Summary
L’interférence de l’ARN est une technique puissante et largement applicable pour manipuler l’expression des gènes à des stades de développement spécifiques. Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour mettre en œuvre cette technique dans le coléoptère de plongée aquatique Thermonectus marmoratus, de l’acquisition de séquences génétiques à l’effondrement des gènes qui affectent la structure ou le comportement.
Abstract
L’interférence de l’ARN (RNAi) reste une technique puissante qui permet la réduction ciblée de l’expression génique par la dégradation de l’ARNm. Cette technique s’applique à une grande variété d’organismes et est très efficace dans l’ordre riche en espèces Coleoptera (coléoptères). Ici, nous résumons les étapes nécessaires pour développer cette technique dans un organisme nouveau et illustrons son application aux différents stades de développement du coléoptère de plongée aquatique Thermonectus marmoratus. Les séquences de gènes cibles peuvent être obtenues de manière rentable grâce à l’assemblage de transcriptomes contre un proche parent atteint de génomique connue ou de novo. Le clonage génétique des candidats utilise un vecteur de clonage spécifique (le plasmide pCR4-TOPO), qui permet la synthèse de l’ARN à double brin (arne) pour n’importe quel gène ayant l’utilisation d’une amorce commune unique. Le dsRNA synthétisé peut être injecté dans des embryons pour des processus de développement précoces ou des larves pour des processus de développement ultérieurs. Nous illustrons ensuite comment l’ARNI peut être injecté dans les larves aquatiques en utilisant l’immobilisation dans l’agarose. Pour démontrer la technique, nous fournissons plusieurs exemples d’expériences RNAi, générant des knockdowns spécifiques avec des phénotypes prévus. Plus précisément, l’ARNI pour le gène de bronzage laccase2 conduit à l’éclaircie de cuticule dans les larves et les adultes, et l’ARNI pour le gène de pigmentation des yeux blanc produit un éclaircissement / manque de pigmentation dans les tubes oculaires. En outre, l’élimination d’une protéine de lentille clé conduit à des larves avec des déficiences optiques et une capacité réduite de chasser les proies. Combinés, ces résultats illustrent la puissance de l’ARNI comme un outil pour étudier à la fois les modèles morphologiques et les traits comportementaux dans les organismes avec seulement des bases de données transcriptomiques.
Introduction
La question de savoir comment des gènes spécifiques contribuent à l’évolution de divers traits est un sujet passionnant en biologie. Au cours des dernières décennies, beaucoup de progrès ont été réalisés en ce qui concerne la dissection des fondements génétiques des processus de développement dans quelques organismes modèles, tels que le nématode Caenorhabditis elegans, la mouche des fruits Drosophila melanogaster, et la souris maison Mus musculus1. Plus récemment, l’invention de puissantes techniques d’édition génétique telles que les répétitions palindromiques courtes régulièrement intercalées (CRISPR)/Cas92 ont permis de modifier le code génétique des organismes non modèles (pour des exemples tels que3,4). En conséquence, il y a eu une augmentation des études génétiques sur une variété d’organismes qui n’avaient pas été approchés auparavant par des techniques moléculaires. Compte tenu de l’énorme diversité de notre règne animal, avec de nombreux traits intéressants ou des écarts de traits qui ne sont représentés que dans des espèces spécifiques, ce progrès en a fait une période passionnante pour la biologie évolutionnaire-développementale (« evo-devo ») travaux connexes. Cependant, les techniques d’édition du génome qui sont disponibles pour les organismes non modèles sont relativement limitées en ce qui concerne les points de temps de développement auxquels elles peuvent être appliquées, ce qui rend difficile de discerner les propriétés temporelles liées au rôle que jouent des gènes spécifiques dans n’importe quel trait. En outre, les techniques transgéniques sont souvent limitées aux gènes qui ne sont pas essentiels à la survie (c.-à-d. dont l’élimination n’entraîne pas de létalité). Par conséquent, bien que les techniques d’édition génétique aient commencé à devenir populaires, il reste nécessaire de techniques efficaces qui s’appliquent à une variété d’organismes différents à des moments de développement spécifiques et facilitent les renversements partiels (plutôt que la perte complète de la fonction). Ici, nous attirons l’attention sur l’interférence de l’ARN (RNAi), une technique de knockdown génétique quelque peu datée mais puissante5 qui est particulièrement précieuse comme approche synergique de l’édition génétique. Plus précisément, nous avons mis au point des procédures qui permettent l’application de l’ARN aux coléoptères aquatiques de plongée à titre d’exemple qui illustre la mise en œuvre de cette technique, de l’acquisition des séquences moléculaires nécessaires à l’injection réussie d’ARN à double brin (ARN) dans les œufs et les larves.
Le knockdown de gène basé sur l’RNAi tire parti d’un mécanisme de défense inné des organismes, dans lequel les molécules dsRNA facilitent le silence des séquences d’acide nucléique envahissante, telles que les virus et les transposons6. En bref, dsRNA est pris dans la cellule, où il est coupé en 20–25 morceaux de nucléotides par l’enzyme Dicer. Ces pièces activent ensuite la formation du complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), qui inhibe l’ARNm ciblé en le liant à des sites spécifiques à l’aide du brin de guidage. Ce processus conduit finalement à la dégradation de l’ARNm et interfère donc avec la traduction de l’ARNm dans la protéine respective6. La technique de knockdown génétique basée sur l’ARNI présentée ici repose donc sur l’injection de dsRNA. Pour les modèles animaux, cette technique a été développée à l’origine dans C. elegans7 et D. melanogaster8, mais a depuis émergé comme un puissant outil génétique fonctionnel dans les organismes non modèles9,10. En raison de sa nature très efficace chez certains insectes, l’ARNI peut même être appliqué dans la lutte antiparasitaire11.
En tant qu’outil de recherche, l’ARNi a été utilisé pour examiner comment les voies moléculaires et développementales clés fonctionnent dans les modèles d’insectes non traditionnels. Par exemple, l’ARNI chez le coléoptère de la farine Tribolium castaneum a joué un rôle déterminant dans la façon dont les gènes profondément conservés contribuent à des traits spécifiques dans ce coléoptère, comme en témoigne le développement d’ailes spécifiquement formées12,13,14 et les yeux15,16. Les techniques qui sous-tendent les manipulations dans T. castaneum ont été bien décrites17 et reposent sur la capacité d’immobiliser les œufs et les larves relativement secs sur une surface collante. Une telle immobilisation n’est toutefois pas possible pour les formes de développement humides d’organismes aquatiques tels que le Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Comme c’est le cas pour de nombreux organismes modèles non traditionnels, il manque un génome annoté. Manipuler l’expression des gènes dans n’importe quel organisme sans génome, une première étape raisonnable et rentable consiste à générer des transcriptomes et à identifier les séquences putatives de nucléotides des gènes d’intérêt exprimés en fonction de la similitude de séquence avec des organismes modèles connexes mais plus établis, dans ce cas, principalement le Tribolium (Coleoptera) et les gènes de la Drosophila.
Ici, pour démontrer comment l’ARNI peut être utilisé sur un organisme aquatique, nous discutons d’abord des protocoles et des logiciels pour l’extraction de l’ARN et la génération de transcriptome et l’assemblage, qui permettent l’identification de séquences génétiques ciblées spécifiques. Nous résumons ensuite les étapes nécessaires à la synthèse de l’ARN d spécifique aux gènes. Par la suite, nous illustrons comment les œufs peuvent être injectés dans un environnement aquatique et démontrons des protocoles d’incubation pour la culture d’embryons en développement. En outre, nous montrons comment le gel d’agarose peut être utilisé pour immobiliser complètement les larves pendant le processus d’injection, une technique qui est généralement utile au cours de diverses procédures et pourrait être appliquée à une variété d’arthropodes. Pour démontrer comment l’ARNI peut être appliqué à différents stades de développement, nous incluons un exemple dans lequel nous avons réduit au silence le gène de pigmentation des yeux blanc dans les embryons. En outre, nous décrivons un exemple dans lequel le gène de bronzage laccase2(lac2) a été réduit au silence pendant la deuxième étoile larvaire (pour affecter les larves de la troisième étoile larvaire) et le troisième étoile larvaire (pour affecter les adultes). Enfin, nous démontrons que l’injection d’une concentration plus faible de dsRNA conduit à un renversement partiel, ce qui montre que cette technique peut également être appliquée aux gènes où la perte de fonction est connue pour être mortelle.
Protocol
1. Isolation de l’ARN et assemblage de novo transcriptome
- Effectuer l’isolement total de l’ARN à partir des tubes oculaires larvaires du coléoptère de plongée tardive et des coléoptères adultes à l’aide d’un kit d’isolement de l’ARN(voir tableau des matériaux) conçu pour les tissus riches en lipides. Isoler l’ARN total de T. marmoratus et le séquencer suivant les méthodes précédemment décrites18.
- Assemblage de transcription de novo
REMARQUE : Pour assembler le transcriptome de novo, diverses plates-formes bioinformatiques peuvent être utilisées (voir tableau des matériaux). Ces plates-formes sont disponibles dans le commerce et, dans certains cas, existent sous forme de scripts de ligne de commande unix. Étant donné que l’assemblage est de novo, il est recommandé d’assembler les transcriptomes indépendamment sur deux plates-formes et de comparer les résultats pour exclure les faux positifs ou les faux négatifs.- Pour commencer à assembler les transcriptomes, téléchargez les lectures brutes sur la plate-forme bioinformatique respective.
REMARQUE : Ces fichiers sont généralement compressés et au format FASTQSANGER. Gz. Il n’est pas nécessaire de décompresser les fichiers car ce format est accepté à l’étape suivante. - À l’aide de la ligne de commande Trimomatic, coupez les lectures brutes pour supprimer les séquences d’adaptateur ou les lectures courtes qui tombent en dessous du seuil par défaut. Décompresser les lectures brutes parées; les fichiers seront maintenant au format FASTQ. Concatenate les lectures brutes FASTQ pour chaque échantillon pour obtenir des fichiers qui sont prêts pour l’assemblage de novo.
- Assemblez les lectures brutes concatnées de novo à l’aide de n’importe quel script de ligne de commande qui peut assembler des transcriptomes de novo. Enregistrez le transcriptome assemblé, qui aura maintenant une liste de contigs avec leurs séquences respectives, comme un fichier FASTA. Pour augmenter la couverture de l’assemblage, combinez et assemblez plusieurs transcriptomes pour la même espèce.
REMARQUE : Ce processus augmente les chances de générer des contigs plus précis et est particulièrement important si les gènes à faible nombre de copies sont intéressants. - Une fois assemblé, évaluez le transcriptome pour déterminer l’exhaustivité en calculant les scores de couverture (le logiciel d’évaluation de la couverture est librement disponible, voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Un transcriptome avec un score de couverture >75% est considéré comme bon. Cependant, la pertinence de cette partition dépend de la raison de la génération de transcription. Par exemple, si le transcriptome est utilisé pour identifier les gènes à faible nombre de copies, alors un score >85% est mieux, car il signifie une plus grande couverture. - Annoter le transcriptome de novo assemblé à l’aide d’un outil de recherche d’alignement local de base (BLAST; voir Table of Materials).
REMARQUE : Pour cette expérience, le transcriptome a été annoté principalement sur une base de données de protéines connues de la Drosophila et une base de données de protéines connues du coléoptère. La liste des annotations peut être téléchargée sous forme de fichier feuille de calcul et de contigs/contigs qui indiquent la similitude de la séquence avec les protéines d’autres organismes peut être téléchargée sous forme de fichier FASTA. - Identifier le nombre/nombre de contig de la protéine d’intérêt et extraire les séquences de nucléotides. Utilisez BLAST pour déterminer si des régions conservées spécifiques aux protéines (telles que les domaines homeobox) sont présentes dans la séquence d’intérêt des nucléotides annotés. Vérifiez d’autres contigs avec la même annotation pour les chevauchements de séquences de nucléotides pour générer la séquence d’une transcription spécifique au gène.
