Bidrag fra Na⁺/ K⁺ Pumpen til rytmisk sprængning, udforsket med modellering og dynamisk klemme analyser

Summary

Præsenteret her er en metode til undersøgelse af rollerne i Na⁺/ K⁺ pumpen og vedvarende Na⁺ strøm i igle hjerte interneurons ved hjælp af dynamisk klemme.

Abstract

Na⁺/K⁺ pumpen, ofte tænkt som en baggrundsfunktion i neuronal aktivitet, bidrager med en udadgående strøm (jeg_pumpe),der reagerer på den interne koncentration af Na⁺ ([Na⁺]_i). I sprængning neuroner, som dem, der findes i centrale mønster generator (CPG) neuronale netværk, der producerer rytmiske bevægelser, [Na⁺]_i og derfor I_pumpe, kan forventes at variere i hele burst cyklus. Denne reaktionsevne over for elektrisk aktivitet, kombineret med uafhængighed fra membran potentiale, begave jeg_pumpe med dynamiske egenskaber ikke fælles for kanalbaserede strømme (f.eks spænding- eller sender-gated eller lækage kanaler). Desuden er pumpens aktivitet i mange neuroner moduleret af en række modulatorer, hvilket yderligere udvider den potentielle rolle, som jeg_pumper i rytmisk sprængaktivitet. Dette papir viser, hvordan man bruger en kombination af modellering og dynamisk klemme metoder til at bestemme, hvordan jeg_pumpe og dens interaktion med vedvarende Na⁺ nuværende indflydelse rytmiske aktivitet i en CPG. Specifikt vil dette papir fokusere på en dynamisk klemme protokol og beregningsmæssige modellering metoder i hjertet interneurons af medicinske igler.

Introduction

Heartbeat i igler er drevet af en CPG bestående af 9 bilaterale par hjerte interneurons (HNs) fordelt på så mange mid-body segmentale ganglier. Kernen i CPG er gensidigt hæmmende par interneurons placeret i 3^rd og 4^th segmentale ganglier, der danner halv-center oscillatorer (HCOs) (Figur 1A). Disse neuroner fortsætter med at briste, når synaptisk isolerede farmakologisk ved hjælp af bikukulin¹. Andre, såsom parret i 7^th segmentale ganglier (fokus i denne protokol), er også bursters, i stand til at producere sprængning aktivitet, når synaptisk isoleret. De er ikke indbyrdes forbundne og modtager kun faldende input, og dermed er let isoleret ved at afskære ganglion fra resten af nerveledningen. Denne uafhængige sprængningsaktivitet er følsom over for indført lækagestrøm forårsaget af penetration med skarpe mikroelektroder til optagelse, men kraftigt bristet, når den registreres med løse patchmetoder¹.

Både individuelle HN neuroner og HN HCOs er blevet modelleret (Hodgkin-Huxley-baserede enkelt isopotential rum modeller af HN neuroner, der indeholder alle eksperimentelt identificeret spænding-gated og synaptiske strømme), og alle de bristede egenskaber af det levende system er blevet med succes fanget². Myomodulin, en endogen neuropeptid i igler, markant nedsætter perioden (T) af burst rytme isolerede HN neuroner og HN HCOs. Denne modulator virker til at øge h-strøm (hyperpolarisering-aktiveret indadgående strøm, jeg_h)og at mindske jeg_pumpe³. Denne observation førte til udforskning af, hvordan jeg_pumpe interagerer med I_h, og hvordan deres co-graduering bidrager til den rytmiske aktivitet af HN neuroner. Aktivering af pumpen ved at øge [Na⁺]_i (ved hjælp af ionophore monensin) hastigheder HN burst rytme i både HN HCOs og isolerede HN neuroner⁴. Denne fremskyndelse var afhængig af I_h. Da jeg_h blev blokeret (2 mM Cs⁺), blev burst periode ikke ændret ved denne metode til pump aktivering; bristeperioden (BD) blev dog begrænset, og pauseintervallet (IBI) steg i både HN HCOs og isolerede HN-neuroner⁴.

For denne protokol, alle strømme af en levende HN (7) neuron, herunder pumpen strøm, jeg_pumpe, er indarbejdet i HN model som følger:

(1)

hvor C er membranen kapacitans (i nF), V er membranpotentialet (i V), t er tid (i s). Detaljerede ioniske aktuelle beskrivelser og ligninger er blevet beskrevet andetsteds^2,4. Den komplette HN-model neuron kører i realtid (Figur 2). Softwaren vil blive gjort tilgængelig på GitHub ved offentliggørelse og vil være egnet til at køre på det digitale signalbehandlingsbræt, der er beskrevet i materialetabellen. Her er fokus for undersøgelsen er Na⁺/ K⁺ pumpestrøm(jeg_pumpe)og spænding-gated strømme bidrager betydelige Na⁺ flux: en hurtig Na⁺ strøm (I_Na) og en vedvarende Na⁺ strøm (I_P). De maksimale ledningsninger af disse strømme er henholdsvis. Na⁺/K⁺ pumpen udveksler tre intracellulære Na⁺ ioner for to ekstracellulære K⁺ ioner, hvilket producerer en nettoudstrøm. Vigtigere er det, det pumper 3 gange så meget Na⁺ ud af neuron som denne strøm indikerer, hvilket er vigtigt for beregning af intracellulære Na⁺ koncentration.

Na⁺/K⁺ pumpestrømmen afhænger af intracellulære Na⁺ koncentrationer og udtrykkes ved følgende sigmoidale funktion:

(2)

hvor [Na]_i er den intracellulære Na⁺ koncentration, er den maksimale Na⁺/ K⁺ pumpestrøm, [Na]_ih er den intracellulære Na⁺ koncentration for halvaktivering af Na⁺/ K⁺ pumpen, og [Na]_er følsomheden af Na⁺/ K⁺ pumpen til [Na]_i. [Na]_Jeg bygger som et resultat af Na⁺ tilstrømningen båret af I_P og I_Na og er formindsket af Na⁺ efflux af Na⁺/ K⁺ pumpen. Bidraget fra I_h og jeg_Leak til den samlede Na⁺ flux er lille og er ikke overvejet i realtid model.

(3)

hvor v er volumen (~ 6,7 pL) af intracellulære Na⁺ reservoir, F er Faraday's konstant, og den ekstracellulære Na⁺ koncentration holdes konstant.

Spændingsafledninger og lækageledninger er blevet differentieret - disse reagerer på membranpotentialet - fra pumpestrømmen, som reguleres af den beregnede intracellulære Na^{+-koncentration} ([Na⁺]_i). [Na⁺] _Jeg er bygget op gennem Na⁺ post via den hurtige Na⁺ strøm(I_Na),der producerer handling potentialer (pigge) og den vedvarende Na⁺ strøm(I_P),der giver depolarisering til støtte spiking. [Na⁺] _Jeg er igen reduceret ved virkningen af pumpen gennem ekstrudering af Na⁺. Baseline levende HN værdier af (5nS) og (150 nS) er blevet antaget, og vi tager hensyn til enhver ekstra dynamisk klemme .

Målet med den protokol, der er beskrevet her, er at manipulere jeg_pumpe præcist og reverably i realtid for at opdage, hvordan det interagerer med spænding-gated strømme (vedvarende Na⁺ strøm i den nuværende protokol) for at kontrollere rytmisk sprængning i enkelt HNs. For at nå dette mål blev dynamisk klemme brugt, som kunstigt introducerer, ved kommando, en præcis mængde af enhver strøm, der kan beregnes som modellen kører. Denne metode har fordele i forhold til farmakologisk manipulation af pumpen, som påvirker hele vævet, kan have off-target effekter, der ofte er svære at vende, og kan ikke manipuleres præcist. Dynamisk klemme^5,6 læser spændingen af en registreret neuron i realtid ( Figur1B) og beregner og injicerer i realtid mængden af enhver strøm baseret på model ligninger og de fastsatte værdier af en eller . Lignende metoder kan let anvendes på enhver neuron, der kan registreres intracellulært. Parametrene skal dog omskaleres til den valgte neuron, og neuronen skal isoleres fra synaptiske input, f.eks. farmakologisk.

Protocol

BEMÆRK: Hvirvelløse forsøgspersoner i dyr er ikke reguleret af NIH- eller Emory- og Georgia State Universities. Alle foranstaltninger blev ikke desto mindre truffet for at minimere lidelserne i de igler, der anvendes i dette arbejde.

1. Forbered isolerede ganglion 7 fra igle nerveledningen

1. Vedligehold igler Hirudo verbana i kunstigt damvand (indeholdende 0,05% w/v havsalt) fortyndet i de-ioniseret vand ved 16 °C på en 12:12 lys-mørk cyklus.
2. Forbered igler til dissektion ved koldbedøvelse dem i en seng af knust is i >10 min indtil immobile.
3. Fyld en sort, harpiks-foret dissekering parabol til en dybde på ~ 1 cm med kølet saltvand, der indeholder 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl_2,10 mM D-glukose, og 10 mM HEPES i de-ioniseret vand; pH justeret til 7,4 med 1 M NaOH. Fastgør igle dorsalsiden op i det sorte harpiksbelagte kammer (mindst 20 cm x 10 cm med en dybde på mindst 2 cm over harpiksen, der er mindst 2 cm tyk).
4. Under et steromicroskop ved 20x forstørrelse med skrå lyslederbelysning skal du lave et langsgående snit, der er mindst 3 cm langt med 5 mm fjedersaks gennem kropsvæggen i den rostral 1/3^rd del af kroppen. Brug stifter til at trække til side af kroppen væggen og udsætte de indre organer.
   BEMÆRK: Ethvert opbevaret blodmel kan fjernes ved sugning med en brandpoleret Pasteur-pipette.
5. Isoler en individuel mid-body ganglion 7 (syvende gratis segmental ganglion kaukasal til hjernen).
   1. Åbn sinus, hvor nerveledningen er placeret ved hjælp af 5 mm fjedersaks. Sørg for at dele sinus dorsally og ventrally forlader to strimler af sinus. Brug skarpe # 5 sammentrrampe til at hjælpe med at guide skæring og holde sinus.
   2. Hold sinus knyttet til hver af de to bilaterale nerve rødder, der kommer ud af ganglion (det klæber tæt til hver rod) for at bruge disse strimler af sinus for pinning ud ganglion.
   3. Fjern ganglionen fra kroppen ved at skære rostral og kaukasiske bindende nervebundter, der forbinder ganglieren (så langt fra den^7. ganglion som muligt) og sinusstrimlerne, og skær derefter rødderne sideværts til hvor de kommer ud af sinus.
6. Pin ganglion (ved hjælp af gamle afstumpede # 5 pinps) med forkortet minuten insekt stifter, ventral side op, i klar, harpiks foret Petri retter. Indsæt stifter i strimler af sinus og løs væv klæber til rødderne og rostral og kaukasiske bindestoffer, så langt fra ganglion som muligt.
   BEMÆRK: Harpiksen må ikke være tykkere end 3 mm, hvis der skal opnås god belysning nedefra under optagelsen. Sørg for, at ganglionen er stram, både langsgående og sideværts
7. Forøg forstørrelsen af stereomikroskopet til 40x eller større, og juster den skrå belysning, så neuronale cellelegemer let kan ses på ganglionens ventrale overflade lige under perineurium.
8. Fjern perineurium af ganglion (desheath) med microscissors.
   1. Start afsheathing ved at skære den løse kappe mellem rødderne på den ene side, og fortsæt snittet sideværts til den anden side, og sørg for at holde saksebladene overfladiske og ikke skade de neuronale cellelegemer direkte under kappen.
   2. Lav en lignende overfladisk snit caudally fra den laterale snit langs midterlinjen.
   3. Tag nu den caudolaterale klap af kappe på den ene side med de fine #5 sammentrækninger, træk den væk fra ganglionen, og skær den af med mikrosaksorerne.
   4. Gentag på den anden side; denne procedure udsætter både HN(7) neuroner til optagelse med mikroelektroder.
9. Anbring forberedelsesskålen i optagelsesopsætningen, og superfuse med saltvand med en strømningshastighed på 5 mL/min ved stuetemperatur.

2. Identificer og registrer iglehjerte interneuroner med skarpe mikroelektroder

1. For varigheden af optagelsen af HN(7) neuron (optagelser varer mellem 30 og 60 min), erhverve og digitalisere intracellulære strøm og spænding spor fra en neurofysiologisk elektrometer prøveudtagning med en hastighed på 5 kHz med en digital dataindsamling (Analog til Digital, A til D) og stimulation (Digital til Analog, D til A) system, og vises på en computerskærm.
   BEMÆRK: Enhver kommerciel eller specialbygget software og A til D /D til et bord kan bruges til dataindsamling (A til D). D til A og specialbygget software er påkrævet for dynamisk klemme.
2. Under et steromicroskop ved 50-100x med mørk feltbelysning nedefra identificerer forsøgsvis en HN(7) neuron af det bilaterale par ved dets kanoniske placering på den bageste position i midbody ganglion syv.
3. Nu har til formål at trænge ind i putative HN(7) neuron med en skarp mikroelektrode fyldt med 2 M kaliumacetat og 20 mM KCl ved hjælp af en mikromanipulator.
   1. Placer mikroelektroden meget tæt på målcellekroppen.
   2. Konstant observere det registrerede potentiale med elektrometeret, og sæt dette potentiale til nul mV, før du trænger ind i neuronen.
   3. Gennemtræng neuronen med mikroelektroden ved langsomt at køre elektroden langs sin lange akse med manipulatoren. Ved hjælp af elektrometer buzz-funktionen, indstillet til 100 ms buzz varighed, indtil et negativt skift i membranpotentialet og kraftig spiking aktivitet observeres.
4. Indstil elektrometeret i diskontinuerlig strømklemmetilstand (DCC) ≥ 3 kHz for samtidig at registrere membranpotentialet og passere strøm med den enkelte mikroelektrode (kapacitetskompensation indstillet til lige under ringen og derefter ringet 10 tilbage).
   1. Overvåg afregningen af elektroden under DCC på et oscilloskop.
   2. Indsprøjt en jævn strøm på -0,1 nA med elektrometeret stabil strøminjektor i et minut eller to for at stabilisere optagelsen.
5. Endeligt identificere HN(7) neuron ved sin karakteristiske spike form og svage sprængning aktivitet (Figur 1Ci).
6. Udfør enhver dataanalyse offline, når eksperimentet er fuldført, og gem alle data på en disk.

3. Byg en real-time HN eller en anden model neuron

1. Byg brugerdefineret software ved hjælp af et digitalt signalbehandlingsbræt (DSB; D til A og A til D) i en desk-top computer til at gennemføre i realtid modelstrømme beskrevet i^2,4 eller forskellige modelstrømme til andre neuroner eller eksperimenter.
   1. Brug Hodgkin-Huxley stil ligninger, da de er den generelt foretrukne metode til at repræsentere modelstrømme.
   2. Se⁷ for en detaljeret beskrivelse af implementeringen af realtids HN-modellen og den dynamiske klemme forud for tilsætning af pumpestrømmen. Se introduktionsafsnittet for beskrivelsen af strømme, intracellulær Na⁺ koncentration og ledningsføringer af den levende HN(7) neuron i HN-modellen.

4. Implementer og variere dynamiske klemmeledninger/strømme

1. Brug den specialbyggede dynamiske klemme software til DSB til at gennemføre og ændre i realtid dynamisk klemme nogen af de grafiske brugergrænseflade (Figur 3) (GUI)-tilgængelige, programmerede ledninger og strømme af HN real-time model af HN (7) neuron.
   BEMÆRK: Som en påmindelse, og er den maksimale ledning af den vedvarende Na⁺ strøm (I_P) og den maksimale pumpestrøm (jeg_pumpe),henholdsvis.
2. Brug GUI-indgangsbokse i softwaren til at foretage ændringer, som modellen kører, i boksen (PumpMaxL) og (GpinHNLive) (Figur 3).
   BEMÆRK: GUI-inputboksene accepterer indtastede værdier, og trin på 0,1 nA anbefales til, og trin på 1 nS anbefales til .
   1. Tilsæt små mængder af og med dynamisk klemme for at stabilisere sprængningen af HN(7) neuron, som svækkes af en mikroelektrode-induceret lækage, som vist i figur 1Cii.
      BEMÆRK: Skarp mikroelektrodeindtrængning forårsager membranskader, der udtrykkes som øget lækageledning eller nedsat inputmodstand.
   2. Start med at tilføje en værdi på 0,1-0,2 nA, som kompenserer for mikroelektrode-induceret lækage, men trykker ophidselse, og derefter gradvist øge , hvilket øger ophidselse, indtil regelmæssig sprængning ensues, normalt på ~ 1-4 nS (Figur 4A).
3. Systematisk co-variere disse strømme (trin på 0,1 nA for og 1 nS for) til den registrerede HN(7) neuron med dynamisk klemme (figur 3), og vurdere deres virkninger på burst egenskaber: spike frekvens (f: den gensidige af gennemsnittet af interspike interval under en burst), interburst interval (IBI: tiden mellem den sidste spike i en burst til den første spike i den næste burst), burst varighed (BD: tiden mellem den første spike i en burst og den sidste spike i en burst), og burst periode (T: tiden mellem den første spike i en burst og den første spike i den efterfølgende burst).
   1. Ændre værdierne af og – som i videodemonstrationen – for at blive fortrolig med teknikken og derefter vove sig ud.
      1. Hold fast værdi til en bestemt fast værdi, og fej i 1 nS-intervaller over en række understøttende regelmæssig sprængaktivitet.
      2. Nu øge den faste værdi af med 0,1 nA og igen feje over en række understøttende regelmæssig sprængning aktivitet.
      3. For hvert implementeret parameterpar skal du indsamle data, der indeholder mindst 8 udbrud, så der kan foretages pålidelige gennemsnitlige mål for f, IBI, BD og T.
      4. Fortsæt med sweeps, så længe neuronen forbliver levedygtig, som vurderet af stærk spiking og et stabilt baseline potentiale for svingning.
      5. Indsamle data fra flere neuroner (fra forskellige dyr) for at generere en sammensat graf (Figur 5).

