Summary
RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.
Abstract
RNA girişim (RNAi) mRNA bozunması yoluyla gen ekspresyonunun hedeflenen azaltılmasına olanak sağlayan güçlü bir teknik olmaya devam etmektedir. Bu teknik organizmaların geniş bir yelpazede için geçerlidir ve tür açısından zengin sıracoleoptera (böcekler) son derece etkilidir. Burada, bu tekniği yeni bir organizmada geliştirmek için gerekli adımları özetler ve su dalış böceği Thermonectus marmoratus'un farklı gelişim aşamalarına uygulanmasını gösteririz. Hedef gen dizileri bilinen genomik veya de novo ile yakın bir akrabası karşı transkripsiyon montajı ile maliyet-etkin elde edilebilir. Aday gen klonlama belirli bir klonlama vektörü kullanır (pCR4-TOPO plazmid), hangi çift iplikli RNA sentezi sağlar (dsRNA) tek bir ortak astar kullanımı ile herhangi bir gen için. Sentezlenen dsRNA erken gelişimsel süreçler için embriyolara veya daha sonraki gelişimsel süreçler için larvalara enjekte edilebilir. Daha sonra RNAi'nin agarose'da immobilizasyon kullanılarak sudaki larvalara nasıl enjekte edilebildiğini gösteriyoruz. Tekniği göstermek için, tahmin edilen fenotiplerle belirli nakavtlar oluşturarak RNAi deneylerinden birkaç örnek salıyoruz. Özellikle, bronzlaşma geni laccase2 için RNAi larvalar ve yetişkinlerde ve RNAi göz pigmentasyon gen beyaz için mite yumuşatma yol açar göz tüpleri pigmentasyon bir aydınlatma / eksikliği üretir. Buna ek olarak, önemli bir lens proteini nakavt optik eksiklikleri ve av avlamak için azaltılmış yeteneği ile larvayol açar. Bu sonuçlar, rnai'nin sadece transkripsiyonel veritabanlarına sahip organizmalardaki morfolojik desenleme ve davranışsal özellikleri araştırmak için bir araç olarak gücünü örneklemektedir.
Introduction
Belirli genlerin farklı özelliklerin evrimine nasıl katkıda olduğu sorusu biyolojide heyecan verici bir konudur. Son birkaç on yıl içinde, çok ilerleme nematode Caenorhabditis elegansgibi birkaç model organizmalar, gelişimsel süreçlerin genetik temelleri diseksiyon ile ilgili olarak yapılmıştır , meyve sinek Drosophila melanogaster, ve ev fare Mususculus1. Daha yakın zamanda, kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas92 gibi güçlü gen düzenleme tekniklerinin icadı, model olmayan organizmaların genetik kodunu değiştirme olanağı sağlamıştır (örneğinbkz. 3,4). Sonuç olarak, daha önce moleküler tekniklerle yaklaşılmayan çeşitli organizmalar üzerinde yapılan genetik çalışmalarda bir artış olmuştur. Sadece belirli türlerde temsil edilen birçok ilginç özellik veya özellik varyansları ile hayvan krallığımızın muazzam çeşitliliği göz önüne alındığında, bu ilerleme evrimsel gelişimsel biyoloji ("evo-devo") ile ilgili çalışmalar için heyecan verici bir zaman almıştır. Ancak, model olmayan organizmalar için mevcut olan genom düzenleme teknikleri, uygulanabilecekleri gelişimsel zaman noktaları açısından nispeten kısıtlanmıştır, bu da belirli genlerin herhangi bir özellikte oynadığı role ilişkin zamansal özellikleri ayırt etmeyi zorlar. Buna ek olarak, transgenik teknikler genellikle hayatta kalmak için gerekli olmayan genler ile sınırlıdır (yani, nakavt öldürücülük ile sonuçlanmaz). Bu nedenle, gen düzenleme teknikleri popüler olmaya başlamış olsa da, belirli gelişimsel zaman noktalarında farklı organizmaların çeşitli uygulanabilir etkili teknikler için bir ihtiyaç kalır ve kısmi knockdowns kolaylaştırmak (yerine tam fonksiyon kaybı). Burada, gen düzenlemeye sinerjik bir yaklaşım olarak özellikle değerli olan, biraz tarihli ama güçlü bir gen yıkma tekniği5 olan RNA girişimine (RNAi) dikkat çekiyoruz. Özellikle, gerekli moleküler dizilerin elde edilmesinden çift iplikli RNA'nın (dsRNA) yumurta ve larvalara başarılı bir şekilde enjeksiyonuna kadar bu tekniğin uygulanmasını gösteren bir örnek olarak rnai'nin sudalış böceklerine uygulanmasına olanak tanıyan prosedürler geliştirdik.
RNAi tabanlı gen nakavt, dsRNA moleküllerinin virüsler ve transpozonlar 6 gibi istilacı nükleik asit dizilerinin susturulması kolaylaştırdığı doğuştan gelen bir savunma mekanizmasındanyararlanır. Kısaca, dsRNA hücreiçine alınır ve Dicer enzimi tarafından 20-25 nükleotit parçasına bölünerek kesilir. Bu parçalar daha sonra kılavuz iplikçik kullanarak belirli sitelerde bağlanarak hedeflenen mRNA inhibe RNA kaynaklı susturma kompleksi (RISC) oluşumunu etkinleştirin. Bu süreç sonuçta mRNA bozulmasına yol açar ve bu nedenle ilgili proteiniçinemRNA çeviri ile müdahale 6 . Burada sunulan RNAi tabanlı gen nakavt tekniği bu nedenle dsRNA enjeksiyonuna dayanır. Hayvan modelleri için, bu teknik aslında C. elegans7 ve D. melanogaster8 geliştirilmiştir ama o zamandan beri olmayan model organizmalarda güçlü bir fonksiyonel genetik araç olarak ortaya çıkmıştır9,10. Bazı böceklerde son derece etkili doğası nedeniyle, RNAi bile haşere yönetimi11uygulanabilir.
Bir araştırma aracı olarak RNAi, geleneksel olmayan böcek modellerinde temel moleküler gelişimsel yolların nasıl çalıştığını incelemek için kullanılmıştır. Örneğin, un böceği Tribolyum kasten içinde RNAi nasıl derinden korunmuş genler bu böcek belirli özelliklere katkıda belirleyici olarak özellikle şekillikanatlarıngelişimi için örnekolmuştur 12,13,14 ve gözler 15,16.16 T. castaneum'daki manipülasyonların altında yatan teknikler17 yaşında iyi tanımlanmıştır ve yapışkan bir yüzeyde nispeten kuru yumurta ve larvaları hareketsiz hale getirme yeteneğine dayanır. Böyle bir immobilizasyon ancak Sunburst Dalış Böceği Thermonectus marmoratusgibi sucul organizmaların ıslak gelişim formları için mümkün değildir. Birçok geleneksel olmayan model organizmada olduğu gibi, açıklamalı bir genomdan yoksundur. Genomu olmayan herhangi bir organizmada gen ekspresyonunu manipüle etmek için, makul ve uygun maliyetli bir ilk adım transkripsiyon lar üretmek ve ilgili ama daha köklü model organizmalarla dizi benzerliğine dayalı olarak ifade edilen ilgi genlerinin putatif nükleotit dizilerini tanımlamaktır, bu durumda, öncelikle Tribolyum (Coleoptera) ve Drosophila genleri.
Burada, RNAi'nin bir su organizması üzerinde nasıl kullanılabileceğini göstermek için, ilk olarak rna ekstraksiyonu ve transkripsiyon üretimi ve montajı için belirli hedefli gen dizilerinin tanımlanmasına olanak tanıyan protokolleri ve yazılımları tartışıyoruz. Daha sonra gen lere özgü dsRNA sentezlemek için gerekli adımları özetleyebiliriz. Daha sonra, yumurtaların suortamında nasıl enjekte edilebildiğini gösteriyoruz ve gelişmekte olan embriyoların kültürlenmeleri için kuluçka protokollerini gösteriyoruz. Buna ek olarak, biz agarose jel enjeksiyon işlemi sırasında larvaları tamamen hareketsiz hale getirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek, genellikle çeşitli prosedürler sırasında yararlı bir teknik ve eklembacaklı çeşitli uygulanabilir. RNAi'nin farklı gelişim evrelerine nasıl uygulanabileceğini göstermek için, embriyolarda göz pigmentasyon genini beyaz olarak susturduğumuz bir örnek ekleyiz. Buna ek olarak, bronzlaşma geni laccase2(lac2) hem ikinci larva instar (üçüncü larva instar larvaları etkilemek için) ve üçüncü larva instar (yetişkinleri etkilemek için) sırasında susturuldu bir örnek açıklayın. Son olarak, dsRNA'nın daha düşük konsantrasyonunun enjeksiyonunun kısmi nakavta yol açtığını gösteriyoruz, bu da bu tekniğin fonksiyon kaybının ölümcül olduğu bilinen genlere de uygulanabileceğini gösteriyor.
Protocol
1. RNA izolasyon ve de novo transkripsiyon montajı
- Lipit açısından zengin doku larvası için tasarlanmış bir RNA izolasyon kiti (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak geç evre üçüncü instar dalış böceği larva göz tüplerinden ve yetişkin böceklerden toplam RNA izolasyonu gerçekleştirin. Toplam RNA'yı T. marmoratus'tan ayırın ve daha önce açıklanan yöntemleri takip ederek dizileyin18.
- De novo transkriptome montaj
NOT: Transkripsiyon de novo'yu monte etmek için çeşitli biyoinformatik platformları kullanılabilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bu platformlar ticari olarak kullanılabilir ve bazı durumlarda Unix tabanlı komut satırı komut dosyaları olarak mevcuttur. Montaj de novo olduğundan, transkriptomların iki platformda bağımsız olarak bir araya getirilen ve yanlış pozitif veya yanlış negatifleri dışlamak için sonuçları karşılaştırmak önerilir.- Transkriptomeleri bir araya getirmek için, ham okumaları ilgili biyoinformatik platformuna yükleyin.
NOT: Bu dosyalar genellikle sıkıştırılmış ve format FASTQSANGER. Gz. Bu biçim bir sonraki adımda kabul edildiğiiçin dosyaları sıkıştırmaya gerek yoktur. - Trimmomatic komut satırını kullanarak, bağdaştırıcı dizilerini veya varsayılan eşiğin altına düşen kısa okumaları kaldırmak için ham okumaları kırpın. Kesilmiş ham okur decompress; dosyalar artık FASTQ biçiminde olacaktır. De novo derlemesi için hazır dosyaları elde etmek için her örnek için FASTQ ham okumaları concatenate.
- Biraraya konabilir ham okuma de novo transcriptomes de novo monte edebilirsiniz herhangi bir komut satırı komut dosyası kullanarak. Şimdi bir FASTA dosyası olarak, kendi dizileri ile bitişik bir listesini olacak monte transkriptome kaydedin. Montaj kapsamını artırmak için, birleştirmek ve aynı tür için birden fazla transkriptomes monte.
NOT: Bu işlem daha doğru kontig üretme şansını artırır ve düşük kopya sayısı genleri ilgi varsa özellikle önemlidir. - Bir kez monte edildikten sonra, kapsama puanları hesaplayarak tamlığı için transkriptom değerlendirmek (kapsama değerlendirme yazılımı serbestçe kullanılabilir, Malzeme Tablosubakınız).
NOT: Kapsama puanı >%75 olan bir transkripsiyon iyi kabul edilir. Ancak, bu skorun alaka transkriptom nesil nedenine bağlıdır. Örneğin, transkripsiyon düşük kopya numarası genlerini tanımlamak için kullanılıyorsa, daha fazla kapsama alanı anlamına gelen bir skor >%85 daha iyidir. - Temel bir yerel hizalama arama aracı kullanarak de novo monte edilmiş transkripsiyonu açıklama (BLAST; bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Bu deney için, transkripsiyon öncelikle bilinen Drosophila proteinlerinin bir veritabanı ve bilinen böcek proteinlerinin bir veritabanı karşı açıklamalı oldu. Ek açıklamalar listesi elektronik tablo dosyası olarak indirilebilir ve diğer organizmaların proteinlerine sıra benzerliğini gösteren bitişik/bitişik ler FASTA dosyası olarak indirilebilir. - İlgi proteininin bitişik sayısını/sayısını belirleyin ve nükleotit dizilerini ayıklayın. Proteine özgü korunmuş bölgelerin (homeobox etki alanları gibi) açıklamalı nükleotit dizisinde bulununp bulunmadığını belirlemek için BLAST'ı kullanın. Genlere özgü bir transkriptin dizisini oluşturmak için nükleotit dizisi çakışmaları için aynı ek açıklamaya sahip diğer bitişikleri kontrol edin.
NOT: Dizi çakışması ile bitişik belirlenmesi genellikle tüm genler için, özellikle düşük kopya numarası genler için mümkün değildir. - Genin tam uzunlukta dizigerekli ise, cDNA biter 3 ' ve 5' hızlı amplifikasyon gibi teknikleri kullanarak tüm olgun transkript nükleotit dizisini tanımlamak için bir başlangıç noktası olarak en yüksek sırabenzerliğe sahip kontig ile başlayın (RACE19).
- 1.2.4-1.2.7 adımlarını izleyen ikinci platformdan alınan derlemeye açıklama ekin.
NOT: İdeal olarak, sonuçlar ilgi proteinler için benzer olmalıdır; ancak, kapsama bir dereceye kadar platformlar arasında farklı olabilir. - Bölüm 2'de belirtildiği gibi türlere özgü dsRNA sentezlemek için birleştirilmiş transkripsiyonu kullanın.
- Transkriptomeleri bir araya getirmek için, ham okumaları ilgili biyoinformatik platformuna yükleyin.
2. Klonlama ve gen özel dsRNA sentezi
NOT: Gen-spesifik klonlama ve dsRNA sentezi Ayrıntılı olarak T. castaneum20,21,22için açıklanmıştır. Aşağıdaki adımlar kısa bir genel bakış vardır.
- Klonlama, bakteriyel dönüşüm ve plazmid dizilimi
- Toplam RNA'yı organizmadan izole edin (adım 1.1'de açıklandığı gibi) ve ters transkripsiyon kiti kullanarak tamamlayıcı DNA (cDNA) oluşturun (bkz. Malzemeler Tablosu). İlgi genlerine özgü olan bir veya iki 100-1000 bp nükleotit dizisini bitişiklerden tanımlayın.
- Tanımlanan nükleotitlerin tüm streç kapsayan tasarım astar çiftleri ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile sırayı yükseltmek. Güçlendirilmiş DNA ürününde 3' adenin çıkıntılar oluşturmak için sonunda ekstra bir 30 dakika adım ekleyin. Bu ürünü bir PCR arıtma kiti kullanarak arındırın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Saflaştırılmış ürünü, klonlama kiti ile sağlanan satıcının protokolünden sonra pCR4-TOPO plazmid vektörü (bkz. Malzemeler Tablosu)halinde klonla. Isı şoku tedavisi kullanarak yetkili hücreler için satıcının protokolü aşağıdaki yetkili bakteri hücrelerine (suş: E.coli DH10B) klonlanmış plazmidler dönüştürmek (Malzemeler Tablosubakınız ), ve başarılı bir şekilde dönüştürülmüş hücreler için ekran.
NOT: Kolonili plakalar, nemi korumak için parafin filmine sarılır ve 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir. - 37 °C'de bir çalkalama-kuluçka makinesinde ampisilin (50 μg/mL) içeren lysogeny suyu (LB) içinde 10 μL pipet ucu ve kültür kullanarak dönüştürülmüş hücrelerin kolonilerini seçin ve 24 saat boyunca 200 rpm'de.
NOT: Uzun süreli depolama için kültürlü hücreler 1:1%100 gliserol ile seyreltilebilir ve -80 °C'de gliserol stokları olarak dondurulabilir. - Miniprep izolasyon kiti kullanarak bu kültürden ilgi geni içeren plazmidleri izole edin (bkz. Malzemeler Tablosu). İzole plazmidleri (minipreps) verimi spektrofotometrik olarak değerlendirdikten sonra -20 °C'de saklayın. Özellikle, 260 nm, 280 nm ve 230 nm'de numune emiciliğini ölçün. DNA'yı ölçmek için A260/A280 ve DNA saflığını ölçmek için260/A230 oranlarını hesaplayın.
NOT: 1.8 260/280 oranı genellikle yeterince saf DNA olarak kabul edilir, oranları 1.5 daha düşük fenol gibi artık ekstraksiyon reaktiflerin varlığını gösterir. 260/230 oranı 260/280 oranından daha büyük veya eşit olmalıdır. Daha düşük oranlar artık reaktif kontaminasyonunu gösterir. Verim genellikle 100 ila 500 ng/μL arasında değişir. - Gene özgü parçanın başarılı bir şekilde entegre edildiğini doğrulamak için izole minipreps sıralayın, plazmid 5 ' T7 ve 3' T3 promotör bölgeleri arasında çevrili olan; bu evrensel T7 ve T3 sıralamaastarları 22kullanılarak yapılabilir. DSRNA hazırlığı için genlere özgü ilgi sırası ile minipreps kullanın.
- Toplam RNA'yı organizmadan izole edin (adım 1.1'de açıklandığı gibi) ve ters transkripsiyon kiti kullanarak tamamlayıcı DNA (cDNA) oluşturun (bkz. Malzemeler Tablosu). İlgi genlerine özgü olan bir veya iki 100-1000 bp nükleotit dizisini bitişiklerden tanımlayın.
- PCR amplifikasyon ve in vitro dsRNA sentezi
- PCR amplifikasyon ve ürün arıtma
- Eklenen genin doğrusal bir parçasını yükseltmek için 5' yanlarında T7 promotör dizisi bulunan plazorta özgü veya gen özgü astarlar tasarlayın (ayrıntılar için referans22'ye bakın). Her biri en az 20 μL'lik en az 10 reaksiyon oluşturarak verimi optimize edin.
NOT: Elde edilen ürün iki 20 bp T7 polimeraz bağlama siteleri ile çevrilidir. - PCR ürününü, satıcının sütun tabanlı elüsasyon protokolünü izleyerek PCR ürün temizleme kiti (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanarak arındırın. Verimi artırmak için, aynı eluent ile 3 kez kadar son elution adım tekrarlayın. Verimi spektrofotometrik olarak değerlendirin.
NOT: Verim genellikle 100 ile 700 ng/μL arasında değişmektedir. Bu saflaştırılmış ürün daha fazla kullanım anına kadar -20 °C'de saklanabilir.
- Eklenen genin doğrusal bir parçasını yükseltmek için 5' yanlarında T7 promotör dizisi bulunan plazorta özgü veya gen özgü astarlar tasarlayın (ayrıntılar için referans22'ye bakın). Her biri en az 20 μL'lik en az 10 reaksiyon oluşturarak verimi optimize edin.
- In vitro dsRNA sentezi ve arınma
- Seçtiğiniz bir dsRNA sentez kiti protokolüne göre dsRNA in vitro sentezlemek için gen özel PCR saflaştırılmış ürün kullanın. Gerekirse, artan dsRNA üretimi için kuluçka süresini uzatın.
- Reaksiyon karışımının opaklığına göre reaksiyonun ilerlemesini değerlendirin (dsRNA ürününün miktarı ne kadar fazlaolursa, bulanıklık da o kadar yüksek olur). Kuluçka sonunda, bir DNase tedavisi kullanarak reaksiyonu durdurun. Bunu yapmak için reaksiyon karışımına 2 U/ μL'lik bir stoktan 1 μL ekleyin. Şablon DNA'nın optimum bozulmasını sağlamak için bu tedaviyi 1-2 saate kadar uzatın.
- DSRNA'yı bir arıtma kiti ile veya aşağıdaki adımlarla arındırın.
- Elde edilen ürünü 115°L nükleaz içermeyen su ile seyreltin ve 15 μL 3 M sodyum asetat ekleyin. Bu reaksiyon karışımına 2 cilt buz gibi %100 etanol ekleyin ve dsRNA'yı bir gecede -20 °C'de çökeltin.
NOT: Bu noktada, numuneler nihai verimi etkilemeden güvenli bir şekilde saklanabilir. - Çökeltiyi 9000 x g'da 20 dk için 0 °C'de santrifüj edin ve süpernatantı atın. 13000 x g 15 dakika boyunca buz gibi% 70 etanol ve santrifüj ile bir kez ürün yıkayın.
- 5-15 dakika boyunca pele'yi süpernatant ve hava kurutun. Pelet'i 40 μL'ye kadar nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın (bu hacim izole pelet boyutuna göre ayarlanabilir) ve 2.1.4'te açıklandığı gibi verim ve saflığı spektrofotometrik olarak değerlendirin.
- Saflaştırılmış dsRNA'yı daha fazla kullanım anına kadar -20 °C'de saklayın. İstenilen gelişim aşamasında enjeksiyon için saflaştırılmış dsRNA kullanın.
- Elde edilen ürünü 115°L nükleaz içermeyen su ile seyreltin ve 15 μL 3 M sodyum asetat ekleyin. Bu reaksiyon karışımına 2 cilt buz gibi %100 etanol ekleyin ve dsRNA'yı bir gecede -20 °C'de çökeltin.
- PCR amplifikasyon ve ürün arıtma
3. DsRNA enjeksiyonları için erken evre T. marmoratus embriyolarının toplanması ve hazırlanması
- T. marmoratus embriyolarının kuluçkaiçin bir agarose plakası hazırlayın.
- İlk olarak, otoklavdist distile su 100 mL düşük eriyen agarose tozu 20 mg çözün ve net bir çözüm elde edilene kadar bir mikrodalga bu karışımı kaynatın. Hava kabarcıkları taşma neden olabilir gibi sıcak çözelti ile dikkat edin.
- Küçük bir Petri kabına bu çözelti dağıtın. Agarose plakasının yüzeyine oluklar (embriyoları tutacak) yapmak için, katılaşmadan önce sıvı agarose'un yüzeyine üç adet 1-2 mm genişliğinde plastik boru (plastik transfer pipetleri gibi) yerleştirin.
- Bir kez agarose katılaşmak, bu tüpleri kaldırmak için künt forceps bir çift kullanın. Agarose'daki bu girintiyi kapsayacak şekilde P1000 mikropipet kullanarak 500 μL otoklavlı distile su ekleyin.
- Ince bir doğal saç boya fırçası kullanarak, otoklavlı distile su ile dolu bir cam kavite çanak böcek yuvalama sitelerinden 5-8 saat eski T. marmoratus embriyolar toplamak. Elde edilen yumurtaların uygun yaşta olduğundan emin olmak için yuvalama alanlarını sık sık izleyin.
- İnce diseksiyon forceps kullanarak bir stereomikroskop altında embriyolar dechorionate. Bunu yapmak için, uygun bir açıda ışık kaynağı konumlandırarak mikroskop altında chorion görselleştirmek (istenilen büyütme), sonra keskin çerkeler ile iki taraftan chorion kapmak, açık rip, ve yavaşça embriyo dışarı slayt. İki katman olduğundan, her ikisinin de kaldırıldığından emin olun.
- İnce bir doğal saç boya fırçası kullanarak, dikkatle agarose plaka için cam kavite çanak embriyolar transfer ve stereomikroskop altında oluklar onları düzenlemek. Dechorionated embriyolar çok kırılgan olduğu gibi, bu işlem sırasında büyük özen. DsRNA enjeksiyonları için hazırlanan embriyoları kullanın.
NOT: Biraz daha kalın olan uç, embriyonun başın gelişeceği tarafıdır.
4. erken evre T. marmoratus embriyolarında dsRNA mikroenjeksiyonları
- Erken evre embriyolara genlere özgü dsRNA enjekte etmek için mikroenjeksiyon iğneleri mikroenjeksiyon iğnesi kullanarak hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). İğne ucunu stereomikroskop altında görselleştirirken, iğne ucunu kırmak için bir çift ince çalgı kullanın ve keskin bir kenar yaratın. İdeal olarak, iğne ucunu çapraz olarak kırın, böylece daha keskin bir kenar bir tarafta kalır, bu da embriyoya girmesini sağlarken en az yaralanmaya neden olur.
- Buz üzerinde saflaştırılmış stok dsRNA çözeltisi çözülür, 10x enjeksiyon tampon 1 μL ekleyin ve çift distile su ile üst, enjeksiyon çözeltisi 10 μL yapmak için. Enjeksiyonlar için, 1 μg/μL dsRNA konsantrasyonu genellikle uygundur ancak ortaya çıkan hayvanların henotipik şiddetine göre ayarlanabilir).
NOT: 1 mL 10x enjeksiyontamponu 22 0,1 M sodyum fosfat tamponu (1 M Na2HPO4 8.5 mL ve 1.5 mL 1 1 mL karıştırılarak yapılır 10 μL ekleyerek hazırlayın M NaH2PO4, 100 μL 0,5 M KCl, 100 μL gıda boyası ve 790 μL çift distile su ile 25 °C'de 7,6 pH'ya ayarlanır.- P10 pipetkullanarak mikroenjeksiyon iğnesini çalışan dsRNA çözeltisi ile doldurun. Çözelti iğnenin ucunu doldurduktan sonra, basınç ejeksiyon teknolojisini kullanan bir mikroenjeksiyon sistemine bağlı bir mikroiğne tutucuya takın (bkz. Malzemeler Tablosu).
- Mikroenjeksiyon sistemini ve basınçlı hava kaynağını açın. Mikroenjeksiyon sistemindeki mikrovalfkullanarak enjeksiyon basıncını 15 psi'ye ayarlayın. Zaman ayarlama sıyrıklarını kullanarak enjeksiyon süresini ayarlayın ("Saniye" olarak ayarlayın).
- Enjeksiyon süresi gerekli enjeksiyon hacmine bağlı olduğu için, gerekirse bu parametreyi her enjeksiyondan önce mikroenjeksiyon sisteminde ayarlayın. Erken evre T. marmoratus embriyoları için 1-2 nL enjeksiyon hacmi kullanın.
NOT: Yüksek enjeksiyon hacimleri embriyo sağkalım oranını etkileme eğilimindedir.
- Enjeksiyon süresi gerekli enjeksiyon hacmine bağlı olduğu için, gerekirse bu parametreyi her enjeksiyondan önce mikroenjeksiyon sisteminde ayarlayın. Erken evre T. marmoratus embriyoları için 1-2 nL enjeksiyon hacmi kullanın.
- Mikroenjeksiyon sistemi tarafından dağıtılan enjeksiyon sıvısının hacmini ölçmek için, havaya enjekte ederken iğnenin ucunda oluşan sıvı kabarcığının hacmini değerlendirerek enjeksiyon iğnesini kalibre edin. T. marmoratus embriyoları için 100-200 m optimum kabarcık boyutu kullanın. Enjeksiyon iğnesi, 15 psi'de ~3 s enjeksiyon süresi ile elde edilebiliyorsa kalitelidir.
- İğneyi ve embriyoları içeren agarose plakasını stereomikroskop altında hizalayın, öyle ki iğne embriyolara 45° ile 60° arasında bir açıyla yaklaştığında.
- Mikromanipülörü kullanarak, stereomikroskoptaki ilerlemeyi izlerken mikroiğneyi yavaşça hareket ettirin. İğnenin ucu bir embriyonun yüzeyine değdikten sonra, iğneyi embriyonun yüzeyini delip geçinceye kadar dikkatlice ileri doğru hareket ettirin. Bu embriyonun hayatta kalmasını etkileyebileceğinden, iğne ucuyla embriyoyu derinden delikletmeyin. Değişkenliği azaltmak için, embriyonun ortasında enjeksiyon teslim.
- İğne embriyonun içine girdikten sonra, mikro enjektörün enjeksiyon düğmesine dikkatlice basarak embriyoya dsRNA dozunu iletin. DSRNA'nın 1-2 nL'sini enjekte ettikten sonra, embriyonun kopmasına neden olmayacak şekilde iğneyi yavaş yavaş embriyodan geri çekin.
- Diğer embriyoları da benzer şekilde enjekte edin. İşlem sırasında mikroenjeksiyon iğnesi tıkanırsa, enjeksiyon basıncını ve süresini artırarak blokeyi kaldırın. Enjeksiyon yerinde renkli bir nokta nın varlığı yla başarılı bir şekilde enjekte edilen embriyoları görsel olarak tanımlayın (enjeksiyon tamponu gıda boyası içerdiğinden).
- Dikkatle bir nem odasında enjekte embriyolar ile çanak yerleştirin.
- Böyle bir oda inşa etmek için, bir kapak ile herhangi bir plastik kutu almak,% 70 etanol ile sterilize, kurumasını bekleyin, ve nemli bir ortam sağlamak için alt otoklavlı su batırılmış doku yerleştirin. Bu nem haznesini uygun bir sıcaklıkta (bu durumda 25 °C) ve 14 saat açık ve 10 saat karanlık ışık döngüsüne sahip bir kuvöze yerleştirin.
- Enjekte edilen embriyoların 4-5 gün gerektiren ilk instar larvalarına dönüşmesine izin verin. Şekil 2'debetimlendiği gibi morfolojik olarak görünür nakavt fenotipleri tanımlamak için bir stereomikroskop kullanarak embriyo gelişiminin ilerlemesini günlük olarak izleyin.
- Yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanarak dijital görüntüler çekerek bu ilerlemeyi belgele. Ölü embriyoları çıkarın ve kuluçka döneminde mikrobiyal kontaminasyonun diğer embriyolara yayılmasını ve kurumasını önlemek için her gün agarose plakaüzerindeki suyu yenileyin.
- Tampon enjeksiyonları, ilgi geninin duyu teli karşı sentezlenen dsRNA enjeksiyonları ve hedef organizmaiçinde bulunmayan dizilere karşı sentezlenen dsRNA enjeksiyonları dahil olmak üzere dsRNA enjeksiyonları için uygun kontrolleri yapın. Ek moleküler yöntemler kullanarak RNAi nakavt teyit22.
5. DsRNA enjeksiyonları için T. marmoratus larvalarının hazırlanması
NOT: Erken evre embriyoların aksine, T. marmoratus larvaları nispeten sağlamdır ve daha büyük hacimlerde enjekte edilebilir. Örneğin, ikinci yıldızlara 2 μL'ye kadar dsRNA çalışma çözeltisi ve üçüncü yıldız adedi en az 3 μL ile enjekte edilebilir ve hayatta kalma oranı üzerinde fark edilebilir olumsuz etkiler etüt edilemez. DSRNA enjekte etmek için, larvaları agarose'a yerleştirerek hareketsiz hale getirmek faydalıdır.
- Larvaları toplamadan önce, %2 agarose eritin ve sıvı halde tutmak için 60-70 °C'de bir su banyosunda saklayın. Küçük bir Petri kabına eritilmiş % 2 agarose dökerek bir immobilizasyon kabı hazırlayın ve katılaştırılına kadar soğutun. Enjekte edilecek her hayvan için agarose plaka (kabaca katıştırılmış eklembacaklı boyutu) sığ bir oluk yapmak için künt forseps kullanın.
- Uygun gelişim aşamasında genç larvaları toplayın (analiz için istenilen aşamadan bir aşamada önce). Bunu yapmak için, larva içeren kültür bardakları dikkatle su drenaj ve aşağıda belirtilen adımları izleyin.
- Buz üzerinde anestezi (dikkatle su bardağından larva dışarı almak ve yavaşça buz üzerine yerleştirin) larva kayda değer bir hareket gösterene kadar. Larvayı buzdan dikkatlice kaldırmak ve boynu ve gövdesi olukta, fakat kuyruğu agarose yüzeyinin üzerinde yer alan ve larvanın kuyruk kulelerinden nefes almaya devam etmesini sağlayan, kapalı olmayacak şekilde immobilizasyon aşamasına yerleştirmek için künt, yumuşak uçlu forsepsler kullanın.
- Hala sıvı ama tehlikeli sıcak değil agarose kalın bir tabaka ile larva kapağı. Yanlışlıkla kaplanmışsa, kuyruğu ve altındaki iki parçayı agarose'dan kurtarmak için püzifleri kullanın. Agarose katıladıktan sonra dsRNA enjeksiyonları için larva kullanın.
6. T. marmoratus larvalarında dsRNA mikroenjeksiyonları
- Bir mikroenjeksiyon iğnesini istenilen miktarda gen-spesifik dsRNA çalışma çözeltisi ile hazırlayın ve geri doldurun (4.1-4.2 adımlarında açıklandığı gibi). İğneyi elle kontrol edilen bir mikroenjeksiyon şırıngasına bağlı bir iğne tutucuya takın. İğneyi takmadan önce, enjeksiyon basıncının orta prosedürünün bitmemesi için şırınga pistonunu baştan dışarı çekin.
- Hareketsiz larvayı, üçüncü ve dördüncü gövde plakası segmentleri arasında yer alan enjeksiyon bölgesinin mikroenjeksiyon iğnesinin yörüngesiyle nispeten düz bir açıyla (sahneye neredeyse paralel) hizalandığı şekilde yerleştirin.
NOT: İğne ve larvayı bu pozisyonda oltalamak önemlidir, çünkü iğne ucunun larvaları en az hasarla deliklepertisi için en az direnç sağlar. - İğne ve larva konumlandırıldıktan sonra, bir stereomikroskop ile ilerlemeyi izlerken mikromanipülatör kullanarak iğne ucunu dikkatlice larvaya taşıyın.
- Ucu dokuyu deliklettikten sonra şırıngaya yavaşça ve dikkatlice basınç uygulayın. Mikroskop altında iğnerenkli enjeksiyon sıvısının hareketini gözlemleyerek enjeksiyon basıncını ayarlayın.
- İğneden sonra iğneyi dikkatlice geri çek. Soymak ve dolayısıyla agarose dan larva serbest yumuşak forceps kullanın. Larvayı su içeren bir kap içine geri aktarın (oda sıcaklığında) ve 25\u201228 °C'de bir kuluçka veya kültür odasında daha da gelişmesini ve 14 saat açık ve 10 saat karanlık bir ışık döngüsüne sahip olmasını bekleyin.
- Adım 4.10'da belirtildiği gibi uygun kontrol enjeksiyonları ve nakavt nicelikleri çalıştırın.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, sunburst Dalış Beetle T. marmoratusfarklı gelişim aşamalarında, yani, beyaz, laccase2 (laccase2( lac2 ), ve Lens3 (Tablo 1),üç farklı genler devirdi . T. marmoratus'ta embriyogenez sırasında çok erken bir aşamada dsRNA enjekte ederek RNAi uyguladık (Şekil 1A). Bazı embriyolar süreci hayatta ve nekrotik açmak gibi(Şekil 1B),onlar kalan embriyolar sağlıklı tutmak için kaldırılması gerekir. Burada örnek olarak beyaz genkarşı dsRNA enjeksiyonları vardır. Bu gen iyi gözpigmenti 23öncüleri alımı ve depolanmasında yer üç ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları biri olarak Drosophila bilinmektedir. Buna göre, fonksiyon kaybı pigmentsiz, beyaz göz fenotip ile sonuçlanır. Sonuçlarımız, T. marmoratus embriyolarında ortolog beyaz geni hedef alan dsRNA enjeksiyonlarının yeni ortaya çıkan larvalarda göz pigmentasyonu kaybına yol açtığını göstermektedir. Bu durumda, yabani tip larvalar ağır pigmentli gözler ile karakterizedir, ve beyaz RNAi nakavt azalma ve göz pigmenti bile tam ortadan kaldırılması çeşitli düzeylerde yol açar. Genel olarak, hayatta kalan embriyoların %34'ünde göz renginde en az bir azalma gözlendi (n = 35). Şekil 2A, kontrol bireyini ve biraz daha açık göz rengi olan bir bireyi karşılaştırır. Şekil 2B bir bireyde daha şiddetli bir nakavt göstermektedir, hangi kümenin daha ventral gözleri (Gözler 2-5) tamamen pigmentsiz, sırt gözleri hala bazı pigmentasyon gösterir. Bu farklılıklar, nakavtın etkinliğinin bölgesel olarak nasıl değişebileceğini vurgulamaktadır, ki bu da yoğun dokudaki dsRNA penetrasyonunun etkinliğindeki farklılıklarla ilişkilidir. Başka bir birey aslında tüm gözlerde tam pigment kaybı gösterir(Şekil 2C).
RNAi'nin T. marmoratus'unlarva evresinde ne kadar iyi çalıştığını araştırmak için, üçüncü yıldız aletine erimeden birkaç gün önce tannik gen lac2'yi hedefleyen dsRNA enjekte ettik (Şekil 3) ve üçüncü yıldız larvalarının cuticular renklendirmesi üzerindeki etkisini değerlendirdik. Lac2 oksidatif onları çözünmez yapmak için proteinleri biraraya getiren fenoloksidaz türüdür, sert, ve koyu. Un böceği T. castaneum Knockdown düşük dozlarda hafif renkli bireylere yol gösterilmiştir ama yüksek dozlarda ölümcül olarak kabul edilir24. Şekil 4 bu tedavi de açık renkli Sunburst Dalış Beetle larvayol göstermektedir. Özellikle, bu deneyde, hayatta kalan enjekte edilen larvaların %75'i (n = 12) pigmentasyonu azaltmıştır (kontrol grubunda %0'a kıyasla). Şekil 4A göreceli olarak hafif depigmentasyona sahip bir bireyi gösterirken, Şekil 4C, manikülün koyu renklenmesinin neredeyse yok olduğu bir T. marmoratus larvasının başını göstermektedir. Depigmentasyon özellikle bu larvalar için tipik olan merkezi koyu desenleme de belirgindi, bu desen kontrol enjekte edilen bir bireyde açıkça görülebiliyordu(Şekil 4B). Buna ek olarak, Şekil 4D'degörüldüğü gibi kuyruk trakeasının hafifletilmesi gözlenmiştir. Lac2 dsRNA'nın üçüncü instar larvalarına enjekte edildiği durumlarda daha hafif erişkin bireyler elde edilmiştir(Şekil 5). Knockdown böceğinin kanatlarının, muhtemelen alışılmadık yumuşaklığı nedeniyle biraz deforme olduğunu unutmayın.
Morfolojik özellikleri değiştirmenin yanı sıra, davranışı etkileyen genleri hedeflemek için RNAi kullanmak mümkündür. Bunu göstermek için, biz önemli bir lens protein kodlama geni karşı RNAi yapıldı, Lens318, ve üçüncü instar larva gözlerinin optik özelliklerini etkilemek için ikinci instar larva içine enjekte. T. marmoratus larvagözleri de objektif25büyük optik değişiklikler içerir bu geçiş, büyük göz büyümesi geçmesi nedeniyle burada gözlenen lens üzerinde herhangi bir etki muhtemeldir . Bu deneyde RNAi nakavt son derece verimli oldu. QPCR ile doğrulama% 100 başarı oranı gösterdi; test edilen 13 bireyden 12'si kontrol bireylerinin ifade düzeyinin %10'undan azına düşürülerken, geri kalan birey kontrol seviyesinin %17'si (yayınlanmamış gözlem) ifade düzeyine sahip oldu. Henotypik düzeyde, sadece bazı bireyler ağır özürlü veya av yakalama aciz, Şekil 6'da tekrar tekrar çok yakın bir mesafeden avı yaklaştı ama sürekli overshot bir birey için gösterildiği gibi.
Tablo 1: Beyaz, lak2 ve Lens3 proteinleri için astar dizileri ve amperler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 1: Embriyo enjeksiyonlarının illüstrasyonu. (A) Dechorionated embriyolar bir agarose plaka üzerinde dizilmiş ve dsRNA ve gıda boyası içeren enjeksiyon tampon udoldurulmuş bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanarak kendi merkezine yakın enjekte. Ölçek çubuğu 500 μm'yi temsil eder. (B) Daha şiddetli bir nakavt ile bir birey. Enjekte edilen embriyolar nem odasında tutulur ve fenotipleri puanlamak ve ölü bireyleri çıkarmak için her gün izlenir (kahverengiye dönüşür). Ölçek çubuğu 5 mm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Beyaza karşı dsRNA enjekte edilen tam gelişmiş embriyo örneği. (A)Göz pigmentasyonunda azalma olan bir bireyin karşılaştırılması (solda) ve kontrole enjekte edilen bir bireyin (sağda). E1-E6, Eyes 1-6'ya bakınız. (B) Daha şiddetli bir nakavt fenotip ile bir birey, hangi göstermektedir, zaman zaman, küme içinde bazı gözler daha ciddi diğerlerinden daha nakavt etkilenir. (C) Göz pigmentasyonu neredeyse tam kaybı ile bireysel. Ölçek çubuğu 200 μm'yi temsil eder; B ve C panelleri aynı ölçekte temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Larva enjeksiyonlarının çizimi. (A) Kuyruk kuleleri herhangi bir agarose açık bırakılan% 2 agarose gömme tarafından hareketsiz birkaç larvalar. (B) Ucu iki segment arasındaki ince membrana nüfuz edebilmesi için yerleştirilen enjeksiyon çözeltisini içeren mikroelektrot. (C) Enjeksiyon dan sonra enjeksiyon yerinde görülebilen mavi enjeksiyon boyası. Ölçek çubukları 1 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Laccase2 için RNAi ikinci instar larvalarına uygulanır ve üçüncü instar larvalarında azalmış milet rengi elde edin. (A) Bir lac2 RNAi bireysel renklendirme nispeten hafif kaybı (alt) bir kontrol enjekte birey (üst) ile karşılaştırıldığında. Ölçek çubuğu 5 mm. (B) Başın ortasında karakteristik koyu renkli deseni gösteren bir kontrol bireyinin başını temsil eder. (C) Lak2 nispeten şiddetli nakavt merkezi baş renklendirme neredeyse tam kaybına yol açan. (D) Bir lac2 RNAi bireyin büyük kuyruk cuticle renkkaybı (alt) bir kontrol enjekte birey (üst) ile karşılaştırıldığında. B\u2012D'deki ölçek çubukları 1 mm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Laccase2 için RNAi üçüncü bir instar larvasına uygulanır ve bu da bir yetişkinde daha az mite renklendirmeile sonuçlanır. Knockdown bireysel (sol) da kontrol (sağ) ile karşılaştırıldığında çok yumuşak elytra ile karakterizedir. Ölçek çubuğu 5 mm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Av yakalama eksikliklerine yol açan büyük bir lens proteininin nakavtı. (A–C). Optik açıkların RNAi aracılığıyla indüklendiği Sunburst Diving Beetle larvası avını (sivrisinek larvaları) yakalayamadıkları üç örnek. Temsili hareketsiz görüntüler karakteristik av yakalar bir video kaydı seçildi. (D) Avını yakalayan larvayı kontrol edin. Tüm ölçek çubukları 2 cm.'yi temsil eder.
Discussion
Amacımız, bu yöntem derlemesi RNAi'yi yaygın olarak kullanılabilir hale getirecektir, özellikle de bu araç CRISPR/Cas9 tabanlı gen düzenlemesi için güçlü bir sinerjik teknik olmaya devam ettiği için, incelenen organizmaların istenilen gelişim evrelerine uygulanabileceği avantajıyla. Bu gücü örneklemek için dsRNA'yı embriyolara ve farklı larva aşamalarına enjekte ettik. Yumurtalara yapılan enjeksiyonlar embriyoların gelişimini etkilemiştir(Şekil 2),ikinci larva evresine yapılan enjeksiyonların üçüncü larva evresinde belirgin etkileri vardı (Şekil 4 ve Şekil 6), üçüncü larva evresine yapılan enjeksiyonlar erişkinlerde etkili oldu(Şekil 5). Tam zamanlama deneysel olarak belirlenmek zorunda olsa da, genellikle, enjeksiyonlar birkaç gün içinde yürürlüğe girer. Bu işlemin başarısı dsRNA dizisinin uzunluğundan etkilenebilir. Burada, 800 bp'den biraz fazla 200 bp kullanarak örnekler sunduk. Genel bir kural olarak, 100 ve 600 bp arasındaki diziler hedef dışı efektleri sınırlamak için tercih edilir, ancak 1000 bp'ye kadar olan diziler iyi sonuçlar verir22. RNAi ile ilgili bir soru bu teknik ile elde edilebilir nakavt süresidir. Fenotipler her aşamada terminal olduğundan, sunulan sonuçlara dayanarak bu konuda yorum yapamayız. Ancak, daha önce RNAi etkileri genellikle nispeten uzun ömürlü olduğunu ve yüksek konsantrasyonlarda daha uzun süreli knockdowns yol dikkat edilmiştir20.
Bu tekniğin bir sınırlama diğerlerine göre bazı organizmalar için daha iyi çalışıyor olmasıdır, ve ne kadar iyi bir priori çalışacağını tahmin doğrudan bir yolu var gibi görünüyor. Bununla birlikte, farklı organizmaların geniş bir yelpazede iyi çalışması bulunmuştur. Eklembacaklılar içinde, bu araknids içerir26, kabuklular27, ve böceklerin çeşitli, böceklerde özellikle yüksek başarı oranları ile28. Bir diğer komplikasyon da, aynı miktarda dsRNA uygulanmasına rağmen bireyler arasında fenotip şiddetinde farklılıklar ın meydana gelmesidir. Şekil 2B'degösterildiği gibi, varyasyon bir birey içinde bile oluşabilir. T. marmoratus larva göz gelişiminde yer alan farklı genleri hedef alan RNAi çalışmalarımızda, bazı gözlerin diğerlerinden daha ciddi şekilde etkilendiğini sık sık gördük. Bu fenomen göz kümesinin nispeten yoğun doku ile ilgili olabilir, dsRNA daha iyi bazı birimleri ulaşmak mümkün.
RNAi deneylerinin başarılı bir şekilde yürütülmesi için, hedef gen için çeşitli parametrelerin optimize edilmiş olması önemlidir. Örneğin, dsRNA konsantrasyonu ve hedeflenen genin uzunluğu kuvvetle sonucu etkileyebilir20. Bu işlem hayatta kalma oranını büyük ölçüde etkileyebildiği için, bir diğer kritik parametre de enjeksiyonların nasıl yürütüldedildiğidir. Embriyolar için, embriyonun merkezini hedefleyerek en iyi sonuçları elde ettik. İyi hazırlanmış bir tabak, tek bir seansta 100 veya daha fazla embriyo enjeksiyonuna olanak tanır. Larvalar için enjeksiyon iğnesinin segmentler arasına yerleştirilmesi çok önemlidir. Bu enjeksiyonlar daha fazla dsRNA gerektirir ve larva larına uygunluğunu temel alan enjeksiyon setlerimiz genellikle bir seferde sadece birkaç hayvandan oluşuyordu. Tüm enjeksiyonlar için havanın organizmaya girmesini önlemek çok önemlidir.
Bazı durumlarda, bir gen düzenleyici ağ ve genetik fazlalık geribildirim döngüleri Tutarlı knockdowns rağmen, RNAi fenotiplerin penetrasyon etkileyebilir. Bu önemli bir lens proteini, Lens318son derece başarılı knockdowns ile larva bizim davranışsal gözlemler için durum gibi görünüyor . Bu nakavtların yüksek verimliliğini qPCR ile doğrulasak da, ilişkili fenotiplerde önemli farklılıklar gözlenmiştir. Bu sonuç, RNAi knockdowns düzgün niceleme gerekliliğini vurgulamaktadır (seçenekler hakkında ayrıntılı bilgi içinbkz. 22). Ortaya çıkan fenotipler ile ilgili net bir priori beklentisi yoksa, RNAi'nin hedef dışı etkilerini kontrol etmenin iyi bir yolu aynı geni iki örtüşmeyen dsRNA dizisiyle hedeflemek ve ortak fenotiplerin sonuçlarını değerlendirmektir.
Gen düzenleme tekniklerinin aksine, RNAi aynı zamanda ölümcül genleri incelemek için güçlü bir araçtır ve bunu yapmanın iki yolu vardır. Örneğin, gelişmenin erken dönemlerinde fonksiyon kaybının ölümcül olduğu bilinen bir genin işlevsel katkısı yla ilgileniyorsanız, böyle bir genin fonksiyonel bir incelemesi sadece hayvanın normal gelişimine izin vererek ve daha sonra geliştirmede (yani yetişkinde) RNAi ile geni devirerek elde edilebilir. Alternatif olarak, tam fonksiyon kaybının ölümcül olduğu bilinen bir gen kısmi bir nakavt yoluyla araştırılabilir, bu da bir dizi dsRNA konsantrasyonu enjekte edilerek elde edilebilir. Bazı sonuçlarımız, böceklerdeki miğverin aşırı yumuşak olması durumunda öldürücü olduğu bilinen lac2'ninyıkılışlarını göstermektedir24. Şekil 5'te betimlenen lac2 RNAi böceğinin bile laboratuvar koşulları dışında hayatta kalması pek olası değildir. Başka bir ölümcül gen kesilir, eklembacaklılar çeşitli organ sistemlerinde hücre kaderi özellikleri için temel bir transkripsiyon faktörü için kodları ve Drosophila görme sisteminde glia gelişimi ile bağlantılı olmuştur29. T. marmoratus embriyolarındaki kesik RNAi ile ilgili deneyimimize dayanarak, embriyonik göz gelişimini (yayınlanmamış gözlemler) tamamlayabilen embriyolarda bilgilendirici göz fenotiplerini çağrıştırabiliriz. Burada, daha yüksek dozlarda yüksek öldürücüoranları yol görünür, düşük dozlarda gözlemlenebilir ve bilgilendirici fenotipler neden iken.
Protokolümüz sadece bir araştırmacı nın T. marmoratusüzerinde RNAi deneylerini sürdürmesi için gerekli adımları listelemekle kalmıyor, aynı zamanda genellikle diğer organizmalar, özellikle de sucul organizmalar için de geçerlidir. Sucul organizmalar arasında, su pireleri Daphnia30 ve karides gibi kabuklular içinde zaten birkaç örnek vardır (yeni bir inceleme için, referans31bakınız). Sucul böcekler arasında bol miktarda fırsat vardır, çünkü tüm böcek çeşitliliğinin yaklaşık %6'sını oluşturduğu tahmin edilmektedir, muhtemelen 200.000'den fazla tür32. Ayrıca, RNAi zaten su ortamlarının yüzeyinde yaşama eğilimindedir su striders üzerinde yapılmıştır33. Genom yoksa, bir transkripsiyon de novo monte edilebilir. Bu süreç birkaç yüz nükleotitin bitişiklerini ortaya çıkardığı sürece, belirli genlere karşı dsRNA tasarlanabilir. Agarose'daki böcekleri hareketsiz hale getirme protokolümüz, özellikle yumuşak, yumuşak ve sucul organizmalar için diğer işlemler için de yararlı olacaktır. Birlikte ele alındığında, RNAi organizmaların farklı bir grup gen ekspresyonu manipüle etmek için güçlü bir teknik olmaya devam etmektedir, başka moleküler ve genetik araçlar mevcut olsa bile.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz editör yardım için Sunburst Dalış Beetles ve Tamara Pace yetiştirme onun yardım için biyoinformatik Hailey Tobler ile yaptığı yardım için Dr Josh Benoit teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı tarafından EKB'ye IOS-1456757 ve IOS-1856341 ve YT'ye IOS-1856341 hibeleri kapsamında desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
- Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
- Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
- Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Mello, C. C., Conte, D.
- Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
- Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
- Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
- ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
- Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
- Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
- Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
- Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
- Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
- Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
- Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
- Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
- Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
- Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
- Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).
