Summary
산소 유발 망막병증(OIR)은 미숙아 및 증식 성 당뇨병 망막증의 망막병증과 같은 허혈성 망막 질환을 모델링하고 신생아 질환에 대한 항 혈관 신생 약물을 평가하는 개념 증명 연구의 모델로 사용될 수 있다. OIR는 정량화 될 수있는 망막에서 견고하고 재현 가능한 신생 혈관화를 유도합니다.
Abstract
허혈성 망막증에 일반적으로 사용되는 모델 중 하나는 산소 유발 망막병증 (OIR) 모델입니다. 여기에서 우리는 마우스와 쥐 둘 다에 있는 OIR 모형 유도 및 그것의 판독을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 망막 신생 혈관화는 중구 성 새끼를 hyperoxia (마우스) 또는 hyperoxia 및 저산소증 (쥐)의 교대 수준을 노출시킴으로써 OIR에서 유도됩니다. 이 모형의 1 차적인 판독은 망막에 있는 신생혈관 (NV) 및 avascular (AVA) 지역의 크기입니다. 생체 내이 전임상 은 잠재적인 항 혈관 신생 약물의 효능을 평가하거나 유전자 조작 된 동물을 사용하여 망막 혈관 신생에서 특정 유전자의 역할을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델에는 실험을 설계할 때 고려해야 할 OIR 유도에 약간의 변형 및 공급업체별 변형이 있습니다.
Introduction
안정적이고 재현 가능한 실험 모델은 혈관 신생 안구 질환의 병리학을 연구하고 이러한 치명적인 질병에 대한 새로운 치료법을 개발하는 데 필요합니다. 병리학적 혈관신생은 습한 노화 관련 황반 변성(AMD)과 미숙아(ROP), 증식성 당뇨병 성 망막병증(PDR) 및 망막 정맥 폐색(RVO)1,2,3,4의망막병증의 망막병증을 위한 특징이다. 인간과 설치류 망막은 인간과 설치류 망막이 혈관화되는 마지막 조직 중 하나이기 때문에 유사한 발달 패턴을 따릅니다. 망막 혈관이 완전히 발달하기 전에 망막은 히알로이드 혈관에서 영양 공급을 받는데, 이는 망막 혈관이1,2를개발하기 시작할 때 회귀한다. 인간에서는 망막 혈관 발달이 출생 전에 완료되는 반면 설치류에서는 망막 혈관의 성장이 출생 후에 발생합니다. 망막 혈관 발달은 설치류에서 산후에서 발생하기 때문에 혈관 신생2,3을연구하기에 이상적인 모델 시스템을 제공한다. 신생아 설치류는 완전한 혈관 망막 발달이 3 차 산후 주4의말까지 달성 될 때까지 점차적으로 발생하는 혈관 망막을 가지고 있습니다. 신생아 마우스의 성장 혈관은 플라스틱, 그들은 hyperoxia 자극 동안 회귀를겪는다 5.
ROP는 1,250 g6,7의밑에 출생 무게를 가진 미숙아의 거의 70%에 영향을 미치기 때문에, 서양 국가에 있는 유년기 실명에 대한 주요한 원인입니다. ROP는 망막 혈관이 정상 성장을 완료하기 전에 태어난 미숙아에서 발생합니다. ROP는 2단계로 진행한다: 단계 I에서, 조산은 망막 혈관 성장을 지연시키는 단계 II에서, 개발망티나의 미완성 혈관화는 새로운 및 비정상적인 혈관 성장을 자극하는 혈관신생 성장 인자의 발현을 유도하는 저산소증을 일으킨다8. OIR 모델은 ROP 및 기타 허혈성 망막증의 병리학을 연구하고 새로운 약물 후보2,3,9를테스트하는 데 널리 사용되는 모델입니다. 그것은 널리 안구뿐만 아니라 비 안구 질환에 대한 잠재적 인 항 혈관 유발 약물에 대한 개념 증명 연구를 수행하기위한 재현 가능한 모델로 간주됩니다. 두 설치류 모델 즉, 마우스와 쥐 OIR는 모델 유도 및 질병 표현형이 다릅니다. 쥐 모델은 ROP 표현형을 보다 정확하게 모방하지만 마우스 모델은 망막 신생 혈관화 (NV)를 위한 보다 강력하고 빠르며 재현 가능한 모델을 제공합니다. 마우스 모델에서 NV는 중앙 망막으로 발전합니다. 이러한 병리학적 판독은 PDR, RV 및 발출 AMD와 같은 많은 허혈성 망막병증뿐만 아니라 암과 같은 비안구, 혈관신생 질환에 대한 약리효능 연구에서 중요합니다. 더욱이, 유전자 조작 (형질전환 및 녹아웃) 마우스의 가용성은 마우스 OIR 모델을 더 인기있는 옵션으로 만든다. 그러나 마우스나 쥐 OIR 모델은 인간 질환에서 전형적인 망막 섬유증을 생성하지 않습니다.