Representative Results

Modellering med tilføjelsen af jeg_pumpe⁴ bragte de eksperimentelle resultater præsenteret i indledningen sektion i skarpere fokus og begyndte at forklare pumpe-assisteret mekanisme sprængning. Realtidsmodellen, der er demonstreret her, er blevet indstillet ( og valgte parametre), så den producerer regelmæssig rytmisk aktivitet, der falder inden for grænserne af normal aktivitet som observeret i eksperimenter - f, IBI, BD, T - og fortsætter med at producere en sådan aktivitet, når de myomodulinmodulin-modulerede parametre (den maksimale pumpestrøm) og (maksimal ledning af h-strøm) er varierede eller med varierede i modellen. De fastlagte parameterværdier kan bruges som benchmark eller kanonisk sæt til modelleringseksperimenter. I disse model tilfælde, _{jeg pumpe} svinger hele burst cyklus som [Na⁺]_i omkring en baseline niveau. Jeg_pumpe bidrager til burst opsigelse i løbet af burst fase, og hyperpolarization det producerer aktiverer I_h under IBI; mærke det maksimale niveau af I_h nær burst indledning (figur 2).

Selvom HN-modellen i realtid alle har implementeret strøm^2,4 til rådighed for dynamisk fastspænding, var fokus her på og , som er tilgængelige for ændringer, mens modellen kører i den dynamiske klemme GUI (Figur 3). Dynamisk klemme gør det muligt for eksperimentatoren at tilføje (eller trække med en negativ eller) enhver ledning eller strøm i en neuron kunstigt, der efterligner spændingen og ionisk afhængighed af en reel ledning eller strøm. Det er således muligt fuldt ud at undersøge, hvordan en bestemt ledning /strøm interagerer med de endogene ledningsninger / strømme inde i celler (Figur 1). Den real-time HN model viser, at den vedvarende Na⁺ strøm (I_P) i HN neuroner bidrager meget af Na⁺ indrejse stærkt påvirker [Na⁺]_i (Figur 2) og dermed, jeg_pumpe. Fordi I_P er aktiv på relativt negative membran potentialer, det modsætter jeg_pumpe selv under IBI.

Disse observationer tyder på, at det er lærerigt at udforske interaktioner mellem og i isolerede HN neuroner med dynamisk klemme som diskuteret tidligere^8,9,10. Disse eksperimenter (igangværende) udføres med skarpe mikroelektrodeoptagelser i enkelt, synaptisk isolerede HN(7) neuroner (syvende ganglion afskåret fra nerveledningen). Til dato viser disse eksperimenter, at robust sprængning genoprettes i tonisk aktive HN-neuroner (på grund af mikroelektrodeindtrængning indført lækage) ved co-tilføjelse af I_P og jeg_pumpe med dynamisk klemme (Figur 4). Dette er en vigtig observation, der indikerer, at en sprængningsmekanisme er tilgængelig i disse neuroner (selv når lækagen er kompromitteret), der skyldes samspillet mellem jeg_pumpe og jeg_P. Foreløbige resultater viser deres stærke komplicerede interaktion, som kan udforskes i modellen og eksperimenterne (Figur 5).