REMARQUE : Il n’est généralement pas possible d’identifier les contiges avec le chevauchement des séquences pour tous les gènes, en particulier pour les gènes à faible nombre de copies. - Si la séquence complète du gène est nécessaire, commencez par le contig qui a la similitude de séquence la plus élevée comme point d’initiation pour identifier la séquence nucléotidique de la transcription mature entière en utilisant des techniques telles que 3′ et 5′ amplification rapide des extrémités de l’ADNC (RACE19).
- Annoter l’assembly obtenu à partir de la deuxième plate-forme suivant les étapes 1.2.4–1.2.7.
REMARQUE : Idéalement, les résultats devraient être similaires pour les protéines d’intérêt; toutefois, la couverture peut différer d’une certaine forme à l’autre. - Utilisez le transcriptome assemblé pour synthétiser l’ARSD spécifique à l’espèce, tel qu’indiqué à la section 2.
- Pour commencer à assembler les transcriptomes, téléchargez les lectures brutes sur la plate-forme bioinformatique respective.
2. Clonage et synthèse d’ARN spécifique aux gènes
REMARQUE : Le clonage spécifique aux gènes et la synthèse de l’ARN a été décrit en détail pour T. castaneum20,21,22. Les étapes suivantes sont un bref aperçu.
- Clonage, transformation bactérienne et séquençage du plasmide
- Isoler l’ARN total de l’organisme (tel que décrit à l’étape 1.1) et créer de l’ADN complémentaire (ADC) à l’aide d’unkit de transcription inversée (voir tableau des matériaux). Identifiez une ou deux séquences nucléotides de 100 à 1000 pb à partir de contigs spécifiques aux gènes d’intérêt.
- Concevoir des paires d’amorces couvrant l’ensemble de l’étendue identifiée des nucléotides et amplifier la séquence par une réaction en chaîne de polymérase (PCR). Ajoutez une étape supplémentaire de 30 min à la fin pour créer des surplombs d’adénine de 3′ dans le produit d’ADN amplifié. Purifier ce produit à l’aide d’un kit de purification PCR (voir Tableau des matériaux).
- Clonez le produit purifié dans un vecteur plasmide pCR4-TOPO (voir tableau des matériaux)suivant le protocole du fournisseur fourni avec le kit de clonage. L’utilisation d’un traitement par choc thermique transforme les plasmides clonés en cellules bactériennes compétentes (souche : E. coli DH10B) suivant le protocole du fournisseur pour les cellules compétentes (voir tableau des matériaux)et dépistez les cellules transformées avec succès.
REMARQUE : Les plaques avec colonies peuvent être enveloppées dans un film de paraffine pour retenir l’humidité et stockées à 4 °C pendant un mois. - Choisissez des colonies de cellules transformées à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL et de la culture dans le bouillon de lysogénie (LB) contenant de l’ampicilline (50 μg/mL) dans un shaker-incubateur à 37 °C et 200 tr/min pendant 24 h.
REMARQUE : Pour le stockage à long terme, les cellules cultivées peuvent être diluées 1:1 avec 100% glycérol et congelées à -80 °C sous forme de stocks de glycérol. - Isoler les plasmides contenant le gène d’intérêt de cette culture à l’aide d’un kit d’isolement miniprep (voir tableau des matériaux). Stockez les plasmides isolés (minipreps) à -20 °C après évaluation du rendement spectrophotométriquement. Plus précisément, mesurer l’absorption de l’échantillon à 260 nm, 280 nm et 230 nm. Calculer les ratios A260/A280 pour la quantification de l’ADN, et A260/A230 pour quantifier la pureté de l’ADN.
REMARQUE : Un rapport de 260/280 de 1,8 est généralement accepté comme adn suffisamment pur, des ratios inférieurs à 1,5 indiquent la présence de réactifs résiduels d’extraction tels que le phénol. Le ratio 260/230 devrait être supérieur ou égal au ratio 260/280. Des ratios plus faibles indiquent une contamination résiduelle par les réactifs. Le rendement varie généralement de 100 à 500 ng/μL. - Séquencer les minipreps isolés pour confirmer que le fragment spécifique au gène a été intégré avec succès, étant flanqué entre 5′ T7 et 3′ T3 régions promotrices dans le plasmide; cela peut être fait à l’aide d’amorces universelles de séquençage T7 et T322. Utilisez les minipréps avec la séquence d’intérêt spécifique au gène pour la préparation de l’ARN.
- Isoler l’ARN total de l’organisme (tel que décrit à l’étape 1.1) et créer de l’ADN complémentaire (ADC) à l’aide d’unkit de transcription inversée (voir tableau des matériaux). Identifiez une ou deux séquences nucléotides de 100 à 1000 pb à partir de contigs spécifiques aux gènes d’intérêt.
- Amplification pcr et synthèse in vitro d’arna
- Amplification et purification des produits PCR
- Concevoir des amorces spécifiques au plasmide ou spécifiques aux gènes qui ont la séquence de promoteur T7 sur leurs côtés de 5' (voir référence22 pour plus de détails) pour amplifier un fragment linéaire du gène inséré. Optimisez le rendement en mettant en place au moins 10 réactions de 20 μL chacune.
REMARQUE : Le produit qui en résulte est flanqué de deux sites de liaison T7 de la polymérase de 20 pb. - Purifier le produit PCR à l’aide d’un kit de purification de produit PCR (voir tableau des matériaux),suivant le protocole d’ellion basé sur la colonne du fournisseur. Pour augmenter le rendement, répétez l’étape finale d’ellion jusqu’à 3 fois avec le même eluent. Évaluer le rendement spectrophotométriquement.
REMARQUE : Le rendement varie habituellement de 100 à 700 ng/μL. Ce produit purifié peut être stocké à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage.
- Concevoir des amorces spécifiques au plasmide ou spécifiques aux gènes qui ont la séquence de promoteur T7 sur leurs côtés de 5' (voir référence22 pour plus de détails) pour amplifier un fragment linéaire du gène inséré. Optimisez le rendement en mettant en place au moins 10 réactions de 20 μL chacune.
- Synthèse et purification de l’ARN
- Utilisez le produit purifié PCR spécifique au gène pour synthétiser le dsRNA in vitro selon le protocole d’un kit de synthèse d’ARN de choix. Si nécessaire, prolongez le délai d’incubation pour augmenter la production d’ARN.
- Évaluer la progression de la réaction en fonction de l’opacité du mélange de réaction (plus la quantité du produit dsRNA est élevée, plus la turbidité est élevée). À la fin de l’incubation, arrêter la réaction en utilisant un traitement DNase. Pour ce faire, ajouter 1 μL d’un stock de 2 U/ μL, au mélange de réaction. Étendre ce traitement à 1 à 2 h pour assurer la dégradation optimale de l’ADN du modèle.
- Purifier le dsRNA avec un kit de purification ou par les étapes suivantes.
- Diluer le produit résultant avec 115 μL d’eau sans nucléase et ajouter 15 μL d’acétate de sodium de 3 M. Ajouter 2 volumes d’éthanol 100% glacé à ce mélange de réaction et précipiter le dsRNA pendant la nuit à -20 °C.
REMARQUE : À ce stade, les échantillons peuvent être stockés en toute sécurité sans affecter le rendement final. - Centrifuger le précipité à 0 °C pendant 20 min à 9000 x g et jeter le supernatant. Laver le produit une fois avec de l’éthanol glacé à 70 % et une centrifugeuse pendant 15 min à 13 000 x g.
- Retirer le supernatant et sécher le granulé pendant 5 à 15 min. Resuspendez le granulé dans jusqu’à 40 μL d’eau sans nucléase (ce volume peut être ajusté en fonction de la taille des granulés isolés) et évaluez le rendement et la pureté spectrophotométriquement, comme décrit dans 2.1.4.
- Conserver le dsRNA purifié à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage. Utilisez le dsRNA purifié pour l’injection au stade de développement souhaité.
- Diluer le produit résultant avec 115 μL d’eau sans nucléase et ajouter 15 μL d’acétate de sodium de 3 M. Ajouter 2 volumes d’éthanol 100% glacé à ce mélange de réaction et précipiter le dsRNA pendant la nuit à -20 °C.
- Amplification et purification des produits PCR
3. Collecte et préparation d’embryons T. marmoratus à un stade précoce pour les injections dsRNA
- Préparer une plaque d’agarose pour l’incubation des embryons de T. marmoratus.
- Tout d’abord, dissoudre 20 mg de poudre d’agarose à faible fusion dans 100 mL d’eau distillée autoclavée (2% d’agarose) puis faire bouillir ce mélange au micro-ondes jusqu’à ce qu’une solution claire soit obtenue. Prenez soin de la solution chaude, car les bulles d’air peuvent provoquer son débordement.
- Distribuer cette solution dans un petit plat Petri. Pour faire des rainures (qui tiendront les embryons) à la surface de la plaque d’agarose, placez trois tubes en plastique de 1 à 2 mm de large (tels que les pointes des pipettes de transfert en plastique) sur la surface de l’agarose liquide avant qu’elle ne se solidifie.
- Une fois que l’agarose se solidifie, utilisez une paire de forceps émoussés pour enlever ces tubes. Ajouter 500 μL d’eau distillée autoclavée à l’aide d’une micropiplette P1000 pour couvrir ces indentations dans l’agarose.
- À l’aide d’un pinceau naturel fin pour les cheveux, recueillir des embryons de T. marmoratus qui ont entre 5 et 8 h à partir des sites de nidification du coléoptère dans un plat de cavité en verre rempli d’eau distillée autoclavée. Surveillez fréquemment les sites de nidification pour vous assurer que les œufs obtenus sont de l’âge approprié.
- Déchorioniser les embryons sous un stéréomicroscope à l’aide de forceps fins de dissection. Pour ce faire, visualisez le chorion au microscope (au grossissement souhaité) en positionnant la source lumineuse à un angle approprié, puis prenez le chorion de deux côtés avec des forceps pointus, déchirez-le et faites glisser doucement l’embryon. Comme il ya deux couches, assurez-vous que les deux sont enlevés.
- À l’aide d’un pinceau naturel fin, transférer soigneusement les embryons du plat de cavité en verre à la plaque d’agarose et les disposer dans les rainures sous un stéréomicroscope. Prenez grand soin pendant ce processus, car les embryons déchoirés sont très fragiles. Utilisez les embryons préparés pour les injections dsRNA.
REMARQUE : L’extrémité légèrement plus épaisse est le côté de l’embryon dans lequel la tête se développera.
4. microinjections dsRNA dans les embryons de T. marmoratus au stade précoce
- Pour injecter des embryons à un stade précoce avec un dsRNA spécifique aux gènes, préparez des aiguilles de microinjection à l’aide d’un pulleur d’aiguille à microinjection (voir tableau des matériaux). Tout en visualisant la pointe de l’aiguille sous un stéréomicroscope, utilisez une paire de forceps fins pour briser la pointe de l’aiguille, créant un bord pointu. Idéalement, casser la pointe de l’aiguille en diagonale de sorte qu’un bord plus pointu reste d’un côté, ce qui lui permettra d’entrer dans l’embryon tout en causant des blessures minimales.
- Décongeler la solution dsRNA de stock purifié sur la glace, ajouter 1 μL du tampon d’injection 10x et le compléter avec de l’eau distillée double, pour faire 10 μL de solution d’injection. Pour les injections, une concentration d’ARN de 1 μg/μL est habituellement appropriée, mais peut être ajustée en fonction de la gravité phénotypique des animaux qui en résultent).
REMARQUE : Préparer 1 mL de tampon d’injection 10x22 en ajoutant 10 μL de tampon de phosphate de sodium de 0,1 M (fait en mélangeant 8,5 mL de 1 M Na2HPO4 et 1,5 mL de 1 M NaH2PO4 ajusté à un pH 7,6 à 25 °C avec 100 μL de 0,5 M KCl), 100 μL de colorant alimentaire et 790 μL d’eau double distillée.- À l’aide d’une pipette P10, remplissez l’aiguille de microinjection avec la solution dsRNA de travail. Une fois que la solution a rempli la pointe de l’aiguille, attachez-la à un support de microaèdille relié à un système de microinjection qui utilise la technologie d’éjection de pression (voir tableau des matériaux).
- Allumez le système de microinjection et l’alimentation en air pressurisé. En utilisant le microvalve sur le système de microinjection, ajuster la pression d’injection à 15 psi. Réglez la durée d’injection à l’aide du bouton d’ajustement de temps (définissez-le sur « Secondes »).
- Comme la durée d’injection dépend du volume d’injection requis, si nécessaire, ajuster ce paramètre sur le système de microinjection avant chaque injection. Utiliser un volume d’injection de 1 à 2 nL pour les embryons T. marmoratus à un stade précoce.
REMARQUE : Des volumes d’injection plus élevés ont tendance à interférer avec le taux de survie des embryons.
- Comme la durée d’injection dépend du volume d’injection requis, si nécessaire, ajuster ce paramètre sur le système de microinjection avant chaque injection. Utiliser un volume d’injection de 1 à 2 nL pour les embryons T. marmoratus à un stade précoce.
- Pour mesurer le volume de liquide d’injection qui est distribué par le système de microinjection, calibrer l’aiguille d’injection en évaluant le volume de la bulle de fluide qui se forme à l’extrémité de l’aiguille lors de l’injection dans l’air. Pour les embryons de T. marmoratus, utilisez une taille optimale de bulle de 100–200 μm. L’aiguille d’injection est de bonne qualité si cela peut être réalisé à 15 psi avec une durée d’injection de ~3 s.
- Aligner l’aiguille et la plaque d’agarose contenant les embryons sous un stéréomicroscope, de sorte que l’aiguille s’approche des embryons à un angle compris entre 45° et 60°.
- À l’aide du micromanipulateur, déplacez le microdécement lentement tout en surveillant les progrès à travers le stéréomicroscope. Une fois que la pointe de l’aiguille touche la surface d’un embryon, déplacez soigneusement l’aiguille vers l’avant jusqu’à ce qu’elle perce la surface de l’embryon. Ne perforez pas l’embryon profondément avec la pointe de l’aiguille, car cela peut affecter la survie de l’embryon. Pour réduire la variabilité, livrer l’injection au milieu de l’embryon.
- Une fois que l’aiguille est à l’intérieur de l’embryon, appuyez soigneusement sur le bouton d’injection du micro-injecteur pour délivrer la dose d’ARN à l’embryon. Après avoir injecté 1–2 nL de dsRNA, rétractez lentement l’aiguille de l’embryon, de sorte qu’elle ne provoque pas la rupture de l’embryon.
- Injectez les autres embryons de la même façon. Si l’aiguille de microinjection est bloquée pendant la procédure, débloquez-la en augmentant la pression et la durée de l’injection. Identifier visuellement les embryons injectés avec succès par la présence d’une tache colorée sur le site de l’injection (puisque le tampon d’injection contient des colorants alimentaires).
- Placez soigneusement le plat avec des embryons injectés dans une chambre d’humidité.
- Pour construire une telle chambre, prendre n’importe quelle boîte en plastique avec un couvercle, la stériliser avec 70% d’éthanol, lui permettre de sécher, et placer le tissu trempé dans l’eau autoclavée au fond pour fournir un environnement humide. Placez cette chambre d’humidité dans un incubateur à température appropriée (dans ce cas, 25 °C) et un cycle de lumière de 14 h de lumière et 10 h de noir.
- Laisser les embryons injectés se développer en premières larves d’étoiles, ce qui nécessite 4 à 5 jours. Surveiller les progrès du développement de l’embryon quotidiennement à l’aide d’un stéréomicroscope pour identifier les phénotypes morphologiquement visibles knockdown comme décrit à la figure 2.
- Documentez ces progrès en prenant des images numériques à l’aide d’une caméra haute résolution. Enlever les embryons morts et reconstituer l’eau de la plaque d’agarose chaque jour pour éviter la dessiccation et la propagation possible de la contamination microbienne à d’autres embryons survivants pendant la période d’incubation.
- Effectuer des contrôles appropriés pour les injections de dsRNA, y compris les injections tampon, les injections de dsRNA synthétisées contre le brin de sens du gène d’intérêt, et les injections de dsRNA synthétisé contre des séquences qui n’existent pas dans l’organisme cible. Confirmer RNAi knockdown en utilisant des méthodes moléculaires supplémentaires22.
5. Préparation des larves de T. marmoratus pour les injections de dsRNA
REMARQUE : Contrairement aux embryons à un stade précoce, les larves de T. marmoratus sont relativement robustes et peuvent être injectées avec de plus grands volumes. Par exemple, les deuxièmes instars peuvent être injectées avec jusqu’à 2 μL de solution de travail dsRNA et troisième instars avec au moins 3 μL sans effets négatifs notables sur le taux de survie. Pour injecter de l’ARN, il est utile d’immobiliser les larves en les intégrant dans l’agarose.
- Avant de recueillir les larves, faire fondre 2 % d’agarose et la garder dans un bain d’eau à 60–70 °C pour la maintenir sous forme liquide. Préparer un plat d’immobilisation en versant de l’agarose fondue de 2 % dans une petite boîte de Pétri, puis en refroidissant jusqu’à ce qu’elle soit solidifiée. Utilisez des forceps émoussés pour faire une rainure peu profonde dans la plaque d’agarose (à peu près la taille de l’arthropode à intégrer) pour chaque animal qui sera injecté.
- Recueillir les jeunes larves au stade de développement approprié (un stade avant le stade souhaité pour analyse). Pour ce faire, égouttez soigneusement l’eau des gobelets de culture contenant les larves et suivez les étapes mentionnées ci-dessous.
- Anesthésier sur la glace (ramasser soigneusement la larve de sa tasse d’eau et la placer doucement sur la glace) jusqu’à ce que la larve ne montre aucun mouvement notable. Utilisez des forceps émoussés et mous pour soulever soigneusement la larve de la glace et la placer sur le stade d’immobilisation avec son cou et son corps dans la rainure, mais sa queue située au-dessus de la surface agarose afin qu’elle ne soit pas couverte, ce qui permet à la larve de continuer à respirer à travers ses spiracles de queue.
- Couvrir la larve d’une épaisse couche d’agarose qui est encore liquide mais pas dangereusement chaude. S’il a été accidentellement couvert, utilisez les forceps pour libérer la queue et les deux segments en dessous de l’agarose. Une fois que l’agarose se solidifie, utilisez la larve pour les injections de dsRNA.
6. microinjections dsRNA chez les larves de T. marmoratus
- Préparer et remplir une aiguille de microinjection avec la quantité désirée de solution de travail dsRNA spécifique au gène (comme décrit aux étapes 4.1–4.2). Attachez l’aiguille à un porte-aiguille relié à une seringue de microinjection contrôlée manuellement. Avant de fixer l’aiguille, tirez le piston de seringue tout le chemin pour éviter de manquer de pression d’injection à mi-procédure.
- Positionner la larve immobilisée de telle sorte que le site d’injection, qui se trouve dossalement entre les segments de la troisième et de la quatrième plaque corporelle, soit aligné sur la trajectoire de l’aiguille de microinjection à un angle relativement plat (presque parallèle à l’étape).
REMARQUE : La pêche à l’aiguille et la larve dans cette position est importante, car elle fournit le chemin de la moindre résistance pour que la pointe de l’aiguille perfore les larves avec des dommages minimaux. - Une fois que l’aiguille et la larve ont été positionnées, déplacez soigneusement la pointe de l’aiguille dans la larve à l’aide du micromanipulateur tout en surveillant la progression à travers un stéréomicroscope.
- Après que la pointe perfore le tissu, appliquez lentement et soigneusement la pression sur la seringue. Ajuster la pression d’injection en observant le mouvement du liquide d’injection coloré dans l’aiguille sous le microscope.
- Rétractez soigneusement l’aiguille après l’injection. Utilisez des forceps mous pour décoller et donc libérer la larve de l’agarose. Transférer la larve dans un récipient avec de l’eau (à température ambiante) et lui permettre de se développer davantage dans un incubateur ou une salle de culture à 25\u201228 °C et un cycle léger de 14 h de lumière et 10 h de noir.
- Utiliser des injections de contrôle appropriées et des quantifications de knockdown, comme indiqué à l’étape 4.10.
Representative Results
En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons renversé trois gènes différents, à savoir, blanc, laccase2 (lac2), et Lens3 (Tableau 1), à une variété de différents stades de développement de la Sunburst Diving Beetle T. marmoratus. Nous avons effectué l’ARNAi à T. marmoratus en injectant de l’ARN à un stade très précoce pendant l’embryogenèse (Figure 1A). Comme certains embryons ne survivent pas au processus et deviennent nécrotiques (figure 1B), ils doivent être enlevés pour garder les embryons restants en bonne santé. Les injections de dsRNA contre le gène blanc sont illustrées. Ce gène est bien connu dans Drosophila comme l’un des trois transporteurs de cassettes à liaison ATP (ABC) impliqués dans l’absorption et le stockage des précurseurs du pigment oculaire23. En conséquence, sa perte de fonction se traduit par un phénotype non-œil blanc. Nos résultats montrent que les injections de dsRNA ciblant le gène blanc orthologue dans les embryons de T. marmoratus conduit à la perte de pigmentation oculaire chez les larves nouvellement émergentes. Dans ce cas, les larves de type sauvage sont caractérisées par des yeux fortement pigmentés, et l’RNAi knockdown du blanc conduit à divers niveaux de réduction et même l’élimination complète du pigment oculaire. Dans l’ensemble, nous avons observé au moins une certaine réduction de la coloration oculaire dans 34 % des embryons survivants (n = 35). La figure 2A compare un individu témoin et un individu avec une couleur légèrement plus claire des yeux. La figure 2B illustre un renversement plus grave chez un individu, dans lequel les yeux plus ventrals (Yeux 2–5) de l’amas sont complètement non pigmentés, tandis que les yeux dorsaux montrent encore une certaine pigmentation. Ces différences mettent en évidence la façon dont l’efficacité de l’effondrement peut varier à l’échelle régionale, ce qui est peut-être lié à des différences dans l’efficacité de la pénétration de l’ARN dans les tissus denses. Un autre individu montre une perte de pigment essentiellement complète dans tous les yeux (Figure 2C).
Pour étudier le fonctionnement de l’ARNI au stade larvaire de T. marmoratus,nous avons injecté du dsRNA ciblant le gène tannique lac2 en deuxième année, quelques jours avant qu’elles ne soient dues à la mue en troisième étoile (figure 3) et nous avons évalué l’effet sur la coloration cuticulaire des larves de troisième étoile. Lac2 est un type de phénoloxidase qui conjugue oxydativement les protéines pour les rendre insolubles, plus dures et plus foncées. Knockdown dans le coléoptère de la farine T. castaneum a été montré pour conduire à des individus de couleur plus claire à faibles doses, mais est considéré comme mortel à fortes doses24. La figure 4 illustre que ce traitement mène également à des larves de coléoptères de plongée de couleur plus claire. Plus précisément, dans cette expérience, 75 % des larves injectées survivantes (n = 12) avaient réduit la pigmentation (comparativement à 0 % dans le groupe témoin). La figure 4A montre un individu avec une dépigmentation relativement légère, tandis que la figure 4C illustre la tête d’une larve de T. marmoratus dans laquelle la coloration foncée de la cuticule est presque absente. La dépigmentation était particulièrement évidente pour les motifs sombres centraux qui sont typiques de ces larves, alors que ce modèle est resté clairement visible chez un individu sous injection de contrôle (figure 4B). En outre, un allègement de la trachée de la queue a été observé, comme décrit dans la figure 4D. Dans le cas où l’ARN de lac2 a été injecté dans les larves d’étoiles troisième, des individus adultes plus légers ont été obtenus (figure 5). Notez que les ailes du coléoptère knockdown sont quelque peu déformées, probablement en raison de sa douceur inhabituelle.
En plus de modifier les traits morphologiques, il est possible d’utiliser l’ARNI pour cibler les gènes qui affectent le comportement. Pour le démontrer, nous avons effectué RNAi contre un gène de codage de protéine de lentille clé, Lens318, et l’avons injecté dans les larves d’étoiles deuxième pour affecter les propriétés optiques des yeux larvaires d’étoile troisième. Tous les effets sur la lentille observée ici sont probablement parce que les yeux des larves de T. marmoratus subissent une croissance oculaire importante à cette transition, qui implique également des changements optiques majeurs de la lentille25. RNAi knockdown dans cette expérience a été très efficace. La vérification par l’intermédiaire de qPCR a montré un taux de réussite de 100 %; sur 13 personnes testées, 12 ont été renversées à moins de 10 % du niveau d’expression des individus témoins, le reste ayant un niveau d’expression de 17 % du niveau de contrôle (observation non publiée). Au niveau phénotypique, seuls quelques individus étaient gravement handicapés ou incapables de capturer des proies, comme l’illustre la figure 6 pour un individu qui s’est approché à plusieurs reprises de sa proie à une distance très étroite, mais qui l’a constamment dépassée.
Tableau 1 : Séquences d’amorces et amplicons pour les protéines blanches, lac2 et Lens3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Figure 1 : Illustration des injections d’embryons. (A) Des embryons déchorionnés alignés sur une plaque d’agarose et injectés près de leur centre à l’aide d’une aiguille de microinjection remplie de dsRNA et de tampon d’injection contenant des colorants alimentaires. La barre d’échelle représente 500 μm. (B) Un individu avec un knockdown plus grave. Les embryons injectés sont conservés dans une chambre d’humidité et surveillés quotidiennement pour marquer des phénotypes et enlever les personnes mortes (qui brunissent). La barre d’échelle représente 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Exemple d’embryons entièrement développés qui ont été injectés avec de l’ARN contre le blanc. (A)Comparaison d’un individu avec une réduction de la pigmentation oculaire (à gauche) et d’un individu sous contrôle (à droite). E1–E6 se réfèrent aux yeux 1–6. (B) Un individu avec un phénotype plus grave knockdown, qui illustre que, parfois, certains des yeux dans le cluster sont plus sévèrement affectés par le knockdown que d’autres. (C) Individu avec une perte presque complète de pigmentation oculaire. La barre d’échelle représente 200 μm; Les panneaux B et C sont représentés à la même échelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Illustration des injections de larves. (A) Plusieurs larves immobilisées en incorporant dans l’agarose de 2 % avec leurs spiracles de queue laissées à l’écart de toute agarose. (B) Microélectrode contenant la solution d’injection placée de sorte que sa pointe puisse pénétrer la membrane fine entre deux segments. (C) Colorant d’injection bleu visible au site d’injection après l’injection. Les barres d’échelle représentent 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : RNAi pour laccase2 appliqué aux larves d’étoiles deuxième, ce qui réduit la coloration cuticule chez les troisièmes larves d’étoiles. (A)Perte relativement légère de coloration chez un individu RNAi lac2 (en bas) par rapport à un individu injecté par contrôle (en haut). La barre d’échelle représente 5 mm. (B) Tête d’un individu de contrôle montrant le motif caractéristique de couleur foncée au centre de la tête. (C) Knockdown relativement grave de lac2 conduisant à une perte presque complète de coloration centrale de la tête. (D) Perte de coloration dans la cuticule principale de la queue d’un individu RNAi lac2 (en bas) par rapport à un individu sous contrôle (en haut). Les barres d’échelle en B\u2012D représentent 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : RNAi pour laccase2 appliqué à une troisième larve d’étoile ayant pour résultat une coloration cuticule réduite chez un adulte. L’individu knockdown (à gauche) est également caractérisé par elytra très doux par rapport à la commande (à droite). La barre d’échelle représente 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Élimination d’une protéine de lentille importante entraînant des carences dans la capture des proies. (A–C). Trois exemples dans lesquels une larve de coccinelle de plongée sunburst, dans laquelle les déficits optiques ont été induits par l’ARNI, n’a pas été en mesure de capturer des proies (larves de moustiques). Des images fixes représentatives ont été sélectionnées à partir d’un enregistrement vidéo des captures de proies caractéristiques. (D) Contrôle des larves qui attrapent des proies. Toutes les barres d’échelle représentent 2 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Notre objectif est que cette compilation de méthodes rende l’ARNi largement disponible, d’autant plus que cet outil reste une puissante technique synergique pour l’édition génétique à base de CRISPR/Cas9, avec l’avantage qu’il peut être appliqué aux stades de développement souhaités des organismes étudiés. Pour illustrer cette force, nous avons injecté de l’ARN dans les embryons et dans différents stades larvaires. Les injections dans les ovules ont affecté le développement d’embryons (figure 2), les injections au deuxième stade larvaire ont eu des effets apparents au troisième stade larvaire (figure 4 et figure 6),et les injections au troisième stade larvaire ont montré des effets chez les adultes (figure 5). Bien que le moment exact doit être établi expérimentalement, généralement, les injections prennent effet dans quelques jours. Le succès de ce processus peut être affecté par la longueur de la séquence dsRNA. Ici, nous avons présenté des exemples utilisant un peu plus de 200 pb à plus de 800 pb. En règle générale, les séquences entre 100 et 600 pb sont préférées pour limiter les effets hors cible, mais les séquences jusqu’à 1000 pb donnent de bons résultats22. Une question en ce qui concerne l’ARNI est la durée de knockdown qui peut être atteint grâce à cette technique. Étant donné que les phénotypes étaient terminaux à chaque étape, nous ne pouvons pas commenter cette question en fonction de nos résultats présentés. Cependant, il a déjà été noté que les effets de l’ARNI sont généralement relativement longs, et que des concentrations plus élevées conduisent à des effondrements plus durables20.
Une limitation de cette technique est qu’elle fonctionne mieux pour certains organismes que pour d’autres, et il semble y avoir aucun moyen direct de prédire comment il fonctionnera a priori. Néanmoins, il s’est avéré qu’il fonctionne bien pour un large éventail d’organismes différents. Dans les arthropodes, cela comprend les arachnides26, crustacés27, et une variété d’insectes, avec des taux de réussite particulièrement élevés chez les coléoptères28. Une autre complication est que les différences dans la sévérité de phénotype se produisent souvent entre les individus en dépit de l’application de la même quantité de dsRNA. Comme l’illustre la figure 2B,la variation peut même se produire chez un individu. Dans nos études RNAi ciblant différents gènes impliqués dans le développement des yeux larvaires T. marmoratus, nous avons souvent constaté que certains yeux sont affectés plus sévèrement que d’autres. Ce phénomène peut être lié au tissu relativement dense de l’amas oculaire, avec le dsRNA mieux en mesure d’atteindre certaines des unités.
Pour l’exécution réussie des expériences RNAi, il est essentiel que plusieurs paramètres soient optimisés pour le gène cible. Par exemple, la concentration de l’ARN et la longueur du gène ciblé peuvent fortement influencer le résultat20. Un autre paramètre critique est la façon dont les injections sont exécutées, car ce processus peut grandement influencer le taux de survie. Pour les embryons, nous avons obtenu les meilleurs résultats en ciblant le centre de l’embryon. Une plaque bien aménagée permet l’injection de 100 embryons ou plus en une seule séance. Pour les larves, il est essentiel d’insérer l’aiguille d’injection entre les segments. Ces injections nécessitent plus d’ARN, et en fonction de la disponibilité des larves, nos ensembles d’injection ici ne se composaient généralement que de quelques animaux à la fois. Pour toutes les injections, il est essentiel d’empêcher l’air d’entrer dans l’organisme.
Dans certains cas, les boucles de rétroaction d’un réseau de régulation des gènes et la redondance génétique peuvent influencer la pénétration des phénotypes de l’ARNAi, malgré des effondrements constants. Cela semble être le cas pour nos observations comportementales des larves avec des knockdowns très réussis d’une protéine de lentille proéminente, Lens318. Bien que nous ayons vérifié l’efficacité élevée de ces knockdowns par qPCR, des variations considérables ont été observées dans les phénotypes associés. Ce résultat souligne la nécessité de quantifier correctement les knockdowns RNAi (pour plus de détails sur les options voir22). S’il n’y a pas d’attente a priori claire en ce qui concerne les phénotypes qui en résultent, une bonne façon de contrôler les effets hors cible de l’RNAi est de cibler le même gène avec deux séquences non-chevauchement de dsRNA et d’évaluer les résultats pour les phénotypes communs.
Contrairement aux techniques d’édition génétique, l’ARNI est également un outil puissant pour étudier les gènes mortels, et il y a deux façons de le faire. Par exemple, si l’on s’intéresse à la contribution fonctionnelle d’un gène dont on sait que la perte de fonction au début du développement est mortelle, une étude fonctionnelle d’un tel gène peut être réalisée en permettant simplement à l’animal de se développer normalement, puis en abattant le gène par l’intermédiaire de l’ARNI plus tard dans le développement (c.-à-d. chez l’adulte). Alternativement, un gène où la perte complète de fonction est connue pour être mortelle peut être étudié par un knockdown partiel, qui peut être réalisé en injectant une gamme de concentrations de dsRNA. Certains de nos résultats montrent knockdowns de lac2, qui sont connus pour être mortels si la cuticule chez les insectes devient trop doux24. Même le coléoptère de l’ARN2 représenté à la figure 5 aurait peu de chances de survivre en dehors des conditions de laboratoire. Un autre gène mortel est coupé, qui code pour un facteur de transcription qui est fondamental pour la spécification du destin cellulaire dans divers systèmes d’organes dans les arthropodes et a été lié au développement de la glia dans le système visuel Drosophila 29. Sur la base de notre expérience avec l’ARNI coupé dans les embryons de T. marmoratus, nous pouvons évoquer des phénotypes oculaires informatifs dans des embryons qui sont capables de compléter leur développement oculaire embryonnaire (observations non publiées). Ici, des doses plus élevées semblent conduire à des taux de létalité plus élevés, tandis que des doses plus faibles entraînent des phénotypes observables et informatifs.
Notre protocole énumère non seulement les étapes nécessaires pour qu’un chercheur poursuive des expériences RNAi sur T. marmoratus, comme illustré, mais est également généralement applicable à d’autres organismes, en particulier les organismes aquatiques. Parmi les organismes aquatiques, il existe déjà plusieurs exemples chez les crustacés tels que les puces d’eau Daphnia30 et les crevettes (pour un examen récent, voir référence31). Il existe de nombreuses possibilités parmi les insectes aquatiques, car on estime qu’ils représentent environ 6 % de toute la diversité des insectes, avec probablement plus de 200 000 espèces32. En outre, RNAi a déjà été effectué sur des striders d’eau qui ont tendance à habiter la surface des milieux aquatiques33. Si aucun génome n’est présent, alors un transcriptome peut être assemblé de novo. Tant que ce processus révèle des contigs de quelques centaines de nucléotides, dsRNA contre des gènes spécifiques peut être conçu. Notre protocole pour immobiliser les insectes dans l’agarose sera probablement également utile pour d’autres procédures, en particulier pour les organismes mous, malléables et aquatiques. Pris ensemble, l’ARNI reste une technique puissante pour manipuler l’expression des gènes dans un groupe diversifié d’organismes, même lorsqu’aucun autre outil moléculaire et génétique n’est disponible.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Josh Benoit pour son aide à la bioinformatique Hailey Tobler pour son aide dans l’éducation sunburst Diving Beetles et Tamara Pace pour l’aide éditoriale. Cette recherche a été soutenue par la National Science Foundation dans le cadre des subventions IOS-1456757 et IOS-1856341 à EKB et IOS1557936 à YT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
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