높은 산소 수준이 1950년대10,11년에 ROP의 발달에 기여했다는 이해는 동물 모형의 발달로 이끌어 냈습니다. 망막 혈관에 산소의 효과에 대한 첫 번째 연구는 1950년 12,13,14및 1990 년대까지 OIR 모델에 많은 정제가 있었다. 1994년 스미스 외(Smith) 등의 연구는 히알로이도병증과망막병증(15)을분리하는 현재 마우스 OIR 모델에 대한 표준을 세웠다. 코너 등(2009)에 의해 혈관 소성 및 병리학적 NV를 정량화하는 방법의 폭넓은 채택은 그 인기를 더욱 높였다16. 이 모델에서, 마우스는 P7에서 5일 동안 75%의 산소(O2)에배치되고, 그 다음으로 5일 동안 노목성 조건에서 배치된다. P7에서 P12까지의 Hyperoxia는 망막 중앙망막에서 회귀하는 망막 혈관을 일으키는 원인이 됩니다. 노목학적 조건으로 돌아오면 혈관 망막이 저산소가됩니다(도 1A). 바낭 중앙 망막의 저산소 자극으로 인해 망막 혈관 중 일부는 유리체쪽으로 싹이 나고, 전리동맥 NV를 형성하여2,3. 이 터프트는 미숙하고 과과성입니다. P17에서 NV 피크의 양이 재생됩니다. 망막은 완전히 재변되고 NV는 P23 - P25(그림 2A)2,3에의해 완전히 회귀된다.
쥐 OIR 모델 (O2의다양한 수준을 사용하여) 먼저 80 % 및 40 %에서 O2 수준이 80 % 이하보다 더 발음 NV를 일으키는 것을 보여주는 1990 년대에 설명되었다 80% O2 상수 노출17. 나중에 O2가 과옥시아 (50 %)에서 순환되는 간헐적 저산소증 모델이 발견되었습니다. 저산소증(10-12%)으로 인해 80/40% O2 모델18보다더 많은 NV가 발생합니다. 50/10% 모델에서 쥐 새끼는 24시간 동안 50%에 노출되고, 10% O2에서24시간 동안 노출됩니다. 이러한 주기는 P14까지 계속되며, 쥐 새끼가 노목학적조건(도 1B)으로반환될 때 계속됩니다. 인간 ROP 환자에서와 마찬가지로, 쥐 모델에서, 변기 부위는 미성숙한 망막 혈관 신경총(도3)으로인해 망막 주변으로 발전한다.
두 모델 모두에서 일반적으로 정량화되는 주요 매개 변수는 AVA 및 NV의 크기입니다. 이러한 파라미터는 전형적으로 내피 세포가4,16으로표지되는 망막 플랫 마운트로부터 분석된다. 이전에는 전리동맥 NV의 양이 혈관 또는 혈관 세포 핵을 내부 제한 막 이상으로 유리체로 확장하여 망막 단면으로부터 평가하였다. 이 방법의 주요 제한은 AVA를 정량화할 수 없다는 것입니다.
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Protocol
여기에 설명된 프로토콜은 핀란드 국립 동물 윤리위원회(프로토콜 번호 ESAVI/9520/2020 및 ESAVI/6421/04.10.07/2017)의 승인을 받았습니다.
1. 실험 동물 및 마우스 OIR 모델 유도
참고: 시간 제동 동물(예: 일반적으로 사용되는 C57BL/6J 마우스)을 사용하여 같은 날에 새끼를 낳습니다. 예를 들어, 129균제(129S1/SvImJ 또는 129S3/SvIM) 수유 댐을 사용하여 초옥시아 유도 중 및 후 새끼를 간호합니다. 또는 피로로 인해 간호 댐을 교체해야 하는 경우를 대비하여 추가 수유 댐이 있는지 확인하십시오. C57BL/6J 마우스/댐을 사용할 때 각 댐에 대한 쓰레기 크기를 6-7마리로 제한합니다(새끼가 체중 증가가 제한되는 경향이 있는 것보다 더 큰 경우)16.
- 과옥증 유도 전후, 그리고 희생시 동물의 무게를 기록한다.
- 케이지 바닥에 충분한 음식이 있는지 확인하여 댐이 음식에 쉽게 접근할 수 있도록 하십시오.
- 여과 시스템을 사용하지 않을 때 여분의CO2를 흡수하기 위해 챔버 의 바닥에 색상 표시기와 소다 라임을 추가합니다.
- 챔버 내부의 습도와 온도를 모니터링하고 습도를 40~65% 사이로 유지합니다. 챔버의 바닥에 물을 접시를 배치하여 필요한 경우 챔버의 습도를 증가 (예를 들어, 페트리 접시).
- O2 센서를 100% O2 및 일반 실내 공기로 보정합니다.
- P7 마우스를 챔버에 넣고 O2 레벨을 75%로 설정합니다. P12까지 5 일 동안 챔버에 마우스를 유지합니다. 과옥증 유도 중에 챔버를 열지 마십시오. O2 실린더의 가스 압력을 확인하고 필요할 때 실린더를 교체하십시오. 유도 중에 동물을 모니터링합니다.
- 마우스 케이지를 챔버에서 꺼내 모든 새끼의 무게를 측정합니다. 각 실험 그룹이 새끼에 유사한 무게 분포를 가지고 있도록 무게를 기반으로 새끼를 그룹화.
2. 실험 동물 및 쥐 OIR 모델 유도 (반 폐쇄 시스템 사용)
참고: 시간 제동 된 동물을 사용하여 같은 날에 태어난 새끼를 얻습니다. 쥐 OIR의 경우, 쥐 모델에서 충분한 NV 유도를 얻기 위해 약 18 새끼 / 댐 증가 쓰레기 크기를 사용합니다. 여러 쓰레기에서 풀 새끼는 각 쓰레기에 충분한 새끼를 얻기 위해.
- 유도 전후, 그리고 희생시에 동물의 무게를 기록한다.
- 케이지 바닥에 충분한 음식이 있는지 확인하여 댐이 음식에 쉽게 접근할 수 있도록 하십시오.
- 여과 시스템을 사용하지 않을 때 여분의CO2를 흡수하기 위해 챔버 의 바닥에 색상 표시기와 소다 라임을 추가합니다.
- 챔버 내부의 습도와 온도를 모니터링합니다. 챔버 바닥에 실리카 젤을 추가하여 여분의 습도 (여러 수의 쥐에서 생성)를 흡수하십시오.
- O2 센서를 100% N2 및 일반 실내 공기로 보정합니다.
- P0 (출생 후 몇 시간)에서 챔버에 쥐를 배치합니다. O2 레벨을 50%로 설정하고 O2 실린더를 챔버에 연결하여 24시간 동안 연결합니다. 그 후 설정을 10% O2로 전환하고 질소(N2) 실린더를 챔버에 24시간 동안 연결한다. 14일 동안 24시간 사이클링을 50%에서 10% O2 레벨로 계속 합니다.
- 연구 기간 동안 동물의 가스 소비와 웰빙을 모니터링합니다. 50/10% O2 사이의 변경 중에 챔버를 열고 필요한 경우 더 많은 음식과 물을 추가합니다. 유도 하는 동안 동물을 청소 하는 동물의 새장을 변경 합니다.
- 쥐 케이지를 챔버밖으로 꺼내 모든 새끼의 무게를 측정합니다. 각 실험 그룹이 새끼에 유사한 계량 분포를 가지고 있도록 무게를 기반으로 새끼를 그룹화합니다.
3. 약물 관리 (선택 사항)
참고: OIR에서 일반적으로 사용되는 약물 투여 경로는 쥐에 대한 P12-P14에서 인트라비티 트리트먼트 (ivt), 쥐에 대한 P14입니다. 실험 설정에 따라 치료 일을 결정합니다. 새끼의 여러 쓰레기가 실험에 사용되는 경우, 모든 쓰레기에서 동물을 가지고 치료 그룹을 분할. 바람직하게는, 한 눈에만 약물을 주입하고, 대조군으로서 반대측 눈을 유지한다.
- 동물의 무게를 측정하고 꼬리 및 / 또는 귀에 식별 표시를합니다.
- 주사용 마취(예: 케타민과 메데토미딘, 30 mg/kg 및 마우스용 0.4 mg/kg) 또는 흡입 마취(이소플루란 2-3.5% 이소플루란 및 200-350mL/min 공기)로 동물을 마취시합니다. 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 확인합니다. 치료 하는 동안 난방 패드에 동물을 유지 합니다.
- 국소 마취의 경우 눈꺼풀에 진통제 한 방울을 바르습니다. 쥐와 쥐가 P14 주위에 눈을 뜨면서 ivt를 수행하기 전에 집게로 눈꺼풀을 조심스럽게 엽니 다. 각막에 진통제(예를 들어, 옥시부프로카인 염산염)를 발라주세요.
- ivt 주입을 수행하기 전에 요오드 한 방울을 적용하십시오.
- ivt 주입을 위해 33-34 G 바늘이 부착된 유리 주사기를 사용한다. 눈꺼풀을 아래로 누르고 집게로 안구를 갈아 누릅니다. 시신경을 가리키는 45° 각도 바늘에서 약45° 각도 바늘로 주사 후방을 하십시오.
- 1.0 μL 이상을 인트라비티 공간에 주입하지 마십시오. 주입된 용액의 역류를 피하기 위해 약물을 주입 한 후 30 s에 대한 바늘을 제자리에 유지하십시오.
- 바늘을 제거한 후 출혈이나 망막 손상과 같은 합병증에 대해 눈 (예를 들어 안과)을 검사하십시오. 주사 후 각막 위에 항생제 연고를 발라주세요.
참고: 마우스의 ivt 주입 부피는 0.5 - 1.0 μL이어야 합니다. - 마취를 반전시면(예: 메데토미딘(2.5 mg/kg)에 대한 α2-길항제와 함께 강아지를 케이지로 되돌려 놓습니다. 연구가 끝날 때까지 쓰레기를 정상적으로 보관하십시오.
4. 생체 내 이미징 및 전세 전세 (선택 사항)
- 원하는 경우, 혈관 신생 반응 동안 망막에서 발생하는 변화를 기록하기 위해 후속 기간 동안 살아있는 동물에 생체 내 이미징을 수행하십시오. 예를 들어, 형광 혈관 조영술(FA) 또는 스캐닝 레이저 공초점 현미경검사법(19)을 수행하여 혈관을 시각화한다(도4). 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영(SD-OCT)을 사용하여 생체 내에서 망막 층을 시각화합니다(그림4).
- 원하는 경우, 전하 (ERG)(도 5)를사용하여 OIR 유도 후 상이한 망막 세포 집단의 기능적 변화를 조사한다.
5. 조직 수집 및 망막 플랫 마운트의 준비
참고: 원하는 연구 가설에 따라 조직을 수집합니다. 마우스의 경우, 예를 들어 P12(과옥상 후 혈관-말살을 연구하기 위해) 또는 저산소 기간(P13-P17)에서 샘플을 수집한다. 샘플링의 가장 일반적인 시점인 P17에서 마우스 OIR 샘플을 수집하여 NV 양에서 피크를 감지합니다. 쥐 OIR에서, P18-P21에서 샘플을 수집하여 가장 높은 양의 NV(도3)를관찰한다.
- 샘플링하기 전에 동물의 무게를 측정합니다.
- 망막 혈관을 표시하려면 심층 마취 된 동물이 FITC-dextran과 함께 트랜스 카디널리 퍼질 수 있습니다. (또는, 나중에 이솔렉틴으로 망막 플랫 마운트를 얼룩).
- 마취 약물 (예 : 케타민과 메데토미딘의 혼합물, 300 mg / kg 및 쥐의 경우 4 mg / kg) 또는 CO2 흡입을 사용하여 동물을 희생하십시오.
- 구부러진 집게로 안구 뒤로 잡고, 눈 주위의 조직을 자르고, 궤도에서 눈을 들어 올려 동물의 눈을 수집합니다.
- 1-4 h에 대해 갓 만든 4 % 파라 포름 알데히드 (인산염 완충식식염, PBS)에서 안구를 배양합니다. 고정을 제거하고 PBS로 3 x 10 분 눈알을 씻으시다. 망막을 즉시 해부하거나 +4°C에서 PBS에 저장합니다.
주의: Paraformaldehyde는 흡입에 의해, 피부와 접촉하고 삼키는 경우에 유독합니다. 안전 데이터 시트를 읽고 작업하기 전에 문의해 주십시오.
참고: 전체 안구의 단면이 이루어지는 경우 망막 분리를 피하기 위해 샘플링 또는 조직 처리의 단계 동안 안구에 압력을 가하지 마십시오. - 망막 플랫 마운트를 준비하여 NV의 양과 AV의 크기를 정량화합니다. 대안적으로, 안구/망막을 공수학, 또는 RNA 또는 단백질 분석을 처리한다. 마이크로 가위와 집게를 사용하여 스테레오 현미경으로 망막을 해부합니다.
- PBS에 안구를 놓고 바늘 (23G)으로 림푸스에서 안구를 촉촉하게 유지하고 눈알을 구멍을 뚫고 휘감이 있는 마이크로 가위로 팔다리를 잘라 홍채와 각막을 제거합니다.
- 조심스럽게 clera와 망막 사이에 가위의 끝을 배치하고 시신경을 향해 clera를 잘라. 안구의 반대편에서도 똑같이 하고 망막 컵이 노출될 때까지 조심스럽게 클레라를 잘라내거나 찢습니다. 망막 컵에서 렌즈를 꺼내 컵에 PBS를 추가합니다.
- 망막을 손상시키지 않고 모든 히알로이드 혈관, 유리체 및 파편을 제거하십시오. 망막 컵에 PBS를 추가하여 망막을 씻으시면 씻습니다. 꽃과 같은 구조를 만들기 위해 직선 마이크로 가위로 망막에 4 개의 절개 (12, 3, 6 및 9시)를 수행하십시오. 선택적으로, 샘플을 장착하기 전에 수술 블레이드로 절단을합니다. 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 망막을 잘 접시에 올려 염색합니다.
- 내피 세포의 표면을 얼룩지게 하는 이솔록틴 B4를 사용하여 망막 혈관에 라벨을 붙입니다(동물이 FITC-dextran으로 퍼프지지 않은 경우). 망막 버퍼(10% NGS + TBS의 0.5% 트리톤)에서 망막을 1h로 배양하고 10분 동안 TBS에서 1% NGS + 0.1% 트리톤으로 세척합니다. 빛으로부터 보호되는 동안 1% NGS + 0.1% 트리톤에서 형광염 염료 컨쥬게이트 이솔렉틴 B 4(5-10μg/ml)로 망막을 배양한다.
참고: 원하는 경우 특정 항체를 사용하여 염증 세포 및 pericytes와 같은 다른 세포에 라벨을 붙입니다. - 망막 3x를 10분 동안 1% NGS + TBS의 0.1% 트리톤으로 씻고 현미경 슬라이드에서 망막을 들어 올려 위쪽으로 향합니다. 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 망막을 조심스럽게 펴고 남은 히알로이드 용기 나 파편을 제거하십시오. 커버 슬립에 마운팅 미디엄을 넣고 망막 위에 놓습니다. 망막을 +4°C에 저장하고 빛으로부터 보호하십시오.
6. 플랫 마운트 분석
- 10배 의 객관적인 형광 현미경을 사용하여 망막 플랫 마운트의 이미지를 가져 가라. 피상혈관 신경총과 전리혈관에 초점을 맞춥니다. 전체 망막을 캡처하고 타일 스캔을 병합하는 타일 스캔 이미지를 확인
- 이미지 처리 프로그램을 사용하여 AvA, NV 영역 및 총 망막 영역을 측정하여 이미지를 정량화합니다(재료 표참조).
- 무료 손 그리기 도구를 사용하여 AVA 및 총 망막 영역을 그리고 선택 도구를 사용하여 신생 영역을 선택합니다. 이 소프트웨어는 픽셀에 대한 관심 영역을 측정하며 AVA 및 NV 영역(픽셀단위로 표현됨)을 사용하여 전체 망막 영역과 관련하여 백분율을 계산할 수 있습니다. 또한 일부 소프트웨어 도구는 NV를 정량화할 수 있습니다.
참고: 최근 딥 러닝 신경망을 이용한 OIR 이미지의 주요 가치의 정량화를 위한 오픈 소스, 완전 자동화 된 프로그램이 도입되었으며 망막 AVA 및 NV (예 : https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21의재현 가능한 정량화를위한 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다.
- 무료 손 그리기 도구를 사용하여 AVA 및 총 망막 영역을 그리고 선택 도구를 사용하여 신생 영역을 선택합니다. 이 소프트웨어는 픽셀에 대한 관심 영역을 측정하며 AVA 및 NV 영역(픽셀단위로 표현됨)을 사용하여 전체 망막 영역과 관련하여 백분율을 계산할 수 있습니다. 또한 일부 소프트웨어 도구는 NV를 정량화할 수 있습니다.
- 개별 세포 집단의 면역조직화학적 검출을 위해 항체를 사용하는 경우, 원하는 경우 망막 플랫 마운트에서 스테인드 셀(microglia, 도 2B)의수를 정량화한다.
7. 통계
- 학생의 테스트 또는 단방향 ANOVA에 의해 일반적으로 분산된 데이터를 분석한 다음 Dunnett 또는 Tukey의 여러 비교 테스트가 적절히 수행됩니다. Mann-Whitney U 테스트 또는 Kruskal Wallis 테스트와 같은 비파라메트릭 테스트를 사용하여 일반적으로 분산되지 않는 데이터에 대해 사용하십시오. P&05 수준에서 통계적으로 유의한 차이를 고려하십시오.
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Representative Results
모델의 주요 결과는 혈관 표현형입니다 : AVA의 크기와 NV의 양. 마우스 OIR 모델에서, 혈관 투약은 중앙 망막(도2A)에서발생하며, 쥐 모델에서는 주변, 즉 인간ROP(22)와 유사하게개발된다. 이는 마우스가 아옥시아에 노출될 때 피상적 혈관 신경총이 이미 개발되었지만 쥐 모델에서는 망막이 OIR 유도(P0)의 시점에서 바탈구이기 때문이다. 전황 신생 혈관화는 혈관 영역, 즉 마우스의 중앙 망막 및 쥐 의 주변 부근에서 발생합니다(도 2A 및 도 3A).
단면 또는 평평한 마운트를 이용한 조직학적 분석은 OIR 망막의 형태학적 변화 또는 관심 있는 세포 유형의 존재, 예를 들어 염증세포(도2B)의존재를 평가하기 위해 행해질 수 있다. 망막 이외에, 전체 눈 또는 유리체 샘플은 OIR 모델 동안 상이한 시간 지점에서 추가 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 수집될 수 있다. 유전자 또는 단백질 발현 수준은 RT-qPCR 또는 서부 블로팅과 같은 표준 방법으로 분석될 수 있다.
선택적으로, 비침습적 생체 내 이미징은 OIR 후속 기간 동안 수행될 수 있다. 망막 및 히알로이드 혈관은FA(도 4A)로시각화될 수 있다. SD-OCT는 망막의 구조적 변화를 평가하는 데 사용될 수있다(도 4B). 망막의 기능적 변화는 ERG(도5)에의해 측정될 수 있다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제제는 일반적으로 인간 혈관 신생 안구 질환의 치료에 사용된다. 따라서, 안티 VEGF는 종종 OIR에서 기준 화합물로 사용된다. Aflibercept, 그 수용 성 VEGF-트랩으로 작동, 높은 및 낮은 복용량모두에서 OIR에서 NV와 생리적 재보정을 억제 (P14에서 주입). P14에서 고용량의 아플리버셉트를 주입한 OIR 눈은 치료되지 않은 눈보다 더 큰 망막 AVA를가졌다(도 6). 이것은 aflibercept 블록또한 저산소증에 의해 구동되는 생리적인 망막 재보정이 있다는 것을 건의합니다. 마우스 및 쥐 모델 모두 망막 NV 및 망막의 생리적 재보정에 대한 상이한 항 혈관신생 제의 효과를 평가하는 데 사용될 수있다(도 3B 및 도 6).
그림 1: 쥐와 쥐에 대한 표준 OIR 연구 디자인의 그래픽 개요. (A)마우스 OIR 모델은 P7에서 P12로 마우스를 75% O2로 노출시킴으로써 유도되어 일반 실내 공기로 돌아왔다. preretinal NV의 피크는 P17에서 보였으며, 이는 일반적으로 실험의 샘플링 포인트이다. (B)쥐 OIR 모델은 P0에서 P14로 O2 수준(50/10% O2)을번갈아 가며 쥐를 노출시킴으로써 유도되어 노목상상태로 돌아왔다. 쥐는 일반적으로 P20에서 희생, 때 NV의 양이 피크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 마우스 OIR 모델의 혈관 표현형. 마우스 OIR 모델은 도 1에 설명된 대로 생성되었다. (A)피상적 혈관 신경총은 정상 마우스에서 개발되었으며 OIR 마우스는 P7에서 P12까지 75% O2에 노출되었다. 이 시간 동안, 혈관 전소는 중앙 망막에서 개발 (정량화 된 이미지에서 P12 및 P17에서 파란색으로 표시). 마우스는 정상 실내 공기로 반환되었고, 혈관 망막은 저산소가되어 망막과 병리학적 NV에서 기능성 혈관 재성장(아래 패널의 P17에서 빨간색으로 표시됨). 중앙 망막에 있는 혈관과 혈관 지역 사이 개발된 전황 난바혈관 tufts. NV의 양은 P17에서 정점에 달했고 나중에 회귀했습니다. 망막은 완전히 재구성되었고 NV는 P24-P25 주위에 회귀했다. (B)P12 및 P17에서 망막 이바-1 염색 마이크로글리아(green) 및 GS-IB4 염색 혈관(red)을 나타내는 망막 플랫 마운트의 면역히스토케미컬 염색의 예. (C)P17에서 마우스 OIR 눈의 단면, 여기서 전리회 터프트 (화살표)는 유리체를 향해 발아했다. 또한, 내부 핵층(INL) 및 외부 플렉시폼 층(OPL)의 희석이 보였다. 스케일 바는 A에서 1mm, B에서 50 μm, C. ILM = 내부 제한 멤브레인, GCL = 신경절 세포 층, IPL = 내부 플렉시폼 층, INL = 내부 핵층, OPL = 외부 플렉시폼 층, ONL = 외부 핵층, RPE = 망막 색소 에피텔륨이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혈관 표현형 및 쥐 OIR 모델의 개발. (A)인간 ROP와 유사한 망막 주변에서 개발된 혈관 영역(파란색으로 표시) 및 NV(빨간색으로 표시). (B)AVA는 OIR 망막에서 보였지만, 노목상 대조군에서는 볼 수 없었다. (C)NV 면적의 정량화는 P20에서 NV의 양이 최고조에 이르는 추세를 보였지만, 그 차이는 OIR의 P18 및 P21에 비해 통계적으로 유의하지 않았다. (학생의 t-테스트, 시간 일치 normoxic 및 OIR 망막 사이, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, 그래프에 플롯 동물의 두 눈). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 쥐 OIR 모델에서 형광 혈관 조영술(FA) 및 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영(SD-OCT)을 이용한 생체 내 이미징. (A)혈관 강자도(arrowheads)는 노목식 P19 쥐에 비해 OIR 쥐의 P18 및 P20의 중앙 망막(상단 행)에서 찍은 이미지에서 볼 수 있었다. P18 및 P20 OIR 망막에서 볼 수 있듯이 NV(화살표) 및 AVA(별표)는 망막(가운데 행)의 주변으로 개발되었습니다. 회귀 히알로이드 혈관(아래 줄)은 유린체를향한 혈관 의 성장이 OIR 망막(arrow)에서 신경 섬유 층(NFL) 및 신경절 세포 층(GCL)에 두껍게 되는 것으로 관찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 망막 뉴런의 기능은 플래시 전세노피(fERG)를 사용하여 측정할 수 있다. (A)파는 망막 콘및 막대 광수용체로부터 유래되었고 그들의 진폭은 쥐 OIR 모델에서 현저히 감소하였다. 효과 증가 높은 빛 강도, 결함 원뿔 광 수용 체 기능에 주로 영향을 미치는 제안. (B)OIR 동물의 B파 진폭은 노목식 대조군에 비해 감소하였다. B파는 온 양극성 세포 및 뮐러 세포로부터 유래되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 인트라빗주입 PBS는 마우스 OIR 모델에서 NV및 AVA를 감소시킨다. (A)처리되지 않은 망막 플랫 마운트의 대표적인 이미지, 및 flibercept 처리 (P14에서 20 μg) 및 PBS는 P17에서 OIR 눈을 주입. 고용량의 aflibercept (20 μg)는 AVA의 크기를 47 %(흰색으로 설명) 증가시켰으며 치료되지 않은 컨트롤에 비해 NV를 98 %(화살표)로 억제했습니다. PBS 주사는 치료되지 않은 대조군에 비해 AVA를 31%, NV가 42% 감소했습니다. 또한, ivt를 닮은 clera의 펑크는 PBS의 ivt 주입과 유사한 효과를 일으켰지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 해부 중에 제거되지 않은 히알로이드 용기의 화살표 헤드 포인트. (편도 ANOVA, * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
질병 표현형의 중증도는 마우스와 쥐 OIR모델(23)의균주와 공급업체 모두에 의존한다. 이것은 병리학 발달에 있는 넓은 genotypic 가변성이 있다는 것을 건의합니다. 일반적으로, 색소 설치류는 알비노 보다 더 심각한 표현형을 개발. 예를 들어, 알비노 BALB/c의 망막 혈관은 과옥증 후 급속히 변조되고24전혀NV를 개발하지 않는다. 유사하게, 쥐에서, 색소 브라운 노르웨이 쥐는 알비노 스프라그 Dawley (SD) 쥐25보다더 심각한 병리학을 보여줍니다. SD 쥐는 일반적으로 사용되는 변형, 그리고 OIR 표현형에 공급 업체 관련 차이 변형 내에서 보고 되었습니다. 예를 들어, 찰스 강에서 SD 쥐는 할란 또는 지빅 밀러23에서쥐보다 훨씬 더 많은 NV를 생산하고 있습니다. C3H/HeJ 마우스는, 차례로 망막 변성1(Rd1)유전자에 돌연변이가 있고, 얇은 망막을 가지며, NV26을개발하지 않는다. 이러한 이유와 형질 전환 쥐 라인의 가용성으로 인해, 근친교C57BL/6J는 OIR 연구에 가장 일반적으로 사용되는 마우스 변형이다. 그러나, Hyperoxic 노출로 인한 C57BL/6J 댐 중 사망률이 상당히 높기 때문에, 실험 중에 연구를 설계하고 모니터링할 때 마우스의 웰빙을 고려해야 합니다. 더욱이, 증가된 광수용체 손상은 BALB/c마우스(27)에비해 C57BL/6 마우스에서 볼 수 있다.
쥐의 복지와 댐과 새끼의 생존을 보장하기 위해, 쓰레기 크기는 작은 유지되어야한다 (6-7 새끼 / 댐). 이것은 Hyperoxic 응력27,28에더 취약하다 C57BL/6 마우스를 사용할 때 특히 중요합니다. 또한, 쉽게 접근할 수 있는 지지 식품(케이지 의 바닥에 놓음)은 마우스에 제공되어야 한다. 일부 연구자들은 대리 댐을 사용하여 산소 유도 후 챔버의 댐을 건강한 댐으로 대체합니다. 그러나 대부분의 연구자들은 댐이22,29를소진한 경우에만 대리를 사용합니다. 더 큰 쓰레기 크기를 사용하는 경우 대리 댐을 사용하는 것이 좋습니다. 129S3/SvIM 마우스가 C57BL/6보다 더 많은 NV를 생산하고 다양한 산소수준(28)으로인한 변화를 더 잘 유지한다는 사실이 발표되었다. OIR유도 후 OIR에 사용되는 댐은 불임이며 추가 사육목적(22)에사용해서는 안 된다는 점에 유의해야 한다. 새끼의 출생 후 체중 증가는 OIR 병리학의 심각도에 영향을 미칩니다. 가난한 산후 체중 증가와 새끼 (&5 g at P17) 정상 (5 - 7.5 P17g) 또는 광범위한 체중 증가 (P17에서 7.5 g)29와새끼에 비해 따라서 망막증의 지연 된 발현을 표시합니다. 더욱이, P7에서 5g 이상의 무게의 마우스 새끼는 OIR 유도30후에 혈관 말살 부위를 나타내지 않는다. 따라서, 실험 중에 새끼를 계량하는 것이 중요하다. 반대로 치료되지 않은 눈은 마우스의 영양 상태가 결과에 영향을 미치지 않도록 내부 대조군으로 사용될 수 있다. 상황은 쥐에서 유사하다; 새끼가 작을수록31을개발하는 더 심각한 OIR 표현형이 더 심합니다. 따라서, 큰 쓰레기 크기 (약 18 새끼)는 쥐 OIR 모델에 사용되는 것이 좋습니다.
OIR 모델 유도는 완전히 닫힌 시스템을 사용하여 수행 할 수 있으며, 필터 시스템 (소다 라임 및 활성 탄)을 통해 공기를 순환시키는 펌프가있는 폐쇄 루프 회로가 챔버로 다시 전달됩니다. 또 다른 옵션은 환기가 과도한 대사산물이 챔버에서 제거되도록 하는 반폐쇄 시스템입니다. 과도한 CO2를 제거하기 위해 탄산음료 라임(수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨과 수산화칼슘의 혼합물)을 챔버 바닥에 배치할 수 있습니다. CO2의 제거는 높은 CO2 수준이쥐(32)의질병 표현형을 악화시킬 때 필수적이다. 하나는 또한 그들은 시간이 지남에 따라 표류 하는 경향이 하 고 의도 한 에서 잘못 된 산소 농도 제공할 수 있습니다 정기적으로 챔버의 산소 센서를 재보정 기억 한다.
차량 분사(PBS)단독으로 또는 인트라비탈 공간에 대한 천자만으로도 NV(도6)33,34,35,36의양에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. PBS/차량 주입으로 본 효과가 주입 중 내 혈압의 변화로 인해 이루어질 수 있는지, 또는 혈관신생 성장 인자의 수준을 증가시키는 안구 구조의 부상으로 인한 것이 아닌지 추측되고 있다34,37. 더욱이, 다만 파일럿 피하 주사(피하 공간에 펑크)는 치료되지 않은쥐(38)에비해 OIR의 혈관 및 기능적 표현형에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 OIR 연구에서 적절한 부정적인 제어의 중요성을 강조하거나 테스트 된 화합물의 전신 투여뿐만 아니라 각 연구 그룹에서 충분한 n-숫자. 차량 주입은 실제로 망막에서 회전 속도를 향상한다는 사실은 REAScularization 속도와 병리학 전리구의 형성이 OIR 모델에서 상호 관련됨에 따라 주요 제한 요소입니다 : 개정 속도가 가속화되면, 그것은 신생아 터프트의 보상 다운 규제로 이어지고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 따라서, OIR 모델의 두 가지 주요 결과 측정은 차량 주입의 영향을 받습니다.
VEGF 억제제는 AMD 및 DR. OIR 모델이 임상적으로 효능을 입증하는 데 사용되었습니다. OIR의 VEGF 억제제와 관련하여, 다른 안티-VEGF및 항-PlGFs를 비교하는 연구 (P12에서 주입) 안티 VEGF 혼자 작은 아바스 영역으로 이어졌다는 것을 보여주었다, 안티 PIGF 처리 눈은 더 큰 avascular 영역을 했다 반면33. Aflibercept는 다른 약물 치료33에비해 가장 큰 AVA를 했다. AfliberceptVE와 PlGF39둘 다 결합 하는 것으로 알려져 있다, 그것은 OIR에서 PlGF를 억제 생리 혈관 신생의 차단에 이르게 될 수 있습니다.
비침습적 생체 내 이미징은 후속 기간 동안 망막 혈관40 및 망막 층 및 구조를 모니터링하기위한 도구를 제공합니다. FA를 사용하여 혈관 밀도 및 동맥 과금 및 정맥 팽창(플러스 질병, 도 4A라고함)과 같은 매개 변수를40,41로측정할 수 있다. SD-OCT는 OIR 후속 기간 동안 구조적 변화를 평가하고 망막 두께를 측정하는 데 사용될 수 있다42,43. ERG는 망막의 기능적 변화를 측정하는 데 사용됩니다. 다른 세포 유형은 빛 자극 후 전기 전위를 생성하고, 이러한 신호 또는 "파도"는 ERG로 측정 될 수있다. 광수용체는 음파를 생성하고 있으며, ON 양극성 세포 및 뮐러 세포는 주로 b-wave44에대한 책임이 있다. 망막 기능의 손실은 OIR 마우스 및쥐(45,46)에서 전형적이다(도5). 망막에서 지속되는 긴 지속적인 변화는 단백질 수준의 기능적 변화와 단백질 수준에 있는 변화 둘 다 에 있는 reascularization 및 NV 회귀34,47후에 OIR 망막에서 보고되었습니다.
망막 혈관을 시각화하기 위해, 살아있는 마우스는 FITC 표지dextran 또는 망막 플랫 마운트로 인응염될 수 있으며, 형광염염료로 염색될 수 있다4. 하나는 형광 염료의 차이를 이해해야합니다; FITC-덱스트랜스 라벨이 부착된 관류는 혈관의 루멘만 표시하고, 이솔록틴 B4는 내피 세포의 표면을 얼룩지게 합니다. 따라서, 적절한 루멘을 가진 기능성 혈관은 FITC-dextran 관류로만 시각화되며, NV의 총 면적은 FITC-dextran 에 퍼진 동물보다 이솔록틴 B4 얼룩망막에서 더 크게 나타나며, 이솔록틴 B4는 본질적으로기능성루멘을 형성하지 않은 내피 세포도 집어들기 때문이다. 3차원 포맷으로 전체 망막/눈볼을 시각화하는 최신 옵션은 2광광자 형광 현미경검사법(49)에의한 깊은 조직 이미징이다.
설치류 OIR 모델뿐만 아니라 일반적으로 동물 모델은 부분적으로 만 인간 질병의 특성을 나타냅니다. OIR와 관련된 주요 차이점은 망막 신생 혈관화가 설치류 OIR의 섬유증과 관련이 없는 반면 망막 신생 혈관화는 인간 신생 혈관 망막 질환의 섬유혈관 증식으로 일반적으로 이어진다는 것입니다. 더욱이, OIR 대 인간 질병을 일으키는 원인이 되는 조건은 거의 반대일 수 있습니다. ROP를 가진 preterm 신생아는 호흡 지원으로 보충 산소를 요구하고, 재발하는 무호흡증에 기인한 수시로 간헐적인 저혈증 및 hyperoxemic 에피소드를 경험합니다, 그러나 산소의 상부에 드러내지 않습니다. 영구적 인 손상을 최소화하기 위해 영감 O2의 높은 분수는 피합니다. 그런 점에서, 5일 동안 75%O2에 지속적으로 노출된 마우스 모델도 50/10 쥐 모델은 인간 ROP의 발병기와 유사하지 않습니다. 또한 쥐와 마우스 OIR 모델 사이에도 차이가 있습니다. P24에 의한 정상 혈관의 재확립을 통해 마우스 모델에서 의외의 회귀는 쥐 OIR 모델(인간 ROP과 유사)에서 상태가 악화된다. 쥐 OIR 모델은 지연된 망막 혈관 발달 및 후속 병리학 적 신생 혈관화와 같은 ROP의 임상적으로 관련된 특징을 보여 주지만, 그 사용은 마우스 OIR 모델보다 트랜스 제닉 쥐 균주의 거의 완전한 부재, 높은 유지 보수 비용 및 NV감소에 의해 제한됩니다.
함께 촬영, 인간의 허혈성 증식 망막증과 설치류 OIR 모델 사이의 차이에도 불구하고, NV가 유도 될 수있는 용이성, 망막의 쉬운 시각화 및 정량화와 결합, IS의 확산 망막에 대한 분자 메커니즘과 잠재적 인 치료법을 연구하는 데 인기있는 OIR 모델을 합니다. 흥미롭게도, 마우스 OIR 모델의 과옥증 노출은 또한 인간 미숙아의 산소 요법에 의한 또 다른 질병인 기관지폐 이형성증을 유도하여, OIR 모델이 ROP와 기관지 간이성 이형성증 모두에 대한 새로운 표적을 동시에 탐구하는 데 사용될 수 있음을 보여준다50.
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Disclosures
저자 마리아 베테투파, 박사, 니나 예스켈라이넨, 마크 세라다- 기메네즈, 박사, 루비나 타파는 실험리카 회사의 직원입니다.
저자 Giedrius Kalesnykas, 박사, 직원 (사장 및 최고 경영자) 및 이 조에 사용되는 전임상 OIR 모델을 고용 계약 연구 서비스를 제공하는 실험가 회사의 주주입니다.
테로 예르비넨, M.D., 박사, 하넬 레 우시탈로-예르비넨, M.D., 박사, 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
마리안 칼스버그, 앤 마리 하파니에미, 피비 파르타넨, 앤 칸쿠넨에게 훌륭한 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 핀란드 아카데미, 피비키키 및 사카리 솔베르크 재단, 탐페레 결핵 재단, 핀란드 의학 재단, 피르칸마 병원 지구 연구 재단 및 탐페레 대학 병원 연구 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
References
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