Afslutningsvis _pumper jeg som reaktion på periodiske stigninger i [Na⁺]_i under sprængning aktivitet bidrager til burst rytme gennem burst opsigelse (faldende BD). Samspillet mellem I_P og jeg_pumpe udgør en mekanisme, der er tilstrækkelig til at støtte endogene sprængning aktivitet; denne mekanisme kan genindføre robust sprængning i HN interneurons registreret intracellulært i ganglion 7. Samspillet mellem I_P og jeg_pumpe gennem [Na⁺]_jeg påvirker HN burst periode ikke-monotont og sikrer robusthed af autonome sprængning. Disse konklusioner er i overensstemmelse med eksperimenter og modellering i hvirveldyrsystemer^11,12.

Figur 1: Iglehjertet elektrisk aktivitet og implementering af I_pumpe og I_P med dynamisk klemme. (A) Normal sprængningsaktivitet registreres samtidig, ekstracellulært (øverst) og intracellulært (nederst), i et igleslag HCO fra en tredje ganglion, et skema over de registrerede neuroner og deres gensidigt hæmmende synaptiske forbindelser til højre. (B) Dynamisk klemme skematisk ved optagelse af en HN(7) interneuron i en isoleret ganglion 7; bemærk, at der ikke er nogen synaptisk interaktion mellem de to HN(7) interneuroner. (Ci) Sprængfyldt i en lækage-kompromitteret HN(7) interneuron. (Cii) Mere robust sprængning kan produceres ved at tilføje dynamisk klemme I_pumpe ( = 0,1 nA), som kompenserer for mikroelektrode induceret lækage, men depresser ophidselse, og (1 nS), hvilket øger ophidselse. Sorte stiplede linjer angiver oprindelige værdier. Forkortelser: HN = hjerte interneuron; HCO = halv-center oscillator; Jeg_pumper = udadgående strøm; I_P = vedvarende Na⁺ strøm; = maksimal Na⁺/K⁺ pumpestrøm; = maksimal ledning af den vedvarende Na⁺ strøm; Vm = membranpotentiale; [Na⁺] _i = intern koncentration af Na⁺. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Single HN interneuron model viser spor for membran potentiale (Vm), jeg _h, jeg_pumpe, [Na⁺]_i,og jeg_P. Udadgående hyperpolariserende strømme er negative, og indadgående depolariseringsstrømme er positive. Sorte stiplede linjer angiver oprindelige værdier. Forkortelser: HN = hjerte interneuron; Jeg_pumper = udadgående strøm; I_P = vedvarende Na⁺ strøm; = maksimal Na⁺/K⁺ pumpestrøm; I_h = hyperpolarisering-aktiveret indadgående strøm; = maksimal ledning af den vedvarende Na⁺ strøm; = maksimal ledning af hyperpolarisering-aktiveret indadgående strøm; Vm = membranpotentiale; [Na⁺] _i = intern koncentration af Na⁺. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Grafisk brugergrænseflade af real-time heart interneuron (HN) model og dynamisk klemme implementeret på et digitalt signalbehandling bord. Øverst til venstre: Røde matematiske bokse er brugerdekrerede parameterbokse til realtidsmodellen, mens Blue Live-bokse er brugerdekrerede parameterbokse, der bruges i den dynamiske klemme. El = lækagestrømmens tilbageførselspotentiale; Gl = lækageledning; Gh = h-aktuel maksimal ledning; Gp = P nuværende maksimal ledning; GCaS = langsom calciumstrøm maksimal ledningsenhed; PumpMax = pumpe maksimal strøm; [GSyn2 maksimal synaptisk ledningsevne til den respektive neuron; ThreshSyn2 spike passage tærskel for at mæstikning et synaptisk potentiale - disse bruges til at gøre en hybrid (levende / model) halv-center oscillator ikke illustreret her.]. Nederste venstre for dynamisk klemme. Til venstre er 5 beregnede værdier af dynamiske klemme variabler: Jeg_pumpe = pumpestrøm injiceret; Ih = h-strøm injiceret (ikke anvendes her); IP = P nuværende injiceret; NaI = beregnet intern Na⁺ koncentration; ENa = beregnet natrium tilbageførselspotentiale. Nederste venstre for dynamisk klemme. Til højre for de beregnede variabler er 6 bruger bestemt parameter kasser: GNa = antages endogene hurtig natrium maksimalledning brug til at beregne Na⁺ flux forbundet med handling potentialer; PumpMaxL = maksimal pumpestrøm, der skal injiceres af dynamisk klemme; Naih se ligning (2); Gh = maksimal ledningsevne til bestemmelse af h-strøm, der skal injiceres af dynamisk klemme; Gp = antaget endogene P nuværende maksimale ledningsbrug til at beregne Na⁺ flux forbundet med endogene P-strøm; GpinHNLive = maksimal ledningsevne til at bestemme P-strøm, der skal injiceres af dynamisk klemme. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Dynamisk klemmeanalyse af uafhængig HN(7) sprængning. Upregulering af fra (A) 4,0 nS til (B) 9,0 nS bremser den uafhængige HN burst rytme. Eksperimentelle spor viser rytmisk sprængning i isolerede HN(7) neuron med dynamisk klemme. Svingningerne i [Na⁺]_i og Vm øges med opregulerede . Spor fra top til bund: indspillet Vm, injiceres jeg_pumpe, beregnet [Na⁺]_i,og injiceres I_P. Sorte stiplede linjer angiver oprindelige værdier. Forkortelser: HN = hjerte interneuron; Jeg_pumper = udadgående strøm; I_P = vedvarende Na⁺ strøm; = maksimal Na⁺/K⁺ pumpestrøm; = maksimal ledning af den vedvarende Na⁺ strøm; Vm = membranpotentiale; [Na⁺] _i = intern koncentration af Na⁺. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Dynamisk klemmeanalyse af uafhængig HN(7) sprængning. Upregulation af tendens til at falde, efterfulgt af en øget HN burst periode. I individuelle eksperimenter (punkter forbundet med linjer) ved hjælp af dynamisk klemme, værdier blev fejet, mens blev holdt konstant. Farver repræsenterer forskellige konstante niveauer af tilføjet bruges i forskellige eksperimenter. Forkortelser: HN = hjerte interneuron; = maksimal Na⁺/K⁺ pumpestrøm; = maksimal ledning af den vedvarende Na⁺ strøm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Modellering, dynamisk klemme og de resulterende analyser, de muliggør, er nyttige teknikker til at undersøge, hvordan individ og grupper af ionisk ledning /strøm bidrager til neuronernes elektriske aktivitet (Figur 1, Figur 2,Figur 4og Figur 5). Brugen af disse teknikker viser, hvordan Na⁺/ K⁺ pumpestrøm(jeg_pumpe)interagerer med spænding-gated strømme, især den vedvarende Na⁺ strøm (I_P),at fremme robust sprængning i igle hjerteslag mønster generatorens kerne HNs. Ved at kombinere dynamiske klemmeforsøg og modellering er det muligt at teste modeller mere direkte end muligt med almindelig spændingsregistrering og strømklemmeteknikker. Resultaterne indsamlet fra de dynamiske klemmeforsøg (Figur 5) vil blive brugt til yderligere at forfine HN-modellen. Den grundlæggende metode til dynamisk fastspænding demonstreret her kan tilpasses til at afspejle egenskaberne af enhver neuron under undersøgelse, hvis en matematisk model af neuronale strømme kan bestemmes med spænding klemme eksperimenter.

Vellykket afslutning af eksperimenter af den type, der vises her, kræver omhyggelig impalementering af en HN eller anden neuron, når du bruger en skarp mikroelektrode, fordi stærk sprængning begrænses af elektrodeindtrængning¹. (Helcelle patch optagelse teknikker, som minimerer indført lækage, gælder også for andre neuroner, men fungerer ikke godt på igle neuroner.) Det er afgørende, at impalementering af HN neuron forårsager minimal skade på neuronen (tilsat lækage), og inputresistens skal overvåges og skal være i intervallet 60-100 MOhms for vellykkede eksperimenter⁴.

Dynamisk klemme er en kraftfuld teknik, men det har begrænsninger pålagt af neuronal geometri, fordi de kunstige ledningsninger er implementeret på stedet for optagelsen elektrode-normalt cellen kroppen-ikke på det sted, hvor rytme-genererende strømme er normalt lokaliseret^5,6,10. I igle HN neuroner, cellelegemet er elektrisk tæt på integration zone (vigtigste neurite) af neuron, hvor de fleste aktive strømme er lokaliseret, og pigge er indledt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl2	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection