RNA-interferens er en allment anvendelig, kraftig teknikk for manipulering av genuttrykk på bestemte utviklingsstadier. Her beskriver vi de nødvendige trinnene for å implementere denne teknikken i den akvatiske dykkerboblen Thermonectus marmoratus, fra oppkjøpet av gensekvenser til knockdown av gener som påvirker struktur eller atferd.
RNA interferens (RNAi) er fortsatt en kraftig teknikk som muliggjør målrettet reduksjon av genuttrykk gjennom mRNA nedbrytning. Denne teknikken gjelder for et bredt utvalg av organismer og er svært effektiv i den artsrike rekkefølgen Coleoptera (biller). Her oppsummerer vi de nødvendige trinnene for å utvikle denne teknikken i en ny organisme og illustrere dens anvendelse på de ulike utviklingsstadiene av den akvatiske dykkerboblen Thermonectus marmoratus. Målgensekvenser kan oppnås kostnadseffektivt gjennom montering av transkripsjoner mot en nær slektning med kjente genomikk eller de novo. Kandidatgenkloning benytter en bestemt kloningvektor (pCR4-TOPO plasmid), som gjør det mulig å syntese dobbelttrådet RNA (dsRNA) for ethvert gen ved bruk av en enkelt vanlig primer. Syntetisert dsRNA kan injiseres i enten embryoer for tidlige utviklingsprosesser eller larver for senere utviklingsprosesser. Vi illustrerer deretter hvordan RNAi kan injiseres i akvatiske larver ved hjelp av immobilisering i agarose. For å demonstrere teknikken gir vi flere eksempler på RNAi-eksperimenter, og genererer spesifikke knockdowns med spådde fenotyper. Spesielt fører RNAi for solingsgenet laccase2 til cuticle lightening hos både larver og voksne, og RNAi for øyet pigmentering genet hvit produserer en lightening / mangel på pigmentering i øyerør. I tillegg fører knockdown av et viktig linseprotein til larver med optiske mangler og redusert evne til å jakte byttedyr. Til sammen eksemplifiserer disse resultatene kraften til RNAi som et verktøy for å undersøke både morfologiske mønstre og atferdstrekk i organismer med bare transkripsjonsdatabaser.
Spørsmålet om hvordan spesifikke gener bidrar til utviklingen av ulike egenskaper er et spennende tema i biologi. I løpet av de siste tiårene har det blitt gjort mye fremgang med hensyn til å dissekere de genetiske grunnlaget for utviklingsprosesser i noen få modellorganismer, som nematoden Caenorhabditis elegans, fruktfluen Drosophila melanogaster, og husmusen Mus musculus1. Mer nylig har oppfinnelsen av kraftige genredigeringsteknikker som gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / Cas92 gitt muligheten til å endre den genetiske koden til ikke-modellorganismer (for eksemplerse 3,4). Som et resultat har det vært en økning i genetiske studier på en rekke organismer som ikke tidligere hadde blitt kontaktet gjennom molekylære teknikker. Tatt i tanke på det enorme mangfoldet i vårt dyrerike, med mange interessante egenskaper eller egenskapsavvik som bare er representert i bestemte arter, har denne fremgangen gjort det til en spennende tid for evolusjonær utviklingsbiologi (“evo-devo”) relatert arbeid. Genomredigeringsteknikker som er tilgjengelige for ikke-modellorganismer er imidlertid relativt begrenset med hensyn til utviklingstiden som de kan brukes på, noe som gjør det utfordrende å skjelne de timelige egenskapene knyttet til rollen som spesifikke gener spiller i enhver egenskap. I tillegg er transgene teknikker ofte begrenset til gener som ikke er essensielle for overlevelse (det vil si hvis knockout ikke resulterer i dødelighet). Derfor, mens genredigeringsteknikker har begynt å bli populære, er det fortsatt behov for effektive teknikker som gjelder for en rekke forskjellige organismer på bestemte utviklingstidspunkter og letter delvise knockdowns (i stedet for fullstendig tap av funksjon). Her trekker vi oppmerksomhet til RNA interferens (RNAi), en noe datert, men kraftig gen knockdown teknikk5 som er spesielt verdifull som en synergistisk tilnærming til genredigering. Spesielt utviklet vi prosedyrer som tillater bruk av RNAi til akvatiske dykkerbagler som et eksempel som illustrerer implementeringen av denne teknikken, fra oppkjøpet av de nødvendige molekylære sekvensene til vellykket injeksjon av dobbelttrådet RNA (dsRNA) i egg og larver.
RNAi-basert genbanke ned utnytter en medfødt forsvarsmekanisme av organismer, der dsRNA molekyler letter deaktivering av invaderende nukleinsyresekvenser, for eksempel virus og transposoner6. Kort sagt, dsRNA er tatt opp i cellen, hvor det er skåret i 20-25 nukleotid stykker av Dicer enzymet. Disse bitene aktiverer deretter dannelsen av RNA-indusert deaktiveringskomplekset (RISC), som hemmer målrettet mRNA ved å binde seg til den på bestemte steder ved hjelp av føringsstrengen. Denne prosessen fører til slutt til mRNA nedbrytning og dermed forstyrrer oversettelsen av mRNA til det respektiveproteinet 6. Den RNAi-baserte genbanketeknikken som presenteres her, er derfor avhengig av injeksjon av dsRNA. For dyremodeller ble denne teknikken opprinnelig utviklet i C. elegans7 og D. melanogaster8, men har siden dukket opp som et kraftig funksjonelt genetisk verktøy i ikke-modellorganismer 9,10. På grunn av sin svært effektive natur i noen insekter, kan RNAi til og med brukes i skadedyrsbekjempelse11.
Som et forskningsverktøy har RNAi blitt brukt til å undersøke hvordan viktige molekylære utviklingsveier fungerer i utradisjonelle insektmodeller. For eksempel har RNAi i melbillen Tribolium castaneum vært medvirkende til å bestemme hvor dypt bevarte gener bidrar til spesifikke egenskaper i den boblen, som eksemplifisert for utviklingen av spesielt formede vinger12,,13,,14 og øyne15,16. Teknikkene som ligger til grunn for manipulasjonene i T. castaneum har blitt godtbeskrevet 17 og er avhengige av evnen til å immobilisere relativt tørre egg og larver på en klebrig overflate. Slik immobilisering er imidlertid ikke mulig for de våte utviklingsformene for vannlevende organismer som Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Som tilfellet er for mange utradisjonelle modellorganismer, mangler det et kommentert genom. For å manipulere genuttrykk i enhver organisme uten genom, er et rimelig og kostnadseffektivt første skritt å generere transkripsjoner og identifisere de antatte nukleotidsekvensene av de uttrykte opprinnelsesgenene basert på sekvens likhet med relaterte, men mer etablerte modellorganismer, i dette tilfellet primært Tribolium (Coleoptera) og Drosophila gener.
Her, for å demonstrere hvordan RNAi kan brukes på en vannlevende organisme, diskuterer vi først protokoller og programvare for RNA-ekstraksjon og transkripsjonsgenerering og montering, noe som tillater identifisering av spesifikke målrettede gensekvenser. Deretter oppsummerer vi de nødvendige trinnene for å syntetisere genspesifikk dsRNA. Deretter illustrerer vi hvordan egg kan injiseres i et akvatisk miljø og demonstrere inkubasjonsprotokoller for å dyrke utvikle embryoer. I tillegg viser vi hvordan agarose gel kan brukes til å helt immobilisere larver under injeksjonsprosessen, en teknikk som generelt er nyttig under ulike prosedyrer og kan brukes på en rekke leddyr. For å demonstrere hvordan RNAi kan brukes på ulike utviklingsstadier, inkluderer vi et eksempel der vi dempet øyetpigmenteringsgenet hvitt i embryoer. I tillegg beskriver vi et eksempel der solingsgenet laccase2(lac2) ble dempet under både den andre larvalinstar (for å påvirke larver av den tredje larval instar) og den tredje larval instar (for å påvirke voksne). Til slutt viser vi at injeksjonen av en lavere konsentrasjon av dsRNA fører til delvis nedslag, noe som viser at denne teknikken også kan brukes på gener der tap av funksjon er kjent for å være dødelig.
Vårt mål er at denne samlingen av metoder vil gjøre RNAi allment tilgjengelig, spesielt etter hvert som dette verktøyet forblir en kraftig synergistisk teknikk til CRISPR/Cas9-basert genredigering, med den fordelen at det kan brukes på de ønskede utviklingsstadiene av studerte organismer. For å eksemplifisere denne styrken injiserte vi dsRNA i embryoer og inn i forskjellige larvestadier. Injeksjoner i egg påvirket utviklingen av embryoer (figur 2), injeksjoner i det andre larvalstadiet hadde tilsynelatende effekter på det tredje larvalstadiet (figur 4 og figur 6), og injeksjoner i tredje larvalstadium viste effekter hos de voksne (figur 5). Mens den nøyaktige timingen må etableres eksperimentelt, vanligvis, injeksjoner trer i kraft i løpet av få dager. Suksessen til denne prosessen kan påvirkes av lengden på dsRNA-sekvensen. Her presenterte vi eksempler med litt over 200 bp til mer enn 800 bp. Som en generell regel foretrekkes sekvenser mellom 100 og 600 bp for å begrense off-target effekter, men sekvenser opp til 1000 bp gir gode resultater22. Et spørsmål i forhold til RNAi er varigheten av knockdown som kan oppnås gjennom denne teknikken. Siden fenotypene var terminale på hvert trinn, kan vi ikke kommentere dette problemet basert på våre presenterte resultater. Det har imidlertid tidligere vært bemerket at RNAi effekter er generelt relativt lang levd, og at høyere konsentrasjoner føre til lengre varige knockdowns20.
En begrensning av denne teknikken er at den fungerer bedre for noen organismer enn for andre, og det synes ikke å være noen direkte måte å forutsi hvor godt det vil fungere a priori. Likevel har det blitt funnet å fungere godt for et stort spekter av forskjellige organismer. Innenfor leddyr inkluderer dette arachnids26,krepsdyr27, og en rekke insekter, med spesielt høye suksessrater hos biller28. En ytterligere komplikasjon er at forskjeller i fenotype alvorlighetsgrad ofte forekommer mellom individer til tross for anvendelsen av samme mengde dsRNA. Som illustrert i figur 2Bkan variasjon til og med forekomme i en person. I våre RNAi-studier rettet mot ulike gener som er involvert i T. marmoratus larval øyeutvikling, har vi ofte funnet ut at noen øyne påvirkes mer alvorlig enn andre. Dette fenomenet kan være relatert til det relativt tette vevet i øyeklyngen, med dsRNA bedre i stand til å nå noen av enhetene.
For vellykket gjennomføring av RNAi-eksperimenter er det avgjørende at flere parametere er optimalisert for målgenet. For eksempel kan konsentrasjonen av dsRNA og lengden på det målrettede genet sterkt påvirke utfallet20. En annen kritisk parameter er hvordan injeksjonene utføres, da denne prosessen i stor grad kan påvirke overlevelsesraten. For embryoer oppnådde vi de beste resultatene ved å målrette midten av embryoet. En godt lagt ut plate gjør det mulig å injeksjon av 100 eller flere embryoer i en enkelt økt. For larver er det viktig å sette inn injeksjonsnålen mellom segmentene. Disse injeksjonene krever mer dsRNA, og basert på larver tilgjengelighet, våre injeksjonssett her vanligvis bare besto av noen få dyr om gangen. For alle injeksjoner er det viktig å forhindre at luft kommer inn i organismen.
I noen tilfeller kan tilbakemeldingssløyfene til et genregulatorisk nettverk og genetisk redundans påvirke penetreringen av RNAi fenotyper, til tross for konsistente knockdowns. Dette synes å være tilfelle for våre atferdsobservasjoner av larver med svært vellykkede knockdowns av et fremtredende linseprotein, Lens318. Selv om vi bekreftet den høye effektiviteten av disse knockdowns gjennom qPCR, ble det observert betydelig variasjon i de tilknyttede fenotypene. Dette resultatet understreker nødvendigheten av å kvantifisere RNAi knockdowns (for detaljer om alternativer, se22). Hvis det ikke er noen klar forventning om en priori i forhold til de resulterende fenotypene, er en god måte å kontrollere for off-target effektene av RNAi å målrette det samme genet med to ikke-overlappende sekvenser av dsRNA og å evaluere resultatene for vanlige fenotyper.
I motsetning til genredigeringsteknikker er RNAi også et kraftig verktøy for å studere dødelige gener, og det er to måter å gjøre det på. For eksempel, hvis man er interessert i det funksjonelle bidraget til et gen hvor tap av funksjon tidlig i utviklingen er kjent for å være dødelig, kan en funksjonell undersøkelse av et slikt gen oppnås ved ganske enkelt å la dyret utvikle seg normalt og deretter slå ned genet via RNAi senere i utvikling (det vil si hos den voksne). Alternativt kan et gen der fullstendig funksjonstap er kjent for å være dødelig undersøkes gjennom en delvis knockdown, som kan oppnås ved å injisere en rekke dsRNA-konsentrasjoner. Noen av våre resultater viser knockdowns av lac2, som er kjent for å være dødelig hvis skjellaget i insekter blir altfor myk24. Selv lac2 RNAi beetle avbildet i figur 5 ville være usannsynlig å overleve utenfor laboratorieforhold. Et annet dødelig gen er kuttet, som koder for en transkripsjonsfaktor som er grunnleggende for celle-skjebne spesifikasjon i ulike organsystemer i leddyr og har vært knyttet til glia utvikling i Drosophila visuelle system29. Basert på vår erfaring med kutt RNAi i T. marmoratus embryoer, kan vi fremkalle informative øye fenotyper i embryoer som er i stand til å fullføre sin embryonale øyeutvikling (upubliserte observasjoner). Her, høyere doser synes å føre til høyere dødelighet, mens lavere doser resultere i observerbare og informative fenotyper.
Vår protokoll viser ikke bare de nødvendige trinnene for en forsker å forfølge RNAi eksperimenter på T. marmoratus, som illustrert, men også er generelt aktuelt for andre organismer, spesielt vannlevende organismer. Blant vannlevende organismer er det allerede flere eksempler innen krepsdyr som vannlopper Daphnia30 og reker (for en nylig gjennomgang, se referanse31). Det er gode muligheter blant akvatiske insekter, da de har blitt anslått å utgjøre ca 6% av alt insektmangfold, med sannsynligvis mer enn 200.000 arter32. Videre har RNAi allerede blitt utført på vann striders som har en tendens til å bebo overflaten av vannmiljøer33. Hvis det ikke finnes noe genom, kan det monteres en transkripsjonsome de novo. Så lenge denne prosessen avslører kontinger av noen få hundre nukleotider, kan dsRNA mot bestemte gener utformes. Vår protokoll for immobiliserende insekter i agarose vil trolig også være nyttig for andre prosedyrer, spesielt for myke, formbare og vannlevende organismer. Samlet sett er RNAi fortsatt en kraftig teknikk for å manipulere genuttrykk i en mangfoldig gruppe organismer, selv når ingen andre molekylære og genetiske verktøy er tilgjengelige.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. Josh Benoit for hans hjelp med bioinformatikk Hailey Tobler for hennes hjelp til å heve Sunburst Diving Beetles og Tamara Pace for redaksjonell hjelp. Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation under tilskudd IOS-1456757 og IOS-1856341 til EKB og IOS1557936 til YT.
1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
injection buffer (10x) | See section 4 | ||
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |