Na +^{/ K +}Pumpens^{bidrag till} rytmisk sprängning, utforskad med modellering och dynamiska klämanalyser

Summary

Presenteras här är en metod för undersökning av rollerna för Na⁺/ K⁺ pump och ihållande Na⁺ ström i leech hjärta interneurons med hjälp av dynamisk klämma.

Abstract

Na⁺/ K⁺ pumpen, ofta tänkt som en bakgrundsfunktion i neuronal aktivitet, bidrar med en utåtström (jag_pump) som svarar på den inre koncentrationen av Na⁺ ([Na⁺]_i). I spruckna nervceller, som de som finns i centrala mönstergenerator (CPG) neuronala nätverk som producerar rytmiska rörelser, kan [Na⁺]_{i och} därför_I-pumpen, förväntas variera under hela sprängcykeln. Denna responsivitet för elektrisk aktivitet, i kombination med oberoende från membranpotential, ger jag pump med dynamiska egenskaper som inte är gemensamma för kanalbaserade strömmar (t.ex. spännings- eller sändar-gated eller läckagekanaler). Dessutom, i många nervceller, pumpens aktivitet moduleras av en mängd olika modulatorer, ytterligare utöka den potentiella rollen av jag_pump i rytmisk sprängning verksamhet. Detta dokument visar hur man använder en kombination av modellering och dynamiska klämmetoder för att bestämma hur jag_{pumpar och} dess interaktion med ihållande Na⁺ ström påverkar rytmisk aktivitet i en CPG. Specifikt kommer detta dokument att fokusera på ett dynamiskt klämprotokoll och beräkningsmodelleringsmetoder i hjärtpraktorer av medicinska leeches.

Introduction

Hjärtslag i leeches drivs av en CPG bestående av 9 bilaterala par hjärt interneurons (HNs) fördelade över så många mellankropps segmentala ganglier. Kärnan i CPG är ömsesidigt hämmande par interneuroner belägna i 3^rd och 4:^e segmentella ganglier som bildar halvcenter oscillatorer (HCOs) (Figur 1A). Dessa nervceller fortsätter att brista när synaptiskt isolerade farmakologiskt med bicuculline¹. Andra, som paret i den^{7: e} segmentella ganglierna (fokus för detta protokoll), är också bursters, som kan producera bursting aktivitet när synaptiskt isolerade. De är inte ömsesidigt anslutna och får endast fallande ingång, och isoleras därför lätt genom att bryta ganglionen från resten av nervsladden. Denna oberoende sprängningsaktivitet är känslig för införd läckageström orsakad av penetration med skarpa mikroelektroder för inspelning men spricker kraftigt när den registreras med lösa patchmetoder¹.

Både enskilda HN-nervceller och HN HCOs har modellerats (Hodgkin-Huxley-baserade enispotentialfackmodeller av HN-nervceller som innehåller alla experimentellt identifierade spännings-gated och synaptiska strömmar), och alla burst egenskaper i det levande systemet har framgångsrikt fångats². Myomodulin, en endogen neuropeptid i leeches, minskar markant perioden (T) av burst rytmen av isolerade HN nervceller och HN HCOs. Denna modulator verkar för att öka h-strömmen (hyperpolariseringsaktiverad inåtström, I_h) och för att minska_pumpen³. Denna observation ledde till utforskningen av hur_{jag pumpar} interagerar med I_h, och hur deras sammodulering bidrar till den rytmiska aktiviteten hos HN-neuroner. Aktivering av pumpen genom att öka [Na⁺]_i (med hjälp av jonofore monensin) påskyndar HN burst rytmen i både HN HCOs och isolerade HN nervceller⁴. Denna hastighet var beroende av I_h. När I_h blockerades (2 mM Cs⁺) ändrades inte burst-perioden med denna metod för pumpaktivering; Burst varaktigheten (BD) begränsades dock, och det interburst intervallet (IBI) ökade i både HN HCOs och isolerade HN nervceller⁴.

För detta protokoll införlivas alla strömmar av en levande HN(7) neuron, inklusive pumpströmmen, I_pump, i HN-modellen enligt följande:

(1)

där C är membrankeacitansen (i nF), är V membranpotentialen (i V), t är tid (i s). Detaljerade joniska aktuella beskrivningar och ekvationer har beskrivits någon annanstans^2,4. Den kompletta HN-modellen neuron körs i realtid (Figur 2). Programvaran kommer att göras tillgänglig på GitHub vid publicering och kommer att vara lämplig att köra på den digitala signalbehandlingstavlan som beskrivs i materialförteckningen. Här är fokus för förfrågan Na⁺/ K⁺ pumpströmmen ( jag pump )_ochde spänningsportade strömmarna som bidrar med betydande Na⁺ flöde: en snabb Na⁺ ström (I_Na) och en ihållande Na⁺ ström (I_P). De maximala ledningarna för dessa strömmar är respektive. Na⁺/ K⁺ pumpen byter tre intracellulära Na⁺ joner mot två extracellulära K⁺ joner, vilket ger en netto utåtström. Viktigt är att den pumpar 3 gånger så mycket Na⁺ ur neuron som denna ström indikerar, vilket är viktigt för att beräkna den intracellulära Na^{+ koncentrationen.}

Pumpströmmen Na^{+/K +} beror på intracellulära Na⁺ koncentrationer och uttrycks med följande sigmoidala funktion:

(2)

där [Na]_{i är den} intracellulära Na⁺ koncentrationen, är den maximala Na⁺/ K⁺ pumpströmmen, [Na]_{ih är den} intracellulära Na⁺ koncentrationen för halvaktivering av Na⁺/ K⁺ pumpen, och [Na]_är känsligheten hos Na⁺/ K⁺ _{pumpen till}[Na] i. [Na]_jag bygger som ett resultat av Na⁺ tillströmningar som bärs av I_P och I_Na och minskas av Na⁺ efflux av Na⁺/ K⁺ pumpen. Bidraget från I_h och I_Leak till det totala Na⁺ flödet är litet och beaktas inte i realtidsmodellen.

(3)

där v är volymen (~6,7 pL) av den intracellulära Na⁺ behållaren, F är Faradays konstant och den extracellulära Na⁺ koncentrationen hålls konstant.

Spännings-gated och läckageledning har differentierats-dessa svarar till membranpotential - från pumpaströmmen, som regleras av den beräknade intracellulära Na⁺ koncentrationen ([Na⁺]_i). [Na⁺] _Jag är uppbyggd via Na⁺ post via den snabba Na⁺ ström (I_Na) som producerar åtgärdspotentialer (spikar) och den beständiga Na⁺ ström (I_P) som ger depolarisering för att stödja spikning. [Na⁺] _Jag reduceras i sin tur av pumpens verkan genom extruderingen av Na⁺. Baslinje levande HN-värden på (5nS) och (150 nS) har antagits, och vi tar hänsyn till eventuella extra dynamiska klämmor .

Målet med protokollet som beskrivs här är att manipulera jag_{pumpar exakt} och reversibelt i realtid för att upptäcka hur det interagerar med spännings-gated strömmar (ihållande Na⁺ ström i det nuvarande protokollet) för att styra rytmisk sprängning i enstaka HNs. För att uppnå detta mål användes dynamisk klämma, som artificiellt introducerar, efter kommando, en exakt mängd av alla strömmar som kan beräknas när modellen körs. Denna metod har fördelar jämfört med farmakologisk manipulering av pumpen, som påverkar hela vävnaden, kan ha off-target effekter som ofta är svåra att vända, och kan inte manipuleras exakt. Dynamisk^{klämma 5,6} läser spänningen hos en inspelad neuron i realtid ( Figur1B) och beräknar och injicerar i realtid mängden ström baserat på modellekvationer och de inställda värdena för någon eller . Liknande metoder kan enkelt tillämpas på alla neuroner som kan registreras intracellulärt. Parametrar måste dock omskalas till den valda neuron, och neuron bör isoleras från synaptiska ingångar, t.ex. farmakologiskt.

Protocol

OBS: Försökspersoner för ryggradslösa djur regleras inte av NIH eller Emory och Georgia State Universities. Alla åtgärder vidtogs ändå för att minimera lidandet för de leeches som används i detta arbete.

1. Förbered isolerad ganglion 7 från leech nervkabeln

1. Håll leeches Hirudo verbana i konstgjorda dammvatten (som innehåller 0,05% w/v havssalt) utspädda i avjoniserat vatten vid 16 °C på en 12:12 ljus-mörk cykel.
2. Förbered leechesna för dissekering genom att kallbedöva dem i en bädd av krossad is i >10 min tills de är orörliga.
3. Fyll en svart, hartsfodrad dissekeringsform till ett djup av ~ 1 cm med kyld saltlösning som innehåller 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl_2,10 mM D-glukos och 10 mM HEPES i avjoniserat vatten; pH justerat till 7,4 med 1 M NaOH. Fäst leech dorsalsidan upp i den svarta hartsfodrade kammaren (minst 20 cm x 10 cm med ett djup av minst 2 cm över hartset som är minst 2 cm tjockt).
4. Under ett steromicroscope vid 20x förstoring med sned ljusstyrningsbelysning, gör ett längsgående snitt minst 3 cm långt med 5 mm fjädersax genom kroppsväggen i rostral 1/3^{rd del} av kroppen. Använd stift för att dra åt sidan kroppsväggen och exponera de inre organen.
   OBS: Eventuell lagrad blodmjöl kan avlägsnas genom sugning med en brandpolerad Pasteur-pipett.
5. Isolera en individuell mid-body ganglion 7 (sjunde fria segmental ganglion caudal till hjärnan).
   1. Öppna sinusen där nervsladden finns med hjälp av 5 mm fjädersaxen. Var noga med att dela sinus dorsally och ventrally lämnar två remsor av sinus. Använd vassa #5 tångar för att styra skärningen och hålla sinusen.
   2. Håll sinusen fäst vid var och en av de två bilaterala nervrötterna som kommer ut ur ganglionen (den klibbar tätt på varje rot) för att använda dessa sinusremsor för att fästa ut ganglionen.
   3. Ta bort ganglionen från kroppen genom att skära rostrala och kaudala bindvävsbuntar som länkar ganglierna (så långt från den^{7: e} ganglionen som möjligt) och sinusremsorna och skär sedan rötterna i sidled till där de kommer ut ur sinusen.
6. Fäst ganglionen (med gamla trubbiga #5 tångar) med förkortade minuten insektsstift, ventral sida upp, i klar, hartsfodrad Petri disk. Sätt in stift i remsorna av sinus och lös vävnad som följer rötterna och rostrala och kaudala bindningar, så långt från ganglion som möjligt.
   OBS: Hartset får inte vara tjockare än 3 mm om god belysning underifrån ska uppnås under inspelningen. Se till att ganglionen är spänd, både längsgående och i lydnad
7. Öka förstoringen av stereomikroskopet till 40x eller mer och justera den sneda belysningen så att neuronala cellkroppar lätt kan ses på ganglions ventrala yta strax under perineuriumet.
8. Ta bort ganglionens perineurium (desheath) med mikroscissorer.
   1. Börja desheathing genom att skära den lösa manten mellan rötterna på ena sidan och fortsätt snittet i sidled till andra sidan, se till att hålla saxbladen ytliga och inte skada neuronala cellkroppar direkt under manttan.
   2. Gör ett liknande ytligt snitt kaudally från sidosnittet längs mittlinjen.
   3. Ta nu tag i mantelklaffen på ena sidan med de fina #5 tångarna, dra den bort från ganglionen och skär av den med mikrostärarna.
   4. Upprepa på andra sidan; denna procedur exponerar både HN(7) nervceller för registrering med mikroelektroder.
9. Placera beredningsskålen i inspelningsinställningarna och superfuse med saltlösning med en flödeshastighet på 5 ml/min vid rumstemperatur.

2. Identifiera och registrera leech hjärta interneurons med skarpa mikroelektroder

1. Under registreringen av HN(7) neuron (inspelningar varar mellan 30 och 60 min), förvärva och digitalisera intracellulära ström- och spänningsspår från ett neurofysiologisk elektrometerprovtagning med en hastighet av 5 kHz med ett digitalt datainsamlingssystem (analogt med digitalt, A till D) och stimuleringssystem (Digital to Analog, D till A). och visas på en datorskärm.
   OBS: All kommersiell eller specialbyggd programvara och A till D/D till A-bräda kan användas för datainsamling (A till D). D till A och specialbyggd programvara krävs för dynamisk klämma.
2. Under ett steromicroscope vid 50-100x med mörk fältbelysning underifrån, preliminärt identifiera en HN(7) neuron av bilaterala paret genom dess kanoniska plats på den posteriolateral positionen i midbody ganglion sju.
3. Sikta nu på att penetrera den förmodade HN(7) neuron med en skarp mikroelektrod fylld med 2 M kaliumacetat och 20 mM KCl med en mikromanipulator.
   1. Placera mikroelektroden mycket nära målcellskroppen.
   2. Observera kontinuerligt den registrerade potentialen med elektrometern och ställ in denna potential på noll mV innan du tränger in i neuron.
   3. Penetrera neuronen med mikroelektroden genom att långsamt driva elektroden längs sin långa axel med manipulatorn. Använd elektrometerns buzzfunktion, inställd på 100 ms buzz varaktighet, tills en negativ förändring i membranpotential och kraftig spikning aktivitet observeras.
4. Ställ in elektrometern i diskontinuerligt strömklämmaläge (DCC) ≥ 3 kHz för att samtidigt registrera membranpotentialen och passera strömmen med den enda mikroelektroden (kapacitetskompensation inställd på strax under ringsignalen och sedan uppringd tillbaka 10%).
   1. Övervaka elektrodens sedimentering under DCC på ett oscilloskop.
   2. Injicera en jämn ström på -0,1 nA med elektrometerns stadiga ströminjektor i en minut eller två för att stabilisera inspelningen.
5. Slutgiltigt identifiera HN(7) neuron genom sin karakteristiska spik form och svag sprängning aktivitet (Figur 1Ci).
6. Utför alla data analyser offline när experimentet är slutfört och spara alla data på en disk.

3. Bygg en HN i realtid eller en annan modellneuron

1. Skapa anpassad programvara med hjälp av ett digitalt signalbehandlingskort (DSB; D till A och A till D) i en skrivbordsdator för att i realtid implementera de modellströmmar som beskrivs^{i 2,4} eller olika modellströmmar för andra neuroner eller experiment.
   1. Använd ekvationer med Hodgkin-Huxley-stil eftersom de är den metod som föredras generellt för att representera modellströmmar.
   2. Se⁷ för en detaljerad beskrivning av implementeringen av HN-modellen i realtid och den dynamiska klämman innan pumpströmmen tillförs. Se introduktionsavsnittet för beskrivning av strömmar, intracellulär Na⁺ koncentration och ledning av levande HN(7) neuron i HN-modellen.

4. Implementera och variera dynamiska klämlednings-/strömmar

1. Använd den specialbyggda dynamiska klämprogramvaran för DSB för att implementera och ändra den dynamiska klämman i realtid i något av det grafiska användargränssnittet(figur 3)(GUI)-tillgängliga, programmerade ledningar och strömmar i HN:s realtidsmodell för HN(7) neuron.
   OBS: Som en påminnelse, och är den maximala ledningsförmågan hos den beständiga Na⁺ strömmen (I_P) respektive den maximala pumpströmmen (jag_pump), respektive.
2. Använd GUI-inmatningsrutor i programvaran för att göra ändringar, när modellen körs, i rutan (PumpMaxL) och (GpinHNLive-rutan) (bild 3).
   OBS: GUI-inmatningsrutorna accepterar maskinskrivna värden och steg på 0,1 nA rekommenderas för och steg om 1 nS rekommenderas för .
   1. Tillsätt små mängder och med dynamisk klämma för att stabilisera sprängningen av HN(7) neuron, som försvagas av en mikroelektrodinducerad läcka, som visas i figur 1Cii.
      OBS: Kraftig mikroelektrodpenetration orsakar membranskador som uttrycks som ökad läckageledningsförmåga eller minskad ingångsbeständighet.
   2. Börja med att lägga till ett värde på 0,1-0,2 nA, vilket kompenserar för den mikroelektrode-inducerade läckan, men deprimerar excitabiliteten och ökar sedan gradvis , vilket ökar excitabiliteten, tills regelbunden sprickning följer, vanligtvis vid ~ 1-4 nS (Figur 4A).
3. Systematiskt sam-variera dessa strömmar (steg om 0,1 nA för och 1 nS för ) till den registrerade HN(7) neuron med dynamisk klämma (figur 3), och bedöma deras effekter på burst egenskaper: spikfrekvens (f: reciprocal av genomsnittet av interspike intervallet under en burst), interburst intervall (IBI: tiden mellan den sista spiken i en sprängning till den första spiken i nästa burst), burst-varaktighet (BD: tiden mellan den första spiken i en burst och den sista spiken i en burst) och burst-period (T: tiden mellan den första spiken i en burst och den första spiken i den efterföljande burst).
   1. Ändra värdena för och , som i videodemonstrationen, för att bekanta dig med tekniken och sedan våga dig ut.
      1. Håll vid ett visst fast värde och svep i steg om 1 nS över en rad olika stöd för regelbunden sprängningsaktivitet.
      2. Öka nu det fasta värdet på 0,1 nA och svep igen över en rad stödjande regelbunden sprängningsaktivitet.
      3. För varje implementerat parameterpar samlar du in data som innehåller minst 8 bursts så att tillförlitliga genomsnittliga mått på f, IBI, BD och T kan göras.
      4. Fortsätt med svep så länge neuron förblir livskraftig, vilket bedöms genom stark spikning och en stabil baslinjepotential för svängning.
      5. Samla in data från flera nervceller (från olika djur) för att generera ett sammansatt diagram (figur 5).

Representative Results

Modellering med tillägg av I_pump⁴ förde de experimentella resultaten som presenteras i introduktionsavsnittet i skarpare fokus och började förklara den pumpassisterade mekanismen för sprängning. Realtidsmodellen som demonstreras här har justerats ( och valda parametrar) så att den producerar regelbunden rytmisk aktivitet som faller inom gränserna för normal aktivitet som observerats i experiment - f, IBI, BD, T - och fortsätter att producera sådan aktivitet när myomodulinmodulerade parametrar (maximal pumpström) och (maximal ledning av h-ström) varieras eller samväxlas i modellen. De fastställda parametervärdena kan användas som riktmärke eller kanonisk uppsättning för modelleringsexperiment. I dessa modell fall pumpar_jag svänger under hela burst cykeln som [Na⁺]_{i runt en} baslinjenivå. Jag_pumpar bidrar till sprängning under sprängningsfasen, och hyperpolariseringen den producerar aktiverar I_h under IBI; observera den maximala nivån av I_{h nära} sprängstart ( figur2).

Även om HN-modellen i realtid alla har implementerade strömmar^2,4 tillgängliga för^dynamisk fastspänning, låg fokus här på och , som är tillgängliga för ändringar medan modellen körs i det dynamiska kläm-GUI (Figur 3). Dynamisk klämma gör det möjligt för experimenteraren att lägga till (eller subtrahera med en negativ eller ) ledningsförmåga eller ström i en neuron artificiellt som efterliknar spänningen och jonberoendet av en verklig ledning eller ström. Det är således möjligt att fullt ut undersöka hur en viss ledning/ström interagerar med de endogena ledningarna/strömmarna inuti cellerna (figur 1). HN-modellen i realtid indikerar att den ihållande Na⁺ strömmen (I_P) i HN-neuroner bidrar med mycket av Na⁺ -posten som starkt påverkar [Na⁺]_i (Figur 2) och därmed _{pumpar jag}. Eftersom I_P är aktiv vid relativt negativa membranpotentialer motsätter det sig att jag_pumpar även under IBI.

Dessa observationer indikerar att det är lärorikt att utforska interaktioner mellan och i isolerade HN-nervceller med dynamisk klämma som diskuterats^{tidigare 8,9,10}. Dessa experiment (pågående) utförs med skarpa mikroelektrodinspelningar i enstaka, synaptiskt isolerade HN(7) nervceller (sjunde ganglion avskurna från nervsladden). Hittills visar dessa experiment att robust sprängning återställs i toniskt aktiva HN-nervceller (på grund av mikroelektrodpenetration introducerad läcka) genom samsyrening av I_P- och_I-pump med dynamisk klämma (figur 4). Detta är en viktig observation som indikerar att en sprängmekanism finns i dessa nervceller (även när läckan äventyras) som är resultatet av interaktionen mellan_I-pump och I_P. Preliminära resultat visar deras starka komplicerade interaktion, som kan utforskas i modellen och experimenten (figur 5).

Sammanfattningsvis pumpar_jag som svar på periodiska ökningar i [Na⁺] i under burstaktivitet_{bidrar till} burst rytmen genom burst avslutning (minskande BD). Interaktionen mellan I_{P och} I pump _utgör en mekanism som är tillräcklig för att stödja endogen sprängning aktivitet; denna mekanism kan återinföra robust sprängning i HN interneurons registreras intracellulärt i ganglion 7. Interaktionen mellan I_P och I_pumpar igenom [Na⁺]_{i påverkar} HN burst-perioden icke-monotont och säkerställer robustheten hos autonom sprängning. Dessa slutsatser är i linje med experiment och modellering i ryggradssystem^11,12.

Bild 1:Leech heart interneuron elektrisk aktivitet och implementering av I_pump och I_P med dynamisk klämma. (A) Normal sprängning aktivitet samtidigt inspelad, extracellulärt (överst) och intracellulärt (botten), i en leech hjärtslag HCO från en tredje ganglion, en schematisk av de registrerade nervcellerna och deras ömsesidigt hämmande synaptiska anslutningar till höger. B)Dynamisk klämschema vid inspelning av en HN(7) interneuron i en isolerad ganglion 7. observera att det inte finns någon synaptisk interaktion mellan de två HN(7) interneuronerna. C i) Iartikel 3.1 skall jag haför Spränger i en läcka-komprometterad HN(7) interneuron. C ii) Iartikel 3.2 i dettadirektivskall Mer robust sprängning kan produceras genom att tillsätta dynamisk klämma _I-pump ( = 0,1 nA), vilket kompenserar för den mikroelektrodinducerade läckan, men deprimerar excitabiliteten och (1 nS), vilket ökar excitabiliteten. Svarta streckade linjer anger baslinjevärden. Förkortningar: HN = hjärtpraktik; HCO = halvcenter oscillator; Jag_pumpar = utåtström; I_P = ihållande Na⁺ ström; = maximal Na⁺/ K⁺ pumpström; = maximal ledning av den ihållande Na^{+ strömmen;} Vm = membranpotential; [Na⁺] _i = intern koncentration av Na⁺. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 2:En HN-interneuronmodell som visar spår för membranpotential (VM), I_h, jag_pumpar, [Na⁺]_i, och I_P. Utåtriktade hyperpolariserande strömmar är negativa och inåtpolariserande strömmar är positiva. Svarta streckade linjer anger baslinjevärden. Förkortningar: HN = hjärtpraktik; Jag_pumpar = utåtström; I_P = ihållande Na⁺ ström; = maximal Na⁺/ K⁺ pumpström; I_h = hyperpolariseringsaktiverad inåtström; = maximal ledning av den ihållande Na^{+ strömmen;} = maximal ledning av den hyperpolariseringsaktiverade inåtströmmen; Vm = membranpotential; [Na⁺] _i = intern koncentration av Na⁺. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 3:Grafiskt användargränssnitt för HN-modellen (Real-Time Heart Interneuron) och den dynamiska klämman implementerad på ett digitalt signalbehandlingskort. Övre vänstra: Röda matematiska rutor är användarbestämda parameterrutor för realtidsmodellen, medan Blue Live-rutor är användarbestämda parameterrutor som används i den dynamiska klämman. El = läckageströmmens återföringspotential. Gl = läckageledning; Gh = h-aktuell maximal ledning; Gp = P aktuell maximal ledning; GCaS = långsam kalciumström maximal ledning; PumpMax = pump maximal ström; [GSyn2 maximal synaptisk ledningsförmåga till respektive neuron; Trösksyn2 spikkorsningströskel för medling av en synaptisk potential - dessa används för att göra en hybrid (levande / modell) halvcenter oscillator illustreras inte här.]. Nedre vänstra för dynamisk klämma. Längst till vänster finns 5 beräknade värden för dynamiska klämvariabler: I_pump = pumpström injicerad; Ih = h-ström injicerad (används inte här); IP = P-ström injicerad; NaI = beräknad intern Na^{+ koncentration;} ENa = beräknad natriumåterföringspotential. Nedre vänstra för dynamisk klämma. Till höger om de beräknade variablerna finns 6 användarbestämda parameterrutor: GNa = förmodad endogen snabb natrium maximal ledningsanvändning för att beräkna Na⁺ flöde som är associerat med åtgärdspotentialer; PumpMaxL = maximal pumpström som ska injiceras med dynamisk klämma; Naih se ekvation (2); Gh = maximal ledningsförmåga för att bestämma h-ström som ska injiceras med dynamisk klämma; Gp = förmodad endogen P ström maximal ledningsanvändning för att beräkna Na⁺ flöde i samband med endogen P ström; GpinHNLive = maximal ledningsförmåga för att bestämma P-ström som ska injiceras med dynamisk klämma. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4:Dynamisk klämanalys av oberoende HN(7) sprängning. Uppreglering av från (A) 4,0 nS till (B) 9,0 nS saktar ner den oberoende HN burst rytmen. Experimentella spår visar rytmiska sprängning i isolerade HN(7) neuron med dynamisk klämma. Svängningsintervallen för [Na⁺]_{i och} VM ökar med uppreglerad . Spår uppifrån och ner: inspelat VM, injicerat_pumparjag , beräknat [Na⁺]_i, och injicerat I_P. Svarta streckade linjer anger baslinjevärden. Förkortningar: HN = hjärtpraktik; Jag_pumpar = utåtström; I_P = ihållande Na⁺ ström; = maximal Na⁺/ K⁺ pumpström; = maximal ledning av den ihållande Na^{+ strömmen;} Vm = membranpotential; [Na⁺] _i = intern koncentration av Na⁺. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 5:Dynamisk klämanalys av oberoende HN(7) sprängning. Uppreglering av tenderar att minska, följt av en ökad HN burst period. I enskilda experiment (punkter som är sammankopplade med linjer) med hjälp av dynamisk klämma sveptes värdena medan de hölls konstanta. Färger representerar olika konstanta nivåer av tillagd som används i olika experiment. Förkortningar: HN = hjärtpraktik; = maximal Na⁺/ K⁺ pumpström; = maximal ledning av den beständiga Na^{+ strömmen.} Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Modellering, dynamisk klämma och de resulterande analyser som de möjliggör är användbara tekniker för att utforska hur individer och grupper av jonisk ledning/strömmar bidrar till neuroners elektriska aktivitet(figur 1, figur 2,figur 4och figur 5). Användningen av dessa tekniker visar hur Na⁺/ K⁺ pumpströmmen ( jag pump )_interagerarmed spänningsgrindade strömmar, särskilt den ihållande Na⁺ strömmen (I_P), för att främja robust sprängning i leech heartbeat mönster generatorns kärna HNs. Genom att kombinera dynamiska klämexperiment och modellering är det möjligt att testa modeller mer direkt än vad som är möjligt med vanlig spänningsregistrering och strömklämmatekniker. Resultaten från de dynamiska klämexperimenten (figur 5) kommer att användas för att ytterligare förfina HN-modellen. Den grundläggande metoden för dynamisk fastspänning som demonstreras här kan anpassas för att återspegla egenskaperna hos alla neuroner som studeras om en matematisk modell av neuronala strömmar kan bestämmas med spänningsklämmorexperiment.

Framgångsrikt slutförande av experiment av den typ som visas här kräver noggrann impalement av en HN eller annan neuron när man använder en skarp mikroelektrod, eftersom stark sprängning begränsas av elektrodpenetration¹. (Helcelliga patchinspelningstekniker, som minimerar införd läcka, är också tillämpliga på andra nervceller, men fungerar inte bra på leechneuroner.) Det är viktigt att impalementen av HN-neuron orsakar minimal skada på neuron (extra läcka), och ingångsmotstånd bör övervakas och måste vara i intervallet 60-100 MOhms för framgångsrika experiment⁴.

Dynamisk klämma är en kraftfull teknik, men den har begränsningar som införts av neuronal geometri eftersom de konstgjorda ledningarna implementeras på platsen för inspelningselektroden - vanligtvis cellkroppen - inte på den plats där rytmgenererande strömmar vanligtvis är^{lokaliserade 5,6,10}. I leech HN-nervceller är cellkroppen elektriskt nära integrationszonen (huvud neuriten) i neuron där de flesta aktiva strömmar är lokaliserade och spikar initieras.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl2	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection