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Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

La retinopatia indotta dall'ossigeno (OIR) può essere utilizzata per modellare malattie retiniche ischemiche come la retinopatia della prematurità e la retinopatia diabetica proliferativa e per servire da modello per studi proof-of-concept nella valutazione dei farmaci antiangiogenetici per le malattie neovascolari. OIR induce una neovascolarizzazione robusta e riproducibile nella retina quantificabile.

Abstract

Uno dei modelli comunemente usati per le retinopatie ischemiche è il modello di retinopatia indotta dall'ossigeno (OIR). Qui descriviamo protocolli dettagliati per l'induzione del modello OIR e le sue letture sia nei topi che nei ratti. La neovascolarizzazione retinica è indotta nell'OIR esponendo i cuccioli di roditori all'iperossia (topi) o alternando livelli di iperossia e ipossia (ratti). Le letture principali di questi modelli sono le dimensioni delle aree neovascolari (NV) e avascolari (AVA) nella retina. Questo modello preclinico in vivo può essere utilizzato per valutare l'efficacia di potenziali farmaci anti-angiogenici o per affrontare il ruolo di specifici geni nell'angiogenesi retinica utilizzando animali geneticamente manipolati. Il modello presenta alcune variazioni specifiche della deformazione e del venditore nell'induzione OIR che dovrebbero essere prese in considerazione durante la progettazione degli esperimenti.

Introduction

Sono necessari modelli sperimentali affidabili e riproducibili per studiare la patologia alla base delle malattie oculari angiogeniche e per sviluppare nuove terapie a queste malattie devastanti. L'angiogenesi patologica è il segno distintivo per la degenerazione maculare legata all'età umida (AMD) e per molte malattie retiniche ischemiche tra cui retinopatia della prematurità (ROP), retinopatia diabetica proliferativa (PDR) e occlusione della vena retinica (RVO)1,2,3,4. Le retine umane e roditori seguono un modello di sviluppo simile, poiché sia la retina umana che quella dei roditori sono tra gli ultimi tessuti vascolarizzati. Prima che la vascolarizzazione retinica si sia completamente sviluppata, la retina riceve il suo apporto nutritivo dalla vascu caratteristica ialoide, che, a sua volta, regredisce quando la vascolarizzazione retinica inizia asvilupparsi 1,2. Nell'uomo, lo sviluppo vascolare retinale è completato prima della nascita, mentre nei roditori la crescita della vascolarizzazione retinica avviene dopo la nascita. Poiché lo sviluppo vascolare retinale avviene postnatale nei roditori, fornisce un sistema modello ideale per studiare l'angiogenesi2,3. I roditori appena nati hanno una retina avascolare che si sviluppa gradualmente fino a quando lo sviluppo completo della retina vascolare si ottiene entro la fine della terza settimana postnatale4. I vasi sanguigni in crescita del topo neonatale sono di plastica e subiscono regressione durante lo stimolo dell'iperossia5.

Il ROP è la principale causa di cecità infantile nei paesi occidentali, in quanto colpisce quasi il 70% dei neonati prematuri con peso alla nascita inferiore a 1.250 g6,7. La ROP si verifica nei neonati prematuri che nascono prima che i vasi retinali completino la loro crescita normale. La ROP progredisce in due fasi: nella Fase I, la nascita pretermine ritarda la crescita vascolare retinica dove dopo nella fase II, la vascolarizzazione incompiuta della retina in via di sviluppo provoca ipossia, che induce l'espressione di fattori di crescita angiogenici che stimolano la crescita nuova e anomala dei vasisanguigni 8. Il modello OIR è stato un modello ampiamente utilizzato per studiare la fisiopatologia del ROP e di altre retinopatie ischemiche, nonché per testare nuovi candidatiai farmaci 2,3,9. È ampiamente considerato come un modello riproducibile per effettuare studi proof-of-concept per potenziali farmaci antiangiogenetici per malattie oculari e non oculari. I due modelli di roditori, vale a dire l'OIR del topo e del ratto, differiscono nel loro modello di induzione e fenotipo della malattia. Il modello di ratto imita il fenotipo ROP in modo più accurato, ma il modello del mouse fornisce un modello più robusto, veloce e riproducibile per la neovascolarizzazione retinica (NV). Nel modello di topo, NV si sviluppa nella retina centrale. Questa lettura patologica è importante negli studi di efficacia farmacologica per molte retinopatie ischemiche, come PDR, RV e AMD essudativa, nonché per malattie angiogeniche non oculari come il cancro. Inoltre, la disponibilità di topi geneticamente manipolati (transgenici e knockout) rende il modello OIR del topo un'opzione più popolare. Tuttavia, né il modello OIR del topo né quello del ratto creano fibrosi retinica, tipica delle malattie umane.

L'intesa che alti livelli di ossigeno contribuiscono allo sviluppo del ROP negli anni '5010,11 ha portato allo sviluppo di modelli animali. I primi studi sull'effetto dell'ossigeno sulla vascuola retinica sono stati effettuati nel 195012,13,14 e fino agli anni '90 ci sono stati molti perfezionamenti al modello OIR. La ricerca di Smith et al. Un'ampia adozione del metodo per quantificare la vaso-obliterazione e la NV patologica daparte di Connor et al. In questo modello, i topi vengono posti al 75% di ossigeno (O2)per 5 giorni a P7, seguiti da 5 giorni in condizioni normossiche. L'iperossia da P7 a P12 fa regredire la vascolarizzazione retinica nella retina centrale. Al ritorno in condizioni normossiche, la retina avascolare diventa ipossica (Figura 1A). A causa degli stimoli ipossici della retina centrale avascolare, alcuni dei vasi sanguigni retinali germogliano verso il vitreo, formando NV preretinale, chiamati ciuffi preretinali2,3. Questi ciuffi sono immaturi e iperpermeabili. La quantità di NV raggiunge i picchi a P17, dopo di che regredisce. La retina è completamente rivascolarizzata e NV è completamente regredito da P23 - P25 (Figura 2A)2,3.

Il modello OIR del ratto (che utilizza livelli variabili di O2)è stato descritto per la prima volta negli anni '90 dimostrando che vari livelli di O2 all'80% e al 40% causano NV più pronunciato rispetto a meno dell'80% O2 esposizionecostante 17. Più tardi si scoprì che il modello di ipossia intermittente, dove O2 è pedalato dall'iperossia (50%) all'ipossia (10-12 %), causa ancora più NV rispetto all'80/40% O2 modello18. Nel modello 50/10%, i cuccioli di ratto sono esposti al 50% per 24 ore, seguiti da 24 ore nel 10% O2. Questi cicli continuano fino a P14, quando i cuccioli di ratto vengono restituiti a condizioni normossiche (Figura 1B). Come nei pazienti con ROP umano, nel modello del ratto le aree avascolari si sviluppano verso la periferia della retina a causa del plesso vascolare reticolare immaturo (Figura 3).

In entrambi i modelli, i parametri principali che vengono solitamente quantificati sono le dimensioni di AVA e NV. Questi parametri vengono in genere analizzati da supporti piatti retinali in cui le cellule endotelialisono etichettate come 4,16. In precedenza la quantità di NV preretinale era valutata dalle sezioni trasversali retiniche contando i vasi sanguigni o i nuclei cellulari vascolari che si estendevano fino a vitrei al di sopra della membrana limitante interna. La principale limitazione di questo approccio è che non è possibile quantificare gli APA.

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Protocol

Il protocollo qui descritto è stato approvato dal Comitato Nazionale di Etica Animale della Finlandia (numero di protocollo ESAVI/9520/2020 ed ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Induzione di animali sperimentali e modello OIR di topo

NOTA: Utilizzare animali accoppiati nel tempo, ad esempio topi C57BL/6J comunemente usati, per far nascere i cuccioli lo stesso giorno. Utilizzare dighe che favoriscono, ad esempio 129 dighe in allattamento (129S1/SvImJ o 129S3/SvIM), per allattare i cuccioli durante e dopo l'induzione dell'iperossia. In alternativa, assicurarsi che siano disponibili dighe in allattamento aggiuntive nel caso in cui le dighe infermieristiche rozzino vengono sostituite a causa dell'esaurimento. Limitare le dimensioni della lettiera a 6-7 cuccioli per ogni diga quando si utilizzano topi / dighe C57BL / 6J (se le cucciolate sono più grandi di quelle i cuccioli tendono ad avere un aumento di peso limitato)16.

  1. Registrare il peso degli animali prima e dopo l'induzione di iperossia e al momento del sacrificio.
  2. Assicurati che ci sia abbastanza cibo sul fondo della gabbia, in modo che le dighe abbiano un facile accesso al cibo.
  3. Aggiungere calce soda con indicatore di colore sul fondo della camera per assorbire l'eccesso di CO2 quando non viene utilizzato un sistema di filtrazione.
  4. Monitorare l'umidità e la temperatura all'interno della camera e mantenere l'umidità tra il 40 e il 65%. Aumentare l'umidità della camera, se necessario, posizionando i piatti con acqua sul fondo della camera (ad esempio, piastre di Petri).
  5. Calibrare il sensore O2 con 100% O2 e aria normale della stanza.
  6. Posizionare i topi P7 in una camera e impostare il livello O2 al 75%. Tenere i topi nella camera per 5 giorni, fino a P12. Evitare di aprire la camera durante l'induzione di iperossia. Controllare la pressione del gas del cilindro O2 e sostituire il cilindro quando necessario. Monitorare gli animali durante l'induzione.
  7. Togliere le gabbie del topo dalla camera e pesare tutti i cuccioli. Raggruppare i cuccioli in base al peso in modo che ogni gruppo sperimentale abbia una distribuzione del peso simile nei cuccioli.

2. Induzione del modello OIR per animali da esperimento e ratto (utilizzando un sistema semichiuso)

NOTA: Usa animali accoppiati nel tempo per far nascere i cuccioli lo stesso giorno. Per l'OIR del ratto, utilizzare una maggiore dimensione della lettiera, circa 18 cuccioli / diga, per ottenere un'induzione NV sufficiente nel modello di ratto. Piscina cuccioli da diverse cucciolate per ottenere abbastanza cuccioli per ogni cucciolata.

  1. Registra il peso degli animali prima e dopo l'induzione e al momento del sacrificio.
  2. Assicurati che ci sia abbastanza cibo sul fondo della gabbia, in modo che le dighe abbiano un facile accesso al cibo.
  3. Aggiungere la calce soda con indicatore di colore sul fondo della camera per assorbire l'eccesso di CO2 quando non viene utilizzato il sistema di filtrazione.
  4. Monitorare l'umidità e la temperatura all'interno della camera. Assorbire l'umidità extra (generata da più ratti) aggiungendo gel di silice sul fondo della camera.
  5. Calibrare il sensore O2 con N2 al 100% e aria normale della stanza.
  6. Posizionare i ratti nella camera a P0 (poche ore dopo la nascita). Impostare il livello O2 al 50% e collegare O2 cilindri alla camera per 24 ore. Successivamente, passare le impostazioni al 10% O2 e collegare il cilindro di azoto (N2)alla camera per 24 ore. Continuare il ciclismo di 24 ore tra il 50% e il 10% O2 per 14 giorni.
  7. Monitorare il consumo di gas e il benessere degli animali durante lo studio. Aprire la camera durante il cambio tra 50/10% O2 e aggiungere più cibo e acqua se necessario. Cambia le gabbie degli animali per pulirne quelle durante l'induzione.
  8. Togliere le gabbie per topi dalla camera e pesare tutti i cuccioli. Raggruppare i cuccioli in base al peso in modo che ogni gruppo sperimentale abbia una distribuzione del peso simile nei cuccioli.

3. Somministrazione di farmaci (facoltativo)

NOTA: La via di somministrazione dei farmaci comunemente usata nell'OIR è per trattamento intravitreale (ivt), a P12-P14 per i topi e a P14 per i ratti. Determinare il giorno del trattamento in base alla configurazione sperimentale. Quando più cucciolate di cuccioli vengono utilizzate negli esperimenti, dividi i gruppi di trattamento per avere animali da tutte le cucciolate. Preferibilmente, iniettare il farmaco a un solo occhio e mantenere l'occhio contralaterale come controllo.

  1. Pesare gli animali e fare segni di identificazione alla coda e/o all'orecchio.
  2. Anestetizzare l'animale con anestesia iniettabile (ad esempio miscela di ketamina e medetomidina, 30 mg/kg e 0,4 mg/kg per i topi) o con anestesia per inalazione (isoflurane al 2-3,5% di isoflurane e 200-350 mL/min flusso d'aria). Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi. Tenere l'animale su una pastiglia riscaldante durante il trattamento.
  3. Per l'anestesia locale, applicare una goccia di analgesico sulla palpebra. Aprire attentamente la palpebra con pini prima di eseguire l'ivt, mentre topi e ratti aprono gli occhi intorno a P14. Applicare una goccia di analgesico (ad esempio, ossbuprocaina cloridrato) sulla cornea.
  4. Applicare una goccia di iodio prima di eseguire l'iniezione ivt.
  5. Per l'iniezione ivt utilizzare una siringa di vetro con un ago da 33-34 G attaccato. Premere le palpebre verso il basso e grappare il bulbo oculare con pinza. Rendere l'iniezione posteriore al limbo, approssimativamente in ago angolato di 45° rivolto verso il nervo ottico.
  6. Evitare di iniettare più di 1,0 μL nello spazio intravitreale. Mantenere l'ago in posizione per 30 s dopo aver iniettato il farmaco per evitare il reflusso della soluzione iniettata.
  7. Esaminare l'occhio (ad esempio, con un oftalmoscopio) per eventuali complicazioni, come emorragie o danni alla retina, dopo aver rimosso l'ago. Applicare unguento antibiotico sopra la cornea dopo l'iniezione.
    NOTA: Il volume di iniezione ivt per i topi deve essere di 0,5 - 1,0 μL.
  8. Invertire l'anestesia (ad esempio con un antagonista α2 per la medetomidina (2,5 mg/kg) e riportare il cucciolo nella gabbia. Ospitare la lettiera normalmente fino alla fine dello studio.

4. Imaging ed elettroretinografia in vivo (opzionale)

  1. Se lo si desidera, condurre immagini in vivo su animali vivi durante il periodo di follow-up per registrare i cambiamenti che si sviluppano nella retina durante le risposte angiogeniche. Ad esempio, eseguire l'angiografia a fluoresceina (FA) o la microscopia confocale lasera scansione 19 per visualizzare la vascucolatura (Figura 4). Utilizzare la tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare gli strati retinali in vivo (Figura 4).
  2. Se lo si desidera, esaminare i cambiamenti funzionali nelle diverse popolazioni di cellule retiniche dopo l'induzione dell'OIR utilizzando l'elettroretinografia (ERG) (Figura 5).

5. Raccolta e preparazione dei tessuti dei supporti piatti retinali

NOTA: Raccogliere i tessuti secondo l'ipotesi di ricerca desiderata. Per i topi, raccogliere i campioni ad esempio in P12 (per studiare la vaso-obliterazione dopo la fase iperossica) o nel periodo ipossico (P13-P17). Raccogliere i campioni OIR del mouse in P17, che è il punto di tempo più comune per il campionamento, per rilevare il picco nella quantità di NV. Nell'OIR del ratto, raccogliere i campioni a P18-P21 per osservare la quantità più elevata di NV (Figura 3).

  1. Pesare gli animali prima del campionamento.
  2. Per etichettare la vascolarizzazione retinica, gli animali profondamente anestetizzati possono essere perfusi trascardialmente con FITC-dextran. (In alternativa, macchiare i supporti piatti della retina con Isolectin più tardi).
  3. Sacrificare gli animali usando un sovradosaggio di farmaci per l'anestesia (ad esempio miscela di chetamina e medetomidina, 300 mg/kg e 4 mg/kg per i topi) oinalazione di CO 2.
  4. Raccogli gli occhi degli animali afferrando dietro il bulbo oculare con pinza curva, taglia il tessuto intorno agli occhi e solleva l'occhio dall'orbita.
  5. Incubare i bulbi oculari in paraformaldeide appena fatta e filtrata al 4% (in salina tamponata da fosfati, PBS) per 1-4 ore. Rimuovere il fissatore e lavare i bulbi oculari 3 x 10 min con PBS. Sezionare immediatamente le retine o conservarle in PBS a +4 °C.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerita. Si prega di leggere la scheda di dati di sicurezza prima di lavorarci.
    NOTA: Non applicare pressione sul bulbo oculare durante il campionamento o qualsiasi fase della lavorazione tissutale al fine di evitare il distacco della retina, se vengono fatte sezioni trasversali da interi bulbi oculari.
  6. Preparare supporti piatti retinali per quantificare la quantità di NV e le dimensioni degli AVA. In alternativa, elaborare i bulbi oculari/retine per l'istologia, o l'analisi dell'RNA o delle proteine. Sezionare la retina al microscopio stereo utilizzando micro forbici e forcep.
    1. Posizionare il bulbo oculare in PBS per mantenerlo umido e forare il bulbo oculare al limbo con un ago (23G) e tagliare intorno al limbo con micro forbici curve per rimuovere l'iride e la cornea.
    2. Posizionare con cura la punta delle forbici tra sclera e retina e tagliare sclera verso il nervo ottico. Fare lo stesso all'altro lato del bulbo oculare e tagliare / strappare con cura la sclera fino a quando la tazza retinica non è esposta. Estrarre l'obiettivo dalla tazza retinica e aggiungere PBS alla tazza.
    3. Rimuovere tutti i vasi ialoidi, vitrei e detriti senza danneggiare la retina. Lavare la retina aggiungendo PBS alla tazza retinica. Eseguire quattro incisioni (a ore 12, 3, 6 e 9) sulla retina con micro forbici dritte per creare una struttura simile a un fiore. Opzionalmente, effettuare i tagli con lama chirurgica prima di montare i campioni. Sollevare la retina utilizzando un pennello morbido su una piastra per la colorazione.
  7. Etichettare la vascolarizzazione retinica utilizzando Isolectin B4 che macchia la superficie delle cellule endoteliali (se gli animali non sono stati perfusi con FITC-dextran). Incubare le retine nel tampone di blocco (10% NGS + 0,5% Tritone in TBS) per 1 h e lavare con 1% NGS + 0,1% Tritone in TBS per 10 min. Incubare le retine con colorante fluorescente coniugato Isolectin B4 (5-10μg/ml) in 1% NGS + 0,1% Tritone in TBS durante la notte a +4 °C pur essendo protetto dalla luce.
    NOTA: Se lo si desidera, etichettare altre cellule come cellule infiammatorie e periciti utilizzando anticorpi specifici.
  8. Lavare le retine 3x per 10 min con 1% NGS + 0.1% Triton in TBS e sollevare le retine su uno scivolo microscopico, retina interna rivolta verso l'alto. Stendere con cura la retina utilizzando pennello morbido e rimuovere eventuali vasi ialoidi o detriti rimanenti. Aggiungere il supporto di montaggio a uno slittamento di copertura e posizionarlo sopra la retina. Conservare le retine a +4 °C e proteggere dalla luce.

6. Analisi dei supporti piatti

  1. Scatta immagini dei supporti piatti retinali utilizzando un microscopio a fluorescenza con obiettivo 10x. Mettere a fuoco il plesso vascolare superficiale e la neovascolarizzazione preretinica. Creare un'immagine di scansione dei riquadri per acquisire l'intera retina e unire le scansioni dei riquadri
  2. Quantificare le immagini misurando gli AVER, l'area di NV e l'area retinica totale utilizzando un programma di elaborazione delle immagini (vedere Table of Materials).
    1. Disegnate gli AVA e l'area retinica totale utilizzando uno strumento di disegno a mano libera e selezionate le aree neovascolari utilizzando uno strumento di selezione. Il software misura le regioni di interesse per i pixel e le aree AVA e NV (espresse in pixel) possono essere utilizzate per calcolare la loro percentuale in relazione all'area retinica totale. Inoltre, sono disponibili alcuni strumenti software per quantificare NV.
      NOTA: Recentemente è stato introdotto un programma open source completamente automatizzato per la quantificazione dei valori chiave delle immagini OIR utilizzando reti neurali di deep learning e fornire uno strumento affidabile per la quantificazione riproducibile di AVA retinica e NV (ad esempio, https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Se si utilizzano anticorpi per il rilevamento immunoistochimico delle singole popolazioni cellulari, quantificare il numero di cellule macchiate (come la microglia, figura 2B)dai supporti piatti retinali a mano o dai sistemi automatizzati di analisi delle immagini, se lo si desidera.

7. Statistiche

  1. Analizza i dati normalmente distribuiti dal test t di Student o dall'ANOVA uni-way seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett o Tukey, a caso. Utilizzare test non parametrici come il test Mann-Whitney U o il test Kruskal Wallis per i dati non normalmente distribuiti. Considerare le differenze statisticamente significative a livello P < 0,05.

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Representative Results

Il risultato principale del modello è il fenotipo vascolare: la dimensione degli AVA e la quantità di NV. Nel modello OIR del topo, la vaso-obliterazione avviene nella retina centrale (Figura 2A), mentre nel modello di ratto si sviluppa in periferia, cioè simile al ROP22 umano ( Figura3A). Questo perché il plesso vascolare superficiale si è già sviluppato quando i topi sono esposti all'iperossia, mentre nel modello del ratto la retina è avascolare al momento dell'induzione OIR (P0). La neovascolarizzazione preretinica si sviluppa vicino alle aree avascolari, cioè la retina centrale nel topo e la periferia nei ratti(figura 2A e figura 3A).

L'analisi istologica mediante sezioni trasversali o supporti piatti può essere effettuata per valutare i cambiamenti morfologici nelle retine OIR o la presenza di tipi cellulari di interesse, ad esempio cellule infiammatorie (Figura 2B). Oltre alla retina, è possibile raccogliere campioni interi o vitrei per ulteriori analisi dell'espressione genica e proteica in diversi punti di tempo durante il modello OIR. I livelli di espressione genica o proteica possono essere analizzati con metodi standard, come RT-qPCR o western blotting.

Facoltativamente, l'imaging in vivo non invasivo può essere condotto durante il periodo di follow-up OIR. La vascucolatura retinica e ialoide può essere visualizzato con fa (Figura 4A). SD-OCT può essere utilizzato per valutare i cambiamenti strutturali nella retina (Figura 4B). Le variazioni funzionali della retina possono essere misurate mediante ERG (Figura 5).

Gli inibitori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sono comunemente usati nel trattamento delle malattie oculari angiogeniche umane. Pertanto, l'anti-VEGF è spesso usato come composto di riferimento in OIR. Aflibercept, che funziona come una trappola VEGF solubile, inibisce sia la NV che la rivascolarizzazione fisiologica in OIR sia in dosi alte che basse (iniettate a P14). Gli occhi OIR iniettati a P14 con un'alta dose di aflibercept avevano AVA retiniche ancora più grandi rispetto agli occhi non trattati (Figura 6). Ciò suggerisce che l'aflibercept blocca anche la fisiologica rivascolarizzazione retinica guidata dall'ipossia. Sia i modelli di topo che di ratto possono essere utilizzati per valutare l'effetto di diversi agenti anti-angiogenici sulla NV retinica e la rivascolarizzazione fisiologica della retina(figura 3B e figura 6).

Figure 1
Figura 1: Panoramica grafica di un progetto standard di studio OIR per topi e ratti. (A) Il modello OIR del topo è stato indotto esponendo i topi al 75% O2 da P7 a P12 ed è tornato all'aria normale della stanza. Il picco di NV preretinale è stato visto in P17, che di solito è il punto di campionamento per l'esperimento. (B) Il modello OIR del ratto è stato indotto esponendo i ratti a livelli alternati di O2 (50/10 % O2) da P0 a P14 ed è tornato in condizioni normossiche. I ratti vengono solitamente sacrificati a P20, quando la quantità di NV ha raggiunto il picco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Fenotipo vascolare nel modello OIR del mouse. Il modello OIR del mouse è stato generato come descritto nella figura 1. (A) Il plesso vascolare superficiale si è sviluppato nei topi normali mentre i topi OIR sono stati esposti al 75% O2 da P7 a P12. Durante questo periodo, l'obliterazione vascolare si sviluppò nella retina centrale (contrassegnata in blu a P12 e P17 nelle immagini quantificate). I topi sono stati restituiti all'aria normale della stanza e la retina avascolare è diventata ipossia, portando alla ricrescita funzionale del vaso nella retina e nella NV patologica (contrassegnata in rosso a P17 nel pannello inferiore). Ciuffi neovascolari preretinali sviluppati tra le aree vascolari e avascolari nella retina centrale. La quantità di NV raggiunse il picco di P17 e regredì in seguito. La retina fu completamente rivascolarizzata e la NV regredì intorno al P24-P25. (B) Un esempio di colorazione immunoistochimica del supporto piatto retinale che mostra microglia retinica macchiata Iba-1 (verde) e vasisanguigni macchiati GS-IB 4 (rosso) a P12 e P17. (C) Sezione trasversale di un occhio OIR del topo a P17, dove ciuffi preretinali (frecce) spuntavano verso il vitreo. Inoltre, è stato visto il diradamento dello strato nucleare interno (INL) e dello strato plessiforme esterno (OPL). Le barre di scala sono 1 mm in A, 50 μm in B e 100 μm in C. ILM = membrana limitante interna, GCL = strato di cellule gangliari, IPL = strato plessiforme interno, INL = strato nucleare interno, OPL = strato plessiforme esterno, ONL = strato nucleare esterno, RPE = epitelio pigmentato retinico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Fenotipo vascolare e suo sviluppo nel modello OIR del ratto. (A) Aree avascolari (contrassegnate in blu) e NV (contrassegnate in rosso) sviluppate nella periferia della retina, simili al ROP umano. (B) Gli AVA sono stati osservati nelle retine OIR, ma non nei controlli normossici. (C) La quantificazione della superficie di NV ha mostrato una tendenza verso un picco dell'importo della NV a P20, ma la differenza non era statisticamente significativa rispetto a P18 e P21 nell'OIR. (Test t dello studente, tra retine normossiche e OIR abbinate al tempo, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, entrambi gli occhi degli animali tracciati nel grafico). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Imaging in vivo mediante angiografia a fluoresceina (FA) e tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale (SD-OCT) nel modello OIR del ratto. (A) La tortuosità vascolare (punte di freccia) è stata osservata nelle immagini prese dalla retina centrale (riga superiore) a P18 e P20 nei ratti OIR rispetto ai ratti P19 normossici. NV (frecce) e AVI (asterisco) si svilupparono alla periferia della retina (riga centrale) come visto nelle retine P18 e P20 OIR. I vasi ialoidi regredendo (fila inferiore) sono stati catturati dalla FA. (B) La crescita dei vasi sanguigni verso il vitreo è stata osservata come un ispessimento sullo strato di fibra nervosa (NFL) e sullo strato di cellule gangliari (GCL) nelle retine OIR (freccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: La funzionalità dei neuroni retini può essere misurata utilizzando l'elettroretinografia flash (fERG). (A) le onde a sono state derivate dai fotorecettori del cono retinale e dell'asta e le loro ampiezze sono state significativamente diminuite nel modello OIR del ratto. L'effetto è aumentato con una maggiore intensità luminosa, suggerendo che i difetti stavano influenzando principalmente le funzioni del fotorecettore del cono. (B) Le ampiezze delle onde B degli animali OIR sono state ridotte rispetto ai controlli normossici. Le onde B erano derivate da cellule on-bipolari e cellule di Müller. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: PBS iniettato per via intravitreale riduce NV e AVI nel modello OIR del mouse. (A) Immagini rappresentative dei supporti piatti retinali da montanti piatti non trattati e trattati con aflibercept (20 μg a P14) e pbs iniettati occhi OIR a P17. L'elevata dose di aflibercept (20 μg) ha aumentato le dimensioni degli AVA del 47% (delineata in bianco) e ha inibito NV del 98% (frecce) rispetto ai controlli non trattati. L'iniezione di PBS ha ridotto gli AVA del 31% e NV del 42% rispetto ai controlli non trattati. Inoltre, la puntura della sclera simile a ivt produceva effetti simili a quelli dell'iniezione ivt di PBS, ma le differenze non erano statisticamente significative. La punta di freccia punta verso vasi ialoidi che non sono stati rimossi durante la dissezione. (ANOVA uniri, * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La gravità del fenotipo della malattia dipende sia dal ceppo che dal fornitore sia nei modelli OIR del topo che del ratto23. Ciò suggerisce che c'è un'ampia variabilità genotipico nello sviluppo della patologia. In generale, i roditori pigmentati sviluppano fenotipo più grave di quelli albini. Ad esempio, la vascolarizzazione retinica dell'albino BALB/c si rivascolarizza rapidamente dopo l'iperossia e non sviluppa affatto NV24. Allo stesso modo, nei ratti, i ratti castani di Norvegia pigmentati mostrano una patologia più grave rispetto ai ratti albini Sprague Dawley (SD)25. I ratti SD sono ceppi comunemente usati e le differenze relative al venditore nel fenotipo OIR sono state riportate all'interno del ceppo. Ad esempio, i ratti SD di Charles River producono molto più NV rispetto ai ratti di Harlan o Zivic-Miller23. I topi C3H/HeJ, a loro volta, che hanno una mutazione nel gene della degenerazione retinica 1 (Rd1), hanno retine sottili e non sviluppano NV26. A causa di questi motivi e della disponibilità di linee di topi transgenici, il C57BL/6J inbred è il ceppo di topo più comunemente usato per gli studi OIR. Tuttavia, c'è una mortalità piuttosto elevata tra le dighe C57BL / 6J a causa dell'esposizione iperossica, quindi il benessere dei topi deve essere considerato quando si progetta lo studio e monitorato durante gli esperimenti. Inoltre, un aumento dei danni al fotorecettore si vede nei topi C57BL/6 rispetto ai topi BALB /c27.

Al fine di garantire il benessere dei topi e la sopravvivenza delle dighe e dei cuccioli, le dimensioni della lettiera devono essere mantenute piccole (6-7 cuccioli / diga). Questo è particolarmente importante quando si utilizzano topi C57BL / 6, che sono più suscettibili allo stressiperossico 27,28. Inoltre, ai topi dovrebbe essere fornito cibo di supporto facilmente accessibile (posto sul fondo della gabbia). Alcuni ricercatori usano dighe surrogate per sostituire le dighe nella camera con quelle sane dopo l'induzione di ossigeno. Tuttavia, la maggior parte dei ricercatori utilizza surrogati solo se la diga èesaurita 22,29. Si consiglia di utilizzare dighe surrogate se vengono utilizzate lettiere più grandi. È stato pubblicato che 129S3/SvIM topi producono più NV di C57BL/6 e sostengono meglio i cambiamenti causati dai vari livelli diossigeno 28. Va notato che le dighe utilizzate nell'OIR non sono sterili dopo l'induzione dell'OIR e non devono essere utilizzate per ulteriori scopi riproduttivi22. L'aumento di peso postnatale dei cuccioli influisce sulla gravità della patologia OIR. I cuccioli con scarso aumento di peso postnatale (<5 g a P17) mostrano un'espressione ritardata di VEGF e quindi una fase prolungata di retinopatia rispetto ai cuccioli con normale (5 - 7,5 g a P17) o un aumento di peso esteso (>7,5 g a P17)29. Inoltre, i cuccioli di topo di peso superiore a 5 g a P7 non mostrano aree vaso-cancellate dopo l'induzione OIR30. Pertanto, è importante pesare i cuccioli durante l'esperimento. L'occhio contralaterale non trattato può essere utilizzato come controllo interno per garantire che lo stato nutrizionale dei topi non influenzi i risultati. La situazione è simile nei ratti; più piccoli sono i cuccioli, più grave è il fenotipo OIR che sviluppano31. Pertanto, si consiglia di utilizzare grandi dimensioni della lettiera (circa 18 cuccioli) per il modello OIR del ratto.

L'induzione del modello OIR può essere eseguita utilizzando entrambi i sistemi completamente chiusi, dove c'è un circuito a circuito chiuso con una pompa che fa circolare l'aria attraverso un sistema di filtraggio (calce di soda e carbone attivo) di nuovo alla camera. Un'altra opzione è un sistema semichiamato, in cui la ventilazione assicura che i metaboliti in eccesso siano rimossi dalla camera. Per garantire la rimozionedell'eccesso di CO 2, la calce soda (miscela di idrossido di calcio con idrossido di sodio o idrossido di potassio) può essere posizionata sul fondo della camera. La rimozione di CO2 è obbligatoria in quanto gli alti livelli di CO2 peggiorano il fenotipo della malattia nei ratti32. Si dovrebbe anche ricordare di ricalibrare regolarmente il sensore di ossigeno della camera in quanto tendono ad andare alla deriva nel tempo e possono fornire una concentrazione di ossigeno errata da quella prevista.

È stato riferito che l'iniezione del veicolo (PBS) da sola o anche solo la puntura allo spazio intravitreale ha un effetto per il tasso di rivascolarizzazione e la quantità di NV(Figura 6)33,34,35,36. È stato ipotizzato se l'effetto visto con l'iniezione PBS / veicolo potrebbe essere dovuto a cambiamenti nella pressione intraoculare durante l'iniezione o a lesioni a strutture oculari che aumentano i livelli di fattori di crescita angiogenici tra cui il fattore di crescita derivato dall'epitelio pigmentato34,37. Inoltre, solo un'iniezione subretinale pilota (puntura allo spazio subretinale) ha dimostrato di avere effetti sul fenotipo vascolare e funzionale nell'OIR rispetto ai ratti non trattati38. Questi risultati evidenziano l'importanza di adeguati controlli negativi negli studi OIR o anche della somministrazione sistemica di composti testati, nonché di n-numeri abbastanza grandi in ogni gruppo di studio. Il fatto che l'iniezione del veicolo migliori effettivamente il tasso di rivascolarizzazione nella retina è un fattore limitante importante in quanto il tasso di rivascolarizzazione e la formazione di ciuffi prerezionali patologici sono inter-correlati nel modello OIR: se il tasso di rivascolarizzazione viene accelerato, porta alla downregolazione compensativa dei ciuffi neovascolari e viceversa. Pertanto, entrambe le misure di risultato primario del modello OIR sono influenzate dall'iniezione del veicolo.

Gli inibitori del VEGF hanno rivoluzionato il trattamento AMD e DR. Il modello OIR è stato utilizzato per dimostrare la loro efficacia preclinicamente. Per quanto riguarda gli inibitori del VEGF nell'OIR, uno studio che confronta diversi anti-VEGF e anti-PlGF (fattore di crescita placentare) (iniettato a P12) ha mostrato che solo l'anti-VEGF ha portato a piccole aree avascolari, mentre gli occhi trattati con anti-PIGF avevano aree avascolaripiù grandi 33. Aflibercept aveva i più grandi AVER rispetto ad altri trattamenti farmacologici33. Aflibercept è noto per legare sia VEGF che PlGF39, potrebbe essere che inibire PlGF in OIR porta al blocco dell'angiogenesi fisiologica.

L'imaging in vivo non invasivo fornisce uno strumento per monitorare la vascolarizzazione retinica40 e gli strati e la struttura retinica durante il periodo di follow-up. Utilizzando fa, parametri come la densità vascolare e la tortuosità arteriosa e la dilatazione venosa (chiamata malattia plus, Figura 4A) possono esseremisurati 40,41. SD-OCT può essere utilizzato per valutare i cambiamenti strutturali e misurare lo spessore della retina durante il periodo di follow-upOIR 42,43. L'ERG viene utilizzato per misurare i cambiamenti funzionali nella retina. Diversi tipi di cellule producono potenziali elettrici dopo lo stimolo della luce, e questi segnali o "onde" possono essere misurati con ERG. I fotorecettori stanno producendo l'onda a negativa, e le cellule bipolari ON e le cellule di Müller sono principalmente responsabili dell'onda B44. La perdita della funzione retinica è tipica nei topi e nei ratti OIR45,46 ( Figura5). Cambiamenti duraturi persistono nella retina e sia i cambiamenti funzionali che i cambiamenti nel livello proteico sono stati riportati nelle retine OIR anche dopo la rivascolarizzazione e la regressione NV34,47.

Per visualizzare la vascolarizzazione retinica, i topi vivi possono essere perfusi con dextran con etichetta FITC o i supporti piatti retinali possono essere macchiati con colorante fluorescente etichettato Isolectin B4. Bisogna capire la differenza tra i coloranti fluorescenti; la perfusione con FITC-dextrans etichetta solo il lume dei vasi, mentre Isolectin B4 macchia la superficie delle cellule endoteliali. Pertanto, i vasi sanguigni funzionali con lume adeguato saranno visualizzati solo con perfusione FITC-dextran, mentre la superficie totale di NV appare più grande nelle retine macchiate di Isolectin B4 che negli animali perfusi FITC-dextran, perché Isolectin B4 raccoglie essenzialmente anche cellule endoteliali che non hanno ancora formato lumen funzionali48. Un'opzione più recente per visualizzare l'intera retina / sfera oculare in formato 3D è l'imaging dei tessuti profondi mediante microscopia a fluorescenza a due fotoni(49).

Il modello OIR roditore, così come i modelli animali in generale, rappresentano solo parzialmente le caratteristiche delle malattie umane. La principale differenza correlata all'OIR è che la neovascolarizzazione retinica non è associata alla fibrosi nell'OIR dei roditori, mentre la neovascolarizzazione retinica porta comunemente alla proliferazione fibrovascolare nelle malattie della retina neovascolare umana. Inoltre, le condizioni che causano L'OIR rispetto alle malattie umane possono essere quasi opposte. I neonati pretermine con ROP richiedono ossigeno supplementare con supporto respiratorio, sperimentano frequentemente episodi ipossiemici e iperossiemici intermittenti causati da apnea ricorrente, ma non sono esposti ad alti livelli di ossigeno. Per ridurre al minimo i danni permanenti, vengono evitate frazioni elevate di O2 ispirato. A tale riguardo, né il modello di topo con esposizione costante al 75% O2 per 5 giorni né il modello di ratto 50/10 assomigliano alla patogenesi del ROP umano. Inoltre, ci sono anche differenze tra il ratto e i modelli OIR del topo. La neovascolarizzazione regredisce nel modello del topo con il ripristino dei vasi normali da parte di P24, mentre la condizione peggiora nel modello OIR del ratto (simile al ROP umano). Sebbene, il modello OIR del ratto mostri caratteristiche clinicamente rilevanti della ROP come lo sviluppo vascolare retinale ritardato e la successiva neovascolarizzazione patologica, il suo uso è limitato dall'assenza quasi completa di ceppi transgenici di ratto, da costi di manutenzione più elevati e da meno NV rispetto al modello OIR del topo.

Nel complesso, nonostante le differenze tra retinopatie prolifeative ischemiche umane e modelli OIR roditori, la facilità con cui l'NV può essere indotto, insieme a una facile visualizzazione e quantificazione della retina, rendono i modelli OIR popolari per studiare i meccanismi molecolari e le potenziali terapie per le retinopatie prolifeative ischemiche. È interessante notare che l'esposizione all'iperossia nel modello OIR del topo induce anche la displasia broncopolmonare, un'altra malattia causata dall'ossigenoterapia supplementare nei neonati prematuri umani, dimostrando che il modello OIR potrebbe essere utilizzato per esplorare nuovi obiettivi sia per la displasia ROP che broncopolmonarecontemporaneamente 50.

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Disclosures

Gli autori Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD e Rubina Thapa sono dipendenti di Experimentica Ltd.

L'autore Giedrius Kalesnykas, PhD, è un dipendente (Presidente e Amministratore Delegato) e azionista di Experimentica Ltd. che offre servizi di ricerca a contratto che utilizzano modelli OIR preclinici utilizzati in questo articolo.

Tero Järvinen, M.D., PhD, e Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen e Anne Kankkunen per l'eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato finanziato dall'Accademia di Finlandia, dalla Fondazione Päivikki e Sakari Sohlberg, dalla Fondazione per la tubercolosi di Tampere, dalla Fondazione medica finlandese, dalla Fondazione per la ricerca distrettuale ospedaliera di Pirkanmaa e dal Fondo di ricerca ospedaliera dell'Università di Tampere.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

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