing van NaCl in water in een petrischaaltje.
    2. Breng het PMMA-grafeen bovenop de NaCl-oplossing met de grafeenzijde naar beneden met behulp van een glazen schuif.
    3. Houd een NaCl-kristal met een pincet vast en pak het zwevende PMMA-grafeen.
      OPMERKING: De grootte van het NaCl-kristal moet iets groter zijn dan de grootte van het PMMA-grafeen om te voorkomen dat het uitstekende grafeen aan de rand van het zout wordt opgevouwen of het grafeen met een pincet wordt aangedrongen. In deze experimenten wordt nacl-kristal van 12 mm x 12 mm x 0,5 mm gebruikt voor het oppakken van een 10 mm x 10 mm grafeenplaat en daarna ondersteunend.
    4. Houd het PMMA-grafeen-op-zout 2 min verticaal vast om overtollig water eruit te laten stromen.
    5. Laat het PMMA-grafeen-op-zout 30 minuten drogen bij kamertemperatuur en bak het gedurende 20 minuten in een oven op 100 °C om het water volledig te verwijderen.
  4. Verwijder PMMA met behulp van een acetonwas(figuur 2C).
    1. Verwarm aceton voor in een glazen petrischaal tot ~50 °C op een kookplaat in de rookkap. Let goed op de temperatuur om brand te voorkomen.
    2. Dompel het PMMA-grafeen-op-zout onder in de petrischaal gevuld met aceton en laat het de PMMA 30 minuten oplossen.
    3. Herhaal de vorige stap in totaal drie keer met nieuwe, schone aceton.
    4. Laat het grafeen-op-zout lucht grondig drogen alvorens het te gebruiken voor monsterbereiding.

7. Grafeencoating

OPMERKING: De grafeencoatingprocedure wordt schematisch weergegeven in figuur 3A.

  1. Was een microchip bereid met vaste cellen en gelabeld HER2 in zuiver water om eventuele resten van zout uit de buffer te verwijderen. Plaats de microchip op een filterpapier. De cellen zijn zichtbaar als donkere vlekken(figuur 3B).
  2. Snijd het meerlaags grafeen op NaCl kristal in een stuk dat past bij de SiN venster van een microchip met behulp van een scheermesje.
  3. Bereid een bekerglas zuiver water en verwijder het grafeen uit het NaCl-kristal door het kristal ongeveer 45° hoek ten opzichte van het wateroppervlak te kantelen en het water aan te raken. Het grafeen zweeft op het wateroppervlak (figuur 3C).
  4. Vang het grafeen met een metalen lus van het wateroppervlak. Het grafeen zweeft in de druppel onder de lus(figuur 3D).
  5. Raak het bovenste oppervlak van de microchip aan met het onderste lusoppervlak. De microchip blijft aan de metalen lus kleven. Het grafeen is te zien op de microchip(figuur 3E).
  6. Gebruik onder een stereomicroscoop filterpapier om het resterende water uit de microchip te verwijderen, zodat het grafeen alle cellen op het SiN-venster bedekt.
    LET OP: Het grafeen beweegt wanneer uitgewist. Zorg ervoor dat het grafeen boven aan het venster blijft door de microchip aan te raken met de rand van het filterpapier.
  7. Gebruik een pincet om de microchip uit de metalen lus te verwijderen en op een filterpapier te plaatsen. Het grafeen is zichtbaar als een paarse glans op de microchip(figuur 3F).
  8. Breng de microchip van het papier naar een compartiment Petri schotel.
  9. Pipette een druppel water in een van de vrije compartimenten en sluit het deksel om een waterverzadigde atmosfeer te bieden.
  10. Verzegel de schotelschotel met paraffinefolie en bewaar deze in de koelkast op 4 °C indien nodig voor verdere metingen.

8. STEM

  1. Pas de STEM aan op 200 kV bundelenergie met behulp van een uitlijning/testmonster voor een sondegrootte van ten minste 0,2 nm door de condensorlenzen aan te passen, een sondestroom I = 180 pA (informatie over de sondestroom voor verschillende microscoopinstellingen wordt door de fabrikant binnen 5% nauwkeurigheid verstrekt) en een bundelconvergentie semi-hoek van 13,2 mrad door het invoegen van een diafragma. Stel de ADF STEM detector die het semi-hoekbereik (binnen en buiten) opent in op 68-280 mrad door de instellingen van de projectorlens aan te passen. Stel de grootte van de STEM-afbeelding in op 2048 x 2048 pixels en de pixeltijd t = 6 μs.
  2. Laad de microchip met gegrafeerde cellen in een standaard specimenhouder voor TEM zodanig dat de cellen naar boven gericht zijn.
  3. Laad de houder in de elektronenmicroscoop.
  4. Verkrijg een overzichtsfoto bij vergroting (M) = 800x (Figuur 4) met behulp van de instellingen in stap 8.1.
  5. Identificeer een interessegebied op een cel.
  6. Beeld de QD's met een ADF detector bij M = 80.000x bij een pixelgrootte d = 1,3 nm (figuur 4) met behulp van de instellingen in stap 8.1.
  7. Verwerf een beeld van het gebied na blootstelling met een lagere vergroting (hier, M = 50.000x) om het blootgestelde gebied weer te geven (figuur 4).
  8. Bereken de elektronendosis
    Equation 3
    waar e de elementaire lading is. Met de instellingen in het bovenstaande,
    Equation 4
    en een fout van 5%.
  9. Verwerf 20 afbeeldingen voor een dosisreeks met dezelfde instellingen, maar met t = 60 μs wat resulteert in een geaccumuleerde dosis
    Equation 20.
  10. Als u de aanwezigheid van grafeen wilt bevestigen, schakelt u de microscoop in op TEM bij M = 1.200x, selecteert u een gebied in de buurt van een cel en schakelt u over naar de diffractiemodus. Neem een diffractiepatroon op bij een belichtingstijd van 0,5 s, 2048 x 2048 x 3 pixels en een geselecteerd gebiedsopening van 50 μm (figuur 4).
  11. Verwijder aan het einde van de sessie het monster uit de microscoop, plaats de microchip terug in de schotelschaal, sluit de schotel af met paraffinefolie en bewaar het indien nodig in de koelkast bij 4 °C voor verdere metingen.
  12. Selecteer de tweede microchip die op dezelfde manier wordt bereid als de eerste microchip, maar zonder grafeencoating.
  13. Herhaal stap 8.2-8.11, maar nu voor dit voorbeeld. Neem een diffractiepatroon op met dezelfde instellingen als in het bovenstaande, als vergelijking(figuur 4).

9. Analyse

OPMERKING: Voor geautomatiseerde detectie van QD-posities in een STEM-afbeelding maakt de analyse gebruik van een plug-in van lokaal ontwerp voor ImageJ (NIH), zoals elders beschreven20. De plugin is beschikbaar op aanvraag.

  1. De software past automatisch de volgende stappen toe om deeltjes in een STEM-afbeelding te detecteren:
    1. Pas een Gaussian-filter toe om pixelruis te verminderen.
    2. Breng een Fast Fourier Transform (FFT) bandpass filter aan om alleen nanodeeltjes te verkrijgen.
    3. Stel een drempelwaarde in om de afbeelding te binariseren.
    4. Gebruik een deeltjesdiameter van 10 nm met een tolerantiefactor van 2 voor deeltjesdetectie.
    5. Detecteer deeltjesposities.
  2. Meet de afstand tussen tien paar QD's per serie. Hier werden 10 afstanden met verschillende afmetingen gemeten per reeks.
  3. Bereken de relatieve verandering in deeltjesafstand door elke deeltjesafstand te vergelijken met de afstand in de eerste afbeelding met behulp van:
    Equation 5.

Representative Results

Figuur 1A toont cellen die zodanig zijn ingezaaid dat het venster bedekt is, maar voldoende ruimte heeft om ze af te vlakken en te hechten, wat leidt tot een samenloop van ongeveer 2/3rd (figuur 1B). In het geval dat er te veel cellen op een microchip worden gezaaid(figuur 1C),is er onvoldoende ruimte voor alle cellen om zich aan de microchip te hechten. Figuur 1D toont dezelfde microchip na 24 uur. Meer dan de helft van de cellen heeft niet afgevlakt. Aan de andere kant, als er te weinig cellen worden gezaaid (figuur 1E), zal het SiN-venster na 24 uur eindigen met een grote lege ruimte, zoals te zien is in figuur 1F. Figuur 1G toont de DIC-afbeelding van de cellen in figuur 1A en figuur 1B. Figuur 1H toont de overeenkomstige fluorescentie afbeelding vals gekleurd in geel aangeeft succesvolle etikettering van HER2.

Representatieve STEM-gegevens worden weergegeven in figuur 4. Grafeengecoate (linkerkolom) en niet-gecoate (rechterkolom) SKBR3 cellen werden onderzocht. Figuur 4A,B tonen M = 800x overzichtsafbeeldingen van de cellen op het venster. De gebieden die als insets werden weergegeven, werden afgebeeld bij M = 80.000x tijdens de dosisreeks, zie figuur 4C,D. De QD's zijn hier zichtbaar als lichtpuntjes. Figuur 4E en figuur 4F tonen M = 50.000x vergrote beelden die zijn verkregen op de locaties van de rechthoeken in figuur 4C,D. Beide beelden werden opgenomen na de verwerving van een dosisreeks met D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. De dosisserie werd geregistreerd bij M = 80.000x. De blootgestelde gebieden kunnen worden herkend als rechthoeken, waarbij de rechthoek duidelijk zichtbaar was voor het niet-gecoate monster (figuur 4F).

Om de aanwezigheid van grafeen te verifiëren, werden diffractiepatronen van gebieden zonder cellen, maar met of zonder grafeen op het SiN-venster verworven. De zeshoekige structuur van het grafeen werd waargenomen in het diffractiepatroon van het met grafeen gecoate monster (figuur 4G),terwijl het afwezig was voor het niet-gecoate monster (figuur 4H). Het diffractiepatroon van enkel kristalgrafeen zal zesvoudige symmetrie hebben als gevolg van een hoogst geordende zeshoekige structuur van grafeen. De zeshoekige structuur geeft de aanwezigheid van grafeen op de monsters aan.

Om het effect van elektronenbundelverlichting op het monster te onderzoeken, werden STEM-beelden verkregen in een beeldreeks met een accumulerende elektronendosis. Representatieve resultaten voor monsters met niet-gecoate en grafeencoating zijn respectievelijk weergegeven in figuur 5A-D en figuur 5E-G. Alle gegevens werden verkregen aan de rand van de cel, waar de cel de platste is, en de waargenomen structuur is dus het dichtst bij het SiN-membraan. De blootstelling van een niet-gecoate monsters leidde tot heldere structuren die op de celoppervlakken bij D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (figuur 5B) verschenen. Deze structuren werden groter met hogere doses, dus ze waren duidelijk zichtbaar in het laatste beeld van de serie bij D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Figuur 5C,D). Deze vlekken verschenen niet op een van de met grafeen gecoate monsters(figuur 5E-G).

Aanvullende microchips werden bereid en onderzocht met behulp van het protocol beschreven in het bovenstaande. In totaal werden zes gecoate en zeven niet-gecoate monsters onderzocht. Twee van de zeven niet-gecoate monsters toonden deze artefacten. Geen van de gecoate monsters toonde geen extra lichtpuntjes.

Als een andere maatregel van stralingsschade, werd de afstand tussen QDs onderzocht. Als er structurele schade zou optreden, zou men verwachten dat de afstanden tussen QD's zullen veranderen. Veranderingen in afstanden werden gemeten voor verschillende paren QDs met het accumuleren van D voor een reeks paarafstanden. Figuur 5H toont aan dat de relatieve verandering van de deeltjes voor niet-gecoate monsters gemiddeld onder de 1,3% bleef, terwijl de gemiddelde relatieve afstand voor de gecoate monsters onder 0,8% bleef. Men kan dus concluderen dat de grafeencoating het monster stabiliseerde, maar de gedroogde monsters zonder grafeencoating waren ook opmerkelijk stabiel.

Figure 1
Figuur 1: Celzaaien op een SiN-venster van een siliciummicrochip en HER2 gelabeld. (A) Voorbeeldig beeld van een SiN venster gebied met SKBR3 cellen 5 min na het zaaien op de microchip. (B) Dezelfde cellen verspreid op dezelfde SiN venster na 24 uur (C) SKBR3 cellen op een Si microchip 5 min na het zaaien. (D) Dezelfde cellen als in (C) na 24 uur. Cellen niet goed af te vlakken als er te veel cellen op de chips bij het zaaien. (E) Cellen op een microchip 5 min na het zaaien. (F) Slechts weinig cellen waren zichtbaar op het venster omdat er te weinig cellen op de microchip werden gezaaid. (G) DIC-beeld van dezelfde SKBR3-cellen na QD-etikettering van HER2. (H) Overlay afbeelding van DIC en overeenkomstige fluorescentie afbeelding van gelabelde SKBR3 cellen met HER2-QD655 (vals gekleurd in geel). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schoonmaken en overbrengen van grafeen op NaCl-kristallen. (A) PMMA-grafeen-op-polymeer wordt ondergedompeld in zuiver water om PMMA-grafeen vrij te geven. PMMA-grafeen kan worden gevangen met een glazen schuif. (B) Verontreinigingen op basis van koper werden geëtst met behulp van natriumpersulfaatoplossing. Om het grafeen schoon te maken, werd het overgebracht naar een beker met gedeïoniseerd water. Deze stappen werden 3 keer herhaald. Het PMMA-grafeen werd vervolgens overgebracht naar verzadigde oplossing van NaCl in zuiver water. Een NaCl kristal werd gebruikt om het grafeen op te halen uit de zoutoplossing. (C) Het PMMA-grafeen op NaCl kristal werd uitgedroogd gedurende 30 min bij kamertemperatuur. PMMA werd verwijderd door het blok in aceton voor 30 min uit te broeden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Grafeencoating van cellen gezaaid op een Si microchip. (A) Procedure van grafeencoating. Grafeen op NaCl kristal wordt vrijgegeven op het wateroppervlak. Het grafeenstuk wordt vervolgens gevangen met een metalen lus en overgebracht naar de Si microchip. (B) Microchip (2,0 x 2,6 mm) met een SiN-venster van afmetingen 400 x 160 μm zonder grafeen. SKBR3-cellen waren zichtbaar als donkere vlekken. (C) Grafeen (rode cirkel) drijvend op het oppervlak van een beker gevuld met water. (D) Grafeen gevangen met een metalen lus. (E) De microchip bevestigd aan de waterdruppel zodat het grafeen was op de top van de SiN venster. (F) Microchip na grafeencoating. Het grafeen was zichtbaar als een paarse glans. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: STENGEL van gecoat grafeen en niet-gecoate SKBR3-cellen op het SiN-venster. (A) STEM-beeld van een met grafeen bekleed monster dat is verkregen bij een M = 800x. (B) STEM-afbeelding van een niet-gecoate steekproef die is verkregen bij M = 800x. (C) M = 80.000x beeld dat is opgenomen op de positie van de blauwe rechthoek in A. Gele lijnen vertegenwoordigt voorbeeldenafstanden gemeten binnen deeltje. (D) M = 80.000x beeld opgenomen op de positie van de blauwe rechthoek in B. Gele lijn vertegenwoordigt voorbeelden afstanden gemeten in deeltjes. (E) M = 50.000x beeld van hetzelfde gebied als C blootgesteld aan D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2. (F) M = 50.000x beeld van hetzelfde gebied als D en blootgesteld aan D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2. Het blootgestelde gebied was duidelijk te zien. (G) Diffractiepatroon van een met grafeen bekleed monster uit een gebied zonder cellen. De zesvoudige symmetrie van het grafeen is zichtbaar als lichtpuntjes. (H) Diffractiepatroon van een monster zonder grafeen dat geen 6-voudige lichtpuntjes vertoont. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Artefacten die ontstaan op monsters zonder grafeencoating. (A) Eerste afbeeldingen van gebieden op monsters zonder grafeencoating die bij M = 80.000x zijn verworven en zijn blootgesteld aan D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) Afbeeldingen met de eerste artefacten die zich voordoen bij D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (gele pijlen). C,D) Laatste beeld van de serie verworven met D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Artefacten waren zichtbaar als lichtpuntjes. (E-G) Grafeen gecoate monsters zonder zich voorwerpelijk artefacten. (E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. (H) Relatieve verandering in deeltjesafstanden voor gecoat grafeen en niet-gecoate monsters. Twee van de niet-gecoate monsters met artefacten, waarvan er een getoond in (A-C), en de laatste afbeelding van het tweede monster in D, evenals drie gecoate monsters werden geanalyseerd (een wordt weergegeven in E-G). In totaal werden tien QD-paren per monster onderzocht met afstanden tussen 250 nm en 3 μm. De relatieve verandering weerspiegelt het gemiddelde van alle metingen in één groep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Recepten voor oplossingen en buffers. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Om de eiwitfunctie beter te begrijpen, is het belangrijk om informatie te verkrijgen over eiwitlocaties in het plasmamembraan van intacte cellen. Methoden voor het verkrijgen van deze informatie omvatten superresolutie fluorescentie microscopie1,2. Hoewel de microscopie met superresolutie zich de afgelopen jaren verder heeft ontwikkeld, is de resolutie ervan nog steeds beperkt tot ongeveer 20 nm voor praktische omstandigheden van celexperimenten, terwijl typische receptoreiwitten maten hebben in het bereik van 1-10 nm. De beeldvorming van eiwitten op eencellig en enkelvoudig molecuulniveau met voldoende resolutie om eiwitten te visualiseren is mogelijk met EM. Maar als gevolg van sectioning, conventionele EM-methoden meestal niet laat de cel intact26, wat leidt tot het verlies van belangrijke informatie over de context en de ruimtelijke verdeling van eiwitten in het plasmamembraan. Methoden voor hele cellen met cryo-TEM zijn ontwikkeld6, is het haalbaar om eiwit etikettering te combineren met cryo-EM27, ook cryo-STEM is aangetoond28. Cryo-EM workflows zijn echter geoptimaliseerd voor het bestuderen van de cellulaire ultrastructuur en eiwitstructuur, en niet zozeer voor het analyseren van membraaneiwit ruimtelijke distributies. Kritiek punt drogen is een andere hele cel voorbereiding methode, maar de monsters worden onderworpen aan verschillende droogstappen, en de techniek is zeer tijdrovend29. Membraaneiwitten zijn ook onderzocht via vriesfractuur7. Bij deze methode worden cellen vast, bevroren en gebroken. De gebroken delen worden gerepliceerd door koolstof- en platinalagen en het biologische monster wordt verwijderd. De replica's kunnen vervolgens worden geanalyseerd met EM30. Hele celanalyse is onmogelijk met vriesfractie omdat informatie over de verdeling van eiwitten in het membraan binnen de context van de hele cel verloren gaat.

De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk het celmembraan te bestuderen zonder het monster9,31te hoeven snijden. De cellen worden intact gehouden zodat de lokalisatie van de membraaneiwitten zichtbaar is van de fluorescentiebeelden, die gecorreleerd zijn met de EM-beelden. Het bestuderen van eiwitten op het niveau van één cel en enkelvoudig molecuul in intacte cellen in gehydrateerde toestand heeft aangetoond mogelijk te zijn met een resolutie van 2 nm met behulp van STEM van QD gelabelde eiwitten met behulp van deze grafeenbehuizingsmethode9. Het houden van cellen in hun eigen staat is van cruciaal belang, omdat het de ruimtelijke verdeling van membraaneiwitten zodanig behoudt dat analyses mogelijk zijn op het niveau van één cel en enkelvoudig molecuul, wat belangrijk is voor het begrijpen van eiwitfuncties, en het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen voor therapiebenaderingen.

Een ander kritiek aspect van beeldvorming biologische monsters met EM is de stralingsschade van de monsters veroorzaakt door de elektronenbundel. Oplossingen omvatten vaak de vermindering van de elektronendosis zoveel mogelijk of verschillende coatingmethoden, zoals het inkapselen van het monster tussen dunne lagen koolstof32. Onze methode toont aan dat grafeen coating vermindert beam-geïnduceerde artefacten die ontstaan op het celoppervlak voor niet-gecoate monsters. Onderzoek van de chemisch vaste, en grafeen gecoate biologische monsters is mogelijk onder elektronenbundel bestraling bij 200 keV straal energie tot D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2 zonder stralingsschade, zoals heldere vlekken, verschijnen op het monster. In vergelijking met andere EM-methoden die een uitgebreide monstervoorbereiding omvatten, bijvoorbeeld kleuring, inbedding, (cryo-) secties, breken, enz., is de hier beschreven methode minder tijdrovend. Etikettering van de eiwitten wordt uitgevoerd binnen een paar uur, en grafeen coating vereist slechts ongeveer 15 minuten voor opgeleide onderzoekers. Het monsterpreparaat is vergelijkbaar met de procedures die nodig zijn voor fluorescentiemicroscopie.

Het protocol kan in sommige stappen worden gewijzigd. Het grafeen op de microchip kan ook worden gedroogd om ervoor te zorgen dat het grafeen niet beweegt wanneer het met een filterpapier wordt uitgewist. Als het grafeen met zout is verontreinigd, is het mogelijk om het ongeveer een uur op het wateroppervlak te laten drijven om het zout op te lossen en zo verontreiniging te minimaliseren. Voorkomende koper- of PMMA-verontreiniging op het grafeen kan worden verminderd door de bijbehorende etsstappen in het protocol uit te breiden. Andere grafeencoatingmethoden zijn beschreven waarbij bijvoorbeeld grafeen-PMMA rechtstreeks op cellen werd afgezet en de PMMA werd verwijderd door het wassen in aceton achteraf33. In onze methode werd PMMA verwijderd voordat de coating werd verwijderd om eventuele schade aan de cellen veroorzaakt door extra acetonwasstappen te voorkomen. NaCl werd gekozen als een substraat hier omdat het plat is, dus het kreukt het grafeen niet, en het lost op in water om het grafeen9vrij te geven. Bovendien kan het in de gewenste grootte worden gesneden en blijven er geen substraatresten over op het grafeen. Maar rekening houdend met deze criteria, kunnen ook andere substraten zoals kaliumchloride worden gebruikt.

Om de kans op potentiële label-geïnduceerde clustering te verminderen, kan de GA fixatie stap direct na FA fixatie worden geïmplementeerd, waarna alle membraaneiwitten worden geïmmobiliseerd. De eerste fixatiestap met FA bevestigt al de biologische structuur, maar een verlaagd niveau van membraaneiwitdiffusie kan nog steeds optreden34, wat mogelijk leidt tot label geïnduceerde clustering als gevolg van de aanwezigheid van meerdere Streptavidin per QD. Fixatie met GA kan leiden tot een autofluorescentiesignaal tijdens LM, en wordt daarom na LM in het beschreven protocol gedaan, maar kan worden verminderd zoals elders beschreven34. Cacodylaat buffer is vrij giftig, en andere fixatiemiddelen kunnen ook worden gebruikt, maar cacodylaat wordt hier gebruikt omdat het een veelgebruikte buffer voor EM-protocollen is, neerslag vermijdt, de groei van bacteriële en schimmels voorkomt en compatibel is met calciumionen die nodig zijn om de ultrastructurele integriteit van lipidemembranen te behouden35. Indien nodig kan osmiumteroxide worden gebruikt als extra fixatie voor het stabiliseren van de lipiden. Dit zou helpen om het contrast van de celstructuur te verbeteren, maar ook een ander metaal toe te voegen aan het systeem en het contrast verkregen op de QDs te verminderen.

Het hier beschreven protocol bevat veel stappen die een goede instructie vereisen. Enige training is vereist voor het hanteren van microchips om krassen op het SiN-oppervlak van de microchips te voorkomen en breuk te voorkomen. Zoals eerder vermeld, is het raadzaam om microchips in duplicaten te bereiden, omdat het SiN-venster van tijd tot tijd kan breken. Het verkrijgen van het vereiste aantal cellen op een microchip vereist ook enige ervaring. Coating van de cellen met grafeen heeft enige training nodig, omdat het moeilijk kan zijn om de juiste kantelhoek te vinden om grafeen op water te zweven. Bij het vangen van het grafeen uit water, kan het ook moeilijk zijn om het dunne grafeen te zien. Zodra het grafeen op de microchip staat, moet overtollig water worden afgewimpeld met een filterpapier. Dit mag alleen worden gedaan met de punt van een filter papier om te voorkomen dat het grafeen uit de microchip.

Grafeencoating voorkwam dat artefacten op het monster konden worden weergegeven. Maar voor D < 4 x 102 e-/ Å2 ook geen artefacten ontstaan voor de niet-gecoate monster, en artefacten verscheen voor 2 niet-gecoate monsters alleen. Zo lijken onderzoeken van niet-gecoate cellen ook mogelijk, hoewel het beter zou zijn om grafeen te gebruiken en het risico van artefactvorming te vermijden. De samenstelling van deze artefacten kan worden geanalyseerd in de toekomst om hints te geven over hoe ze hun vorming te voorkomen. Wat de structurele stabiliteit van de cellen betreft, werd slechts een kleine verbetering van de grafeencoating waargenomen. De vaste cellen werden blijkbaar gestabiliseerd in de onderzochte dunne gebieden, waar hun structuur in dichte nabijheid van het membraan SiN was. Wat we hier niet hebben onderzocht, waren echter drogen artefacten waarvan bekend is dat ze optreden voor cellulaire monsters bij blootstelling aan vacuüm4. Het drogen van de cellen zou leiden tot krimp van de cellen, zodat ook de QD afstanden bijgevolg zouden veranderen. Voor de hier gebruikte elektronendosis bleef de afstand van QD's van met grafeen bedekte en niet-gecoate monsters stabiel. Verdere studies zijn nodig om het effect van grafeencoating op de cellen voor EM te onderzoeken.

Een beperking van deze methode is dat de chemische fixatie van de cellen noodzakelijk is; daarom kunnen geen levende celexperimenten worden uitgevoerd. Maar in het geval dat de etikettering niet nodig is en cellen met een hogere structurele stabiliteit worden gebruikt, bijvoorbeeld bacteriën, dan kunnen niet-vaste cellen worden ingesloten in grafeen voor EM36 zij het met een andere elektronendosistolerantie. Ook zijn de eiwitten niet direct detecteerbaar, dus QD's zijn nodig om de eiwitten te visualiseren. De methode zou profiteren van kleinere labels. Een punt van discussie is of het goed of slecht is dat de ultrastructuur niet duidelijk zichtbaar is. Onze methode is vergelijkbaar met die van fluorescentie microscopie waar alleen geselecteerde eiwitten zichtbaar zijn37. Het vergroten van de zichtbaarheid van de ultrastructuur zou ook veel meer informatie toevoegen aan de afbeelding, en dan op een gegeven moment voorkomen dat detectie van de individuele label posities. Bovendien is de hier beschreven methode voor één eiwitsoort, en toevoegingen van het protocol zijn nodig om meerdere eiwitten te kunnen labelen. Ten slotte werkt de methode wanneer een kleine hoge affiniteit specifiek bindende molecuul zoals antilichaam mimetische21 of nanobody38 beschikbaar is. Veelgebruikte antilichamen zijn veel groter en zouden de detectie van de functionele toestand van de eiwitsubeenheden in oligomeren voorkomen.

Onze methode is nuttig voor het bestuderen van eiwitfunctie op hele cellen met behulp van EM terwijl de cellen in gehydrateerde toestand. Het is gemakkelijk mogelijk om reeksen cellen te onderzoeken. Andere soorten cellen en eiwitten kunnen ook worden bestudeerd. Als eiwitlabeling niet nodig is, kan een deelverzameling van het protocol worden gebruikt voor grafeencoating van grote verscheidenheid aan biologische specimens. De mogelijkheid om hele cellen te bestuderen is relevant in cellulair onderzoek voor het begrijpen van correlaties van membraaneiwitfunctie op moleculair niveau.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken D. B. Peckys voor hulp met het celcultuurprotocol, F. Weinberg voor het herzien van het manuscript, T. Trampert voor hulp met de experimenten en de cijfers, S. Smolka voor hulp met de cijfers, en E. Arzt voor zijn steun door INM. Dit onderzoek wordt gefinancierd door Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. The Transmission Electron Microscope. , Springer. (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , Jones and Barlett Publishers. (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , Springer. (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Tags

Biologie grafeen nanodeeltjes hele cel gehydrateerd scanning transmissie elektronenmicroscopie STEM membraaneiwitten stralingsschade
Grafeen behuizing van chemisch vaste zoogdiercellen voor vloeibare fase elektronenmicroscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N.… More

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter