Bidrag fra Na⁺/ K⁺ pumpen til rytmisk sprengning, utforsket med modellering og dynamiske klemmeanalyser

Summary

Presentert her er en metode for undersøkelse av rollene til Na⁺/ K⁺ pumpen og vedvarende Na⁺ strøm i leech heart internurons ved hjelp av dynamisk klemme.

Abstract

Na⁺/ K⁺ pumpen, ofte sett på som en bakgrunnsfunksjon i nevronaktivitet, bidrar med en utoverstrøm (_I-pumpe) som reagerer på den indre konsentrasjonen av Na⁺ ([Na⁺]_i). I sprengende nevroner, som de som finnes i sentrale mønstergenerator (CPG) nevronnettverk som produserer rytmiske bevegelser, kan [Na⁺]_i og derfor _I-pumpen forventes å variere gjennom hele burst-syklusen. Denne responsen på elektrisk aktivitet, kombinert med uavhengighet fra membranpotensial, gir jeg_pumpe med dynamiske egenskaper som ikke er felles for kanalbaserte strømmer (f.eks. spennings- eller senderporterte eller lekkasjekanaler). Videre, i mange nevroner, er pumpens aktivitet modulert av en rekke modulatorer, og utvider ytterligere den potensielle rollen til jeg_pumper i rytmisk sprengningsaktivitet. Dette dokumentet viser hvordan du bruker en kombinasjon av modellering og dynamiske klemmemetoder for å bestemme hvordan jeg_pumper og samspillet med vedvarende Na⁺ strøm påvirker rytmisk aktivitet i en CPG. Spesielt vil dette papiret fokusere på en dynamisk klemmeprotokoll og beregningsmodelleringsmetoder i hjertet internurons av medisinske leeches.

Introduction

Hjerterytme i leeches er drevet av en CPG bestående av 9 bilaterale par hjerte internurons (HNs) fordelt på så mange mid-body segmental ganglia. Kjernen i CPG er gjensidig hemmende par interneuroner som ligger i 3^rd og^{4 th} segmental ganglia som danner halv-center oscillatorer (HCOer) (Figur 1A). Disse nevronene fortsetter å briste når synaptisk isolert farmakologisk ved hjelp av bicuculline¹. Andre, som paret i det^7. segmentelle gangliaet (fokuset i denne protokollen), er også burstere, som er i stand til å produsere sprengningsaktivitet når synaptisk isolert. De er ikke gjensidig forbundet og mottar bare synkende inngang, og er dermed lett isolert ved å kutte ganglion fra resten av nerveledningen. Denne uavhengige sprengningsaktiviteten er følsom for introdusert lekkasjestrøm forårsaket av penetrasjon med skarpe mikroelektroder for opptak, men kraftig brister når den registreres med løse patchmetoder¹.

Både individuelle HN-nevroner og HN HCOer har blitt modellert (Hodgkin-Huxley-baserte enkeltispotentielle rommodeller av HN-nevroner som inneholder alle eksperimentelt identifiserte spenningsporterte og synaptiske strømmer), og alle burstegenskapene til det levende systemet har blitt vellykket fanget². Myomodulin, et endogent nevropeptid i leeches, reduserer markant perioden (T) av burst rytmen til isolerte HN-nevroner og HN HCOer. Denne modulatoren virker for å øke h-strømmen (hyperpolariseringsaktivert innadstrøm, I_h) og for å redusere _I-pumpen³. Denne observasjonen førte til utforskning av hvordan jeg_pumper samhandler med I_h, og hvordan deres medmodulering bidrar til rytmisk aktivitet av HN-nevroner. Aktivering av pumpen ved å øke [Na⁺]_i (ved hjelp av ionoformonensin) øker hastigheten på HN-bristerytmen i både HN HCO-er og isolerte HN-nevroner⁴. Denne hastigheten var avhengig av I_h. Når jeg_h ble blokkert (2 mM Cs⁺), ble ikke sprengningsperioden endret av denne metoden for pumpeaktivering; Imidlertid ble burst-varigheten (BD) begrenset, og interburstintervallet (IBI) økte i både HN HCOer og isolerte HN-nevroner⁴.

For denne protokollen er alle strømmene til en levende HN (7) neuron, inkludert pumpestrømmen, _I-pumpen, innlemmet i HN-modellen som følger:

(1)

der C er membran kapasitansen (i nF), V er membranpotensialet (i V), t er tid (i s). Detaljerte ioniske strømbeskrivelser og ligninger er beskrevet andre steder^2,4. Den komplette HN-modellen neuron kjører i sanntid (Figur 2). Programvaren vil bli gjort tilgjengelig på GitHub ved publisering og vil være egnet til å kjøre på det digitale signalbehandlingskortet som er beskrevet i Materialfortegnelsen. Her er fokuset på henvendelse Na⁺/ K⁺ pumpestrøm (_I-pumpe) og spenningsportede strømmer som bidrar til betydelig Na⁺ flux: en rask Na⁺ strøm (I_Na) og en vedvarende Na⁺ strøm (I_P). De maksimale ledningene til disse strømmene er henholdsvis. Na⁺/ K⁺ pumpen bytter tre intracellulære Na⁺ ioner for to ekstracellulære K⁺ ioner, og produserer dermed en netto utoverstrøm. Viktigst, det pumper 3 ganger så mye Na⁺ ut av nevronen som denne strømmen indikerer, noe som er viktig for å beregne den intracellulære Na⁺ konsentrasjonen.

Na⁺/ K⁺ pumpestrømmen avhenger av intracellulære Na⁺ konsentrasjoner og uttrykkes av følgende sigmoidal funksjon:

(2)

der [Na]_i er den intracellulære Na⁺ konsentrasjonen, er maksimal Na⁺/ K⁺ pumpestrøm, [Na]_ih er den intracellulære Na⁺ konsentrasjonen for halvaktivering av Na⁺/ K⁺ pumpen, og [Na]_er følsomheten til Na⁺/ K⁺ pumpen til [Na]_i. [Na]_jeg bygger som et resultat av Na⁺ tilstrømninger båret av I_P og I_Na og er redusert av Na⁺ efflux av Na⁺/ K⁺ pumpen. Bidraget fra I_h og I_Leak til den totale Na⁺ flux er liten og vurderes ikke i sanntidsmodellen.

(3)

hvor, v er volumet (~ 6,7 pL) av det intracellulære Na⁺ reservoaret, F er Faradays konstant, og den ekstracellulære Na⁺ konsentrasjonen holdes konstant.

Spennings-gated og lekkasjeledninger har blitt differensiert -disse reagerer på membranpotensial - fra pumpestrømmen, som reguleres av den beregnede intracellulære Na⁺ konsentrasjonen ([Na⁺]_i). [Na⁺] _Jeg er bygget opp gjennom Na⁺ oppføring via den raske Na⁺ strøm (I_Na) som produserer handlingspotensialer (pigger) og vedvarende Na⁺ strøm (I_P) som gir depolarization å støtte spiking. [Na⁺] _Jeg er i sin tur redusert av pumpens virkning gjennom ekstrudering av Na⁺. Baseline levende HN-verdier på (5nS) og (150 nS) er antatt, og vi tar hensyn til eventuelle ekstra dynamiske klemmer .

Målet med protokollen som er beskrevet her er å manipulere jeg_pumpe nøyaktig og reversibelt i sanntid for å oppdage hvordan den samhandler med spenningsportert strøm (vedvarende Na⁺ strøm i den nåværende protokollen) for å kontrollere rytmisk sprengning i enkelt HN-er. For å oppnå dette målet ble dynamisk klemme brukt, som kunstig introduserer, ved kommando, en presis mengde av enhver strøm som kan beregnes når modellen kjører. Denne metoden har fordeler i forhold til farmakologisk manipulering av pumpen, som påvirker hele vevet, kan ha off-target effekter som ofte er vanskelig å reversere, og kan ikke nøyaktig manipuleres. Dynamisk klemme^5,6 leser spenningen til en registrert nevron i sanntid ( Figur1B) og beregner og injiserer i sanntid mengden av enhver strøm basert på modellligninger og de angitte verdiene til noen eller . Lignende metoder kan lett brukes på alle nevroner som kan registreres intracellulært. Imidlertid må parametrene om skaleres til den valgte nevronen, og nevronen skal isoleres fra synaptiske innganger, for eksempel farmakologisk.

Protocol

MERK: Virvelløse dyr eksperimentelle er ikke regulert av NIH eller Emory og Georgia State Universities. Alle tiltak ble likevel tatt for å minimere lidelsen til leeches som brukes i dette arbeidet.

1. Forbered isolert ganglion 7 fra leech nerve ledning

1. Vedlikehold leeches Hirudo verbana i kunstig damvann (inneholder 0,05% m/v havsalt) fortynnet i avionisert vann ved 16 °C på en 12:12 lys-mørk syklus.
2. Forbered leeches for disseksjon ved å kaldbedøvelse dem i en seng av knust is i >10 min til immobile.
3. Fyll en svart, harpiksforet dissekeringsfat til en dybde på ~ 1 cm med kjølt saltvann som inneholder 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl₂, 10 mM D-glukose og 10 mM HEPES i deionisert vann; pH justert til 7,4 med 1 M NaOH. Fest leech dorsalsiden opp i det svarte harpiksforede kammeret (minst 20 cm x 10 cm med en dybde på minst 2 cm over harpiksen som er minst 2 cm tykk).
4. Under et steromikroskop ved 20x forstørrelse med skrå lyslederbelysning, gjør en langsgående kutt minst 3 cm lang med 5 mm vårsaks gjennom kroppsveggen i rostral 1/3^rd delen av kroppen. Bruk pinner til å trekke til side kroppsveggen og eksponere de indre organene.
   MERK: Ethvert lagret blodmåltid kan fjernes ved sug med en brannpolert Pasteur pipette.
5. Isoler en individuell midtkropps ganglion 7 (syvende fri segmentell ganglion caudal til hjernen).
   1. Åpne bihulen der nerveledningen ligger ved hjelp av 5 mm vårsaksen. Pass på å dele sinus dorsally og ventrally forlate to strimler av sinus. Bruk skarpe #5 tang for å hjelpe til med å lede kuttingen og holde sinusen.
   2. Hold bihulen festet til hver av de to bilaterale nerverøttene som kommer ut av ganglion (den holder seg tett til hver rot) for å bruke disse stripene av sinus for å feste ganglionen.
   3. Fjern ganglion fra kroppen ved å kutte rostral og kaudale bindende nervebunter som forbinder ganglia (så langt fra den^7. ganglion som mulig) og sinusstrimlene, og klipp deretter røttene lateral til hvor de kommer ut av bihulen.
6. Fest ganglion (ved hjelp av gamle stumpe # 5 tang) med forkortede minuten insektpinner, ventral side opp, i klar, harpiksforet Petri-retter. Sett pinner i strimlene av sinus og løs vev som holder seg til røttene og rostral- og kaudale bindemidler, så langt fra ganglion som mulig.
   MERK: Harpiksen må ikke være tykkere enn 3 mm hvis god belysning nedenfra skal oppnås under opptak. Pass på at ganglion er stram, både langsgående og lateralt
7. Øk forstørrelsen av stereomikroskopet til 40x eller større, og juster den skrå belysningen slik at nevroncellelegemene lett kan ses på ganglionens ventrale overflate like under perineuriumet.
8. Fjern perineurium av ganglion (desheath) med mikroscissorer.
   1. Start desheathing ved å kutte den løse hylsen mellom røttene på den ene siden, og fortsett kuttet sidelengs til den andre siden, sørg for å holde saksebladene overfladiske og ikke skade nevroncellelegemene rett under hylsen.
   2. Lag et lignende overfladisk kutt årsaksmessig fra sidesnittet langs midtlinjen.
   3. Ta nå tak i den kaudolaterale klaffen av hylse på den ene siden med de fine # 5 tangene, trekk den bort fra ganglion, og kutt den av med mikroscissorene.
   4. Gjenta på den andre siden; Denne prosedyren eksponerer både HN(7) nevroner for opptak med mikroelektroder.
9. Plasser tilberedningsfatet i opptaksoppsettet, og superfuse med saltvann med en strømningshastighet på 5 ml / min ved romtemperatur.

2. Identifiser og registrer leech heart internurons med skarpe mikroelektroder

1. I løpet av registreringen av HN(7) nevron (opptak varer mellom 30 og 60 min), anskaffe og digitalisere intracellulær strøm og spenning spor fra en nevrofysiologisk elektrometer sampling med en hastighet på 5 kHz med en digital datainnsamling (Analog til Digital, A til D) og stimulering (Digital til Analog, D til A) system, og vises på en dataskjerm.
   MERK: All kommersiell eller spesialbygd programvare og A til D/D til A-kort kan brukes til datainnsamling (A til D). D til A og spesialbygd programvare kreves for dynamisk klemme.
2. Under et steromikroskop på 50-100x med mørkt feltbelysning nedenfra, identifiserer foreløpig en HN(7) neuron av det bilaterale paret ved sin kanoniske plassering i den bakre posisjonen i midbody ganglion syv.
3. Nå tar sikte på å trenge inn i den putative HN (7) nevronen med en skarp mikroelektrode fylt med 2 M kaliumacetat og 20 mM KCl ved hjelp av en mikromanipulator.
   1. Plasser mikroelektroden svært nær målcellekroppen.
   2. Følg kontinuerlig det registrerte potensialet med elektrometeret, og sett dette potensialet til null mV før du trenger inn i nevronen.
   3. Penetrer nevronen med mikroelektroden, ved å sakte kjøre elektroden langs sin lange akse med manipulatoren. Bruk elektrometer buzz-funksjonen, sett til 100 ms buzz varighet, til et negativt skifte i membranpotensial og kraftig spiking aktivitet observeres.
4. Sett elektrometeret i diskontinuerlig strømklemmemodus (DCC) ≥ 3 kHz for samtidig å registrere membranpotensial og passere strøm med den enkle mikroelektroden (kapasitetskompensasjon satt til like under ringing og deretter ringt tilbake 10%).
   1. Overvåk sedimenteringen av elektroden under DCC på et oscilloskop.
   2. Injiser en jevn strøm på -0,1 nA med elektrometerets stødige strøminjektor i et minutt eller to for å stabilisere opptaket.
5. Identifiser definitivt HN(7)-nevronen ved sin karakteristiske piggform og svake sprengningsaktivitet (Figur 1Ci).
6. Utfør en dataanalyse frakoblet etter at eksperimentet er fullført, og lagre alle dataene på en disk.

3. Bygg en sanntids HN eller en annen modell neuron

1. Bygg tilpasset programvare ved hjelp av et digitalt signalbehandlingskort (DSB; D til A og A til D) i en datamaskin på skrivebordet for å implementere modellstrømmene beskrevet i^{sanntid 2,4} eller forskjellige modellstrømmer for andre nevroner eller eksperimenter.
   1. Bruk Hodgkin-Huxley-stilligninger, da de er den generelt foretrukne metoden for å representere modellstrømmer.
   2. Se⁷ for en detaljert beskrivelse av implementeringen av sanntids HN-modellen og dynamisk klemme før tilsetning av pumpestrømmen. Se introduksjonsdelen for beskrivelse av strømmene, intracellulær Na⁺ konsentrasjon og ledningsevner av den levende HN (7) nevronen i HN-modellen.

4. Implementere og variere dynamiske klemmeledninger /strømmer

1. Bruk den spesialbygde dynamiske klemmeprogramvaren for DSB til å implementere og endre dynamisk klemme i sanntid hvilket som helst av de grafiske brukergrensesnittene (Figur 3) (GUI)-tilgjengelige, programmerte ledninger og strømmer av HN-sanntidsmodellen til HN(7)-nevronen.
   MERK: Som en påminnelse, og er maksimal ledning av den vedvarende Na ⁺ strøm (I_P) og maksimal pumpestrøm (I_pumpe), henholdsvis.
2. Bruk GUI-inngangsbokser i programvaren til å gjøre endringer, mens modellen kjører, i (PumpMaxL -boksen) og (GpinHNLive -boksen) (Figur 3).
   MERK: GUI-inndataboksene godtar inntastede verdier, og trinn på 0,1 nA anbefales for , og trinn på 1 nS anbefales for .
   1. Tilsett små mengder og med dynamisk klemme for å stabilisere sprengning av HN(7) nevronen, som svekkes av en mikroelektrodindusert lekkasje, som vist i figur 1Cii.
      MERK: Skarp mikroelektrod penetrasjon forårsaker membranskader som uttrykkes som økt lekkasjeledning eller redusert inngangsmotstand.
   2. Begynn med å legge til en verdi på 0,1-0,2 nA, som gjør opp for den mikroelektrodinduserte lekkasjen, men deprimerer spenning, og deretter gradvis øker , noe som øker spenning, til regelmessig sprengning følger, vanligvis ved ~ 1-4 nS (Figur 4A).
3. Systematisk samgrader disse strømmene (trinn på 0,1 nA for og 1 nS for ) til den registrerte HN(7) nevronen med dynamisk klemme (figur 3), og vurder effektene på bristeegenskaper: spikefrekvens (f: resiprokal av gjennomsnittet av interspikeintervallet under et utbrudd), interburstintervall (IBI: tiden mellom den siste toppen i ett briste til den første spissen i neste utbrudd), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste spissen i ett briste til den første spissen i neste utbrudd), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste spissen i ett briste til den første spissen i neste utbrudd), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste piggen i ett briste til den første spissen i neste utbrudd), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste piggen i ett briste til den første spissen i neste brist), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste piggen i ett briste til den første spissen i neste utbrudd), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste piggen i en briste til den første spissen i neste brist), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste piggen i en briste til den første spissen i neste brist), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste piggen i en briste til den første spissen i neste brist), interburst intervall (IBI: tiden mellom den siste piggen burst varighet (BD: tiden mellom den første spissen i en brist og den siste spissen i en burst), og burst periode (T: tiden mellom den første spissen i en brist og den første spissen i den påfølgende bristen).
   1. Endre verdiene for og , som i videodemonstrasjonen, for å bli kjent med teknikken og deretter dra ut.
      1. Hold fast ved en bestemt fast verdi og sveip i trinn på 1 nS over en rekke vanlige bursting-aktiviteter.
      2. Nå øke den faste verdien av med 0.1 nA og igjen feie over en rekke støtte regelmessig sprengningsaktivitet.
      3. For hvert implementerte parameterpar samler du inn data som inneholder minst 8 serier, slik at pålitelige gjennomsnittlige mål på f, IBI, BD og T kan gjøres.
      4. Fortsett med feier så lenge nevronen forblir levedyktig, som vurdert av sterk spiking og et stabilt baselinepotensial for oscillasjon.
      5. Samle inn data fra flere nevroner (fra forskjellige dyr) for å generere en sammensatt graf (Figur 5).

Representative Results

Modellering med tillegg av _I-pumpe⁴ brakte de eksperimentelle funnene som ble presentert i introduksjonsdelen i skarpere fokus og begynte å forklare den pumpeassisterte mekanismen for sprengning. Sanntidsmodellen som er demonstrert her har blitt justert (og parametere valgt) slik at den produserer regelmessig rytmisk aktivitet som faller innenfor grensene for normal aktivitet som observert i eksperimenter - f, IBI, BD, T - og fortsetter å produsere slik aktivitet når myomodulinmodulerte parametere (maksimal pumpestrøm) og (maksimal ledning av h-strøm) er varierte eller varierte i modellen. Parameterverdiene som bestemmes, kan brukes som et benchmark- eller kanonisk sett for modelleringseksperimenter. I disse modelltilfellene _pumper jeg svinger gjennom hele burst-syklusen som [Na⁺]_i rundt et basislinjenivå. Jeg_pumper bidrar til bristeavslutning i burst-fasen, og hyperpolariseringen den produserer aktiverer I_h under IBI; legg merke til det maksimale nivået av I_h nær burst initiering (Figur 2).

Selv om sanntids HN-modellen alle har implementert strøm^2,4 tilgjengelig for dynamisk klemming, var fokuset her på og , som er tilgjengelige for endringer mens modellen kjører i den dynamiske klemmen GUI ( Figur3). Dynamisk klemme gjør det mulig for eksperimentet å legge til (eller trekke fra med en negativ eller ) enhver ledning eller strøm i en nevron kunstig som etterligner spenningen og ionavhengigheten til en reell ledning eller strøm. Dermed er det mulig å utforske fullt ut hvordan en bestemt ledning / strøm samhandler med endogene ledninger / strømmer inne i celler (figur 1). Sanntids HN-modellen indikerer at den vedvarende Na⁺ strømmen (I_P) i HN-nevroner bidrar til mye av Na⁺ -oppføringen som sterkt påvirker [Na⁺]_i (Figur 2) og dermed _pumperjeg. Fordi I_P er aktiv ved relativt negative membranpotensialer, motsetter den seg at jeg_pumper selv under IBI.

Disse observasjonene indikerer at det er lærerikt å utforske interaksjoner mellom og i isolerte HN-nevroner med dynamisk klemme som diskutert tidligere^8,9,10. Disse eksperimentene (pågående) utføres med skarpe mikroelektrodeopptak i enkle, synaptisk isolerte HN(7) nevroner (syvende ganglion avskåret fra nerveledningen). Til dags dato viser disse eksperimentene at robust sprengning gjenopprettes i tonisk aktive HN-nevroner (på grunn av mikroelektrod penetrasjon introdusert lekkasje) ved samtidig tilsetning av I_P og jeg_pumper med dynamisk klemme (Figur 4). Dette er en viktig observasjon som indikerer at en sprengningsmekanisme er tilgjengelig i disse nevronene (selv når lekkasje er kompromittert) som skyldes samspillet mellom _I-pumpen og I_P. Foreløpige resultater indikerer deres sterke kompliserte interaksjon, som kan utforskes i modellen og eksperimenter (Figur 5).

Til slutt _pumper jeg som svar på periodiske økninger i [Na⁺]_i under sprengningsaktivitet bidrar til bristerytmen gjennom burst-terminering (avtagende BD). Samspillet mellom I_P og I_pumpe utgjør en mekanisme som er tilstrekkelig til å støtte endogen sprengningsaktivitet; denne mekanismen kan gjeninnføre robust sprengning i HN internurons registrert intracellulært i ganglion 7. Samspillet mellom I_P og jeg_pumper gjennom [Na⁺]_i påvirker HN-bristeperioden ikke-monotont og sikrer robusthet av autonom sprengning. Disse konklusjonene er i tråd med eksperimenter og modellering i virveldyrsystemer^11,12.

Figur 1: Leech heart internuron elektrisk aktivitet og implementering av I_pumpe og I_P med dynamisk klemme. (A) Normal sprengningsaktivitet samtidig registrert, ekstracellulært (topp) og intracellulært (bunn), i en leech heartbeat HCO fra en tredje ganglion, et skjematisk av de registrerte nevronene og deres gjensidig hemmende synaptiske forbindelser til høyre. (B) Dynamisk klemmeskjema når du registrerer en HN(7) internuron i en isolert ganglion 7; vær oppmerksom på at det ikke er noen synaptisk interaksjon mellom de to HN(7) internuronene. (Ci) Sprengning i en lekkasje-kompromittert HN(7) internuron. (Cii) Mer robust sprengning kan produseres ved å legge til dynamisk klemme _I-pumpe ( = 0,1 nA), som gjør opp for den mikroelektrodinduserte lekkasjen, men deprimerer spenning og (1 nS), noe som øker spenningsevnen. Svarte stiplede linjer angir grunnlinjeverdier. Forkortelser: HN = hjerte internuron; HCO = halv-senter oscillator; Jeg_pumper = utover strøm; I_P = vedvarende Na⁺ strøm; = maksimal Na⁺/ K⁺ pumpestrøm; = maksimal ledning av den vedvarende Na⁺ strømmen; Vm = membranpotensial; [Na⁺] _i = intern konsentrasjon av Na⁺. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Enkelt HN internuron modell som viser spor for membranpotensial (Vm), jeg _h, jeg_pumper, [Na⁺]_iog I_P. Hyperpolariseringsstrømmer utover er negative, og depolariserende strømmer innover er positive. Svarte stiplede linjer angir grunnlinjeverdier. Forkortelser: HN = hjerte internuron; Jeg_pumper = utover strøm; I_P = vedvarende Na⁺ strøm; = maksimal Na⁺/ K⁺ pumpestrøm; I_h = hyperpolariseringsaktivert innadstrøm; = maksimal ledning av den vedvarende Na⁺ strømmen; = maksimal ledning av hyperpolariseringsaktivert innadstrøm; Vm = membranpotensial; [Na⁺] _i = intern konsentrasjon av Na⁺. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Grafisk brukergrensesnitt for HN-modell (heart interneuron) i sanntid og dynamisk klemme implementert på et digitalt signalbehandlingskort. Øverst til venstre: Røde matematiske bokser er brukerbestemte parameterbokser for sanntidsmodellen, mens Blue Live-bokser er brukerbestemte parameterbokser som brukes i den dynamiske klemmen. El = reverseringspotensialet til lekkasjestrømmen; Gl = lekkasjeledning; Gh = h-current maksimal ledning; Gp = P nåværende maksimal ledning; GCaS = langsom kalsiumstrøm maksimal ledning; PumpMax = pumpe maksimal strøm; [GSyn2 maksimal synaptisk ledningsevne til den respektive nevronen; ThreshSyn2 spike crossing threshold for mediating a synaptic potential - disse brukes til å lage en hybrid (levende / modell) halvsenter oscillator ikke illustrert her.]. Nederst til venstre for dynamisk klemme. Helt til venstre er 5 beregnede verdier av dynamiske klemmevariabler: I_pumpe = pumpestrøm injisert; Ih = h-strøm injisert (ikke brukt her); IP = P strøm injisert; NaI = beregnet intern Na⁺ konsentrasjon; ENa = beregnet natrium reverseringspotensial. Nederst til venstre for dynamisk klemme. Til høyre for de beregnede variablene er 6 brukerbestemte parameterbokser: GNa = antatt endogen rask natriummaksimal ledningsbruk for å beregne Na⁺ flux forbundet med handlingspotensialer; PumpMaxL = maksimal pumpestrøm som skal injiseres ved dynamisk klemme; Naih se ligning (2); Gh = maksimal ledningsevne for å bestemme h-strømmen som skal injiseres av dynamisk klemme; Gp = antatt endogen P strøm maksimal ledningsbruk for å beregne Na⁺ flux forbundet med endogen P-strøm; GpinHNLive = maksimal ledning for å bestemme P-strømmen som skal injiseres med dynamisk klemme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Dynamisk klemmeanalyse av uavhengig HN(7)-sprengning. Oppregulering av fra (A) 4,0 nS til (B) 9,0 nS bremser den uavhengige HN-rytmen. Eksperimentelle spor viser rytmisk sprengning i isolert HN(7) neuron med dynamisk klemme. Områdene oscillasjon av [Na⁺]_i og VM øker med upregulert . Spor fra topp til bunn: innspilt VM, injisert I_pumpe, beregnet [Na⁺]_i, og injisert I_P. Svarte stiplede linjer angir grunnlinjeverdier. Forkortelser: HN = hjerte internuron; Jeg_pumper = utover strøm; I_P = vedvarende Na⁺ strøm; = maksimal Na⁺/ K⁺ pumpestrøm; = maksimal ledning av den vedvarende Na⁺ strømmen; Vm = membranpotensial; [Na⁺] _i = intern konsentrasjon av Na⁺. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Dynamisk klemmeanalyse av uavhengig HN(7) sprengning. Oppregulering av tendenser til å avta, etterfulgt av en økt HN-utbruddsperiode. I individuelle eksperimenter (punkter forbundet med linjer) ved hjelp av dynamisk klemme ble verdier feid mens de ble holdt konstant. Farger representerer forskjellige konstante nivåer av lagt til som brukes i forskjellige eksperimenter. Forkortelser: HN = hjerte internuron; = maksimal Na⁺/ K⁺ pumpestrøm; = maksimal ledning av den vedvarende Na⁺ strømmen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Modellering, dynamisk klemme og de resulterende analysene de muliggjør, er nyttige teknikker for å utforske hvordan individuelle og grupper av ionisk ledning / strømmer bidrar til nevroners elektriske aktivitet (Figur 1, Figur 2,Figur 4og Figur 5). Bruken av disse teknikkene viser hvordan Na⁺/ K⁺ pumpestrømmen (_I-pumpen) samhandler med spenningsportdstrømmer, spesielt den vedvarende Na⁺ strømmen (I_P), for å fremme robust sprengning i leech heartbeat mønster generatorens kjerne HN-er. Ved å kombinere dynamiske klemmeforsøk og modellering er det mulig å teste modeller mer direkte enn det som er mulig med vanlig spenningsopptak og strømklemmeteknikker. Resultatene samlet fra de dynamiske klemmeforsøkene (figur 5) vil bli brukt til å videreutvikle HN-modellen. Den grunnleggende metoden for dynamisk klemming demonstrert her kan tilpasses for å gjenspeile egenskapene til enhver nevron som studeres hvis en matematisk modell av nevronstrømmer kan bestemmes med spenningsklemmeforsøk.

Vellykket fullføring av forsøkene av typen som vises her krever forsiktig impalement av en HN eller annen nevron når du bruker en skarp mikroelektrorode, fordi sterk sprengning begrenses av elektrodeinntrengning¹. (Helcellede patchopptaksteknikker, som minimerer introdusert lekkasje, gjelder også for andre nevroner, men fungerer ikke bra på leech-nevroner.) Det er kritisk at impalement av HN-nevronen forårsaker minimal skade på nevronen (ekstra lekkasje), og inngangsmotstand bør overvåkes og må være i området 60-100 MOhms for vellykkede eksperimenter⁴.

Dynamisk klemme er en kraftig teknikk, men den har begrensninger pålagt av nevronal geometri fordi de kunstige ledningene er implementert på stedet for opptakselektroden- vanligvis cellen kroppen - ikke på stedet der rytmegenererende strømmer vanligvis er lokalisert^5,6,10. I leech HN-nevroner er cellekroppen elektrisk nær integrasjonssonen (hoved neuritt) av nevronen der de fleste aktive strømmer er lokalisert, og pigger initieres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl2	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection